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Bioengineering

Améliorer la reproductibilité pour répondre aux informations minimales pour les études sur les vésicules extracellulaires 2018 Lignes directrices dans l’analyse de suivi des nanoparticules

Published: November 17, 2021 doi: 10.3791/63059
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Anatomy and Physiology, Kansas State University College of Veterinary Medicine, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center

Summary

L’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) est une méthode largement utilisée pour caractériser les vésicules extracellulaires. Cet article met en évidence les paramètres expérimentaux et les contrôles de la NTA ainsi qu’une méthode uniforme d’analyse et de caractérisation des échantillons et des diluants nécessaires pour compléter les lignes directrices proposées par MISEV2018 et EV-TRACK pour la reproductibilité entre les laboratoires.

Abstract

L’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) est l’une des nombreuses méthodes de caractérisation utilisées pour la recherche sur les vésicules extracellulaires (EV) depuis 2006. Beaucoup considèrent que les instruments NTA et leurs progiciels peuvent être facilement utilisés après une formation minimale et que l’étalonnage de la taille est réalisable en interne. Comme l’acquisition de NTA et l’analyse logicielle constituent toutes deux une caractérisation des VE, elles sont abordées dans Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). En outre, ils ont été surveillés par Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) afin d’améliorer la robustesse des expériences sur les VE (par exemple, minimiser les variations expérimentales dues à des facteurs incontrôlés).

Malgré les efforts déployés pour encourager la déclaration des méthodes et des contrôles, de nombreux documents de recherche publiés ne rendent pas compte des paramètres critiques nécessaires pour reproduire les observations originales de la NTA. Peu d’articles rapportent la caractérisation par la NTA de témoins négatifs ou de diluants, en supposant évidemment que les produits disponibles dans le commerce, tels que la solution saline tamponnée au phosphate ou l’eau distillée ultrapure, sont exempts de particules. De même, les témoins positifs ou les normes de taille sont rarement rapportés par les chercheurs pour vérifier le dimensionnement des particules. L’équation de Stokes-Einstein incorpore des variables de viscosité et de température de l’échantillon pour déterminer le déplacement des particules. Le signalement de la température stable de la chambre laser pendant toute la collecte vidéo de l’échantillon est donc une mesure de contrôle essentielle pour une réplication précise. La filtration des échantillons ou des diluants n’est pas non plus systématiquement rapportée et, dans l’affirmative, les spécificités du filtre (fabricant, matériau de la membrane, taille des pores) et les conditions de stockage sont rarement incluses. Les normes minimales de détails expérimentaux acceptables de l’International Society for Extracellular Vesicle (ISEV) devraient inclure un protocole NTA bien documenté pour la caractérisation des VE. L’expérience suivante fournit des preuves qu’un protocole d’analyse NTA doit être établi par le chercheur individuel et inclus dans les méthodes de publications qui utilisent la caractérisation NTA comme l’une des options pour répondre aux exigences MISEV2018 pour la caractérisation de vésicules uniques.

Introduction

L’analyse précise et reproductible des véhicules électriques et d’autres particules à l’échelle nanométrique présente de nombreux défis dans la recherche et l’industrie. La réplication de la recherche sur les véhicules électriques a été difficile, en partie, en raison du manque d’uniformité dans la déclaration des paramètres nécessaires associés à la collecte de données. Pour remédier à ces lacunes, l’ISEV a proposé des lignes directrices de l’industrie en tant qu’ensemble minimal de normes biochimiques, biophysiques et fonctionnelles pour les chercheurs en VE et les a publiées sous forme d’énoncé de position, communément appelé MISEV20141. L’accélération du rythme de la recherche sur les véhicules électriques nécessitait une mise à jour des lignes directrices, et le « MISEV2018 : un énoncé de position de l’ISEV » a élargi les lignes directrices MISEV20142. Le document MISEV2018 comprenait des tableaux, des aperçus de protocoles suggérés et des étapes à suivre pour documenter la caractérisation spécifique associée aux VE. En tant que mesure supplémentaire pour faciliter l’interprétation et la réplication des expériences, EV-TRACK a été développé en tant que base de connaissances sur le crowdsourcing (http://evtrack.org) pour permettre des rapports plus transparents sur la biologie des VE et la méthodologie utilisée pour les résultatspubliés 3. Malgré ces recommandations pour la déclaration normalisée des méthodes, le domaine continue de souffrir de la réplication et de la confirmation des résultats publiés.

S’inscrivant dans les efforts des National Institutes of Health et de la National Science Foundation pour les outils d’évaluation de la qualité, cet article suggère que l’ISEV exige des rapports normalisés sur les méthodes et les détails afin que les outils d’évaluation des données puissent être appliqués dans le but de reproduire les résultats entre les laboratoires. La déclaration des sources cellulaires, les procédures de culture cellulaire et les méthodes d’isolement des VE sont des facteurs importants pour définir les qualités de la population de VE. Parmi les instruments de la NTA, des facteurs tels que les paramètres de détection, l’indice de réfraction du fluide porteur, les populations de particules hétérogènes contribuant à la polydispersité, l’absence d’exigences de déclaration normalisées et l’absence de résultats de mesure intra- et inter-observateurs rendent la comparaison de la NTA entre les laboratoires difficile, voire impossible.

Utilisée depuis 2006, la NTA est une méthode populaire pour la détermination de la taille et de la concentration des nanoparticules qui est actuellement utilisée par environ 80 % des chercheurs sur les VE4. Les lignes directrices MISEV2018 exigent deux formes d’analyse d’une seule vésicule, dont la NTA est l’une des options populaires. La NTA continue d’être couramment utilisée pour la caractérisation des véhicules électriques en raison de sa grande accessibilité, de son faible coût par échantillon et de sa théorie fondatrice simple (l’équation de Stokes-Einstein). L’évaluation ev par NTA génère une estimation de la distribution granulométrique et de la concentration à l’aide de la diffusion de la lumière laser et de l’analyse du mouvement brownien, la limite inférieure de détection étant déterminée par l’indice de réfraction de l’EV. Lors de l’utilisation d’un échantillon de fluide de viscosité et de température connues, les trajectoires des VE sont suivies pour déterminer leur déplacement moyen-carré en deux dimensions. Cela permet de calculer le coefficient de diffusion des particules et de le convertir en un diamètre hydrodynamique équivalent à une sphère par une équation de Stokes-Einstein modifiée 5,6,7. L’analyse particule à particule de NTA a moins d’interférences par des agglomérats ou des particules plus grosses dans une population hétérogène de VE que d’autres méthodes de caractérisation7. Alors que quelques particules plus grosses ont un impact minimal sur la précision du dimensionnement, la présence de quantités même infimes de grosses particules à diffusion de lumière élevée entraîne une réduction notable de la détection de particules plus petites en raison de la réduction de la détection et du suivi des VÉHICULES électriques par logiciel8. En tant que technique de mesure, la NTA est généralement considérée comme n’étant pas biaisée en faveur de particules plus grosses ou d’agrégats de particules, mais peut résoudre des populations de plusieurs tailles grâce à une analyse individuelle des particules9. En raison de l’utilisation de la diffusion de la lumière par les particules, l’une des limites de l’analyse NTA est que toute particule telle que la poussière, le plastique ou la poudre ayant des attributs de réfraction et de taille similaires à ceux des véhicules électriques ne peut pas être différenciée des véhicules électriques réels par cette méthode de caractérisation.

Le NanoSight LM10 (analyseur de taille de nanoparticules) et le LM14 (module laser) sont vendus depuis 2006, et bien que de nouveaux modèles de cet instrument aient été développés, ce modèle particulier se trouve dans de nombreuses installations de base et est considéré comme un cheval de bataille fiable. Une formation est nécessaire pour optimiser correctement les paramètres NTA pour les mesures à haute résolution de la taille et de la concentration. Les deux paramètres importants nécessaires pour des enregistrements vidéo optimaux sont (1) le niveau de la caméra et (2) le seuil de détection. Ceux-ci doivent être définis par l’opérateur en fonction des caractéristiques de l’échantillon. L’une des principales contraintes de l’analyse NTA est la recommandation de concentrations d’échantillon comprises entre 107 et 109 particules/mL, pour atteindre cette dilution d’échantillon peut être nécessaire10. Les solutions utilisées pour la dilution, telles que la solution saline tamponnée au phosphate, la solution saline 0,15 M ou l’eau ultrapure, sont rarement exemptes de particules de moins de 220 μm, ce qui peut affecter les mesures de la NTA. La caractérisation NTA des solutions utilisées pour la dilution doit être effectuée au même niveau de caméra et au même seuil de détection que les échantillons de nanoparticules analysés. La taille et la concentration des nanoparticules présentes dans les diluants utilisés pour les dilutions d’échantillons de VE sont rarement incluses dans les publications impliquant l’analyse NTA des VE.

Ce protocole utilise l’analyse NTA de liposomes synthétiques de type EV évalués à l’aide de niveaux de caméra sélectionnés, de seuils de détection et de filtrage mécanique des échantillons pour analyser les effets systématiques du niveau de la caméra, du seuil de détection ou de la filtration des échantillons sur l’ensemble de données NTA. Les liposomes ont été synthétisés comme décrit dans le fichier supplémentaire S1. Les liposomes synthétiques ont été utilisés dans cette expérience en raison de leur uniformité de taille, de leurs caractéristiques physiques et de leur stabilité dans le stockage à 4 ° C. Bien que des échantillons réels de ves aient pu être utilisés, l’hétérogénicité et la stabilité des VE pendant le stockage peuvent avoir compliqué cette étude et son interprétation. Les similitudes dans les rapports NTA des liposomes (A) et des VE (B) indiquent que les effets systématiques révélés pour les liposomes dans cet article s’appliqueront probablement aussi à la caractérisation des VE (Figure 1). Ensemble, ces résultats appuient l’idée que la déclaration complète des paramètres logiciels critiques et la description du traitement des échantillons, tels que le diluant, la dilution et la filtration, ont une incidence sur la reproductibilité des données NTA.

Le but de cet article est de démontrer que la variation des paramètres NTA (température, niveau de la caméra et seuil de détection) et de la préparation des échantillons modifie les résultats recueillis : des différences systématiques et significatives de taille et de concentration ont été obtenues. Comme le NTA est l’une des options populaires pour répondre à la spécification de caractérisation MISEV2018, ces résultats démontrent l’importance de déclarer la préparation des échantillons et les paramètres NTA pour assurer la reproductibilité.

Figure 1
Figure 1 : Rapports représentatifs de la NTA pour comparer les liposomes aux ve. (A) Liposomes: échantillon non filtré caractérisé sur NTA le 12 mars 2020. B) VE: échantillon non filtré caractérisé sur NTA le 26 août 2021. Abréviations : NTA = Analyse de suivi des nanoparticules; VE = vésicules extracellulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocol

1. Lignes directrices générales du protocole

  1. Maintenez le microscope sur une table à air ou au minimum sur une table sans vibrations. Veiller à ce que les vibrations étrangères (p. ex., tapotement du pied sur le sol, toucher la table, fermeture des portes, circulation en laboratoire) soient réduites au minimum.
  2. Réglez et maintenez la température du module laser à une température constante pour tous les enregistrements vidéo.
    REMARQUE: La température choisie était de 25 ° C car l’analyseur de taille de nanoparticule a été étalonné à cette température. Par conséquent, il est important que tous les utilisateurs de l’instrument connaissent et utilisent la température étalonnée. La température ambiante n’est pas un réglage acceptable car elle peut varier.
  3. S’assurer que tous les diluants, également appelés témoins négatifs (p. ex., solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco, eau distillée ultrapure [DW]), sont tous caractérisés par NTA à l’aide du même niveau de caméra et du même seuil de détection que les échantillons de nanoparticules mesurés. Utiliser le DPBS caractérisé pour le rinçage du module laser et la dilution des échantillons. Prendre en compte les contaminants dans le DPBS témoin négatif dans les résultats de l’échantillon si leurs niveaux sont significatifs.
  4. Conservez les échantillons à 4 °C avant l’évaluation et ne les congèlez jamais, car cela dégraderait l’échantillon de liposomes. Réchauffer les échantillons/étalons/diluants à température ambiante pendant 30 minutes avant l’analyse.
    REMARQUE : La manipulation des échantillons était spécifique au matériau examiné.
  5. Évaluer l’échantillon et les étalons à l’aide de la mesure rapide pour établir une dilution appropriée afin d’obtenir 107 à 109 particules/mL (environ 50 à 100 particules/écran vidéo NTA) jugés optimaux pour les analyses NTA.
    REMARQUE: Les auteurs ont constaté que les concentrations de particules à l’extrémité supérieure de cette plage produisent des résultats plus cohérents et reproductibles.
  6. Remplissez tous les champs applicables dans la zone Capture de l’onglet SOP pour les mesures rapides et standard , y compris la dilution et le diluant utilisé.

2. Préparation d’étalons d’étalonnage de taille 50 nm et 100 nm

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux.

  1. Normes de transfert de taille 50 nm diluées 1:5 000
    1. Ajouter 2 μL des étalons de 50 nm à 9 998 μL de chlorure de potassium (KCl) de 10 mM filtré à 0,22 μm/Tween 20 à 0,03 % dans un DW ultrapur dans un tube conique de 15 mL rincé deux fois. Conserver l’étalon dilué de 50 nm à 4 °C jusqu’à un an.
  2. Normes de transfert de taille 100 nm diluées 1:333
    1. Ajouter 30 μL des étalons 100 nm à 9 970 μL de 0,22 μm de KCl 10 mM/0,03 % Tween 20 en DW ultrapur dans un tube conique de 15 mL rincé deux fois. Conserver l’étalon dilué de 100 nm à 4 °C jusqu’à un an.

3. Nettoyage et montage du module laser

  1. Inspectez visuellement le module laser et les fenêtres de couvercle de la cellule d’écoulement à la recherche de rayures ou d’imperfections.
    REMARQUE: Si l’une ou l’autre surface de verre est rayée, l’imagerie peut être affectée.
  2. Nettoyez doucement les deux surfaces vitrées avec un nettoyant pour lentilles et du papier pour lentilles de bonne qualité. N’utilisez pas de lingettes en papier ou d’essuie-tout sur des surfaces en verre.
  3. Assurez-vous que le joint torique est correctement installé dans la rainure du couvercle de la cellule d’écoulement avant l’assemblage.
  4. Placez le couvercle de la cellule d’écoulement sur le module laser, en vous assurant que les contacts électriques sont dans la bonne orientation. Placez les 4 vis à ressort à travers la plaque de cellule d’écoulement et engagez les filetages du module laser, mais ne serrez pas individuellement.
  5. En exerçant une pression uniforme sur le couvercle de la cellule d’écoulement, serrez uniformément les vis à molette de manière diagonale alternée jusqu’à ce qu’elles soient bien ajustées. Ne serrez les vis à pouce que jusqu’à ce qu’elles soient serrées avec les doigts. Ne pas trop serrer.
    REMARQUE: Un serrage inégal des vis à molette peut fissurer la surface du module laser. Les vis à molette de conception plus récente « s’enfonceront » à la pression appropriée, évitant ainsi un éventuel resserrement excessif.

4. Procédure de rinçage du module laser avant et entre les échantillons

  1. Utilisez un récipient de DPBS nouvellement ouvert et une aliquote dans des tubes en polypropylène de 15 mL à triple rinçage. S’assurer que les produits utilisés pour rincer ou diluer les échantillons sont caractérisés par la NTA avant utilisation (voir l’étape 1.3).
  2. Rincez deux seringues à tuberculine de 1 mL avec des adaptateurs de verrouillage antidérapant 3 fois avec 1 mL de DPBS pour éliminer tout résidu de particules. Utilisez l’un ou l’autre port comme entrée, mais utilisez-le de manière cohérente pendant l’expérience. N’utilisez pas de seringues plus grandes en raison du risque de casser les orifices de la seringue en raison de l’augmentation du poids et de la taille de la seringue.
  3. Retirez et jetez le piston de la seringue de tuberculine 1ère et insérez-le dans l’orifice restant pour servir de diluant / réservoir d’échantillon vide.
    REMARQUE: Si vous ne retirez pas le piston, vous augmenterez la pression dans la chambre d’échantillonnage et provoquerez une fuite autour du joint.
  4. Remplissez la 2e seringue avec 1 mL de DPBS et fixez-la à l’orifice d’entrée du couvercle de la cellule d’écoulement.
  5. Maintenez le module laser incliné avec l’orifice de la seringue de sortie surélevé pour permettre à l’air d’être purgé de la chambre pendant que le DPBS est injecté lentement dans le module laser.
  6. Rincez le DPBS restant du module laser en injectant 1 mL d’air dans l’orifice d’entrée. Répétez le rinçage 2 fois de plus.
  7. Videz le module laser aussi complètement que possible après le dernier rinçage.
    REMARQUE: Un rinçage approfondi et minutieux est nécessaire après l’analyse NTA de la norme 50 nm, car ces particules persistent dans le module laser. Le module laser est maintenant prêt à être utilisé.

5. Placement du module laser sur l’étage du microscope

  1. Localisez les guides d’alignement de mise au point du module laser sur le bras du microscope (Figure 2) et alignez-les à l’aide du bouton de mise au point.

Figure 2
Figure 2 : Guide d’alignement de la mise au point du module laser. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Face au microscope, placez le module laser dans la scène rainurée et faites-le glisser doucement aussi loin que possible vers la droite.
    REMARQUE: Si cela est fait avec soin, l’alignement et le point focal seront plus faciles à localiser entre les échantillons.
  2. Allumez l’interrupteur à bascule du boîtier de commande laser.

6. Mise au point et positionnement du module laser

REMARQUE: Cela doit être effectué avec du liquide dans la chambre.

  1. Chargez le logiciel NTA (voir la table des matériaux) à partir du bureau.
    Remarque : Une erreur peut apparaître, « Température H/W introuvable sur COM3. » Il suffit de fermer et de rouvrir le logiciel pour le réparer.
  2. Cliquez sur Démarrer l’appareil photo sous l’onglet Capture dans le coin supérieur gauche. Si l’appareil photo s’éteint automatiquement après 5 minutes, cliquez simplement sur Démarrer l’appareil photo à nouveau pour le redémarrer.
  3. Dans le même onglet, réglez le niveau de la caméra à 14 à 16 pour éclaircir la ligne laser et simplifier l’identification et la mise au point des particules.
  4. Détournez l’image de la caméra vers les oculaires en déplaçant le curseur supérieur sur le côté gauche de la coiffe à l’intérieur ou à l’extérieur.
  5. Trouvez la zone de densité accrue, communément appelée empreinte du pouce. Centrez et concentrez l’empreinte du pouce verticalement dans le champ de vision.
    REMARQUE: La ligne laser sera à gauche de l’empreinte du pouce. L’assombrissement de la pièce peut aider à localiser l’empreinte du pouce et à se concentrer sur la ligne laser.
  6. Centrer la ligne laser dans le champ de vision; déplacez le curseur supérieur pour détourner la lumière vers la caméra comme observé sur l’écran de l’ordinateur.
    REMARQUE: La ligne laser maintenant visible à l’écran est une image miroir de la vue de l’oculaire; à gauche dans les oculaires sera juste sur l’écran de l’ordinateur.
  7. Ajustez la mise au point pour affiner l’image des particules en mouvement individuelles sur l’écran avec le bouton de mise au point.
    REMARQUE: En raison de la profondeur de mise au point, toutes les particules ne seront pas au point, ce qui est acceptable. Même les particules légèrement floues seront capturées par la caméra et analysées par le logiciel.

7. Chargement des étalons/échantillons/diluants dans le module laser pour l’analyse NTA

  1. Prélever 1 mL d’étalon/échantillon/diluant dans une seringue à tuberculine rincée de 1 mL et la fixer à l’orifice d’entrée du couvercle de la cellule d’écoulement. Avancez le piston jusqu’à ce que le liquide soit évident dans la seringue ouverte fixée à l’orifice de sortie.
  2. Dans la vue de la caméra, déplacez-vous vers la droite de la ligne laser vers une zone d’un nombre uniforme de particules. Si nécessaire, ajustez l’orientation verticale pour centrer les bandes horizontales de lumière. Recentrez-vous jusqu’à ce que le plus grand nombre de particules soit visible. Veiller à ce que, pour toutes les mesures ultérieures, cette position soit maintenue aussi fidèlement que possible.
  3. Réglez le niveau de l’appareil photo au point où le symbole d’information Sombre clignote par intermittence en haut à droite de la vue de l’appareil photo.
    REMARQUE: Cela permet de s’assurer qu’une sélection cohérente du niveau de caméra est effectuée au niveau de sensibilité minimum pour chaque série de collecte de données.
    REMARQUE: Le niveau de l’appareil photo ne peut pas être modifié pendant la capture.

8. Validation de l’étalonnage

REMARQUE : Il est recommandé de valider l’étalonnage du module à l’aide d’étalons de taille (voir section 2) avant l’analyse de l’échantillon. Une validation de routine est nécessaire pour assurer des mesures précises. Dans un laboratoire multi-utilisateurs, les ajustements individuels des paramètres de configuration logicielle par l’utilisateur peuvent entraîner par inadvertance une collecte de données inexacte. Pour la collecte de données critiques, la validation quotidienne est une question de bonnes pratiques de laboratoire. La reproductibilité quotidienne de la validation doit être incluse dans les résultats rapportés. En règle générale, l’étalonnage est défini par le technicien et n’est pas réglable par l’utilisateur individuel, sauf si l’utilisateur dispose d’un accès administrateur. Cela empêche la reconfiguration non autorisée par des utilisateurs individuels.

  1. Étalons dilués chauds (voir section 2) à température ambiante pendant 30 min.
  2. Effectuez brièvement un vortex des étalons, puis chargez-les comme décrit à la section 7.
  3. Effectuer l’échantillon de NTA tel que décrit à la section 10 et enregistrer les valeurs pour le calcul ultérieur du coefficient de variation, qui doit être inférieur à 2 % s’il est correctement étalonné.

9. Optimisation de la concentration de l’échantillon pour la NTA

REMARQUE: L’écran doit contenir entre 50 et 100 particules mesurables lorsque le niveau de la caméra et la concentration de l’échantillon sont correctement ajustés. S’il y a une question quant à savoir si un échantillon a un nombre de particules approprié, une mesure rapide peut être exécutée sur l’échantillon à ce stade (voir les étapes 9.1 à 9.7). Il est utilisé pour évaluer rapidement les caractéristiques de l’échantillon avant des captures vidéo plus longues. L’onglet Mesure rapide se trouve dans l’onglet SOP dans la zone centrale inférieure.

  1. Définissez la durée de capture sur 30 s.
  2. Acceptez le nom de fichier de base existant ou entrez un nouveau nom de fichier en cliquant sur l’onglet ... d’un nouveau site de stockage pour les données générées.
  3. Cochez la case Température cible et entrez la température souhaitée.
  4. Chargez l’exemple comme décrit précédemment (étape 7.1) et cliquez sur Créer et exécuter un script.
  5. Attendez que le nombre de particules par image soit affiché en bas à droite de l’écran vidéo après la fin de la vidéo de 30 s. Si le nombre de particules est supérieur à 100, rincez le module laser 3 fois (comme décrit précédemment à l’étape 4.6).
  6. Diluer l’échantillon à la plage de concentration souhaitée à l’aide du diluant caractérisé.
  7. Chargez l’échantillon correctement dilué dans le module laser rincé et exécutez la mesure rapide pour vérifier que l’échantillon se trouve dans la plage acceptable.

10. Exemple de NTA

REMARQUE : L’onglet Mesure standard se trouve dans l’onglet SOP dans la zone centrale inférieure et est utilisé pour l’analyse de routine des échantillons (voir les étapes 10.1 à 10.12).

  1. Définissez la durée sur 30 ou 60 s et le nombre de vidéos sur 5.
  2. Acceptez le nom de fichier de base existant ou entrez un nouveau nom de fichier en cliquant sur l’onglet ... d’un nouveau site de stockage pour les données générées.
  3. Cochez la case Température cible et entrez la température souhaitée.
  4. Cliquez sur Créer un script pour réutiliser cette mesure standard.
  5. Une fois l’exemple chargé comme décrit dans la section 7 et que l’expérience est prête à s’exécuter, cliquez sur Créer et exécuter un script.
  6. Remplissez les champs de l’écran contextuel Définir les détails du rapport avec des informations sur l’opérateur, la description de l’échantillon, la dilution de l’échantillon et le diluant utilisé.
    REMARQUE : Ces renseignements seront consignés et imprimés dans le rapport expérimental final.
  7. Lorsque tous les champs souhaités ont été remplis, cliquez sur OK pour lancer le script.
    REMARQUE: Si la température cible a été sélectionnée, le réchauffeur stabilisera l’échantillon dans le module laser à la température souhaitée pendant 5 s avant de permettre au script de procéder à la mesure. Le panneau de diagnostic dans le coin inférieur gauche de l’écran lira HEATER ON et affichera la température de l’échantillon.
  8. Avant chaque capture vidéo, recherchez une invite pour faire avancer le piston manuellement. Injectez environ 0,05 mL de l’échantillon dans la chambre laser et laissez les particules se « reposer » (c’est-à-dire ne pas couler), puis cliquez sur OK.
  9. Attendez qu’une boîte de confirmation des paramètres apparaisse à la fin de la 5e capture vidéo et que la zone Processus clignote. Définissez le seuil de détection pour le traitement de l’échantillon en notant le nombre de croix bleues marquant les particules à l’écran lorsque les images sont avancées manuellement à partir du bas de l’écran vidéo. S’il y a plus de 3-4 croix bleues marquant des particules sur chaque écran au fur et à mesure que les images sont avancées, augmentez le seuil de détection.
    REMARQUE: Les croix bleues sur les particules individuelles sont analogues à l’effet « essaim » en cytométrie en flux et doivent être minimisées pour une précision et une reproductibilité optimales de la collecte de données.
  10. Cliquez sur Paramètres OK lorsque le seuil de détection est acceptable.
  11. Attendez que les vidéos soient traitées automatiquement et qu’un histogramme des résultats et une notification d’achèvement de la boîte de dialogue s’affichent avant de cliquer sur OK.
  12. Une fois que la zone Paramètres d’exportation apparaît, enregistrez les résultats en cliquant sur Exporter.
    REMARQUE: Tous les résultats des vidéos et de l’analyse seront stockés dans le fichier de destination défini à l’étape 10.2. Cela nécessite une grande quantité de stockage. Surveillez et transférez-les vers un périphérique de stockage secondaire si nécessaire.

11. Réanalyse de l’échantillon actuel à différents seuils de détection

REMARQUE: Immédiatement après l’analyse NTA (étape 10), les données peuvent être réanalysées à l’aide de différents paramètres de seuil de détection. Toutefois, le niveau de l’appareil photo ne peut pas être modifié après la capture.

  1. Mettez en surbrillance les 5 vidéos de capture répertoriées dans l’expérience en cours.
  2. Cliquez sur Traiter les fichiers sélectionnés, puis attendez que la zone Confirmation des paramètres s’affiche et que la zone Processus clignote pour modifier le seuil de détection.
  3. Ajustez le seuil de détection au niveau souhaité et cliquez sur Réglage OK.
  4. Attendez que les vidéos soient traitées automatiquement et qu’un histogramme des résultats et une notification d’achèvement de la boîte de dialogue s’affichent avant de cliquer sur OK.
  5. Cliquez sur Paramètres d’exportation. Lorsque des évaluations supplémentaires sont effectuées sur l’échantillon le plus récent, veillez à cliquer sur la zone Exporter les résultats dans la zone Expérience en cours , car la zone contextuelle Exporter les résultats ne s’affichera pas après la réanalyse de l’exemple.
    REMARQUE: Comme il n’y a pas de rappels pour le faire, il peut facilement être négligé et l’analyse sera perdue. Cependant, les données sous-jacentes resteront et pourront être réanalysées ultérieurement.

12. Analyse des fichiers archivés

REMARQUE: Si les expériences précédemment analysées n’ont pas été enregistrées ou si une analyse supplémentaire doit être effectuée sur ces échantillons, les fichiers individuels peuvent être rechargés dans le logiciel NTA pour des évaluations supplémentaires du seuil de détection . Les changements de niveau de caméra ne peuvent pas être modifiés après la capture.

  1. Chargez le logiciel NTA à partir du bureau.
  2. Cliquez sur l’onglet Analyse dans le panneau central inférieur.
  3. Cliquez sur Ouvrir l’expérience et accédez au fichier .nano souhaité.
    REMARQUE: Les fichiers vidéo associés à l’expérience .nano sélectionnée doivent être dans le même dossier que le fichier d’expérience principal; sinon, une erreur apparaîtra lors de la tentative de traitement des fichiers. Les 6 premiers chiffres du nom de fichier sont la date à laquelle l’expérience a été exécutée (xx-xx-xx). Les 6 derniers chiffres du nom de fichier sont l’heure à laquelle la vidéo a été enregistrée (xx-xx-xx) et l’identifiant vidéo individuel. Le fichier PDF de chaque expérience combinée répertorie les fichiers .nano inclus pour cette analyse.
  4. Cliquez sur Traiter les fichiers sélectionnés pour exécuter l’analyse.
  5. Une fois que la zone Processus clignote pour autoriser les modifications du seuil de détection, définissez le seuil sur le niveau souhaité et cliquez sur OK.
  6. Attendez que les vidéos soient traitées automatiquement et qu’un histogramme des résultats et une notification d’achèvement de la boîte de dialogue s’affichent avant de cliquer sur OK.
  7. Cliquez sur Exporter les résultats. Veillez à cliquer sur la zone Exporter les résultats dans l’expérience en cours, car la zone contextuelle Exporter les résultats ne s’affichera pas après la réanalyse.
    REMARQUE: Comme il n’y a pas de rappels pour le faire, il peut facilement être négligé et l’analyse sera perdue.

13. Nettoyage et démontage du module laser

  1. Éteignez le boîtier de commande laser.
  2. Rincez l’échantillon entier du module laser et jetez-le correctement.
  3. Maintenez le module laser incliné avec le port de seringue ouvert surélevé pour permettre à l’air d’être purgé de la chambre pendant que le DPBS est injecté lentement dans le module laser et est rincé à partir du port de la seringue de sortie.
  4. Rincez le DPBS restant du module laser et jetez-le.
  5. Répétez le rinçage 2 fois de plus et videz le module laser aussi complètement que possible après le dernier rinçage.
  6. En exerçant une pression uniforme sur le couvercle de la cellule d’écoulement, desserrez uniformément les vis à pouce de manière diagonale alternée jusqu’à ce qu’elles soient désengagées des filetages, retirez les vis à molette et rangez-les dans le boîtier du module laser.
  7. Retirez le couvercle de la cellule d’écoulement du module laser.
  8. Nettoyez doucement les deux surfaces vitrées avec un nettoyant pour lentilles et du papier pour lentilles de bonne qualité. N’utilisez pas de papier de soie ou d’essuie-tout sur des surfaces en verre.
  9. Inspectez visuellement les « fenêtres » du module laser et du couvercle de la cellule d’écoulement à la recherche de rayures ou d’imperfections après utilisation et signalez-le au superviseur.
  10. Remplacez le module laser et le couvercle de la cellule d’écoulement dans leurs étuis pour éviter d’endommager les surfaces vitrées pendant le stockage.

14. Protocole d’analyse d’échantillons

  1. Échantillons non filtrés
    1. Vortex l’échantillon avant le chargement et enregistrez des vidéos de 5 x 60 s au niveau de la caméra 12 et au niveau de seuil de détection 3 comme décrit ci-dessus. Réanalysez ces vidéos à l’aide des seuils de détection 2 et 5.
    2. Répétez les collections vidéo du même échantillon aux niveaux de caméra 13 et 14 et au niveau de seuil de détection 3. Réanalysez ces 2 vidéos supplémentaires à l’aide des seuils de détection 2 et 5. Répétez l’ensemble du processus à l’aide de vidéos de 5 x 30 s dans le paramètre SOP .
  2. Échantillons filtrés
    1. Vortex l’échantillon, puis chargez et filtrez simultanément (filtre à seringue de 0,22 μm) directement dans le module laser.
      REMARQUE: Le filtre à seringue a été rincé avec 2 fois le volume de l’espace mort du filtre avant utilisation pour éliminer les particules résidentes. Les filtres à seringue (voir la table des matériaux) avaient un espace mort mesuré de 0,5 mL et ont été rincés avec 1,0 mL de l’échantillon avant les mesures. Notez le type de filtre dans les champs de données SOP . L’échantillon filtré a été traité exactement comme décrit pour les échantillons non filtrés à l’étape 14.1.

15. Analyse statistique des résultats de la NTA

  1. Pour l’analyse des principaux effets ou interactions, effectuer une analyse de variance après une vérification des hypothèses ANOVA (normalité, unimodale, homogénéité de la variance). Utilisez l’ANOVA unidirectionnelle kruskal-Wallis sur les rangs en cas d’échec des hypothèses d’ANOVA.
  2. Après le retour des principaux effets significatifs, utilisez la méthode de Dunn pour effectuer des tests de ressources pour des comparaisons planifiées à l’avance. Considérez qu’une valeur de p de 0,05 est significative dans les essais à deux queues.
    REMARQUE : Les fichiers de données générés ici sont disponibles auprès des auteurs après la conclusion d’un accord de transfert de matériaux.

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Representative Results

Le tableau 1 contient les résultats des vidéos NTA pour les échantillons de liposomes (18 filtrés et 18 non filtrés) et un diluant DPBS représentatif. Des comparaisons entre les deux groupes ont été effectuées, quel que soit le niveau de la caméra ou le seuil de détection dans le présent document. Les échantillons filtrés avaient un diamètre moyen de particules de 108,5 nm, un mode de particules de 86,2 nm et une concentration de 7,4 × 108 particules/mL. En revanche, les échantillons non filtrés avaient un diamètre moyen de particules de 159,1 nm, un mode de particules de 105,7 nm et une concentration de 7,6 × 108 particules/mL. Les valeurs moyennes et de mode pour les échantillons filtrés et non filtrés, quel que soit le niveau de la caméra ou le seuil de détection, étaient statistiquement significatives (p < 0,05). Les différences de concentration entre les échantillons filtrés et non filtrés, quel que soit le niveau de la caméra ou le seuil de détection, n’étaient pas significatives (p = 0,86).

Comparaisons d’échantillons filtrés et non filtrés
Échantillon Cam Lev Det Thr Méchant Moyenne %CV St. Dev. Conc. × 108 St. Dev. × 107
Filtré Non filtré Filtré Non filtré Filtré Non filtré Filtré Non filtré Filtré Non filtré
Liposome 12 3 138.3 162.1 55.5 47.5 76.7 77 3.2 6.48 1.74 3.16
Liposome 12 2 126.3 153.7 58.7 49.8 74.2 76.5 4.94 8.23 2.74 3.5
Liposome 12 5 155 172.2 51.8 45.6 80.3 78.6 1.91 5.05 1.02 2.9
Liposome 13 3 102.7 169 43.5 51.3 44.7 86.7 6.72 7.75 1.91 1.17
Liposome 13 2 95.8 161.4 43.3 52.7 41.5 85 10.3 9.7 1.61 1.83
Liposome 13 5 110.7 176.1 42.5 47.1 47 83 4.16 6.28 1.83 1.07
Liposome 14 3 98 147.6 42.4 43.8 41.6 64.6 10.6 8.56 2.4 1.66
Liposome 14 2 92.9 142.1 42.6 45.2 39.6 64.3 14.9 10.7 2.54 1.83
Liposome 14 5 103.8 153.8 41.1 42.6 42.7 65.5 7.42 7.02 2.37 1.51
Liposome 12 3 105.6 179.4 22.2 46.7 23.4 83.7 5.2 5.81 1.06 4.28
Liposome 12 2 100.3 170.8 24.3 49.1 24.4 83.8 7.76 7.39 1.61 4.41
Liposome 12 5 112 187.2 20.4 42.9 22.8 80.4 3.27 4.68 0.815 3.93
Liposome 13 3 99.8 153.3 23.4 52.1 23.4 79.8 7.19 7.34 3.37 1.5
Liposome 13 2 94.3 143.6 25.8 53.2 24.3 76.4 10.8 9.53 4.3 2.46
Liposome 13 5 106.8 162 21.3 49.4 22.7 80 4.64 5.76 2.63 1.01
Liposome 14 3 103.4 142.3 31.7 49.6 32.8 70.6 9.91 8.66 3.29 12.5
Liposome 14 2 97.8 136 33.3 51.4 32.6 69.9 13.8 11.5 2.98 15.7
Liposome 14 5 109.5 151.4 31.1 49.5 34 74.9 7.27 6.76 3.42 10.1
Moyenne 108.5 159.1 36.4 48.3 40.5 76.7 7.4 7.6 2.3 4.1

Tableau 1 : Tableau de données des valeurs collectées, de l’écart-type et du coefficient de variation en pourcentage pour les échantillons filtrés et non filtrés. Abréviations: Cam Lev = niveau de la caméra; Det Thr = seuil de détection; CV = coefficient de variation; St. Dev. = écart-type; Conc. = concentration.

Lorsque les résultats de l’échantillon de liposomes ont été analysés en fonction du seuil de détection (2, 3, 5) et du niveau de la caméra (12, 13, 14), les résultats n’étaient pas significatifs (figure 3). Il est à noter qu’il n’y a eu que 3 évaluations (n = 3) à chacun de ces niveaux individuels. Cette petite taille d’échantillon à chaque niveau de caméra et seuil de détection a probablement contribué à l’absence de comparaisons individuelles significatives. Cependant, lorsque les échantillons de seuil de détection (2, 3, 5) ont été évalués quel que soit le niveau de la caméra sur les échantillons filtrés et non filtrés (n = 3), la taille moyenne (Figure 3A) et la taille du mode (Figure 3B) étaient significativement différentes (p < 0,05). En revanche, les différences entre les concentrations d’échantillons filtrés et non filtrés (figure 3C) n’étaient pas significativement différentes.

Figure 3
Figure 3 : Effets du niveau de la caméra et du seuil de détection sur la taille et la concentration mesurées des particules filtrées et non filtrées. Taille moyenne (A) et moyenne (B) des particules aux niveaux combinés de la caméra 12, 13, 14 lorsque le seuil de détection a été augmenté de 2 à 3 à 5 (n = 3), montrant une diminution significative de la taille des particules des échantillons filtrés. Concentrations de particules (C) aux niveaux combinés de caméra 12, 13, 14 lorsque le seuil de détection a été augmenté de 2 à 3 à 5) (n = 3), montrant une diminution de la concentration à mesure que le seuil de détection augmentait sans différence significative entre les échantillons filtrés et non filtrés. Taille moyenne (D) et moyenne (E) des particules aux seuils de détection combinés à mesure que le niveau de la caméra passait de 12 à 14 (n = 3), ce qui montre une diminution de la taille des particules des échantillons filtrés. Les concentrations de particules (F) aux seuils de détection combinés à mesure que les niveaux de caméra passaient de 12 à 14 (n = 3), montrant une augmentation de la concentration à mesure que le niveau de la caméra augmentait sans différence significative entre les échantillons filtrés et non filtrés. Abréviation : DT = seuil de détection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Lorsque les 3 niveaux de caméra (12, 13, 14) ont été évalués quel que soit le niveau de seuil de détection (n = 3), la taille moyenne (Figure 3D) et la taille du mode (Figure 3E) ont augmenté dans les échantillons filtrés. Les concentrations dans les échantillons ont montré une tendance à augmenter à mesure que le niveau de la caméra passait de 12 à 14 (figure 3F). Les différences entre les concentrations d’échantillons filtrés et non filtrés évaluées à différents niveaux de caméra n’étaient pas significativement différentes.

Fichier supplémentaire 1 : Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Il existe plusieurs méthodes pour estimer la taille et la concentration des nanoparticules11. Il s’agit notamment de méthodes d’ensemble qui génèrent une estimation de la taille à partir d’une population, y compris la diffusion dynamique de la lumière (DLS), la sédimentation centrifuge et l’analyse au niveau d’une seule particule - microscopie électronique, NTA, microscopie à force atomique et détection d’impulsion résistive accordable. Parmi ceux-ci, DLS et NTA sont des méthodes de mesure de taille et de concentration non destructives largement utilisées, basées sur le mouvement brownien dans un milieu idéal. DLS repose sur la diffusion de la lumière et l’intensité est proportionnelle au carré du volume des particules. Ainsi, le DLS est plus sensible que le NTA à la présence de grosses particules, d’agrégats ou de populations polydispersées.

NTA calcule le coefficient de diffusion à partir de la longueur de trajet des particules individuelles mesurées dans des images vidéo successives. La principale limite de la NTA est la plage étroite de concentration de particules qu’elle peut évaluer par rapport au DLS et à d’autres méthodes de mesure, de sorte que les longueurs de trajet des particules individuelles doivent se situer dans la limite de diffraction du microscope et des capacités du logiciel de suivi. Comme le DLS et le NTA dépendent du mouvement brownien, on peut s’attendre à ce que les deux montrent un bon accord de taille dans les populations monodispersées; ils divergent lors de l’évaluation des populations polydispersées et de celles avec des agrégats. Ce dernier rend le DLS inutile et augmente considérablement l’estimation de la taille des particules NTA12. La limitation la plus connue de la NTA est qu’elle nécessite une concentration de particules beaucoup plus faible (ou une dilution plus importante) que les autres méthodes de mesure. Malgré cela, la caractérisation NTA est populaire dans la recherche sur les nanomatériaux. Étant donné que les estimations de la taille et de la concentration de la NTA dépendent d’une population plus diluée, avec une température définie, des paramètres de capture vidéo, y compris la longueur d’enregistrement, le niveau de la caméra, le seuil de détection et la dilution de l’échantillon pour être hautement reproductibles, cet article se concentre sur la nécessité de les rapporter pour générer des résultats reproductibles.

Cet article montre que l’utilisation d’un protocole standardisé a permis la réplication des résultats et que l’utilisation de contrôles positifs, tels que les étalons de taille, fournit des informations sur l’étalonnage de la machine. De plus, ces résultats ont indiqué l’importance de signaler la température de la chambre du module laser, les niveaux de caméra, le seuil de détection et la filtration (type et taille du filtre). En revanche, la température, le diluant et le facteur de dilution de la chambre du module laser sont tout aussi importants pour des résultats précis et reproductibles. Bien que ni MISEV2018 ni EV-TRACK ne recommandent spécifiquement l’inclusion de ces informations, nous suggérons que l’inclusion de ces détails permette une confirmation indépendante des résultats publiés et ajoute de la robustesse à la conception expérimentale.

Les limites de l’utilisation des étalons d’étalonnage de la taille du latex pour l’étalonnage NTA dans l’analyse EV sont reconnues et incluent les différences connues d’indice de réfraction par rapport aux nanoparticules bicouches lipidiques de taille similaire. Dans cet article, des billes de latex ont été utilisées pour confirmer l’étalonnage de la machine avant les mesures et non pour déterminer les limites de détection. Les liposomes ont une membrane similaire à celle des VE naturels, et l’indice de réfraction sera également représentatif des VE. Les étalons de taille, ainsi que les échantillons de liposomes, sont des populations monodispersées; par conséquent, leur distribution de taille suivra une distribution gaussienne ou log-normale. Les véhicules électriques naturels sont polydispersés et leur distribution de taille suivra une fonction de loi de puissance13.

Historiquement, les publications utilisant la caractérisation de la NTA rapportent de manière incohérente les détails nécessaires pour dupliquer les résultats de la recherche. La capacité de reproduire les données NTA repose sur la possibilité de dupliquer les paramètres utilisés pour capturer les données d’origine. Sans cette information, la reproduction des résultats expérimentaux à l’aide de la NTA sera extrêmement difficile. Avec le respect rigoureux d’un protocole établi et la publication des paramètres de réglage utilisés avec la NTA, une réplication précise des résultats peut être obtenue. Les recommandations suivantes sont faites pour améliorer la cohérence de la caractérisation des nanoparticules de la taille, de la concentration, de la composition et de la pureté à l’aide d’un analyseur de taille de nanoparticules.

Tout d’abord, vérifiez toujours l’étalonnage de l’analyseur de taille de nanoparticules en utilisant des normes de taille appropriées, telles que les normes de taille de latex. Cela devrait être fait régulièrement et consigné dans le journal de l’instrument et avant l’analyse des échantillons critiques. Deuxièmement, tous les paramètres réglables, tels que la température de la chambre du module laser, les niveaux de caméra et les seuils de détection, doivent être enregistrés pour chaque échantillon dans le fichier journal de l’échantillon , tout comme les dilutions et les diluants utilisés. Ces paramètres doivent être signalés car ils dépendent de l’opérateur et ont un impact sur les mesures NTA. Troisièmement, les diluants utilisés pour la dilution des échantillons doivent être caractérisés pour la teneur en nanoparticules et rapportés. Les diluants utilisés pour les échantillons individuels de nanoparticules devront être évalués à l’aide des mêmes paramètres de niveau de caméra et de seuil de détection que ceux utilisés pour l’échantillon dilué. Quatrièmement, les filtres à seringue doivent être rincés avec deux fois le volume d’espace mort avant les étapes de collecte des données ou de préparation des échantillons pour éliminer les nombreuses particules restantes du processus de fabrication. Cinquièmement, la concentration des nanoparticules dans l’échantillon doit être ajustée à l’intérieur de l’optimum suggéré 1,0 × 107 à 1,0 × 109 par mL.

Reconnaissant les limites décrites ci-dessus dans cette étude, nous montrons que les valeurs de taille et de concentration obtenues par la NTA peuvent être affectées par les paramètres de la NTA, tels que les niveaux de caméra et les seuils de détection, et que la taille, mais pas la concentration, peut être affectée par la préparation de l’échantillon. Cela souligne l’importance cruciale de rendre compte de ces paramètres dans la littérature sur les nanomatériaux et les VE, ce qui permet la production d’une littérature robuste et reproductible afin que nous puissions étudier systématiquement l’impact de la source de VE, de l’isolement et d’autres variables expérimentales.

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Disclosures

Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Le travail a été soutenu par l’État du Kansas au Midwest Institute for Comparative Stem Cell Biology (MICSCB), au Johnson Cancer Research Center à MLW et NIH R21AG066488 à LKC. OLS a reçu le soutien de la GRA du MICSCB. Les auteurs remercient le Dr Santosh Aryal d’avoir fourni les liposomes utilisés dans ce projet et les membres des laboratoires Weiss et Christenson pour des conversations et des commentaires utiles. Le Dr Hong He est remercié pour son soutien technique. MLW remercie Betti Goren Weiss pour son soutien et ses conseils.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automatic Pipetter
Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL Thermo Sci. 339650
Kimwipes
Lens Cleaner
Lens Paper
NanoSight LM-10 Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 Laser Module Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2 Malvern Panalytical
Paper Towels
Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding BioExpress P -3243-200X
Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile BioExpress P-3243-1250
Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg) Gibco 14190-144
Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL) Malvern NTA4088
Standards, Latex Transfer- 50 nm  (3 mL) Malvern NTA4087
Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile Fisher brand 09-720-004
Syringe, TB, 1 mL, slip tip Becton Dickinson 309659
Waste fluid container

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References

  1. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  2. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  3. Consortium, E. -T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  4. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
  5. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  6. Danaei, M., et al. Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems. Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).
  7. Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles. Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).
  8. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
  9. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).
  10. Malvern analytical Ltd. NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).
  11. Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly. Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).
  12. Gollwitzer, C., et al. A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium. Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).
  13. vander Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).

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Bioingénierie numéro 177
Améliorer la reproductibilité pour répondre aux informations minimales pour les études sur les vésicules extracellulaires 2018 Lignes directrices dans l’analyse de suivi des nanoparticules
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Snyder, O. L., Campbell, A. W.,… More

Snyder, O. L., Campbell, A. W., Christenson, L. K., Weiss, M. L. Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis. J. Vis. Exp. (177), e63059, doi:10.3791/63059 (2021).

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