Summary
توضح هذه المقالة تغليف الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) باستخدام جهاز تركيز التدفق المحوري المشترك. نحن نثبت أن تقنية تغليف الموائع الدقيقة هذه تمكن من التكوين الفعال للكرويات hPSC.
Abstract
توفر الثقافات ثلاثية الأبعاد (3D) أو الكروية للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) فوائد تحسين نتائج التمايز وقابلية التوسع. في هذه الورقة ، نصف استراتيجية للتكوين القوي والقابل للتكرار للكرويات hPSC حيث يتم استخدام جهاز تركيز التدفق المحوري المشترك لمحاصرة hPSCs داخل كبسولات microcapsule الأساسية shell. يحتوي الحل الأساسي على تعليق خلية واحدة من hPSCs وتم جعله لزجا من خلال دمج البولي (الإيثيلين جلايكول) عالي الوزن الجزيئي (PEG) ووسائط تدرج الكثافة. يتكون تيار القشرة من PEG-4 arm-maleimide أو PEG-4-Mal ويتدفق جنبا إلى جنب مع التيار الأساسي نحو تقاطعين نفطيين متتاليين. حدث تكوين القطيرات عند تقاطع الزيت الأول مع محلول قذيفة يلتف حول القلب. حدث التشابك الكيميائي للقذيفة عند تقاطع الزيت الثاني عن طريق إدخال رابط متقاطع ثنائي الثيول (1,4-dithiothreitol أو DTT) إلى هذه القطرات. يتفاعل الرابط المتقاطع مع المجموعات الوظيفية الماليميدية عبر كيمياء النقر ، مما يؤدي إلى تكوين قشرة هيدروجيل حول الكبسولات الدقيقة. أنتجت تقنية التغليف الخاصة بنا كبسولات قطرها 400 ميكرومتر بمعدل 10 كبسولات في الثانية. تحتوي الكبسولات الناتجة على قشرة هيدروجيل ونواة مائية سمحت للخلايا المفردة بالتجمع بسرعة في مجاميع وتشكيل كرويات. لم تؤثر عملية التغليف سلبا على صلاحية hPSCs ، حيث لوحظت قابلية >95٪ من الجدوى بعد 3 أيام من التغليف. وللمقارنة، فإن مركبات الكربون الهيدروكلورية المغلفة في جسيمات هلامية صلبة (بدون نواة مائية) لم تشكل كرويات وكان لها قابلية <50٪ قابلة للحياة بعد 3 أيام من التغليف. حدث التكوين الكروي ل hPSCs داخل الكبسولات الدقيقة ذات الغلاف الأساسي في غضون 48 ساعة بعد التغليف ، مع كون القطر الكروي دالة على كثافة تلقيح الخلايا. بشكل عام ، كانت تقنية تغليف الموائع الدقيقة الموصوفة في هذا البروتوكول مناسبة تماما لتغليف hPSCs وتشكيل كروي.
Introduction
هناك اهتمام كبير في الثقافات ثلاثية الأبعاد للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) بسبب تحسين تعدد القدرات وإمكانات التمايز التي يوفرها تنسيق الثقافة هذا1،2،3. عادة ما يتم تشكيل hPSCs في كرويات أو تنسيقات أخرى للثقافة ثلاثية الأبعاد عن طريق المفاعلات الحيوية والآبار الدقيقة والمواد الهلامية المائية والسقالات البوليمرية4،5،6. يوفر التغليف وسيلة أخرى لتنظيم hPSCs مفردة في كرويات. بمجرد تغليف الكريات hPSC ، يمكن التعامل معها بسهولة ونقلها إلى لوحات microtiter للتمايز أو نمذجة الأمراض أو تجارب اختبار المخدرات. كما أن تغليف hPSCs في طبقة هيدروجيل يحمي الخلايا من تلف القص ويسمح بزراعة الكرويات في مفاعل حيوي بمعدلات عالية من التحريك7.
تطورت منهجيتنا لتغليف الخلايا الجذعية بمرور الوقت. أولا، ركزنا على الجسيمات الدقيقة الهيدروجيل الصلبة وأظهرنا نجاحا في تغليف وزراعة الخلايا الجذعية الجنينية للفئران (mESCs)8. ومع ذلك، لوحظ أن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) لها صلاحية منخفضة عند تغليفها في مثل هذه الجسيمات الدقيقة الهيدروجيلية، ويرجع ذلك على الأرجح إلى زيادة حاجة هذه الخلايا إلى إعادة الاتصال بين الخلايا والخلايا بعد التغليف. لقد استنتجنا أن الكبسولة الدقيقة غير المتجانسة ، التي تمتلك نواة مائية ، قد تكون أكثر ملاءمة لتغليف الخلايا التي تعتمد على إعادة التأسيس السريع لاتصالات الخلايا الخلوية. تم تكييف مفهوم جهاز الموائع الدقيقة الذي يركز على التدفق المحوري المشترك لصنع كبسولات صغيرة من الغلاف المائي الأساسي / الهيدروجيل من He et al.9 ، ولكن بدلا من الجينات المستخدمة في النهج الأصلي ، تم دمج هيدروجيل قائم على PEG في القشرة. لقد أظهرنا لأول مرة التغليف الناجح والتكوين الكروي لخلايا الكبد الأولية في الكبسولات الدقيقة ذات القشرة الأساسية10 ووصفنا مؤخرا تغليف خلايا hES و iPS7. كما هو موضح في الشكل 1A ، يتم تصنيع الكبسولات في جهاز تركيز التدفق حيث تنتقل تيارات التدفق الصدفي والأساسي من جانب إلى آخر إلى التدفق المحوري المشترك قبل الطرد إلى مرحلة الزيت. يحتوي التدفق الأساسي على خلايا وإضافات تزيد من لزوجة المحلول (PEG MW 35kD غير التفاعلي و iodixanol - الاسم التجاري OptiPrep) بينما يحتوي تيار القشرة على جزيئات تفاعلية (PEG-4-Mal). يتم فصل تيار التدفق المحوري المشترك المستمر إلى قطرات تحتفظ ببنية الغلاف الأساسي. يتم جعل بنية الغلاف الأساسي دائمة عن طريق التعرض ل di-thiol crosslinker (DTT) ، والذي يتفاعل مع PEG-4-Mal عبر كيمياء النقر ويؤدي إلى تكوين جلد هيدروجيل رقيق (~ 10 ميكرومتر) أو قذيفة. بعد كسر المستحلب ونقل الكبسولات إلى مرحلة مائية ، تنتشر جزيئات PEG من القلب ويتم استبدالها بجزيئات الماء. هذا يؤدي إلى كبسولات مائية أساسية وهيدروجيل قذيفة.
فيما يلي إرشادات خطوة بخطوة حول كيفية صنع أجهزة الموائع الدقيقة ، وكيفية تحضير الخلايا ، وكيفية إجراء تغليف hPSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصنيع الجهاز
- قم بعمل تصميمات لجهاز التغليف الدقيق وجهاز التفكك باستخدام برنامج CAD10,11.
- قم بتغطية الطبقات الثلاث من SU-8 المقاومة للضوء بالتتابع على رقاقة السيليكون (الشكل 2A) لتحقيق هياكل ذات ارتفاعات مطلوبة: 60 و 100 و 150 ميكرومتر.
ملاحظة: عملية القوالب العلوية والسفلية متطابقة.- قم بتغطية رقاقة سيليكون نظيفة مقاس 10 سم مع مقاومة سلبية للضوء SU-8 2025 عند 1100 دورة في الدقيقة لإنشاء أول طبقة 60 ميكرومتر. بعد الخبز الناعم عند 65 درجة مئوية لمدة 3 دقائق و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على صفيحة ساخنة ، قم بفضح القالب باستخدام مصفف بدون قناع عن طريق تحميل ملف تصميم نمط القناة الأساسية إلى جهاز الكمبيوتر μPG 101. ثم تابع خبز ما بعد التعرض عند 65 درجة مئوية لمدة 3 دقائق وعند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- قم بتدوير طبقة SU-8 2025 الثانية (40 ميكرومتر) عند 1500 دورة في الدقيقة وقم بعرضها عن طريق تحميل ملف CAD المناسب لنمط قناة shell.
ملاحظة: كانت المخبوزات اللينة وما بعد التعرض مشابهة للخطوة السابقة. - قم بتدوير طبقة SU-8 2025 الثالثة عند 1400 دورة في الدقيقة لتحقيق ارتفاع 50 ميكرومتر وتكرار العملية المذكورة أعلاه ولكن كشف الهياكل لمرحلة الزيت.
- قم بتطوير القالب مع جميع الطبقات الثلاث في خطوة واحدة عن طريق الغمر في مطور SU-8 حتى تتم إزالة جميع مقاومة الضوء غير المكشوفة.
- اخبز القالب بقوة على صفيحة ساخنة عند 160 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتحسين الالتصاق وختم الشقوق الطفيفة التي يمكن أن تظهر بعد التطور.
- قم بتعريض القالب للكلوروتريميثيل سيلان لتجنب ربط المطاط الصناعي في الخطوة التالية وضعه في أطباق بتري 15 سم حتى الاستخدام.
- قم بإعداد قالب جهاز التفكك بنفس الطريقة ، كما هو موضح في الشكل 1D والشكل 2B. قم بتدوير طبقة واحدة من مقاومة الضوء SU-8 على رقاقة سيليكون ، كما هو موضح سابقا في الخطوة 1.2.3 ، لتحقيق هياكل ذات الارتفاع المطلوب: 50 ميكرومتر. قم بإجراء الخبز الناعم وما بعد التعرض ، والتطوير ، والخبز الصلب بشكل مشابه للخطوة السابقة.
ملاحظة: غطت مجموعة من الوظائف المثلثة الشكل الغرفة بأكملها، مع تناقص التباعد بين الوظائف مع انخفاض عرض الغرفة باتجاه المنفذ. كانت أعمدة المثلث 200 ميكرومتر لكل جانب مع درجة تتراوح من 400 ميكرومتر (عند المدخل) إلى 30 ميكرومتر (عند المخرج). - تحضير القوالب عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة باستخدام polydimethylsiloxane (PDMS).
- امزج قاعدة المطاط الصناعي PDMS وعامل معالجة المطاط الصناعي بنسبة 10: 1 واط / واط في جهاز طرد مركزي كوكبي. صب الخليط على كل من القوالب الرئيسية للتغليف الدقيق والقالب الرئيسي للتفكك لإنشاء طبقة 3-4 مم.
ملاحظة: يكفي خليط من 50 جم من قاعدة المطاط الصناعي مع 5 جم من عامل المعالجة لتغطية قالب رئيسي بسماكة 3 مم. - ضع أطباق بتري التي تحتوي على القوالب في مجفف فراغ لمدة 15 دقيقة لإزالة الغاز من PDMS غير المعالج.
- انقل أطباق بتري إلى الفرن واخبزها على حرارة 80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 60 دقيقة.
- قم بإزالة القوالب الرئيسية من الفرن واتركها تبرد. باستخدام سكين دقيق ، قم بقطع PDMS بعناية وفقا لشكل الرقاقة وقشر قطع PDMS من القالب الرئيسي.
- قم بقطع ألواح PDMS عن طريق تقليم حواف كل جهاز باستخدام مشرط ، ثم قم بثقب منافذ سائل المدخل / المخرج في جهاز التفكك وفقط في جهاز الموائع الدقيقة العلوي باستخدام إبر الفولاذ المقاوم للصدأ. قم بتغطية الأجهزة بشريط سحري لتجنب التلوث.
ملاحظة: مقياس الإبرة هو 14 جم و 15 جم لمنافذ المدخل والمخرج ، على التوالي. - للترابط ، عالج الجوانب المنقوشة لقطع PDMS العلوية والسفلية باستخدام بلازما O2 على محفور البلازما لمدة دقيقتين.
- قم بمحاذاة جزأي PDMS تحت منظار مجسمة بعد إضافة طبقة رقيقة منفصلة من الماء المقطر مباشرة في القنوات الدقيقة (2 ميكرولتر).
- ضع جهاز PDMS المحاذاة في الفرن على درجة حرارة 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها لإكمال الترابط واستعادة PDMS إلى حالته الأصلية الكارهة للماء. قم بتخزين الأجهزة حتى مزيد من الاستخدام.
ملاحظة: ينتج عن ذلك جهاز تركيز تدفق محوري واحد بثلاثة ارتفاعات مختلفة تبلغ 120 ميكرومتر للنواة و 200 ميكرومتر للقذيفة و 300 ميكرومتر لقنوات النفط. - من أجل استخدام الجهاز مباشرة بعد الترابط البلازما ، قم بحقن 30 ميكرولتر بعناية ولكن بحزم من محلول الطلاء الكارهة للماء في القنوات المائعة لتحقيق طلاء مسعور. ثم ، قم على الفور بتطهير الهواء في القنوات حتى لا يتم ملاحظة أي بقايا من محلول الطلاء الكارهة للماء في الجهاز.
- قم بربط جهاز التفكك عن طريق معالجة الجانب المزخرف من الجهاز أولا وزجاج منزلق نظيف ببلازما O2 لمدة دقيقتين ، ثم قم بتجميعها لمزيد من المعالجة في الفرن عند 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: يمكن تخزين الأجهزة حتى الاستخدام مرة أخرى.
- امزج قاعدة المطاط الصناعي PDMS وعامل معالجة المطاط الصناعي بنسبة 10: 1 واط / واط في جهاز طرد مركزي كوكبي. صب الخليط على كل من القوالب الرئيسية للتغليف الدقيق والقالب الرئيسي للتفكك لإنشاء طبقة 3-4 مم.
2. إعداد الحلول
- حلول الأسهم. أولا ، قم بإعداد محاليل المخزون (المحاليل المركزة) التي سيتم تخفيفها إلى تركيزات أقل للاستخدام الفعلي.
ملاحظة: تستخدم حلول المخزون لتوفير وقت التحضير، والحفاظ على المواد، وتقليل مساحة التخزين، وتحسين الدقة عند إعداد حل عمل بتركيزات أقل.- قم بإعداد 30 مل من محلول أساسي 2x (16٪ PEG و 34٪ وسائط تدرج الكثافة): امزج 4.8 جم من 35 kDa PEG ، و 10.2 مل من وسائط تدرج الكثافة ، و 19.8 مل من وسائط DMEM / F12. قم بتصفية هذا الحل الأساسي باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
- تحضير 50 مل من الزيت المعدني مع 3 ٪ من الفاعل بالسطح: مزيج 48.5 مل من الزيت المعدني و 1.5 مل من الفاعل بالسطح. يحفظ في حالة معقمة بعد الترشيح من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
- تحضير 50 مل من الزيت المعدني مع 0.5 ٪ من الفاعل بالسطح: مزيج 49.75 مل من الزيت المعدني و 0.25 مل من الفاعل بالسطح. يحفظ في حالة معقمة.
- تحضير 1 M Dithiotheritol (DTT): إذابة 1.5425 غرام من DTT في 10 مل من الماء المقطر. يحفظ في حالة معقمة.
- تحضير 1 م ثلاثي إيثانولامين (TEA): أضف 66.4 ميكرولتر من الشاي في 433.6 ميكرولتر من الماء المقطر. يحفظ في حالة معقمة.
- تحضير 1 ٪ Pluronic F127 (PF127): إذابة 100 ملغ من PF127 في 10 مل من الماء المقطر. يحفظ في حالة معقمة.
- حلول العمل
- تحضير مستحلب كروس لينكر عن طريق خلط 4.5 مل من الزيت المعدني مع 3٪ من الفاعل بالسطح و 300 ميكرولتر من 1 M DTT (نسبة 1:15). دوامة الحل لمدة 2 دقيقة وسونيكات لمدة 45-60 دقيقة في حمام بالموجات فوق الصوتية في 20 درجة مئوية. قم بتحميل هذا الحل إلى حقنة سعة 5 مل بإبرة 27 جم.
ملاحظة: يتم توليد المستحلب عن طريق خليط الزيت / الماء الصوتي. - تحضير محلول زيت التدريع عن طريق تحميل الزيت المعدني مع 0.5٪ من الفاعل بالسطح إلى حقنة 5 مل مع إبرة 27 G.
- تحضير محلول القشرة (8٪ w/v PEG-4-Mal و 15 mM TEA) عن طريق إضافة 32 ملغ من PEG-4-Mal في 400 ميكرولتر من 1x DPBS لتشكيل محلول 8٪ w/v ، ودوامة المحلول لمدة دقيقتين. ثم ، أضف 6 ميكرولتر من 1 M TEA (التركيز النهائي 15 mM TEA). أخيرا ، جهاز طرد مركزي عند 13000 × g لمدة 5 دقائق من خلال مرشح دوار وإبقائه في الظلام على الروك لمدة 30 دقيقة. ثم ، قم بتحميل هذا الحل إلى حقنة 1 مل بإبرة 27 G.
ملاحظة: اترك حاوية PEG-4-Mal للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل فتح الغطاء، ونفخ غاز N 2 لاستبدال O 2 ب N2 قبل إغلاق الغطاء. دوامة الشاي قبل إضافة إلى الحل.
- تحضير مستحلب كروس لينكر عن طريق خلط 4.5 مل من الزيت المعدني مع 3٪ من الفاعل بالسطح و 300 ميكرولتر من 1 M DTT (نسبة 1:15). دوامة الحل لمدة 2 دقيقة وسونيكات لمدة 45-60 دقيقة في حمام بالموجات فوق الصوتية في 20 درجة مئوية. قم بتحميل هذا الحل إلى حقنة سعة 5 مل بإبرة 27 جم.
- تحضير تعليق الخلية في المحلول الأساسي
- عالج hPSCs بالتريبسين لمدة 5 إلى 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم ، جمعها من لوحات. قم بإخماد التربسين بالوسط بعد انفصال الخلية ، ثم انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- جهاز طرد مركزي لتعليق الخلايا السائبة (400 × جم ، 5 دقائق). استنشق بعناية supernatant ثم أعد تعليق بيليه الخلية باستخدام الحد الأدنى من حجم وسط النمو. عد الخلايا باستخدام عداد خلايا تلقائي.
ملاحظة: تحتوي أليكوتات الخلايا النموذجية على 12-20 × 106 خلايا وهي كافية لصنع 400 ميكرولتر من المحلول الأساسي. - خذ 12-20 × 106 خلايا من تعليق الخلايا السائبة وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية / الوسائط (400 × جم ، 5 دقائق).
- استنشق الوسائط بعناية من حبيبات الخلية. ثم ، أضف وسائط 200 ميكرولتر و 200 ميكرولتر من محلول PEG 2x (التركيز النهائي 30-50 × 106 خلية / مل) واخلطها بلطف.
ملاحظة: أدت تركيزات الخلايا المنخفضة (أقل من 20 × 106 خلايا/مل) إلى العديد من الكبسولات الفارغة. - أضف 30 ميكرولتر من 1٪ PF127 إلى المحلول.
- أدخل قضيب تحريك صغير (2 مم × 7 مم) في حقنة سعة 1 مل ، ثم قم بتحميل الخلية التي تحتوي على محلول أساسي في المحقنة بإبرة 27 جم. حافظ على برودة المحلول بالثلج أثناء عملية التغليف بأكملها.
3. الإعداد التجريبي
- ضع جهاز قطرات PDMS المستعبد، بطول أربع قطع بطول 20 سم وقطعة واحدة من الأنابيب الدقيقة ذات المدخل بطول 5 سم (0.38 مم I.D. × 1.1 مم O.D.)، وقطعة واحدة من أنبوب مخرج 10 سم (0.5 مم I.D. × 1.5 مم O.D.)، وست قطع من أنابيب التركيب 0.5 سم (1 مم ID.D. × 1.8 مم O.D.) تحت مصدر ضوء مبيد للجراثيم (عادة ما يكون مدمجا في خزانات السلامة البيولوجية) وتعقيمها لمدة 30 دقيقه.
- استخدم الملقط لتركيب الأنابيب في منافذ المدخل المائعة ومنافذ التفكك.
- استخدم القطع الثلاث من الأنابيب الدقيقة ذات المدخل بطول 20 سم للقشرة والزيت ومداخل مستحلب الوصلة المتقاطعة وقطعة واحدة لمدخل جهاز التفكك. ثم ، أدخل الطرف الآخر من الأنابيب في إبرة المحقنة مع المحلول المقابل. وفي الوقت نفسه ، قم بتوصيل المدخل الأساسي لجهاز الموائع الدقيقة ومخرج جهاز التفكك بأنبوب ميكروتوبي واحد بحجم 5 سم (الشكل 1C).
ملاحظة: يجب أن تكون الأنابيب الدقيقة للمدخل مثبتة بإحكام داخل الأنابيب المناسبة ، والتي تم إدخالها في الخطوة الأخيرة. - أدخل أنبوب مخرج واحد في منفذ مخرج الانسيابية وضع الطرف الآخر في خزان التجميع.
- ضع الجهاز على مرحلة المجهر وقم بتوصيل الأنبوب لتجنب التحرك. قم بمحاذاة المجهر وتركيزه على فوهة الجهاز لفحص التدفق.
- ضع كل حقنة على مضخات حقنة مختلفة وقم بتأمينها بشكل صحيح (الشكل 1B). قم ببرمجة كل مضخة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة لمعدلات التدفق التالية: الأساسية (3-5 ميكرولتر / دقيقة) ، القشرة (3-5 ميكرولتر / دقيقة) ، زيت التدريع (20-80 ميكرولتر / دقيقة) ، وزيت الربط المتقاطع (40-60 ميكرولتر / دقيقة). بدء التدفق في جميع المضخات.
- انتظر حتى يدخل كل سائل إلى الجهاز واملأ القنوات أثناء دفع الهواء المتبقي للخارج.
ملاحظة: إذا كانت هناك كمية كبيرة من الهواء في أنابيب المدخل، فقم بزيادة كل معدل تدفق مؤقتا حتى تتم إزالة الهواء بالكامل. ضع في اعتبارك أن معدل التدفق المفرط يمكن أن يؤدي إلى فشل سندات PDMS إلى PDMS. - عندما يستقر تكوين الكبسولة (الشكل 3) ، ضع الطرف الآخر من أنبوب التجميع في أنبوب مخروطي جديد مع 5 مل من وسائط mTeSR.
ملاحظة: تحتوي الوسائط على مثبط ROCK 10 ميكرومتر ، و 100 U / mL البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. - بعد جمع عدد كاف من الكبسولات ، احتضنها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 10 دقائق. ستكون الكبسولات الموجودة في مرحلة الزيت في الجزء العلوي من الأنبوب (انظر الشكل 4A). يؤدي النقر بلطف على الأنبوب إلى إرسال كبسولات إلى الرواسب إلى القاع. بعد ذلك ، قد يتم شفط معظم النفط ووسائل الإعلام.
- جمع الكبسولات من الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي ، ووضعها على مصفاة خلية (حجم المسام 100 ميكرومتر) ، وغسلها بكميات وفيرة من الوسائط. بعد ذلك ، قم بجمع الكبسولات الدقيقة باستخدام وسائط 2 مل في لوحة استزراع 6 آبار عن طريق تشغيل الوسائط عبر المرشح أثناء قلبها أعلى لوحة البئر (انظر الشكل 4A).
4. زراعة وتحليل hPSC في كبسولات دقيقة
- الثقافة الأساسية
- احتضن كبسولات الخلايا الجذعية في طبق من 6 أطباق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- قم بتغيير الوسائط كل يومين عن طريق جمع الكبسولات على مرشح مصفاة الخلايا ، وغسلها بالوسائط الزائدة ، وإعادة تثبيتها في بئر جديد في ألواح 6 آبار مع وسائط 2 مل كما حدث في الخطوة 3.10.
- ثقافة الكبسولات لمدة 10 أيام على الأقل.
- إجراء الفحص الحي / الميت لتحديد جدوى الخلايا الجذعية المغلفة.
- إذابة محاليل الفحص الحية / الميتة (إيثيديوم هوموديمر-1 وكالسين AM).
- أضف 4 ميكرولتر من 2 ميكرومتر إيثيديوم هوموديمر-1 و 1 ميكرولتر من محاليل 4 ميكرومتر كالسيين AM إلى 2 مل من DPBS المعقمة. دوامة لضمان الخلط الكامل.
- جمع ما يقرب من 100 كبسولة صغيرة على مصفاة الخلايا وشطفها مع DPBS معقمة للسماح بانتشار المتوسطة من الكبسولات.
- اجمعها مرة أخرى إلى لوحة 12 بئر باستخدام 1 مل من المحلول المعد في الخطوة 4.2.2. تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- تصور الخلايا تحت المجهر الفلوري.
ملاحظة: يتم تحديد صلاحية الخلية كميا عن طريق حساب النسبة المئوية للخلايا الحية، التي يتم تصورها على أنها خضراء، من بين العدد الإجمالي للخلايا.
- توصيف حجم كروي.
- عند الرغبة ، ضع صفيحة البئر مع كبسولات صغيرة تحت المجهر وقم بقياس قطر الكرويات الموضحة في البرنامج ذي الصلة باستخدام قضبان مقياس مناسبة.
- قياس وتحليل حجم الكروية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باتباع البروتوكول المذكور أعلاه ، سيتمكن القارئ من تصنيع أجهزة الموائع الدقيقة وإنتاج كبسولات دقيقة حاملة للخلايا. ويبين الشكل 3 ألف أمثلة على الكبسولات الدقيقة المثلى ودون المثلى المصنعة باستخدام توليد قطرات الموائع الدقيقة. أدت التركيبات المختلفة من PEG-4-Mal إلى كبسولات ذات مورفولوجيات مختلفة - ارتبطت الكبسولات المجعدة بالهلام الضعيف ، وانخفاض السلامة الميكانيكية ، ولم تتحمل الزراعة في مفاعل حيوي متحرك. تمثل الكبسولات الملساء التي لوحظت في محتوى PEG بنسبة >6٪ مورفولوجيا الكبسولة المطلوبة وكانت قوية بما يكفي لزراعة الخلايا. تم تأكيد بنية القشرة الأساسية من خلال دمج الميكروبيدات في النواة والفلورسنت في قشرة الكبسولات الدقيقة. تم استخدام تجميع الخرز في وسط الكبسولات كما هو موضح في الشكل 3B كمؤشر على أن النواة كانت مائية ، وكانت الخرز حرة في الحركة. تشير الحلقة الفلورية التي لوحظت في الشكل 3C إلى وجود قشرة هيدروجيل وتم استخدامها لتحديد سمك القشرة. نوصي المستخدمين باستخدام دمج الميكروبيدات ووضع العلامات الفلورية في المراحل المبكرة من إنشاء عملية التغليف.
بمجرد إنشاء عملية التغليف ، يمكن للمرء الانتقال إلى تغليف hPSCs. بينما يصف هذا البروتوكول تغليف خلايا H9 ، فقد استخدمنا استراتيجية مماثلة لتغليف خط hESC آخر (HUES-8) وخط iPSC (1016). 7
في حين أن التغليف يمكن أن يتم باستخدام جهاز التغليف فقط ، فقد لاحظنا أن hPSCs تميل إلى التكتل في النظام مما يؤدي إلى تغليف غير منتظم أو إشغال كبسولة. ولمواجهة هذا التحدي، صممنا جهاز فك التفكك أو الترشيح ووضعناه في المنبع من جهاز التغليف. يتألف جهاز التفكك هذا من قناة تدفق مع مجموعة من المشاركات على شكل مثلث تقاس 200 ميكرومتر لكل جانب وبدرجة ميل تتراوح من 400 ميكرومتر عند المدخل إلى 30 ميكرومتر عند المخرج بحيث يتم الاحتفاظ بالكتل أو تقسيمها قبل دخول جهاز التغليف (انظر الشكل 1D)7. يسمح استخدام جهاز التفكك بتحسين توحيد الكرويات بشكل كبير وزيادة إشغال الخلايا للكبسولات من 57٪ إلى >90٪ 7.
يصف الشكل 4B,C النتائج التمثيلية من تشغيل التغليف. كما يتضح من هذه الصور ، تتمتع خلايا H9 بصلاحية عالية مع قابلية بقاء >95٪ تتحقق بشكل روتيني أثناء عمليات التغليف. قارنا معدل النمو (انظر الشكل 4B ، C) وإمكانات التمايز للكرويات المغلفة مقابل الكروية غير المغلفة7 ، وقررنا أن عملية التغليف ليس لها أي آثار ضارة على hPSCs. من ناحية أخرى ، هناك العديد من الفوائد لتغليف hPSCs. من السهل التعامل مع الكرويات المغلفة ويمكن توزيعها / توزيعها في لوحات ميكروتيتر لتطوير بروتوكولات التمايز أو علاجات الاختبار. يهتم مختبرنا باستخدام الكبسولات الدقيقة كحاملات للخلايا الجذعية لزراعة التعليق في المفاعلات الحيوية المقلوبة وقد أثبت أن قذيفة الهيدروجيل توفر الحماية ضد تلف القص في مثل هذه الثقافات7. هذا هو السبيل الإضافي الذي نتبعه هو إنشاء كبسولات دقيقة نشطة بيولوجيا حيث يمكن تحميل قذيفة الهيدروجيل بعوامل النمو للتسليم المحلي والمستمر للإشارات الاستقرائية أثناء التمايز.
الشكل 1: تصنيع الكبسولات الدقيقة الأساسية (أ) يتكون جهاز الموائع الدقيقة لتوليد الكبسولات من أربع قنوات مدخل (النواة ، القشرة ، الزيت ، وزيت الوصلة المتقاطعة) وقناة سربنتين تؤدي إلى أنبوب تجميع. يتم تصنيع الجهاز بحيث تكون القنوات الأساسية والقشرية والزيتية 120 ميكرومتر (H1) و 200 ميكرومتر (H2) و 300 ميكرومتر (H3) ، على التوالي. يمثل الجزء الداخلي منظرا مقطعيا عرضيا عند الفوهة - التقاطع بين تيارات مائية وزيتية. يميل هذا العرض المقطعي المستعرض بمقدار 90 درجة لإعطاء القارئ رؤية أفضل لقنوات التدفق المحورية. يصور تمثيل 3D لعملية تصنيع الكبسولات الدقيقة الأساسية كيف يتم توليد التدفق المحوري في المنبع من تقاطع التركيز على التدفق لإنتاج بنية الكبسولة الدقيقة الأساسية للقذيفة. يتم تحقيق الاستحلاب عن طريق تعريض القطرات المائية لتيارين زيتيين ، تم تصميم الأول منهما لتحقيق الاستقرار في القطرات ، والثاني لتوفير DTT المتقاطع ، الذي يتفاعل مع PEG-4-Mal. وقد عدل هذا الرقم من المرجع12. حقوق الطبع والنشر 2019 ، الجمعية الكيميائية الأمريكية. (ب) الإعداد التجريبي لنظام التغليف الذي يبين مواقع مضخات المحاقن والأنابيب وأجهزة الموائع الدقيقة وأنبوب جمع الكبسولات. (ج) صورة لنظام التغليف ، والتي تتكون من أجهزة التفكك والتغليف في تسلسل. (د) تصميم جهاز التفكك الموائع الدقيقة المستخدم لتجنب دخول مجاميع الخلايا الكبيرة إلى جهاز التغليف الدقيق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تصنيع أجهزة الموائع الدقيقة المستخدمة في التغليف. (أ) تصنيع جهاز التغليف. كانت ثلاث طبقات من مقاومة الضوء SU-8 مغلفة بالدوران ، وصورة منقوشة لتوليد قنوات أساسية وقذيفة وزيتية بارتفاعات مختلفة. يبلغ عرض القنوات الأساسية 220 ميكرومتر يضيق عند تقاطع الكبسولة إلى 135 ميكرومتر. تتبع القنوات لجميع المراحل نفس المبدأ: تبدأ قنوات القشرة والزيت بعرض 500 ميكرومتر ، وتضيق عند التقاطع إلى 220 ميكرومتر ، ويبدأ زيت التدريع عند 500 ميكرومتر ويضيق إلى 270 ميكرومتر. يبلغ عرض منفذ أفعوانية 1.5 مم وطول ~ 55 مم. ثم تمت محاذاة قطع PDMS العلوية والسفلية ، واستعباد البلازما. (ب) تصنيع جهاز التفكيك. كانت طبقة واحدة من مقاومة الضوء SU-8 مغلفة بالدوران ، وصورة منقوشة لتوليد قنوات التفكك. ثم كانت قطعة PDMS مستعبدة بالبلازما مع شريحة زجاجية. يتكون جهاز التفكك من غرفة صغيرة يبلغ ارتفاعها 30 ميكرومتر وطولها 16.5 مم وعرضها 5 مم عند المدخل و 1.7 مم عند المخرج. لديها هياكل على شكل مثلث (200 ميكرومتر ، متساوية الأضلاع) يتم فصلها عن بعضها البعض بواسطة 420 ميكرومتر من المدخل وتصبح أقرب في الطريق إلى المخرج ، مع فصل 50 ميكرومتر في الصف الأخير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توصيف الكبسولات الدقيقة. (أ) الاختلافات في مورفولوجيا الكبسولة كدالة لمحتوى PEG-4-Mal في القشرة. ترتبط الكبسولات الملساء ذات الحواف الساطعة بالسلامة الميكانيكية المطلوبة. (ب) تأكيد النواة المائية للكبسولات الدقيقة. الميكروبيدات المحاصرة حرة في التحرك في القلب المائي والتجميع في وسط الكبسولات الدقيقة. (ج) تأكيد بنية القشرة الأساسية عن طريق دمج PEG المسمى Rhodamine B في غلاف الكبسولات الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تغليف hPSCs . (أ) يتم جمع الكبسولات الدقيقة في مرحلة الزيت في أنبوب مخروطي مملوء بالوسائط. بعد أن يتم صنع الكبسولات الدقيقة لتستقر في قاع الأنبوب ، يتم شفط الزيت والوسائط ، ويتم غسل الكبسولات الدقيقة ثم نقلها إلى صفيحة من 6 آبار للزراعة. (ب) تلطيخ حي / ميت 6 ساعات بعد تغليف خلايا H9. تم التقاط الصورة العلوية بمعدل 10 أضعاف ، والصورة السفلية عند 20 ضعفا. (C) الصور التي تقارن الأحجام الكروية التي تتغير بمرور الوقت لخلايا H9 في كبسولات وفي لوحات الثقافة ثلاثية الأبعاد التجارية (الصور السفلية). (د) التحديد الكمي للقطر الكروي الذي يزداد بالنسبة ل hPSCs في كبسولات دقيقة وفي لوحات الاستزراع 3D القياسية خلال 7 أيام في وسائط H9. التحليل الإحصائي -t-test, p < 0.05, n = 20. شريط المقياس: 200 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تؤدي عملية التغليف الموصوفة هنا إلى تكوين كروي hPSC قابل للتكرار. يجعل شكل الكبسولة الدقيقة من السهل توزيع الكرويات في آبار صفيحة ميكروتيتر للتجارب التي تهدف إلى تحسين / تحسين بروتوكولات التمايز أو اختبار العلاجات. يمكن أيضا استخدام كرويات الخلايا الجذعية المغلفة في مزارع التعليق حيث تحمي قذيفة الهيدروجيل الخلايا من التلف الناجم عن القص7.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة داخل البروتوكول. من المهم الحفاظ على معدلات تدفق تيارات القلب والقشرة والزيت ضمن النطاق الموضح في قسم البروتوكول. إذا كان معدل تدفق القشرة منخفضا جدا ، يصبح التدفق غير مستقر ، مما يؤدي إلى كبسولات مشوهة وغير مستقرة ميكانيكيا. يجب أن يبدو تغليف الخلايا الناجح مشابها للكبسولات الدقيقة الموضحة في الشكل 4C. يجب أن تكون الكبسولات الدقيقة ذات قطر مماثل ولها عدد مماثل من الخلايا المحاصرة في القلب. عادة ما يحدث تجميع الخلايا المفردة في كرويات في غضون 48 ساعة ونقص التكوين الكروي عند 72 ساعة هو علامة تحذير. قد يكون أحد أسباب عدم تكوين كروي هو أن الجزيئات اللزجة في القلب لا تتسرب بسرعة كافية من خلال قشرة الهيدروجيل. واجهنا هذا السيناريو عند ضبط لزوجة المحلول الأساسي باستخدام بوليمرات عالية الوزن الجزيئي مثل كربوكسي ميثيل السليلوز (MW 250 kD). يمكن للمرء أن يغلف الميكروبيدات (انظر الشكل 3B) لاختبار ما إذا كانت هذه الأجسام بحجم الخلية حرة في التحرك حول اللب ومدى سرعة ترشيح مكونات النواة. كما واجهنا نقص في التكوين الكروي عند استخدام تركيزات PEG-4-Mal >8٪ w/v. في هذا السيناريو ، يتم تقليل مسامية وانتشار قشرة الهيدروجيل ولا تتسرب العناصر عالية اللزوجة في القلب بسرعة كافية للسماح للخلايا بالتشكل في مجاميع. من المتصور أن جودة PEG-4-Mal قد تختلف من دفعة إلى أخرى أو الشركة المصنعة. لذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى بعض التعديل في تركيز البوليمر في القشرة. مرة أخرى ، يجب أن تكشف طريقة دمج الخرز عن مدى سرعة إزاحة المكونات اللزجة في القلب بواسطة جزيئات الماء. في تجربتنا ، يجب أن يحدث هذا في غضون 3 ساعات من نقل الكبسولات الدقيقة إلى البيئة المائية.
لقد عمل بروتوكول التغليف الموصوف هنا بشكل جيد للعديد من خطوط hPSC7 ، وخلايا الكبد الأولية10 ، وخطوط الخلايا السرطانية المتعددة (نتائج غير منشورة). ومع ذلك ، واجهنا صعوبات في تكوين الكرويات بعد تغليف الخلايا الكبدية المشتقة من الخلايا الجذعية (sc) والخلايا β sc. كشف استكشاف الأخطاء وإصلاحها باستخدام الميكروبيدات المغلفة أن المكونات اللزجة تم إخراجها بسرعة من القلب وأن الخلايا كانت حرة في التحرك وتشكيل اتصالات الخلايا الخلوية. وتضمن استكشاف الأخطاء وإصلاحها الإضافي معايرة تركيز ثنائي الثيول كروس لينكر DTT (الموجود في مرحلة الزيت) من 66 مللي متر إلى 10 مللي متر. حدث تكوين كروي لخلايا الكبد SC والخلايا β عند هذا التركيز المنخفض من DTT. لذلك، قد يرغب المستخدم في التفكير في تحسين تركيز الوصلة المتقاطعة ولكن فقط إذا لم تنجح خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الأخرى المذكورة أعلاه. نجد أن تركيز DTT أمر بالغ الأهمية للحفاظ على السلامة الميكانيكية للكبسولات الدقيقة مع 66 mM DTT مما يؤدي إلى كبسولات دقيقة قوية ميكانيكيا وغير سامة للغالبية العظمى من أنواع الخلايا المستخدمة حتى الآن.
تم وصف عدد من الاستراتيجيات لإنشاء هياكل الخلايا الجذعية 3D في الأدبيات. فوائد تشكيل بنى الخلايا الجذعية داخل كبسولات صغيرة ذات قشرة أساسية متعددة. بمجرد تغليفها ، يمكن التعامل مع الكرويات بسهولة باستخدام كبسولات هيدروجيل توفر الحماية ضد تلف القص. يمكن استزراع الكرويات المغلفة في تعليق مع إثارة قوية دون إتلاف الخلايا الجذعية.
هناك طرق متعددة لتوسيع قدرات الكبسولات الدقيقة. وقد وصف فريقنا سابقا استخدام الهلاميات المائية المحتوية على الهيبارين لتغليف خلايا الكبد والخلايا الجذعية 8,12 ، ويقوم حاليا بتطوير كبسولات دقيقة تحتوي على الهيبارين تحتوي على الهيبارين والتي تعمل كمستودعات للتخزين والإطلاق المحلي للإشارات الاستقرائية (GFs) إلى الخلايا الجذعية. قد تساعد هذه الكبسولات الدقيقة في تقليل استخدام GFs باهظة الثمن مع تحسين نتائج التمايز. يمكن تعزيز الكبسولات الدقيقة بشكل أكبر من خلال دمج بروتينات ECM في القلب وبالتالي تعديل البيئة الدقيقة للخلايا الجذعية. يمكن جعل الكبسولات الدقيقة ذات الغلاف الأساسي قابلة للتحلل لتسهيل استرداد الكرويات hPSC13,14. بشكل عام ، تمثل الكبسولات الدقيقة ذات الغلاف الأساسي تقنية منصة يمكن تعديلها وتعزيزها لتلبية احتياجات بروتوكول تمايز الخلايا الجذعية المحدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال المنح المقدمة من مركز Mayo Clinic للطب التجديدي ، ومؤسسة J. W. Kieckhefer ، ومؤسسة آل نهيان ، والطب التجديدي في مينيسوتا (RMM 101617 TR 004) ، والمعاهد الوطنية للصحة (DK107255).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
References
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
