Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Forbedre reproduserbarheten for å møte minimal informasjon for studier av ekstracellulære vesicles 2018 retningslinjer i nanopartikkelsporingsanalyse

Published: November 17, 2021 doi: 10.3791/63059
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Anatomy and Physiology, Kansas State University College of Veterinary Medicine, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center

Summary

Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) er en mye brukt metode for å karakterisere ekstracellulære vesikler. Dette dokumentet fremhever NTA eksperimentelle parametere og kontroller pluss en ensartet metode for analyse og karakterisering av prøver og fortynningsstoffer som er nødvendige for å supplere retningslinjene foreslått av MISEV2018 og EV-TRACK for reproduserbarhet mellom laboratorier.

Abstract

Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) har vært en av flere karakteriseringsmetoder som er brukt til ekstracellulær vesicle (EV) forskning siden 2006. Mange anser at NTA-instrumenter og deres programvarepakker lett kan brukes etter minimal opplæring, og at størrelseskalibrering er mulig internt. Siden både NTA-anskaffelse og programvareanalyse utgjør EV-karakterisering, blir de adressert i Minimal informasjon for studier av extracellulære vesikler 2018 (MISEV2018). I tillegg har de blitt overvåket av Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) for å forbedre robustheten til EV-eksperimenter (f.eks. minimere eksperimentell variasjon på grunn av ukontrollerte faktorer).

Til tross for arbeidet med å oppmuntre til rapportering av metoder og kontroller, klarer mange publiserte forskningsartikler ikke å rapportere kritiske innstillinger som trengs for å reprodusere de opprinnelige NTA-observasjonene. Få artikler rapporterer NTA-karakterisering av negative kontroller eller fortynningsmidler, noe som tydeligvis antar at kommersielt tilgjengelige produkter, som fosfatbufret saltvann eller ultrarent destillert vann, er partikkelfrie. På samme måte rapporteres positive kontroller eller størrelsesstandarder sjelden av forskere for å verifisere partikkelstørrelse. Stokes-Einstein-ligningen inneholder prøveviskositet og temperaturvariabler for å bestemme partikkelforskyvning. Rapportering av stabil laserkammertemperatur under hele prøvevideosamlingen er derfor et viktig kontrollmål for nøyaktig replikering. Filtrering av prøver eller fortynningsstoffer rapporteres heller ikke rutinemessig, og i så fall er spesifikasjonene til filteret (produsent, membranmateriale, porestørrelse) og lagringsforhold sjelden inkludert. International Society for Extracellular Vesicle (ISEV)s minimale standarder for akseptable eksperimentelle detaljer bør inneholde en veldokumentert NTA-protokoll for karakterisering av elbiler. Følgende eksperiment gir bevis på at en NTA-analyseprotokoll må etableres av den enkelte forsker og inkluderes i metodene for publikasjoner som bruker NTA-karakterisering som et av alternativene for å oppfylle MISEV2018-krav for enkelt vesicle karakterisering.

Introduction

Nøyaktig og repeterbar analyse av elbiler og andre nanometerskalerte partikler byr på mange utfordringer på tvers av forskning og industri. Replikering av EV-forskning har blant annet vært vanskelig på grunn av manglende ensartethet i rapportering av nødvendige parametere knyttet til datainnsamling. For å løse disse manglene foreslo ISEV bransjeretningslinjer som et minimalt sett med biokjemiske, biofysiske og funksjonelle standarder for EV-forskere og publiserte dem som en posisjonserklæring, ofte referert til som MISEV20141. Det akselererende tempoet i EV-forskningen krevde en oppdatert retningslinje, og "MISEV2018: a position statement of the ISEV" utvidet MISEV2014-retningslinjene2. MISEV2018-artikkelen inkluderte tabeller, disposisjoner av foreslåtte protokoller og trinn du må følge for å dokumentere spesifikk EV-tilknyttet karakterisering. Som et ytterligere tiltak for å legge til rette for tolkning og replikering av eksperimenter, ble EV-TRACK utviklet som en crowd-sourcing kunnskapsbase (http://evtrack.org) for å muliggjøre mer gjennomsiktig rapportering av EV-biologi og metodikken som brukes for publiserte resultater3. Til tross for disse anbefalingene for standardisert rapportering av metoder, fortsetter feltet å lide når det gjelder replikering og bekreftelse av publiserte resultater.

I henhold til National Institutes of Health's og National Science Foundations innsats for kvalitetskontrollverktøy, antyder dette dokumentet at ISEV krever standardisert rapportering av metoder og detaljer slik at datavurderingsverktøy kan brukes med mål om å replikere resultater mellom laboratorier. Rapportering av cellekilder, cellekulturprosedyrer og EV-isolasjonsmetoder er viktige faktorer for å definere kvalitetene til EV-befolkningen. Blant NTA-instrumenter gjør faktorer som deteksjonsinnstillinger, brytningsindeksen for bærervæske, heterogene partikkelpopulasjoner som bidrar til polydispersitet, mangel på standardiserte rapporteringskrav og fraværende intra- og interobservatørmålingsresultater NTA-sammenligning mellom laboratorier vanskelig eller umulig.

I bruk siden 2006 er NTA en populær metode for nanopartikkelstørrelse og konsentrasjonsbestemmelse som i dag brukes av omtrent 80% av EV-forskere4. MISEV2018-retningslinjene krever to former for enkelt vesicle-analyse, hvorav NTA er et av de populære alternativene. NTA fortsetter å være i vanlig bruk for EV-karakterisering på grunn av sin brede tilgjengelighet, lave kostnader per prøve og dens enkle grunnteori (Stokes-Einstein-ligningen). EV-vurdering fra NTA genererer en partikkelstørrelsesfordeling og konsentrasjonsestimat ved hjelp av laserlysspredning og Brownian bevegelsesanalyse, med den nedre grensen for deteksjon bestemt av den brytningsindeksen til EV. Ved bruk av en væskeprøve av kjent viskositet og temperatur spores banene til ELBIL-ene for å bestemme deres gjennomsnittlige firkantede forskyvning i to dimensjoner. Dette gjør at partikkeldiffusjonskoeffisienten kan beregnes og omdannes til en sfæreekvivalent hydrodynamisk diameter ved en modifisert Stokes-Einstein-ligning 5,6,7. NTA's partikkel-til-partikkelanalyse har mindre interferens ved agglomerater eller større partikler i en heterogen populasjon av elbiler enn andre karakteriseringsmetoder7. Mens noen få større partikler har minimal innvirkning på størrelsesnøyaktigheten, resulterer tilstedeværelsen av jevne minuttmengder med store, høye lysspredningspartikler i en merkbar reduksjon i påvisning av mindre partikler på grunn av redusert programvare EV-deteksjon og sporing8. Som måleteknikk anses NTA generelt ikke å være partisk mot større partikler eller aggregater av partikler, men kan løse flere størrelser gjennom individuell partikkelanalyse9. På grunn av bruk av lysspredning av partikler, er en av begrensningene ved NTA-analyse at eventuelle partikler som støv, plast eller pulver med lignende brytning og størrelsesattributter sammenlignet med elbiler ikke kan skilles fra faktiske elbiler ved denne karakteriseringsmetoden.

NanoSight LM10 (nanopartikkelstørrelsesanalysator) og LM14 (lasermodul) har blitt solgt siden 2006, og selv om nyere modeller av dette instrumentet er utviklet, finnes denne modellen i mange kjerneanlegg og regnes som en pålitelig arbeidshest. Opplæring er nødvendig for å optimalisere NTA-innstillingene riktig for høyoppløselige målinger av størrelse og konsentrasjon. De to viktige innstillingene som trengs for optimale videoopptak er (1) kameranivået og (2) deteksjonsterskelen. Disse må angis av operatøren basert på utvalgets egenskaper. En av de viktigste begrensningene ved NTA-analyse er anbefalingen av prøvekonsentrasjoner mellom 107 og 109 partikler/ml, for å oppnå denne prøvefortynning kan være nødvendig10. Løsninger som brukes til fortynning, som fosfatbufret saltvann, 0,15 M saltvann eller ultrarent vann, er sjelden fri for partikler som er mindre enn 220 μm i størrelse, noe som kan påvirke NTA-målingene. NTA-karakterisering av løsningene som brukes til fortynning, bør utføres på samme kameranivå og deteksjonsterskel som nanopartikkelprøvene som analyseres. Størrelsen og konsentrasjonen av nanopartikler tilstede i fortynningsstoffer som brukes til EV-prøvefortynning er sjelden inkludert i publikasjoner som involverer NTA-analyse av elbiler.

Denne protokollen bruker NTA-analyse av syntetiske EV-lignende liposomer evaluert ved hjelp av utvalgte kameranivåer, deteksjonsterskler og mekanisk filtrering av prøvene for å analysere de systematiske effektene av kameranivå, deteksjonsterskel eller prøvefiltrering på NTA-datasettet. Liposomer ble syntetisert som beskrevet i Supplemental File S1. Syntetiske liposomer ble brukt i dette eksperimentet på grunn av deres størrelse ensartethet, fysiske egenskaper og stabilitet i lagring ved 4 °C. Selv om faktiske prøver av elbiler kunne ha blitt brukt, kan heterogeniteten og stabiliteten til elbiler under lagring ha komplisert denne studien og dens tolkning. Likheter i NTA-rapportene fra (A) liposomer og (B) elbiler tyder på at de systematiske effektene som avdekkes for liposomer i dette papiret, sannsynligvis også vil gjelde for EV-karakterisering (figur 1). Sammen støtter disse funnene forestillingen om at fullstendig rapportering av kritiske programvareinnstillinger og beskrivelsen av prøvebehandling, for eksempel fortynning, fortynning og filtrering, påvirker reproduserbarheten av NTA-data.

Formålet med dette dokumentet er å demonstrere at varierende NTA-innstillinger (temperatur, kameranivå og deteksjonsterskel) og prøvepreparering endrer resultatene som samles inn: systematiske, betydelige forskjeller i størrelse og konsentrasjon ble oppnådd. Siden NTA er et av de populære alternativene for å oppfylle MISEV2018-karakteriseringsspesifikasjonen, viser disse resultatene viktigheten av å rapportere prøvepreparering og NTA-innstillinger for å sikre reproduserbarhet.

Figure 1
Figur 1: Representative NTA-rapporter for å sammenligne liposomer med elbiler. (A) Liposomer: ufiltrert prøve karakterisert på NTA 12. (B) Elbiler: ufiltrert prøve karakterisert på NTA 26. Forkortelser: NTA = Nanopartikkelsporingsanalyse; Elbiler = ekstracellulære vesicles. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generelle retningslinjer for protokoller

  1. Vedlikehold mikroskopet på et luftbord eller i det minste på et vibrasjonsfritt bord. Sørg for at fremmede vibrasjoner (f.eks. fottapping på gulvet, berøring av bordet, dørlukkinger, laboratorietrafikk) holdes på et minimum.
  2. Still inn og vedlikehold temperaturen på lasermodulen ved konstant temperatur for alle videoopptak.
    MERK: Den valgte temperaturen var 25 °C fordi nanopartikkelstørrelsesanalysatoren ble kalibrert ved den temperaturen. Derfor er det viktig at alle brukere av instrumentet kjenner og bruker den kalibrerte temperaturen. Romtemperatur er ikke en akseptabel innstilling fordi den kan variere.
  3. Forsikre deg om at alle fortynningsstoffer, også kalt negative kontroller (f.eks. Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS), ultrarent destillert vann [DW]), alle er NTA-karakterisert ved hjelp av samme kameranivå og deteksjonsterskel som nanopartikkelprøvene som måles. Bruk karakterisert DPBS for spyling av lasermodulen og fortynning av prøver. Faktorkontaminanter i den negative kontrollen DPBS i prøveresultater hvis nivåene er signifikante.
  4. Oppbevar prøver ved 4 °C før evaluering, og frys dem aldri, da dette vil forringe liposomprøven. Varme prøver/standarder/fortynningsstoffer til romtemperatur i 30 min før analyse.
    MERK: Prøvehåndtering var spesifikk for materialet som undersøkes.
  5. Evaluer utvalg og standarder ved hjelp av Rask måling for å etablere en passende fortynning for å oppnå 107 til 109 partikler/ml (ca. 50 til 100 partikler/NTA-videoskjerm) som er fastslått å være optimale for NTA-analyser.
    MERK: Forfatterne har funnet ut at partikkelkonsentrasjoner i den høyere enden av dette området gir mer konsistente og reproduserbare resultater.
  6. Fyll ut alle gjeldende felt i Capture-boksen i kategorien SOP for både Hurtig- og Standard-målinger , inkludert fortynning og fortynningsmiddel som brukes.

2. Utarbeidelse av 50 nm og 100 nm størrelse kalibrering standarder

MERK: Se materialtabellen.

  1. 50 nm størrelse Overføring Standarder fortynnet 1:5,000
    1. Tilsett 2 μL av de 50 nm standardene til 9 998 μL 0,22 μm-filtrert 10 mM kaliumklorid (KCl)/0,03% Tween 20 i ultrarent DW i et to ganger skyllet konisk rør på 15 ml. Oppbevar den fortynnede 50 nm-standarden ved 4 °C i opptil ett år.
  2. 100 nm størrelse overføring standarder fortynnet 1:333
    1. Tilsett 30 μL av de 100 nm standardene til 9,970 μL 0,22 μm-filtrert 10 mM KCl / 0,03% Tween 20 i ultrapure DW i et to ganger skyllet konisk rør på 15 ml. Oppbevar den fortynnede 100 nm-standarden ved 4 °C i opptil ett år.

3. Rengjøring og montering av lasermodulen

  1. Kontroller lasermodulen og strømningscelledekselvinduene visuelt for riper eller ufullkommenheter.
    MERK: Hvis en av glassoverflatene er riper, kan bildebehandlingen bli påvirket.
  2. Rengjør begge glassflatene forsiktig med en linserenser og linsepapir av god kvalitet. Ikke bruk vevsservietter eller papirhåndklær på glassoverflater.
  3. Påse at O-ringtetningen sitter riktig i sporet på strømningscelledekselet før montering.
  4. Plasser strømningscelledekselet på lasermodulen, og sørg for at de elektriske kontaktene er i riktig retning. Plasser de 4 fjærbelastede tommelskruene gjennom strømningscelleplaten og sett inn gjengene i lasermodulen, men ikke stram individuelt.
  5. Legg jevnt trykk ned på strømningscelledekselet, stram tommelskruene jevnt på en vekslende diagonal måte til de sitter godt. Stram bare tommelskruene til de er fingertette. Ikke for anspent.
    MERK: Ujevn stramming av tommelskruene kan knekke lasermoduloverflaten. Nyere designede tommelskruer vil "bunne ut" ved riktig trykk, og unngå mulig overtenting.

4. Spyleprosedyre for lasermodulen før og mellom prøver

  1. Bruk en nyåpnet beholder med DPBS og aliquot i trippelskyllede 15 ml polypropylenrør. Påse at produkter som brukes til å skylle eller fortynne prøver er NTA-karakterisert før bruk (se trinn 1.3).
  2. Skyll to 1 ml tuberkulinsprøyter med glidelåsadaptere 3 ganger med 1 ml DPBS for å fjerne eventuelle svevestøvrester. Bruk en av portene som inndata, men bruk den konsekvent under eksperimentet. Ikke bruk større sprøyter på grunn av faren for å bryte sprøyteporter fra sprøytens økte vekt og størrelse.
  3. Fjern og kast stempelet fra 1st tuberculin sprøyten og sett det inn i den gjenværende porten for å fungere som et annullert fortynnings-/prøvereservoar.
    MERK: Hvis stempelet ikke fjernes, vil det føre til økt trykk i prøvekammeret og lekkasje rundt tetningen.
  4. Fyllden andre sprøyten med 1 ml DPBS og fest den til innløpsporten på strømningscelledekselet.
  5. Hold lasermodulen vippet med utløpssprøyteporten forhøyet slik at luften kan renses fra kammeret når DPBS injiseres sakte i lasermodulen.
  6. Skyll de resterende DPBS fra lasermodulen ved å injisere 1 ml luft i innløpsporten. Gjenta tømmingen 2 ganger til.
  7. Tøm lasermodulen så fullstendig som mulig etter siste spyling.
    MERK: Grundig, forsiktig spyling er nødvendig etter NTA-analyse av 50 nm-standarden, da disse partiklene vedvarer i lasermodulen. Lasermodulen er nå klar til bruk.

5. Plassering av lasermodulen på mikroskopstadiet

  1. Finn fokusjusteringsveiledningene for lasermodulen på mikroskopets arm (figur 2) og juster dem ved hjelp av fokusknappen.

Figure 2
Figur 2: Veiledning for justering av lasermodulfokus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Vendt mot mikroskopet, plasser lasermodulen i det rillede stadiet og skyv den forsiktig så langt som mulig til høyre.
    MERK: Hvis det gjøres nøye, vil justeringen og fokuspunktet være lettere å finne mellom prøvene.
  2. Slå på vippebryteren på laserkontrollboksen.

6. Fokusering og posisjonering av lasermodulen

MERK: Dette må utføres med væske i kammeret.

  1. Last inn NTA-programvaren (se materialtabellen) fra skrivebordet.
    MERK: Det kan oppstå en feil: "Temperatur H/W finnes ikke på COM3." Bare lukk og åpne programvaren på nytt for å fikse den.
  2. Klikk Start kamera under Opptak-fanen øverst til venstre. Hvis kameraet slås av automatisk etter 5 minutter, klikker du bare på Start kamera igjen for å starte det på nytt.
  3. I samme fane justerer du Kameranivå til 14 til 16 for å gjøre laserlinjen lysere og forenkle partikkelidentifikasjon og fokus.
  4. Omdiriger bildet fra kameraet til okularene ved å flytte den øverste glidebryteren på venstre side av hodestykket inn eller ut.
  5. Finn området med økt tetthet, ofte referert til som avtrykket. Midtstill og fokuser avtrykket loddrett i synsfeltet.
    MERK: Laserlinjen vil være til venstre for avtrykket. Mørkere rom kan bidra til å lette lokalisering av avtrykket og fokusere på laserlinjen.
  6. Midtstill laserlinjen i synsfeltet. flytt den øverste glidebryteren for å avlede lyset til kameraet som observert på dataskjermen.
    MERK: Laserlinjen som nå er synlig på skjermen, er et speilbilde av okularvisningen. venstre i okularene vil være rett på dataskjermen.
  7. Juster fokuset for å gjøre bildet av individuelle bevegelige partikler skarpere på skjermen med fokusknappen.
    MERK: På grunn av fokusdybden vil ikke alle partiklene være i fokus, noe som er akseptabelt. Selv partikler som er litt ute av fokus, vil bli fanget opp av kameraet og analysert av programvaren.

7. Lastestandarder/prøver/fortynningsmiddel inn i lasermodulen for NTA-analyse

  1. Trekk opp 1 ml standard/prøve/fortynningsmiddel i en skyllet 1 ml tuberkulinsprøyte og fest den til innløpsporten på strømningscelledekselet. Før stempelet frem til det er tydelig væske i den åpne sprøyten som er festet til utløpsporten.
  2. I kameravisningen flytter du til høyre for laserlinjen til et område med et jevnt antall partikler. Juster om nødvendig den vertikale retningen for å midtstille de horisontale lysbåndene. Fokuser på nytt til det høyeste antallet partikler er synlig. Påse at denne stillingen for alle påfølgende tiltak opprettholdes så nært som mulig.
  3. Juster kameranivået til det punktet at det mørke informasjonssymbolet blinker av og til øverst til høyre i kameravisningen.
    MERK: Dette bidrar til å sikre at et konsekvent valg av kameranivå gjøres på det minste følsomhetsnivået for hver datainnsamlingsserie.
    MERK: Kameranivået kan ikke endres under opptak.

8. Validering av kalibrering

MERK: Det anbefales å validere modulkalibreringen ved hjelp av størrelsesstandarder (se avsnitt 2) før prøveanalyse. Rutinemessig validering er nødvendig for å sikre nøyaktige målinger. I et flerbrukerlaboratorium kan individuelle brukerjusteringer av programvarekonfigurasjonsinnstillinger ved et uhell føre til unøyaktig datainnsamling. For kritisk datainnsamling handler daglig validering om god laboratoriepraksis. Den daglige reproduserbarheten av validering må inkluderes i de rapporterte resultatene. Vanligvis angis kalibrering av teknikeren og kan ikke justeres av den enkelte brukeren med mindre brukeren har administratortilgang. Dette forhindrer uautorisert rekonfigurering av enkeltbrukere.

  1. Varme fortynnede standarder (se avsnitt 2) til romtemperatur i 30 min.
  2. Virvel kort standardene og last deretter inn som beskrevet i avsnitt 7.
  3. Utfør utvalg nta som beskrevet i avsnitt 10 og registrer verdier for etterfølgende beregning av variasjonskoeffisienten, som skal være mindre enn 2 % hvis de er riktig kalibrert.

9. Optimalisering av prøvekonsentrasjon for NTA

MERK: Skjermen skal inneholde mellom 50 og 100 målbare partikler når kameranivået og prøvekonsentrasjonen justeres riktig. Hvis det er spørsmål om en prøve har et passende partikkelnummer, kan en hurtigmåling kjøres på prøven på dette tidspunktet (se trinn 9.1 til 9.7). Den brukes til å vurdere prøveegenskapene raskt før lengre videoopptak. Hurtigmåling-fanen finnes i SOP-fanen i den nederste midtboksen.

  1. Sett Opptaksvarighet til 30 s.
  2. Godta det eksisterende basisfilnavnet, eller skriv inn et nytt filnavn ved å klikke kategorien ... for et nytt lagringsområde for genererte data.
  3. Merk av i boksen for Måltemperatur og angi ønsket temperatur.
  4. Last inn eksemplet som beskrevet tidligere (trinn 7.1), og klikk Opprett og kjør skript.
  5. Vent til antall partikler per bilde vises nederst til høyre på videoskjermen etter at videoen på 30-tallet er fullført. Hvis antall partikler er større enn 100, skyll lasermodulen 3 ganger (som tidligere beskrevet i trinn 4.6).
  6. Fortynn prøven til ønsket konsentrasjonsområde ved hjelp av det karakteriserte fortynningsmiddelet.
  7. Legg den riktig fortynnede prøven inn i den skyllede lasermodulen og kjør hurtigmålingen for å bekrefte at prøven er innenfor det akseptable området.

10. Prøve NTA

MERK: Kategorien Standardmåling er i SOP-fanen nederst i midtboksen og brukes til rutinemessig prøveanalyse (se trinn 10.1 til 10.12).

  1. Sett varigheten til 30 eller 60 s og antall videoer til 5.
  2. Godta det eksisterende basisfilnavnet, eller skriv inn et nytt filnavn ved å klikke kategorien ... for et nytt lagringsområde for genererte data.
  3. Merk av i boksen for Måltemperatur og angi ønsket temperatur.
  4. Klikk Opprett skript for å bruke dette standardmålet på nytt.
  5. Når eksemplet er lastet inn som beskrevet i del 7 og eksperimentet er klart til å kjøres, klikker du Opprett og kjør skript.
  6. Fyll ut feltene i popup-skjermbildet Angi rapportdetaljer med informasjon om operatoren, eksempelbeskrivelse, fortynning av prøven og fortynningsmiddel som brukes.
    MERK: Denne informasjonen vil bli registrert og skrevet ut på den endelige eksperimentelle rapporten.
  7. Når alle ønskede felt er fylt ut, klikker du OK for å starte skriptet.
    MERK: Hvis Måltemperatur ble valgt, vil varmeapparatet stabilisere prøven i lasermodulen til ønsket temperatur i 5 s før skriptet kan fortsette med målingen. Diagnosepanelet nederst til venstre på skjermen vil lese HEATER ON og vise temperaturen på prøven.
  8. Før hver videoopptak, se etter en melding om å flytte stempelet manuelt. Injiser ~0,05 ml av prøven i laserkammeret og la partiklene komme til "hvile" (dvs. ikke flyter), og klikk deretter OK.
  9. Vent til en innstillingsbekreftelsesboks vises når denfemte videoopptaket er fullført, og at Prosess-boksen skal blinke. Angi deteksjonsterskelen for behandling av prøven ved å merke antall blå kryss som markerer partikler på skjermen når delbildene fremskyndes manuelt fra bunnen av videoskjermen. Hvis det er mer enn 3-4 blå kryss som markerer partikler på hver skjerm etter hvert som rammene er avanserte, øker du deteksjonsterskelen.
    MERK: De blå kryssene på de enkelte partiklene er analoge med "sverm"-effekten i strømningscytometri og bør minimeres for optimal nøyaktighet og reproduserbarhet av datainnsamling.
  10. Klikk Innstillinger OK når terskelverdien for gjenkjenning godtas.
  11. Vent til videoene behandles automatisk, og et histogram med resultater og en dialogboksvarsling om fullføring som skal vises før du klikker OK.
  12. Når boksen Eksporter innstillinger vises, lagrer du resultatene ved å klikke Eksporter.
    MERK: Alle resultater fra videoer og analyser lagres i destinasjonsfilen som er definert i trinn 10.2. Dette krever mye lagringsplass. Overvåk og overfør til en sekundær lagringsenhet etter behov.

11. Reanalyse av gjeldende utvalg ved ulike deteksjonsterskler

MERK: Umiddelbart etter NTA-analyse (trinn 10) kan dataene analyseres på nytt ved hjelp av forskjellige terskelinnstillinger for deteksjon. Kameranivået kan imidlertid ikke endres etter innspilling.

  1. Fremhev alle de 5 innspillingsvideoene som er oppført i det nåværende eksperimentet.
  2. Klikk Behandle valgte filer, og vent til innstillingsbekreftelsesboksen vises, og Behandle-boksen for å blinke for å endre gjenkjenningsterskelen.
  3. Juster deteksjonsterskelen til ønsket nivå, og klikk på Innstilling OK.
  4. Vent til videoene behandles automatisk, og et histogram med resultater og en dialogboksvarsling om fullføring som skal vises før du klikker OK.
  5. Klikk Eksporter innstillinger. Når flere evalueringer utføres i det nyeste eksemplet, må du passe på å klikke Eksporter resultater -boksen i boksen Gjeldende eksperiment fordi popup-vinduet Eksporter resultater ikke vises etter eksemplet på nytt.
    MERK: Siden det ikke er noen påminnelser om å gjøre dette, kan det lett overses, og analysen vil gå tapt. De underliggende dataene vil imidlertid forbli og kan bli reanalysert senere.

12. Analyse av arkiverte filer

MERK: Hvis tidligere analyserte eksperimenter ikke er lagret eller ytterligere analyse må gjøres på disse prøvene, kan de enkelte filene lastes inn i NTA-programvaren på nytt for ytterligere Detection Threshold-evalueringer . Endringer på kameranivå kan ikke endres etter opptak.

  1. Last inn NTA-programvaren fra skrivebordet.
  2. Klikk kategorien Analyse i det nedre midtpanelet.
  3. Klikk Åpne eksperiment og naviger til ønsket NANO-fil.
    MERK: Videofilene som er knyttet til det valgte .nano-eksperimentet, må være i samme mappe som hovedeksperimentfilen; Hvis ikke, vises en feil når du prøver å behandle filene. De første 6 sifrene i filnavnet er datoen eksperimentet ble kjørt (xx-xx-xx). De siste 6 sifrene i filnavnet er tidspunktet da videoen ble spilt inn (xx-xx-xx) og den enkelte videoidentifikatoren. PDF-filen til hvert kombinert eksperiment viser de inkluderte NANO-filene for den analysen.
  4. Klikk Behandle valgte filer for å kjøre analysen.
  5. Når Prosess-boksen blinker for å tillate endringer i deteksjonsterskelen, setter du terskelen til ønsket nivå og klikker OK.
  6. Vent til videoene behandles automatisk, og et histogram med resultater og en dialogboksvarsling om fullføring som skal vises før du klikker OK.
  7. Klikk Eksporter resultater. Pass på at du klikker Eksporter resultater-boksen i gjeldende eksperiment, siden popup-boksen Eksporter resultater ikke vises etter ny analyse.
    MERK: Siden det ikke er noen påminnelser om å gjøre dette, kan det lett overses, og analysen vil gå tapt.

13. Rengjøring og demontering av lasermodulen

  1. Slå av laserkontrollboksen.
  2. Skyll hele prøven fra lasermodulen og kast den ordentlig.
  3. Hold lasermodulen vippet med den åpne sprøyteporten forhøyet slik at luften kan renses fra kammeret når DPBS injiseres sakte inn i lasermodulen og skylles fra utløpsprøyteporten.
  4. Skyll de resterende DPBS fra lasermodulen og kast den.
  5. Gjenta spylingen 2 ganger til, og tøm lasermodulen så fullstendig som mulig etter siste innspyling.
  6. Legg jevnt trykk ned på strømningscelledekselet, løsne tommelskruene jevnt på en vekslende diagonal måte til de løsnes fra tråder, fjern tommelskruene og oppbevar i lasermodulhuset.
  7. Fjern strømningscelledekselet fra lasermodulen.
  8. Rengjør begge glassflatene forsiktig med en linserenser og linsepapir av god kvalitet. Ikke bruk papir eller papirhåndklær på glassoverflater.
  9. Inspiser lasermodulen og strømningscelledekselet "vinduer" visuelt for riper eller ufullkommenheter etter bruk og rapporter til veilederen.
  10. Bytt ut lasermodulen og strømningscelledekselet i sine tilfeller for å forhindre skade på glassflater under lagring.

14. Protokoll for prøveanalyse

  1. Ufiltrerte eksempler
    1. Virvel prøven før lasting og ta opp 5 x 60 s videoer på kameranivå 12 og deteksjonsterskelnivå 3 som beskrevet ovenfor. Reanalyser disse videoene ved hjelp av Detection Thresholds 2 og 5.
    2. Gjenta videosamlinger med samme eksempel på kameranivå 13 og 14 og terskelnivå for gjenkjenning 3. Reanalyser disse to ekstra videoene ved hjelp av Detection Thresholds 2 og 5. Gjenta hele prosessen ved hjelp av 5 x 30 s videoer i SOP-innstillingen .
  2. Filtrerte eksempler
    1. Virvel prøven og last den samtidig inn og filtrer den (0,22 μm sprøytefilter) direkte inn i lasermodulen.
      MERK: Sprøytefilteret ble skyllet med 2 ganger volumet av filterets døde rom før bruk for å fjerne eventuelle beboende partikler. Sprøytefiltrene (se materialtabellen) hadde et målt dødt rom på 0,5 ml og ble spylt med 1,0 ml av prøven før målingene. Legg merke til filtertypen i SOP-datafeltene . Det filtrerte eksemplet ble behandlet nøyaktig slik det er beskrevet for ufiltrerte prøver i trinn 14.1.

15. Statistisk analyse av NTA-resultater

  1. For analyse av hovedeffekter eller interaksjoner, utfør variansanalyse etter en kontroll av ANOVA-forutsetninger (normalitet, uimodal, homogenitet av varians). Bruk Kruskal-Wallis enveis ANOVA på rekker i tilfeller av svikt i ANOVA-forutsetninger.
  2. Etter retur av betydelige hovedeffekter, bruk Dunns metode for å utføre middeltesting for forhåndsplanlagte sammenligninger. Vurder en p-verdi på 0,05 for å være signifikant i tosidige tester.
    MERK: Datafiler som genereres her, er tilgjengelige fra forfatterne etter at en materialoverføringsavtale er fullført.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tabell 1 inneholder resultatene av NTA-videoene for liposomprøvene (18 filtrerte og 18 ufiltrerte) og et representativt DPBS-fortynningsmiddel. Sammenligninger på tvers av de to gruppene ble fullført uavhengig av kameranivå eller deteksjonsterskel i dette dokumentet. Filtrerte prøver hadde en gjennomsnittlig partikkeldiameter på 108,5 nm, en partikkelmodus på 86,2 nm og en konsentrasjon på 7,4 × 108 partikler/ml. Ufiltrerte prøver hadde derimot en gjennomsnittlig partikkeldiameter på 159,1 nm, en partikkelmodus på 105,7 nm og en konsentrasjon på 7,6 × 108 partikler/ml. Gjennomsnitts- og modusverdier for de filtrerte og ufiltrerte prøvene, uavhengig av kameranivå eller deteksjonsterskel, var statistisk signifikante (p < 0,05). Forskjeller i konsentrasjon mellom de filtrerte og ufiltrerte prøvene, uavhengig av kameranivå eller deteksjonsterskel, var ikke signifikante (p = 0,86).

Sammenligninger av filtrerte og ufiltrerte eksempler
Eksempel Cam Lev Det Thr Bety Gjennomsnittlig %CV St. Dev. Kons. × 108 St. Dev. × 107
Filtrert Ufiltrert Filtrert Ufiltrert Filtrert Ufiltrert Filtrert Ufiltrert Filtrert Ufiltrert
Liposome 12 3 138.3 162.1 55.5 47.5 76.7 77 3.2 6.48 1.74 3.16
Liposome 12 2 126.3 153.7 58.7 49.8 74.2 76.5 4.94 8.23 2.74 3.5
Liposome 12 5 155 172.2 51.8 45.6 80.3 78.6 1.91 5.05 1.02 2.9
Liposome 13 3 102.7 169 43.5 51.3 44.7 86.7 6.72 7.75 1.91 1.17
Liposome 13 2 95.8 161.4 43.3 52.7 41.5 85 10.3 9.7 1.61 1.83
Liposome 13 5 110.7 176.1 42.5 47.1 47 83 4.16 6.28 1.83 1.07
Liposome 14 3 98 147.6 42.4 43.8 41.6 64.6 10.6 8.56 2.4 1.66
Liposome 14 2 92.9 142.1 42.6 45.2 39.6 64.3 14.9 10.7 2.54 1.83
Liposome 14 5 103.8 153.8 41.1 42.6 42.7 65.5 7.42 7.02 2.37 1.51
Liposome 12 3 105.6 179.4 22.2 46.7 23.4 83.7 5.2 5.81 1.06 4.28
Liposome 12 2 100.3 170.8 24.3 49.1 24.4 83.8 7.76 7.39 1.61 4.41
Liposome 12 5 112 187.2 20.4 42.9 22.8 80.4 3.27 4.68 0.815 3.93
Liposome 13 3 99.8 153.3 23.4 52.1 23.4 79.8 7.19 7.34 3.37 1.5
Liposome 13 2 94.3 143.6 25.8 53.2 24.3 76.4 10.8 9.53 4.3 2.46
Liposome 13 5 106.8 162 21.3 49.4 22.7 80 4.64 5.76 2.63 1.01
Liposome 14 3 103.4 142.3 31.7 49.6 32.8 70.6 9.91 8.66 3.29 12.5
Liposome 14 2 97.8 136 33.3 51.4 32.6 69.9 13.8 11.5 2.98 15.7
Liposome 14 5 109.5 151.4 31.1 49.5 34 74.9 7.27 6.76 3.42 10.1
Gjennomsnitt 108.5 159.1 36.4 48.3 40.5 76.7 7.4 7.6 2.3 4.1

Tabell 1: Datatabell over innsamlede verdier, standardavvik og prosentvariasjonskoeffisient for filtrerte og ufiltrerte utvalg. Forkortelser: Cam Lev = kameranivå; Det Thr = deteksjonsterskel; CV = variasjonskoeffisient; St. Dev. = standardavvik; Kons. = konsentrasjon.

Når liposomets prøveresultater ble analysert etter deteksjonsterskel (2, 3, 5) og kameranivå (12, 13, 14), var ikke resultatene signifikante (figur 3). Det skal bemerkes at det bare var 3 evalueringer (n = 3) på hvert av disse individuelle nivåene. Denne lille utvalgsstørrelsen på hvert kameranivå og deteksjonsterskel bidro sannsynligvis til at mangelen på individuelle sammenligninger var betydelig. Men når deteksjonsterskelprøver (2, 3, 5) ble evaluert uavhengig av kameranivå på tvers av de filtrerte og ufiltrerte prøvene (n = 3), var både gjennomsnittsstørrelsen (figur 3A) og modusstørrelsen (figur 3B) signifikante (p < 0,05) forskjellige. Forskjellene mellom filtrerte og ufiltrerte utvalgskonsentrasjoner (figur 3C) var derimot ikke signifikant forskjellige.

Figure 3
Figur 3: Effekter av kameranivå og deteksjonsterskel på målt partikkelstørrelse og konsentrasjon av filtrerte og ufiltrerte prøver. Gjennomsnittlig (A) og modus (B) partikkelstørrelse ved kombinerte kameranivåer 12, 13, 14 da deteksjonsterskelen ble økt fra 2 til 3 til 5 (n = 3), noe som viser en betydelig reduksjon i partikkelstørrelsene til de filtrerte prøvene. Partikkelkonsentrasjoner (C) ved kombinerte kameranivåer 12, 13, 14 da deteksjonsterskelen ble økt fra 2 til 3 til 5) (n = 3), noe som viste en konsentrasjonsreduksjon da deteksjonsterskelen økte uten signifikant forskjell mellom filtrerte og ufiltrerte prøver. Gjennomsnittlig (D) og modus (E) partikkelstørrelse ved kombinerte deteksjonsterskler etter hvert som kameranivået økte fra 12 til 14 (n = 3), noe som viser en reduksjon i partikkelstørrelsen på de filtrerte prøvene. Partikkelkonsentrasjoner (F) ved kombinerte deteksjonsterskler etter hvert som kameranivåene økte fra 12 til 14 (n = 3), noe som viser en konsentrasjonsøkning ettersom kameranivået øker uten signifikante forskjeller mellom filtrerte og ufiltrerte prøver. Forkortelse: DT = deteksjonsterskel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Når de 3 kameranivåene (12, 13, 14) ble evaluert uavhengig av terskelnivået for deteksjon (n = 3), økte både gjennomsnittsstørrelsen (figur 3D) og modusstørrelsen (figur 3E) i de filtrerte prøvene. Prøvekonsentrasjonene viste en tendens til å øke etter hvert som kameranivået økte fra 12 til 14 (figur 3F). Forskjellene mellom filtrerte og ufiltrerte prøvekonsentrasjoner som ble evaluert på ulike kameranivåer, var ikke signifikant forskjellige.

Tilleggsfil 1: Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finnes flere metoder for å estimere størrelsen og konsentrasjonen av nanopartikler11. Disse inkluderer ensemblemetoder som genererer et størrelsesestimat fra en populasjon, inkludert dynamisk lysspredning (DLS), sentrifugalsedimentering og analyse-elektronmikroskopi på enkeltpartikkelnivå, NTA, mikroskopi og justerbar resistiv pulsmåling. Av disse er DLS og NTA mye brukt, ikke-ødeleggende størrelse og konsentrasjonsmålingsmetoder, basert på brownsk bevegelse i et ideelt medium. DLS er avhengig av spredning av lys og intensiteten er proporsjonal med kvadratet av partikkelvolumet. Dermed er DLS mer følsom enn NTA for tilstedeværelsen av store partikler, aggregater eller polydisperse populasjoner.

NTA beregner diffusjonskoeffisienten fra banelengden til individuelle partikler målt i påfølgende videorammer. Hovedbegrensningen til NTA er det smale spekteret av partikkelkonsentrasjon som den kan evaluere sammenlignet med DLS og andre målemetoder, slik at individuelle partikkelbanelengder må falle innenfor mikroskopets diffraksjonsgrense og sporingsprogramvarens evner. Ettersom DLS og NTA er avhengige av brownsk bevegelse, kan begge forventes å vise god størrelsesavtale i monodisperserte populasjoner; de divergerer når de evaluerer polydispersiske populasjoner og de med aggregater. Sistnevnte gjør DLS ubrukelig og øker NTA-partikkelstørrelsesestimatet betydelig12. NTA's mest kjente begrensning er at den krever mye lavere partikkelkonsentrasjon (eller større fortynning) enn andre målemetoder. Til tross for dette er NTA-karakterisering populær i nanomaterialer forskning. Fordi NTA-størrelse og konsentrasjonsestimater avhenger av en mer fortynnet populasjon, med definert temperatur, videoopptaksinnstillinger, inkludert opptakslengde, kameranivå, deteksjonsterskel og prøvefortynning for å være svært reproduserbar, fokuserer dette papiret på behovet for å rapportere disse for å generere reproduserbare resultater.

Dette dokumentet viser at bruk av en standardisert protokollaktivert replikering av resultater og at bruk av positive kontroller, for eksempel størrelsesstandarder, gir informasjon om maskinens kalibrering. Videre indikerte disse resultatene viktigheten av å rapportere lasermodulkammertemperatur, kameranivåer, deteksjonsterskel og filtrering (filtertype og størrelse). I motsetning er lasermodulkammertemperatur, fortynnings- og fortynningsfaktor like viktig for nøyaktige og reproduserbare resultater. Selv om verken MISEV2018 eller EV-TRACK spesifikt anbefaler inkludering av denne informasjonen, foreslår vi at inkluderingen av disse detaljene muliggjør uavhengig bekreftelse av publiserte resultater og legger robusthet til eksperimentell design.

Begrensninger ved bruk av lateksstørrelseskalibreringsstandarder for NTA-kalibrering i EV-analyse er anerkjent og inkluderer de kjente brytningsindeksforskjellene sammenlignet med lipid tolags nanopartikler av lignende størrelse. I dette dokumentet ble latexperler brukt til å bekrefte maskinkalibrering før målinger og ikke for å bestemme grensene for deteksjon. Liposomene har en membran som ligner på naturlig forekommende elbiler, og brytningsindeksen vil også være representativ for elbiler. Størrelsesstandardene, så vel som liposomprøvene, er monodisperserte populasjoner; Derfor vil deres størrelsesfordeling følge en gaussisk eller logg-normal distribusjon. Naturlige elbiler er polydisperse, og deres størrelsesfordeling vil følge en kraftlovfunksjon13.

Historisk rapporterer publikasjoner som bruker NTA-karakterisering inkonsekvent nødvendige detaljer for å duplisere forskningsresultatene. Muligheten til å reprodusere NTA-data er avhengig av muligheten til å duplisere innstillingene som brukes til å fange opp de opprinnelige dataene. Uten denne informasjonen vil reproduksjon av eksperimentelle resultater ved hjelp av NTA være ekstremt vanskelig. Med streng overholdelse av en angitt protokoll og publisering av innstillingsparametrene som brukes med NTA, kan nøyaktig replikering av resultatene oppnås. Følgende anbefalinger er laget for å forbedre konsistensen av nanopartikkelkarakterisering av størrelse, konsentrasjon, sammensetning og renhet ved hjelp av en nanopartikkelstørrelsesanalysator.

Kontroller først alltid kalibreringen av nanopartikkelstørrelsesanalysatoren ved hjelp av passende størrelsesstandarder, for eksempel lateksstørrelsesstandarder. Dette bør gjøres regelmessig og registreres i instrumentloggen og før analyse av kritiske prøver. For det andre bør alle justerbare parametere, for eksempel lasermodulkammertemperatur, kameranivåer og deteksjonsterskler, registreres for hver prøve i prøveloggfilen , og det samme bør fortynning og fortynning brukes. Disse parameterne bør rapporteres fordi de er operatøravhengige og påvirker NTA-målinger. For det tredje må fortynningsstoffer som brukes til prøvefortynning karakteriseres for nanopartikkelinnhold og rapporteres. Fortynningsmiddelene som brukes til individuelle nanopartikkelprøver, må evalueres ved hjelp av samme kameranivå og deteksjonsterskelinnstillinger som de som brukes til den fortynnede prøven. For det fjerde bør sprøytefiltre skylles med to ganger det døde romvolumet før datainnsamling eller prøveprepareringstrinn for å skylle de mange partiklene som gjenstår fra produksjonsprosessen. For det femte bør konsentrasjonen av nanopartiklene i prøven justeres til innenfor de foreslåtte optimale 1,0 × 107 til 1,0 × 109 per ml.

Ved å anerkjenne de ovenfor beskrevne begrensningene i denne studien, viser vi at både størrelses- og konsentrasjonsverdiene oppnådd av NTA kan påvirkes av NTA-parametere, for eksempel kameranivåer og deteksjonsterskler, og at størrelsen, men ikke konsentrasjonen, kan påvirkes av prøvepreparering. Dette driver hjem den kritiske betydningen av å rapportere disse parametrene i nanomateriale- og EV-litteratur, slik at produksjon av robust, reproduserbar litteratur slik at vi systematisk kan undersøke effekten av EV-kilde, isolasjon og andre eksperimentelle variabler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen av forfatterne har noen interessekonflikter.

Acknowledgments

Arbeidet ble støttet av staten Kansas til Midwest Institute for Comparative Stem Cell Biology (MICSCB), Johnson Cancer Research Center til MLW og NIH R21AG066488 til LKC. OLS mottok GRA-støtte fra MICSCB. Forfatterne takker Dr. Santosh Aryal for å ha gitt liposomene som brukes i dette prosjektet og medlemmene av Weiss- og Christenson-laboratoriene for nyttige samtaler og tilbakemeldinger. Dr. Hong Han er takket for teknisk støtte. MLW takker Betti Goren Weiss for hennes støtte og råd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automatic Pipetter
Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL Thermo Sci. 339650
Kimwipes
Lens Cleaner
Lens Paper
NanoSight LM-10 Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 Laser Module Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2 Malvern Panalytical
Paper Towels
Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding BioExpress P -3243-200X
Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile BioExpress P-3243-1250
Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg) Gibco 14190-144
Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL) Malvern NTA4088
Standards, Latex Transfer- 50 nm  (3 mL) Malvern NTA4087
Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile Fisher brand 09-720-004
Syringe, TB, 1 mL, slip tip Becton Dickinson 309659
Waste fluid container

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  2. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  3. Consortium, E. -T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  4. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
  5. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  6. Danaei, M., et al. Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems. Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).
  7. Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles. Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).
  8. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
  9. Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).
  10. Malvern analytical Ltd. NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).
  11. Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly. Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).
  12. Gollwitzer, C., et al. A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium. Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).
  13. vander Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).

Tags

Bioingeniør utgave 177
Forbedre reproduserbarheten for å møte minimal informasjon for studier av ekstracellulære vesicles 2018 retningslinjer i nanopartikkelsporingsanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Snyder, O. L., Campbell, A. W.,… More

Snyder, O. L., Campbell, A. W., Christenson, L. K., Weiss, M. L. Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis. J. Vis. Exp. (177), e63059, doi:10.3791/63059 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter