Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Använda Phage Display för att utveckla Ubiquitin Variant Modulators för E3 Ligases

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62950
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, College of Biological Science, University of Guelph

Summary

Ubiquitination är ett kritiskt protein post-translationell modifiering, vars dysregulation har varit inblandad i många mänskliga sjukdomar. Detta protokoll beskriver hur display kan användas för att isolera nya ubiquitin varianter som kan binda och modulera aktiviteten hos E3 ligases som styr specificitet, effektivitet och mönster av allestädes närvarande.

Abstract

Ubiquitin är ett litet 8,6 kDa-protein som är en kärnkomponent i ubiquitin-proteasomsystemet. Följaktligen kan det binda till en mängd olika proteiner med hög specificitet men låg affinitet. Genom display, ubiquitin varianter (UbVs) kan konstrueras så att de uppvisar förbättrad affinitet över wildtype ubiquitin och upprätthålla bindande specificitet att mål proteiner. Phage display använder ett fagemidbibliotek, varigenom pII-pälsproteinet hos en filamentös M13-bakteriofag (vald eftersom den visas externt på fagytan) smälts samman med UbVs. Specifika rester av humant wildtype ubiquitin är mjuka och randomiserade (dvs. det finns en förspänning mot infödd vildtypssekvens) för att generera UbVs så att skadliga förändringar i proteinkonformation undviks samtidigt som den mångfald som krävs för att främja nya interaktioner med målproteinet. Under fagvisningsprocessen uttrycks och visas dessa UbVs på fagrockproteiner och panoreras mot ett protein av intresse. BubVs som uppvisar gynnsamma bindningsinteraktioner med målproteinet behålls, medan dåliga bindemedel tvättas bort och tas bort från bibliotekspoolen. De kvarhållna UbVs, som är fästa vid fagpartikeln som innehåller UbV: s motsvarande fagemid, eltas, förstärks och koncentreras så att de kan panoreras mot samma målprotein i en annan omgång fagdisplay. Vanligtvis utförs upp till fem rundor av fagdisplay, under vilken ett starkt urvalstryck införs mot UbVs som binder svagt och / eller promiskuöst så att de med högre affiniteter koncentreras och berikas. I slutändan isoleras UbVs som visar högre specificitet och/eller affinitet för målproteinet än deras vilda typ motsvarigheter och kan karakteriseras genom ytterligare experiment.

Introduction

Att förstå de molekylära detaljerna i protein-proteininteraktioner är avgörande för att avgränsa signaltransduktionsmekanismerna i biologiska processer, särskilt de som bidrar till kliniskt viktiga sjukdomar. Under de senaste åren har faagedisplay använts som en praktisk och tillgänglig metod för att isolera proteiner/peptider med mycket förbättrad bindning till önskat målprotein1,2,3,4, som i sin tur kan användas som intracellulära sonder av protein-proteininteraktioner.

Ubiquitination är en kaskad av enzymatiska aktiviteter (E1-aktiverande enzym → E2 konjugerande enzym → E3 ligaser) som kovalent konjugerar ubiquitin (Ub) till proteinsubstrat för att rikta dem mot nedbrytning eller för att medla cellsignaleringsförändringar. Dessutom katapulterar deubiquitinaser avlägsnandet av ubiquitin från proteiner. Därför finns det i celler tusentals Ub-beroende protein-proteininteraktioner, varav de allra flesta känner igen en gemensam yta med låg affinitet men hög specificitet för att tillåta svaga interaktioner genom stora och olika ytor.

Ernst et al. introducerade mutationer i kända bindande regioner i Ub för att se om de kunde förbättra bindande affinitet för ett protein av intresse samtidigt som hög selektivitet5 bibehålls. Ett kombinatoriskt bibliotek med över 10 miljarder (7,5 x 1010) Ub-varianter (UbVs) med mutationer på positioner över Ub-ytan som förmedlar de kända Ub-proteininteraktionerna utvecklades. Detta bibliotek bestod av fagemider som uttrycker M13 bakteriofag pII kappa protein smält till diversifierade UbVs. Därför kan enskilda UbVs visas på fagytan via pälsproteinet vid uttryck. Under urvalsprocessen kommer som visar UbVs med betydande bindande interaktioner med målproteinet att behållas och berikas i efterföljande rundor, medan som visar UbVs som binder dåligt till målproteinet tvättas bort och avlägsnas från fagpoolen. De balanserade fagpartiklarna innehåller fagemid som motsvarar deras visade UbV, så att de kan sekvenseras och ytterligare karakteriseras när de isolerats.

Med hjälp av denna proteinteknikstrategi utvecklades UbV-hämmare för mänskliga deubiquitinases5 och virala proteaser6. Viktigt är att vi har genererat hämmande UbVs för mänskliga HECT-familjen E3 ligases genom kapning av E2-bindande webbplats och aktivera UbVs som upptar en Ub-bindande exosite på HECT-domänen7. Vi kan också hämma monomeriska RING-familjen E3s genom att rikta in oss på E2-bindningsstället och inducera UbV dimerization för att aktivera homodimeric RING E3s8. För flerdelad RING E3s kan UbVs uppnå hämning genom att rikta in sig på RING-underenheten (t.ex. för APC/C-komplex9) eller störa komplex bildning (t.ex. för SCF E3s10). Tillsammans kan UbVs utnyttjas för att systematiskt förhöra protein-proteininteraktioner i Ub-proteasome-systemet (UPS) så att vi bättre kan dechiffrera biokemiska mekanismer av UPS-enzymer och för att identifiera och validera funktionella platser för terapeutisk intervention.

Följande protokoll beskriver hur man använder ett tidigare genererat som visats UbV-bibliotek för att rikta in sig på ett protein av intresse och hur man berikar de UbV-bindemedel som interagerar med målproteinet genom successiva rundor av fagdisplay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Reagensberedning

  1. PBS (fosfatbuffrad saltlösning): Blanda 50 ml 10x PBS-lösning med 450 ml ultrapur H2O. Sterilisera genom filtrering och förvara vid 4 °C eller rumstemperatur (~20-25 °C).
  2. 10% BSA (bovint serumalbumin): Tillsätt långsamt 1 g BSA till 7 ml ultrapure H2O och blanda tills det är helt upplöst (inga klumpar). Fyll på med ultrapure H2O tills den slutliga volymen är 10 ml. Sterilisera genom filtrering och förvara vid 4 °C.
  3. PB-buffert (PBS kompletterad med 1% BSA): Tillsätt långsamt 5 g BSA till 400 ml ultrapur H2O och 50 ml PBS och blanda tills de är helt upplösta (inga klumpar). Fyll på med ultrapure H2O tills den slutliga volymen är 500 ml. Sterilisera genom filtrering och förvara vid 4 °C.
  4. PBT-buffert (PBS kompletterad med 1% BSA och 0,05% Interpolering 20): Tillsätt långsamt 5 g BSA till 400 ml ultrapur H2O och 50 ml PBS och blanda tills de är helt upplösta (inga klumpar). Tillsätt 250 μL interpolering 20. Fyll på med ultrapure H2O tills den slutliga volymen är 500 ml. Sterilisera genom filtrering och förvara vid 4 °C.
  5. PT-buffert (PBS kompletterad med 0,05% Interpolering 20): Blanda 1 ml interpolering 20 med 400 ml PBS. Fyll på med ultrapure H2O tills den slutliga volymen är 2 L. Sterilisera genom filtrering och förvara vid 4 °C eller rumstemperatur (~20-25 °C).
  6. 2YT buljong: Tillsätt 16 g trypton, 10 g jästextrakt och 5 g NaCl till 800 ml ultrapur H2O och blanda tills den är helt upplöst (inga klumpar). Fyll på med ultrapure H2O tills den slutliga volymen är 1 L. Sterilisera genom autoklavering och förvara vid rumstemperatur (~20-25 °C).
  7. LB/kolhydratplattor: Tillsätt 12,5 g färdig LB-blandning och 7,5 g agar till 400 ml H2O. Fyll på med ultrapure H2O tills den slutliga volymen är 500 ml och steriliseras genom autoklaving. Se till att agaren är helt upplöst och vänta tills den svalnar till under 60 °C. Tillsätt 500 μL 100 mg ml karbinillin, blanda väl och häll i plattan. Förvara vid 4 °C.
  8. LB/tet-plattor: Tillsätt 12,5 g färdig LB-blandning och 7,5 g agar till 400 ml ultrapur H2O. Fyll på med ultrapur H2O tills den slutliga volymen är 500 ml och steriliseras genom autoklaving. Se till att agaren är helt upplöst och vänta tills den svalnar till under 60 °C. Tillsätt 500 μL 10 mg ml tetracyklin, blanda väl och häll i plattan. Förvara vid 4 °C.
  9. 20% PEG (polyetylenglykol)/2,5 M NaCl: Tillsätt 50 g PEG-8000 och 36,5 g NaCl till 200 ml ultrapur H2O. Blanda tills den är helt upplöst.
    OBS: Detta kan ta ett tag; uppvärmning kan hjälpa. Fyll på med ultrapure H2O tills den slutliga volymen är 250 ml. Sterilisera genom filtrering eller autoklavering.
  10. 0,1 M HCl: Blanda 20 ml 1 M HCl med 180 ml ultrapure H2O. Sterilisera genom filtrering och förvara vid rumstemperatur (~20-25 °C).
  11. 1 M Tris (pH 11.0): Tillsätt 6,1 g Tris-basen till 40 ml ultrapure H2O. Justera pH till 11,0 med HCl och blanda tills Tris är helt upplöst. Fyll på med ultrapure H2O tills den slutliga volymen är 50 ml. Sterilisera genom filtrering och förvara vid rumstemperatur (~20-25 °C).
  12. 100 mg/ml (1000x) karbinillin: Tillsätt 2 g karbenicillindisodiumsalt till 20 ml ultrapure H2O. Blanda tills det är helt upplöst. Sterilisera genom filtrering och förvara vid -20 °C.
  13. 50 mg/ml (1000x) kanamycin: Tillsätt 1 g kanamycinsulfat till 20 ml ultrapur H2O. Blanda tills den är helt upplöst. Sterilisera genom filtrering och förvara vid -20 °C.
  14. 10 mg/ml (1000x) tetracyklin: Tillsätt 0,2 g tetracyklinhydroklorid till 20 ml 70 % etanol. Blanda tills den är helt upplöst. Sterilisera genom filtrering och förvara vid -20 °C.

2. Proteinberedning

  1. Bestäm koncentrationen av målproteinlagret i μM. Det mest praktiska sättet att bedöma proteinkoncentrationen är att mäta absorbansen av proteinlagret vid 280 nm. Om koncentrationen är känd i mg/ml, omvandla den till μM med hjälp av målproteinets molekylvikt. En rad metoder kan användas beroende på proteinet av intresse; Mer information finns i avsnittet Diskussion.
    OBS: Om proteinet trunkeras (specifikt proteindomän/motiv) eller taggas, kom ihåg att ta hänsyn till dessa förändringar i molekylvikt vid konvertering från mg/ml till μM.
  2. Förbered tre mikrocentrifugerör märkta "runda 1", "runda 2/3" och "runda 4/5".
    1. Beräkna den mängd protein som behövs för att späda ut det till 1 μM i 800 μL PBS och alikvotera denna volym i rören utan att tillsätta PBS.
      OBS: Om mängden tillgängligt målprotein är låg kan koncentrationen sänkas till så lite som 0,25 μM.

3. Förberedelse för valomgång ett

  1. Förbered en frökultur för odling av faginmatningen för valomgång två.
    1. Inokulera 5 ml 2YT/tet med en välisolerad Escherichia coli-koloni och inkubera över natten vid 37 °C med 200 varv/min omloppsskakning.
  2. Täck plattan för den första urvalsomgången.
    1. Späd ut målproteinet i "runda 1"-röret med lämplig mängd PBS och alikvot 100 μL i åtta brunnar på en 96-välbindningsplatta (dvs. målplattan).
      OBS: Fagdisplay kan göras för fyra olika proteiner samtidigt på en enda tallrik genom att täcka brunnarna i plattans hörn.
    2. Valfri kontroll: Om målproteinet är märkt, t.ex. med GST eller MBP (maltosebindningsprotein), belägga åtta brunnar i en annan 96-brunnsbindningsplatta med 100 μL av en 1 μM-lösning som innehåller lämplig epitopetikett. Detta kommer att användas för att ta bort oönskad som binder till taggen icke-specifikt.
    3. Skaka plattor över natten vid 4 °C med 200 varv/min omloppsskakning.

4. Omgång ett av urvalet

  1. Förbered den andra ronden.
    1. Inokulera 30 ml 2YT/tet med 200 μL frökulturen från steg 3.1.
    2. Inkubera vid 37 °C med 200 varv/min omloppsskakning tills bakterierna befinner sig i mitten av stockfasen (OD600Equation 1 0,6 - 0,8). Detta tar ungefär tre timmar.
  2. Blockera målskylten.
    1. Ta bort beläggningslösningen från plattan, eller båda plattorna om en kontrollplatta har gjorts, genom att vända och skaka över ett handfat. Klappa torrt på pappershanddukar.
    2. Tillsätt 300 μL PB-buffert till varje belagd brunn.
    3. Ta bort PB-bufferten enligt steg 4.2.1 och tillsätt ytterligare 200 μL PB-buffert.
    4. Inkubera vid rumstemperatur (~20-25 °C) i 1 h med 300 varv/min omloppsskakning.
  3. Förbered fagbiblioteket.
    1. Tina fagbiblioteket på is och späda ut det till 100x bibliotekets mångfald i PBS. Om bibliotekets mångfald till exempel är 1 x 1010 och bibliotekskoncentrationen är 1 x 1013, späd ut biblioteket så att koncentrationen är 1 x 1012. För biblioteken som används här, späd dem 10-faldigt i PBS genom att kombinera 1 ml av biblioteket med 9 ml PBS.
      OBS: Bibliotekets mångfald borde ha fastställts under biblioteksskapandet och kan inte lätt bedömas på annat sätt. Bibliotekskoncentrationen kan bestämmas genom inokuring av E. coli-celler i mitten av stockfasen (OD600Equation 1 0,6 - 0,8) och plätering på LB/carb.
    2. Lägg till 1/5 volym PEG/NaCl. Till exempel, för 10 ml av det tidigare utspädda biblioteket, lägg till 2 ml PEG/NaCl.
    3. Inkubera på is i 30 min.
    4. Centrifugera vid 11 000 x g i 30 min vid 4 °C, kassera supernatant och recentrifuge i 2 minuter för att dra ner den återstående supernatanten.
      OBS: Sätt röret i rotorn i samma riktning andra gången som det var den första som höll pelleten på samma plats, vilket gör det lättare att se.
    5. Återanvänd försiktigt fagpellets i 1 ml PBT per protein. För fyra proteiner återanvänder du pelleten i 4 ml PBT.
      OBS: Försök att inte röra pelleten och introducera inte luftbubblor.
  4. Visa till målproteinerna.
    1. Valfri kontroll: Tillsätt 100 μL fagbibliotek till varje belagd brunn i kontrollplattan. Inkubera vid rumstemperatur (~20-25 °C) i 1 h med 300 varv/min omloppsskakning och överför biblioteket från styrplattan till målplattan. Hoppa över steg 4.4.2.
    2. Ta bort PB-bufferten från målplattan enligt steg 4.2.1 och tillsätt 100 μL av fagbiblioteket till varje belagd brunn.
    3. Inkubera vid rumstemperatur (~20-25 °C) i 1 h med 300 varv/min omloppsskakning.
  5. Elute runda ett.
    1. Ta bort fagbiblioteket och tvätta de belagda brunnarna fyra gånger med PT-buffert. Vänd plattan och knacka på en pappershandduk för att ta bort de sista dropparna.
      OBS: Om flera målproteiner är belagda på en tallrik, försök att minimera flödet av alla efterföljande lösningar mellan brunnarna.
    2. Tillsätt 100 μL 0,1 M HCl till varje belagd brunn och inkubera vid rumstemperatur i 5 min med 300 varv/min omloppsskakning.
    3. Neutralisera pH genom att tillsätta 12,5 μL 1 M Tris-HCl (pH 11) till varje belagd brunn.
    4. Poola den eluted från alla 8 brunnar i ett enda 1,5 mL microcentrifuge rör. Pipettera upp och ner under överföringen för att göra lösningar homogena och aspirera all vätska från brunnarna.
    5. Tillsätt 10% BSA till den poolade eluted phage till en slutlig koncentration på 1%. För en typisk rund elutionsvolym på 950 μL, tillsätt 95 μL 10% BSA. Förvara vid 4 °C. Det här är den runda utgången.

5. Förberedelser inför efterföljande urvalsomgångar

  1. Förbered en frökultur för odling av faginmatningen för nästa urvalsomgång som i steg 3.1.
  2. Belägga plattan för den tredje urvalsomgången enligt steg 3.2 med de ändringar som anges nedan.
    1. Täck endast fyra brunnar per protein i en 96-väl bindningsplatta. Använd hälften av innehållet i rören "runda 2/3" eller "runda 4/5" för lämplig runda. Späd innehållet i dessa rör efter behov för att undvika att proteiner sätter sig ur lösningen.
  3. Förbered faginmatningen för nästa valomgång.
    1. Använd hälften av den runda en utgången från steg 4.5.5 för att inokulera 3 ml celler i mitten av loggfasen från steg 4.1. För en typisk rund en uteffekt, inokulera med 500 μL av utgången.
    2. Inkubera vid 37 °C i 30 min med 200 varv/min omloppsskakning.
    3. Tillsätt M13K07 hjälp phage till en slutlig koncentration av 1 x 1010 PFU/mL.
    4. Inkubera vid 37 °C i 1 h med 200 varv/min omloppsskakning.
    5. Överför hela 3 ml kultur till 30 ml 2YT/carb/kan. Växa över natten vid 37 °C med 200 rpm orbital skakningar.
    6. Nästa dag överför du kulturen till ett 50 ml centrifugrör och centrifug vid 11 000 x g i 10 min vid 4 °C för att fälla ut celler.
    7. Dekantera supernatanten i ett nytt 50 ml centrifugrör och blanda med 8 ml PEG/NaCl och inkubera på is i 10 minuter.
    8. Centrifugera vid 11 000 x g i 10 min vid 4 °C, kassera supernatanten och centrifugera igen i 2 min.
      OBS: Sätt röret i rotorn i samma riktning andra gången som det var den första som höll pelleten på samma plats, vilket gör det lättare att se.
    9. Återanvänd fagpelleten i 800 μL PBT så att den är helt homogen och inga klumpar är synliga.
    10. Överför faglösningen till ett 1,5 mL mikrocentrifugerör och centrifug vid 16 200 x g i 4 min vid 4 °C till pelletsskräp.
    11. Överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugerör. Detta är indata för nästa valomgång.
  4. Valfritt: Titer in- och utgångslösningarna.
    1. Använd 500 μL av en E. coli-frökultur för att inokulera 5 ml 2YT/tet och inkubera vid 37 °C med 200 varv/min omloppsskakning tills bakterierna befinner sig i mitten av stockfasen (OD600Equation 1 0,6 - 0,8). Detta tar ungefär 1 timme.
    2. Späd ut faginmatnings-/utgångslösningar till 10-3 - 10-5 i PBS och tillsätt 10 μL av varje utspädning till 90 μL odlade celler.
      OBS: Använd utspädda faglösningar omedelbart eftersom adsorberar till röret över tid, och omvandlingar kan ge falska negativ.
    3. Inkubera vid 37 °C i 20 min med 200 varv/min omloppsskakning.
    4. Platta 5 μL på separata LB/kolhydratplattor.
      OBS: Mängden pläterad är variabel beror på tidigare resultat / personliga preferenser.

6. Efterföljande urvalsomgångar

  1. Utför alla efterföljande rundor tillsammans med förberedelsen som görs i steg 3 respektive 4, med skillnader noterade nedan.
    1. Använd den indata som producerades i föregående omgång som fagkälla i stället för ett bibliotek. Täck 4 brunnar per målprotein med 100 μL av den faginsats som förvärvats från föregående runda. Förvara återstående fagingångar vid 4 °C.
    2. Gör tvättsteget i 4.5.1 strängare för varje valomgång. Rond ett kräver tvätt 4 gånger, rond två kräver 6 gånger, runda tre kräver 8 gånger och rond fyra och fem kräver båda tvätt 10 gånger.
    3. Minska vissa volymer jämfört med de som används i rond ett eftersom efterföljande rundor bara täcker fyra brunnar istället för åtta. Till exempel, i steg 4,5,5 tillsätts endast 45 μL av 10% BSA till fagutgången, och i steg 5.3.1 används endast 250 μL av fagutgången för att inokulera celler.

7. Eftervalsbehandling och fagisolering

  1. Titer in- och utgångslösningarna för rond fyra och fem.
    1. Om det inte redan görs i steg 5.4, följ samma steg för att titer rundor fyra och fem fagutgångar, helst producerar en rad 30-300 kolonier över några plattor.
  2. Kultur och isolera fager.
    1. Aliquot 450 μL 2YT/carb/M13K07 i varje rör i en 96 minirörskulturlåda.
    2. Välj välisolerade kolonier från någon av plattorna från steg 7.1 för att vaccinera varje rör.
      OBS: Använd den övre halvan av lådan för runda fyra utgångar och den nedre halvan för runda fem utgångar.
    3. Inkubera över natten vid 37 °C med 200 varv/min omloppsskakning.
    4. Centrifug vid 1 200 x g i 10 min vid 4 °C.
    5. Överför så mycket supernatant som möjligt till en ny 96 mini tub kulturlåda utan att störa cellpelleten och kassera den gamla. Förvara vid 4 °C.
    6. Från den nya lådan överför du 100 μL från varje rör till en 96 väl icke-bindande platta som innehåller 100 μL 50% glycerol i alla brunnar. Blanda väl och förvara vid -80 °C som reservlager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bindemedel som produceras från fagdisplay kan verifieras och analyseras på många sätt. Det rekommenderas att först fortsätta med sekvensering av med primers som flankerar den diversifierade insatsen i fagemidbiblioteket. Ett idealiskt fagdisplayexperiment visar en tydlig förspänning mot flera sekvenser (bild 1). Andra sekvenser kommer också att finnas men med ett lägre antal, som visas mer som bakgrundsljud. I exemplet som tillhandahålls, där fagvisning utfördes mellan ubiquitin-varianter (UbVs) och wildtype UBE4B, finns det en särskild förspänning mot sekvenser #1-4. Ett exempel python-skript för att organisera och analysera sekvenseringsfiler har tillhandahållits ("phageDisplaySeqAnalysis.py"). För att bekräfta bindemedels betydelse kan enzymkopplade immunsorbentanalyser (ELISA) användas som ett snabbt mått på relativ bindningstillhörighet till wildtype-målproteinet, muterat målprotein, samt proteiner utanför målet (figur 1). Skillnader i bindningstillhörighet mellan de nya bindemedel och det bindprotein av typen wildtype, som de nya bindendemedlen baserades på, kan bestämmas genom att bindemedelens ELISA-absorbans normaliseras till det hos det wildtypprotein (visas inte) eller andra proteiner som inte visar någon märkbar bindning med målproteinet (figur 1). Det här exemplet visar tendensen hos de berikade sekvenserna att ha högre bindningstillhörighet för målproteinet. Ett exempel på Python-skript för att organisera och analysera sekvenseringsfiler har tillhandahållits ("phageDisplayElisaAnalysis.py"). Dessutom har ett exempel python-skript specifikt för att analysera UbV-resultat tillhandahållits ("phageDisplayUbvAnalysis.py"). Helst kommer bindemedelssekvenser som är fler talrika att ha högre relativ bindningstillhörighet än mindre många sekvenser, som förmodligen är bakgrundsljud. Det är möjligt att instabila bindemedel kommer att vara låga i antal men uppvisa märkbar bindning genom ELISAs. Dessa bindemedel bör undersökas ytterligare för att avgöra om ELISA-poängen är artefakter eller om de verkligen är pärmar som är värda ytterligare karakterisering.

Figure 1
Figur 1: Representativa resultat för ett urval av ubv-variant (UbV) mot UBE4B. (A) UbVs beställdes från högsta till lägsta frekvens (antal). Sekvenser representerar den diversifierade ubiquitinregionen i UbV med alla randomiserade rester (specifikt rester 2, 4, 6, 8-12, 14, 42, 44, 46-49, 62-64, 66, 68 och 70-78). Alla ELISA absorbanser normaliserades mot 96 genomsnittliga BSA ELISA-poäng och 96 genomsnittliga GST ELISA-poäng. Mörkare grön representerar starkare relativ bindning. GST inkluderades som en kontroll för icke-specifik bindning på grund av att målproteinet är GST-märkt. (B) Grafisk sammanfattning av ELISA-resultaten från panel A. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Föreslagen ordning på stegen för att utföra fagvisning. Streckade linjer anger processer som överförs till nästa dag eller från föregående dag. Alla efterföljande omgångar efter omgång tre fortsätter på samma sätt som omgång tre, med undantag för omgång fem där ingen beredning av faginmatning är nödvändig om inte fler rundor utförs. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3. Föreslagna labware och etiketter för att konfigurera ett fagvisnings experiment. Syfte och relevanta steg i protokollet anges. R: rund; I: inmatning; O: utmatning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4. Utseende av typiska pellets som påträffas under display förfarandet. Fagbibliotekets pellet presenterar som en strimma längs sidan av röret och kan nyligen bogseras för att koncentrera pelleten i botten av röret. Faginmatning pellets och skräp pellets verkar mer typiska. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Python-skript. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som nämns i steg 2.1 (proteinpreparat) kan en mängd olika metoder användas för att bedöma proteinkoncentrationen, och var och en kommer att ha unika fördelar och nackdelar baserat på det specifika målprotein som används för fagdisplay. En källa till detaljerade beskrivningar och protokoll för populära metoder har tidigare tillhandahållits11.

Att använda fagen som behålls av en tidigare omgång fagdisplay som inmatning för en efterföljande runda berikar de goda bindemedel genom att gradvis ta bort bindemedel som binds svagt, tillfälligt eller av en slump. Vid rond fyra och fem kommer det helst att finnas en tydlig bias mot en liten och specifik uppsättning peptidsekvenser, vilket visar bindande preferenser för målproteinet.

Detta protokoll har optimerats för användning med ett UbV-bibliotek. Även om dessa steg i allmänhet kan gälla för andra typer av bibliotek (t.ex. peptid, antikroppar etc.), kommer de sannolikt att behöva anpassas för att rymma sådana icke-UbV-bibliotek. Som nämns i steg 4.3.1 bör bibliotekets mångfald och koncentration vara känd innan man fortsätter med fagdisplayen. Mer information om hur dessa biblioteksattribut bestäms finns i protokollet som används för att skapa de UbV-bibliotek som används i den här proceduren12.

Fagens displayresultat kan vara mycket tydliga och presentera uppenbara kandidatpärmar för att fortsätta karakteriseringen. Till exempel är bindemedel som både är mycket frekventa och har betydligt högre bindning, mätt med ELISA, tydliga kandidater för vidare studier. Men när frekvensen av ett visst bindemedel inte korrelerar positivt med ELISA-data, kan detta innebära viss förvirring om hur man pekar ut intressanta bindemedel. I exemplet (bild 1) rekommenderas att välja en kombination av de vanligaste bindemedel, även om de har en låg bindningstillhörighet, och de med högre bindningstillhörighet, även om de verkar ovanliga. Sällsynta bindemedel med höga ELISA-poäng kanske inte är lika vanliga på grund av instabilitet under fagvisning, vilket skulle påverka deras prevalens negativt i dessa slutliga data. Som sådan är dessa värda att undersöka så mycket som de mycket frekventa bindemedel är.

Isolerade faglösningar kan enkelt kontamineras. Det rekommenderas att fortsätta med DNA-sekvensering så snart som möjligt med hjälp av primers som flankerar regionen av den diversifierade peptiden. En annan typisk analys efter displayen är att utföra ELISAs av bindemedel med deras målprotein. Dessutom kan ELISAs utföras med bindemedel och muterade/trunkerade versioner av deras målproteiner, vilket kan ge en grov uppfattning om deras troliga bindningsläge. Det är mycket viktigt att notera att faglösningar bör blandas väl före användning i något experiment om de har suttit ett tag. kan adsorbera till rörets väggar eller sätta sig ur lösningen och kan producera falska negativ.

Det mest tidseffektiva sättet att utföra denna procedur illustreras i figur 2. Börja varje runda med att förbereda bakteriekulturen som är nödvändig för att odla fagingången för den efterföljande rundan nästa dag. Medan denna kultur växer kan belagda plattor blockeras. Medan plattorna blockeras kan biblioteket förberedas (för omgång ett) eller fagingången kan förberedas (för efterföljande rundor). På dagen för omgång fyra finns det inget behov av att förbereda en frökultur och därför finns det på dagen för omgång fem inget behov av att göra några förberedelser för nästa rundas faginsats om man inte har för avsikt att göra mer än fem urvalsomgångar. För att ytterligare spara tid har en föreslagen labware-installation också tillhandahållits (bild 3). Dessutom är fagpellets inte alltid distinkta, så bilder av typiska pelletutseenden som påträffats under denna procedur har tillhandahållits (figur 4).

Om det finns några problem med pelletering av under beredningen av inmatningen för en efterföljande runda, kan experimentet behöva stoppas i en dag medan ny odlas. Dessa kan återvinnas genom att gå tillbaka till fagen som sparats i rören för ingången för den rundan. Om till exempel den som krävs för den tredje visningsomgången inte kan pelleteras av någon anledning, kan du återgå till R3I-röret som innehåller 400 μL faginmatning för omgång tre. Detta kan endast upprepas en gång om du belägger fyra brunnar med 100 μL.

Titer av utgående för omgångarna fyra till fem ligger vanligtvis i intervallet 106 till 108 PFU/ml. Om titering inte är av intresse, helt enkelt att ha tillräckligt med kolonier närvarande för att fylla en 96 rör mini kulturlåda bör vara tillräckligt för att ge en korrekt representation av mångfald och titer spelar ingen roll. Men om titer av utgångsfagn är låg och fler kolonier önskas, kan förstärkas genom att upprepa steg 5,3. I huvudsak kan fagen förstärkas genom att ta utdata för önskad urvalsrunda, inokulera medelstocksfasceller, lägga till hjälpfagendom och karbaktorillin, odla kulturen över natten och skörda via PEG-nederbörd som tidigare beskrivits.

Andra visningsmetoder finns, och var och en har sina egna fördelar och nackdelar i förhållande till fagdisplay. In vivo-visningsmetoder, såsom cell-ytdisplay, kan öka sannolikheten för korrekt proteinvikning och även möjliggöra ändringar efter translation. Dessa metoder begränsas dock genom att behöva använda betydligt mindre biblioteksstorlekar13 och uttrycka proteiner polyvalent. Polyvalent uttryck introducerar ivriga effekter som stör och maskerar peptidens inneboende affinitet, vilket är av större intresse när man genererar nya bindemedel. Phage display kringgår det här problemet eftersom det har anpassats för monovalent visning, vilket underlättar valet av bindemedel med verkligt förbättrade affiniteter14,15,16. Andra in vitro-visningsmetoder hindras inte heller av begränsningarna i in vivo-visningsmetoder utan presenterar sina egna unika utmaningar. Till exempel kan ribosomdisplay användas för att undersöka större bibliotek (1013-14)17, men urvalets utdata är i form av mRNA-molekyler som i sig är mindre stabila än den fagerinkapslade DNA-effekten av fagdisplay18. Andra in vitro-displaymetoder, såsom mRNA/cDNA-display, cis aktivitetsbaserad display (CIS) och kovalent antikroppsdisplay (CAD) har visat problem med effektivitet, stabilitet och inkonsekvens19,20,21,22,23.

Själva phagedisplayen begränsas av biblioteksstorlekar som begränsas av effektiviteten i bakterieomvandlingen och genom att inte tillåta bibliotek med sekvenser som stör fag/bakterietillväxt16, men i allmänhet är dessa begränsningar försumbara, och fagdisplayen har lyckats producera mycket specifika och potenta bindemedel av målproteiner2,5,10,24, 25. Detta kan inte bara användas i medicinsk forskning för att utveckla nya terapier utan också för att klargöra protein- och enzymegenskaper och lära sig mer om proteininteraktioner involverade i viktiga biologiska vägar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Ubiquitin variantteknologin utformades i laboratoriet av Dr. Sachdev Sidhu (University of Toronto). WZ är för närvarande cifar azrieli global forskare i människor & Mikrobiomet programmet. Denna forskning finansierades av NSERC Discovery Grants som tilldelats WZ (RGPIN-2019-05721).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) Fisher Scientific 14-222-198 Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific DF0446-17-3 Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V BioShop Canada ALB001 Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous Millipore-Sigma C1389-5G Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker Fisher Scientific 11-676-337 Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape Fisher Scientific 07-200-684 Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-01-0 Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer DeNovix DS-11 FX+ Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate Fisher Scientific 7000133 Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500 Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C854003 Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific AAJ1792406 Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage New England Biolabs  N0315S Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker Fisher Scientific 11-676-076 Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom Life Technologies 44-2404-21 Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution Fisher Scientific BP3994 Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation VWR 60941-120 Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG) Fisher Scientific BP233-1 Phage precipitation.
Sodium chloride Millipore-Sigma S3014 Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100 Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base Fisher Scientific BP1525 Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder Fisher Scientific BP1421-2 Cell growth media component.
Tween 20 Fisher Scientific BP337500 Buffer component.
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2 Cell growth media component.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).
  2. Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
  3. Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
  4. Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
  5. Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
  6. Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).
  7. Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
  8. Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
  9. Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
  10. Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
  11. Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
  12. Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
  13. Sheehan, J., Marasco, W. A. Phage and yeast display. Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).
  14. Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
  15. Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).
  16. Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
  17. Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
  18. Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
  19. Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
  20. Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
  21. Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
  22. Reiersen, H., et al. Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
  23. Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
  24. Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
  25. Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).

Tags

Biokemi nummer 174
Använda Phage Display för att utveckla Ubiquitin Variant Modulators för E3 Ligases
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roscow, O., Zhang, W. Using Phage… More

Roscow, O., Zhang, W. Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases. J. Vis. Exp. (174), e62950, doi:10.3791/62950 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter