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Biology

माउस प्राथमिक जिगर Sinusoidal endothelial कोशिकाओं के अलगाव और लक्षण वर्णन

Published: December 16, 2021 doi: 10.3791/63062
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Division of Gastroenterology & Hepatology, Mayo Clinic, 2Division of Pediatric Gastroenterology, Mayo Clinic

Summary

यहां हम प्राथमिक माउस लिवर साइनसोइडल एंडोथेलियल सेल (एलएसईसी) अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा और प्रदर्शन करते हैं। प्रोटोकॉल जिगर कोलेजनेस परफ्यूजन, कम गति centrifugation द्वारा nonparenchymal सेल शुद्धिकरण, और CD146 चुंबकीय मनका चयन पर आधारित है। हम प्रवाह साइटोमेट्री और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इन पृथक एलएसईसी को भी फेनोटाइप और विशेषता देते हैं।

Abstract

जिगर sinusoidal endothelial कोशिकाओं (LSECs) परिसंचरण और जिगर पैरेन्काइमा के बीच इंटरफ़ेस पर स्थित विशेष एंडोथेलियल कोशिकाएं हैं। LSECs में एक अलग आकृति विज्ञान होता है जो फेनेस्ट्री की उपस्थिति और तहखाने झिल्ली की अनुपस्थिति की विशेषता है। LSECs जिगर में कई रोग संबंधी विकारों में आवश्यक भूमिका निभाते हैं, जिसमें चयापचय विकृति, सूजन, फाइब्रोसिस, एंजियोजेनेसिस और कार्सिनोजेनेसिस शामिल हैं। हालांकि, LSECs के अलगाव और लक्षण वर्णन के बारे में बहुत कम प्रकाशित किया गया है। यहां, यह प्रोटोकॉल स्वस्थ और गैर-अल्कोहलिक फैटी लिवर रोग (एनएएफएलडी) चूहों दोनों से एलएसईसी के अलगाव पर चर्चा करता है। प्रोटोकॉल माउस जिगर के कोलेजनेस परफ्यूजन और चुंबकीय मोतियों LSECs को शुद्ध करने के लिए nonparenchymal कोशिकाओं के सकारात्मक चयन पर आधारित है। यह अध्ययन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विशिष्ट मार्करों का उपयोग करके एलएसईसी की विशेषता है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी को स्कैन करके विशेषता फेनोटाइपिक विशेषताओं की पहचान करता है। इस प्रोटोकॉल के बाद अलग-थलग किए गए LSECs का उपयोग कार्यात्मक अध्ययनों के लिए किया जा सकता है, जिसमें आसंजन और पारगम्यता assays शामिल हैं, साथ ही साथ ब्याज के एक विशेष मार्ग के लिए डाउनस्ट्रीम अध्ययन भी शामिल हैं। इसके अलावा, इन LSECs को व्यक्तिगत रूप से पूल या उपयोग किया जा सकता है, जिससे आरएनए-सेक बल्क या एकल सेल, प्रोटिओमिक या फॉस्फो-प्रोटिओमिक्स सहित मल्टी-ओमिक्स डेटा पीढ़ी की अनुमति मिलती है, और ट्रांसपोसेज-सुलभ क्रोमैटिन के लिए परख अनुक्रमण (ATAC-seq) का उपयोग करके, दूसरों के बीच। यह प्रोटोकॉल स्वास्थ्य और बीमारी में अन्य यकृत कोशिकाओं के साथ एलएसईसी के संचार का अध्ययन करने वाले जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी होगा और तीव्र और पुरानी जिगर की चोट के रोगजनक तंत्र में एलएसईसी की भूमिका की गहराई से समझ की अनुमति देगा।

Introduction

जिगर sinusoidal endothelial कोशिकाओं (LSECs) यकृत sinusoid दीवारों लाइन और जिगर1 में सबसे प्रचुर मात्रा में nonparenchymal कोशिकाओं रहे हैं. LSECs को शरीर में कहीं और अन्य केशिका एंडोथेलियल कोशिकाओं से फेनेस्ट्रा की उपस्थिति और शास्त्रीय तहखाने झिल्ली या डायाफ्राम 2,3 की कमी से अलग किया जाता है। इसलिए, LSECs में विशिष्ट फेनोटाइपिक और संरचनात्मक विशेषताएं होती हैं जो लिपिड और लिपोप्रोटीन सहित विभिन्न प्रकार के परिसंचारी मैक्रोमोलेक्यूल्स को खत्म करने के लिए उनकी पारगम्यता और एंडोसाइटिक क्षमता को बढ़ाती हैं। LSECs पैरेन्काइमल और nonparenchymal कोशिकाओं, जैसे ताराकार कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच crosstalk में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। LSECs एक quiescent स्थिति4 में ताराकार कोशिकाओं और Kupffer कोशिकाओं को रखने के द्वारा जिगर होमोस्टैसिस को बनाए रखने में महत्वपूर्ण हैं। LSECs आसंजन की मध्यस्थता और ट्रांस-एंडोथेलियल माइग्रेशन के द्वारा यकृत प्रतिरक्षा कोशिकाओं की आबादी की संरचना को संशोधित करते हैं ल्यूकोसाइट्स 5,6 परिसंचारी। तीव्र और पुरानी जिगर की चोट7 के दौरान, ischemia-reperfusion चोट (IRI)8, nonalcoholic steatohepatitis (NASH)9, और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (HCC) सहित, LSECs फेनोटाइपिक परिवर्तनों से गुजरते हैं जिन्हें कैपिलेराइजेशन के रूप में जाना जाता है, जो डेफेनेस्ट्रेशन और तहखाने झिल्ली के गठन की विशेषताहै। LSECs में ये फेनोटाइपिक परिवर्तन LSECs की शिथिलता और प्रोथ्रोम्बोटिक, प्रोइंफ्लेमेटरी और प्रोबिर्ोजेनिक गुणों के अधिग्रहण से जुड़े हैं।

माउस जिगर से LSECs के अलगाव के लिए कई तरीकों को विकसित किया गया है11. कुछ तकनीकें गैर-पैरेन्काइमल और पैरेन्काइमल कोशिकाओं को अलग करने पर निर्भर करती हैं, जिसके बाद घनत्व ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन होता है ताकि गैर-पैरेन्काइमल अंशों से एलएसईसी को शुद्ध किया जा सके। इस विधि की सीमा LSECs अलगाव के अंतिम चरणों में दूषित मैक्रोफेज की उपस्थिति है, जो पृथक LSECs12 की शुद्धता को प्रभावित कर सकती है। यह प्रोटोकॉल माउस जिगर के कोलेजेनेस परफ्यूजन और CD146 + चुंबकीय मोतियों LSECs को शुद्ध करने के लिए nonparenchymal कोशिकाओं के सकारात्मक चयन पर आधारित है। इस विधि का उपयोग करके अलग किए गए LSECs उच्च शुद्धता और संरक्षित आकृति विज्ञान और व्यवहार्यता दिखाते हैं। ये LSECs कार्यात्मक अध्ययन के लिए इष्टतम हैं, जिसमें पारगम्यता और आसंजन परख शामिल है, साथ ही साथ ब्याज के मार्गों के लिए डाउनस्ट्रीम अध्ययन भी शामिल हैं। इसके अलावा, नैदानिक अनुसंधान और खोज विज्ञान दोनों में बड़े डेटासेट उत्पन्न करने में बढ़ती रुचि के साथ, इन उच्च गुणवत्ता वाले LSECs को गैर-अल्कोहलिक स्टीटोहेपेटाइटिस (NASH) या अन्य स्थितियों के साथ स्वस्थ और रोगग्रस्त जिगर दोनों से अलग किया जा सकता है, जिन्हें व्यक्तिगत रूप से पूल या उपयोग किया जा सकता है, जिससे बहु-ओमिक्स डेटा पीढ़ी और स्वास्थ्य और रोग के बीच तुलना13,14 हो सकती है। . इसके अलावा, अलग-थलग एलएसईसी को दो-आयामी और साथ ही तीन-आयामी इन विट्रो मॉडल विकसित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है जैसे कि ऑर्गेनोइड्स एलएसईसी में सक्रिय सिग्नलिंग मार्ग और विभिन्न हानिकारक उत्तेजनाओं के तहत अन्य यकृत कोशिकाओं के साथ उनके अंतरकोशिकीय संचार को समझने के लिए और विभिन्न चिकित्सीय हस्तक्षेपों के जवाब में।

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Protocol

पशु प्रोटोकॉल मेयो क्लिनिक की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित के रूप में आयोजित किए गए थे। आठ सप्ताह पुराने C57BL / 6J पुरुष चूहों को जैक्सन प्रयोगशाला से खरीदा गया था। चूहों को आहार तक मुफ्त पहुंच के साथ तापमान-नियंत्रित 12: 12-एच प्रकाश-अंधेरे चक्र सुविधा में रखा गया था।

1. कोलेजन लेपित संस्कृति पकवान या प्लेट की तैयारी

  1. 0.02 mol/L एसिटिक एसिड के 50 mL बनाने के लिए, H2O के 49.4 mL में 0.6 mL ग्लेशियल एसिटिक एसिड जोड़ें।
  2. 0.02 mol/L एसिटिक एसिड में 50 μg/mL कोलेजन प्रकार I बनाएं। तनुकरण बहुत की एकाग्रता पर निर्भर करता है।
  3. कोलेजन समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ कोट 10 सेमी संस्कृति व्यंजन। कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: संस्कृति के लिए एक अलग डिश या प्लेट का उपयोग करते समय, कोटिंग समाधान की मात्रा को संस्कृति क्षेत्र के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता होती है, आमतौर पर 6-10 μg / सेमी2 का उपयोग करें।
  4. लेपित सतह से अतिरिक्त तरल पदार्थ निकालें, और फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के साथ 3 बार धोएं। व्यंजनों को सूखने दें।
  5. यदि कोलेजन समाधान बाँझ नहीं है, तो एक बाँझ ऊतक संस्कृति हुड में 10 मिनट के लिए पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के संपर्क में आकर कोलेजन-लेपित व्यंजनों को निष्फल करें।

2. उपकरण सेटअप

  1. चित्र 1B में दिखाए गए अनुसार गर्म और humidified recirculating परफ्यूजन उपकरण सेट करें।
  2. 5 मिनट के लिए 10% ब्लीच का उपयोग करके परफ्यूजन सिस्टम को कुल्ला करें, इसके बाद एक और 10 मिनट के लिए बाँझ पानी।
  3. कोलेजेनेस समाधान perfusing से पहले जितना संभव हो सके रिंसिंग तरल नाली।
  4. परफ्यूजन सिस्टम के माध्यम से कोलेजनेस समाधान को शामिल करें (जैसा कि चित्र 1 बी में दिखाया गया है) इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीवार्म करने के लिए। गति नियंत्रण डायल (40 mL / मिनट के बराबर) पर दिखाए गए के रूप में गति 1 पर पंप दर सेट करें।
  5. इस गति को पूरी प्रक्रिया के दौरान समान रखें। LSEC अलगाव के दिन के दौरान एक बंद सर्किट में चलाने वाले कोलेजनेस समाधान का पुन: उपयोग करें।
    नोट: पंप की गति 1 पर तय की गई है यांत्रिक दबाव से बचने के लिए जो LSECs जैविक स्थिति को परेशान कर सकती है।

3. सर्जिकल प्रक्रिया

  1. माउस का वजन करें।
  2. केटामाइन के 90 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन और xylazine intraperitoneally (आईपी) के 10 मिलीग्राम / किग्रा बॉडीवेट इंजेक्ट करें।
  3. एक बार माउस दर्दनाक उत्तेजनाओं के लिए nonreactive है, सर्जिकल सतह के लिए माउस सुरक्षित है, जैसा कि चित्रा 1 बी में दिखाया गया है।
  4. माउस पेट को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, पेट के निचले हिस्से से लेकर xiphoid प्रक्रिया तक ~ 5 सेमी लंबा चीरा बनाएं।
  5. इसके बाद, पेट के अंगों को पूरी तरह से उजागर करने के लिए पेट के प्रत्येक तरफ छोटे आईरिस कैंची का उपयोग करके दो पार्श्व कटौती करें।
  6. पेट को उठाने और समतल करने के लिए जानवर की पीठ के नीचे अंतःशिरा (IV) कैथेटर के म्यान को रखें।
  7. एक नियमित घुमावदार ड्रेसिंग संदंश का उपयोग करके, धीरे से आंतों और पेट को जानवर के बाईं ओर खींचें।
  8. उजागर बाएं गुर्दे के ठीक नीचे अवर वेना कावा (आईवीसी) के नीचे एक 5-0 सर्जिकल टांका रखें। सिवनी में एक ढीली अड़चन बांधें।
  9. हेपेटिक पोर्टल नस (पीवी) के चारों ओर एक और 5-0 सर्जिकल सीवन रखें, जो यकृत पीवी से स्प्लेनिक शिरा ब्रांचिंग पॉइंट के ठीक ऊपर है। सिवनी में एक ढीली अड़चन बांधें।
  10. तनाव के रूप में पीवी सीवन का उपयोग करते हुए, यकृत पीवी में 20 जी IV कैथेटर डालें 1 सेमी नीचे जहां यह दाएं और बाएं यकृत पीवी को शाखाएं।
  11. कैथेटर को शिरा के ऊपर स्लाइड करें लेकिन इसे ब्रांचिंग क्षेत्र के नीचे रखें। रक्त को कैथेटर के नीचे यात्रा करने की अनुमति दें जब तक कि यह बाहर निकलना शुरू न हो जाए।
  12. सर्जिकल क्षेत्र के ऊपर स्थित एक अंतःशिरा (IV) बोतल में कुछ बफर ए (तालिका 1) के साथ, एक IV लाइन का उपयोग करें, और इसे कैथेटर से संलग्न करें। सिस्टम में हवा के प्रवेश से बचने के दौरान इस समाधान के साथ जिगर फ्लश करें।
  13. गुर्दे के नीचे अवर वेना कावा के चारों ओर टांका बांधें। यह जिगर को रेट्रो परफ्यूज करने की अनुमति देगा।
  14. जानवर को खून बहने की अनुमति देने के लिए सीवन के नीचे आईवीसी को काटें।
    नोट:: यह चरण जिगर की भीड़ से बचने के लिए जल्दी से किया जाना चाहिए।
  15. पीवी टांका के साथ IV कैथेटर को सुरक्षित करें।
  16. एक बार परफ्यूजिंग के बाद, पेट, आंतों, प्लीहा और जिगर से जुड़े अन्य एन्ट्रेल को काट लें।
  17. वक्ष गुहा से डायाफ्राम और प्रमुख वाहिकाओं को काट लें। जिगर को जानवर से निकालें और इसे परफ्यूजन ट्रे पर रखें।
  18. ध्यान से चतुर्थ लाइन को हटाने और recirculating कक्ष में कोलेजनेस समाधान हुक.
    नोट: चरण 3.16-3.18 को 5 मिनट के भीतर करने की आवश्यकता है, इसलिए जिगर को बफर ए के साथ बहुत लंबे समय तक नहीं रोका जाएगा। जिगर में किसी भी हवा के बुलबुले की अनुमति न देने के लिए बहुत सावधान रहें।
  19. जिगर को तब तक फैलने की अनुमति दें जब तक कि कैप्सूल मोटा नहीं हो जाता है और mushy दिखाई देता है (10-15 मिनट या उससे अधिक, अवधि कोलेजनेज के विभिन्न बहुत सारे के आधार पर भिन्न होती है)।
  20. जबकि जिगर परफ्यूजन में है, सुनिश्चित करें कि जानवर एक necropsy बैग में इसे निपटाने से पहले मर गया है।
  21. एक बार पचने के बाद, कक्ष से जिगर को हटा दें और इसे सीरम-मुक्त डुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के लगभग 20 मिलीलीटर के साथ 10 सेमी पेट्री डिश में रखें।
  22. धीरे पिपेट युक्तियों की एक जोड़ी के साथ जिगर के अलावा उठाओ और पित्त के पेड़ को त्याग दें।
  23. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक 70 μm सेल छलनी के माध्यम से जिगर निलंबन फ़िल्टर।
  24. RT पर 2 मिनट के लिए 50 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। nonparenchymal यकृत कोशिकाओं वाले supernatant को इकट्ठा करें।
    नोट: हेपेटोसाइट्स को गोली में अवक्षेपित किया जाता है, जिसे ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके और शुद्ध किया जा सकता है जैसा कि पहले वर्णित15 था।

4. nonparenchymal यकृत कोशिकाओं और LSECs शुद्धिकरण का पृथक्करण

नोट: CD146 + LSECs immunomagnetic मोतियों का उपयोग कर शुद्ध, निर्माण के निर्देशों का पालन करते हुए.

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर supernatant सेंट्रीफ्यूज।
  2. सेल गोली ले लीजिए और अलगाव बफर (तालिका 1) के 1 मिलीलीटर में resuspend, निर्माता के निर्देशों का पालन एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर सेल संख्या निर्धारित करें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, supernatant को पूरी तरह से एस्पिरेट करें।
  4. 107 कुल कोशिकाओं प्रति अलगाव बफर के 90 μL के साथ गोली resuspend.
  5. CD146 चुंबकीय मोतियों के प्रति 107 कुल कोशिकाओं के 10 μL जोड़ें. अच्छी तरह से मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. कोशिकाओं को धोने के लिए, प्रति 107 कोशिकाओं में 1-2 मिलीलीटर अलगाव बफर जोड़ें, 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर supernatant को पूरी तरह से एस्पिरेट करें।
  7. अलगाव बफर के 500 μL में 109 कोशिकाओं तक पुन: निलंबित (तालिका 1).
    नोट:: उच्च कक्ष संख्याओं के लिए, तदनुसार बफ़र वॉल्यूम को स्केल करें।
  8. पृथक्करण स्तंभ तैयार करें, इसे अलगाव बफर के 3 एमएल के साथ कुल्ला करें।
  9. 70 μm पूर्व-पृथक्करण फ़िल्टर के साथ स्टैक किए गए स्तंभ पर सेल निलंबन लागू करें.
  10. अलगाव बफर के 3 मिलीलीटर के साथ कॉलम को 3 बार धोएं।
    नोट:: स्तंभ को धोते समय, जैसे ही स्तंभ जलाशय रिक्त है अलगाव बफ़र जोड़ा जाना चाहिए।
  11. विभाजक से स्तंभ को निकालें और इसे 15 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब पर रखें। पिपेट 5 एमएल अलगाव बफ़र के स्तंभ पर.
  12. चुंबकीय मोतियों लेबल कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं को बाहर निकालने के लिए स्तंभ में प्लंजर को दृढ़ता से धक्का दें।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज LSECs माइक्रोस्कोपिक परीक्षा और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए तैयार हैं।

5. प्रवाह cytometry द्वारा LSECs immunophenotyping और शुद्धता मूल्यांकन

  1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करके पृथक LSECs की कक्ष संख्या निर्धारित करें.
  2. 5 मिनट के लिए 300 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें, supernatant को पूरी तरह से एस्पिरेट करें।
  3. 1 x 106 कोशिकाओं / ट्यूब लें और धुंधला बफर के 90 μL के साथ resuspend (तालिका 1)।
  4. माउस FcR ब्लॉक के 10 μL / ट्यूब और व्यवहार्यता डाई के 1 μL जोड़ें, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. CD45, CD146, और stabilin-2 एंटीबॉडी के संयोजन के साथ कोशिकाओं को धुंधला बफर के साथ 1:50 पर पतला दाग। 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. 10 मिनट के लिए 300 x g पर धुंधला बफर और सेंट्रीफ्यूज के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोएं, फिर supernatant को पूरी तरह से एस्पिरेट करें।
  7. धुंधला बफर के 300 μL के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और प्रवाह साइटोमीटर के माध्यम से चलाएं।

6. LSECs संस्कृति और परीक्षा

  1. बीज 1 x 106 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक 6-अच्छी तरह से प्लेट में और इसे एंडोथेलियल कोशिकाओं के विकास माध्यम के साथ संस्कृति में 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% एंडोथेलियल कोशिकाओं के विकास पूरक, और 1% प्राइमोसिन समाधान शामिल हैं।
  2. प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा पृथक LSECs की जांच करें। एक 10x आवर्धन के साथ उज्ज्वल क्षेत्र छवियों का अधिग्रहण करें।

7. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा LSECs आकृति विज्ञान और fenestrae परीक्षा

  1. कोलेजन समाधान के साथ सेल संस्कृति आवेषण (3 μm ताकना आकार) पूर्व कोट.
  2. संस्कृति अलग LSECs (120,000 कोशिकाओं) 37 डिग्री सेल्सियस गर्म और humidified वातावरण में एक 24 अच्छी तरह से प्लेट में एंडोथेलियल कोशिकाओं के विकास माध्यम के साथ डालने पर. कोशिकाओं को बसने और 2 घंटे के लिए पालन करने की अनुमति दें।
  3. सेल निर्धारण के लिए, सेल संस्कृति मीडिया के लिए 37 डिग्री सेल्सियस ट्रम्प के फिक्सेटिव पर प्रीवॉर्म्ड की एक बराबर मात्रा जोड़ें।
  4. 10 मिनट के लिए इनक्यूबेशन के बाद, 50% पतला ट्रम्प के फिक्सेटिव को ट्रम्प के फिक्सेटिव के साथ अनड्यूलटेड ट्रम्प के फिक्सेटिव के साथ बदलें।
  5. 2 ज के लिए ट्रम्प फिक्सेटिव में कोशिकाओं को ठीक करें, फिर 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. नमूनों के निर्जलीकरण के साथ आगे बढ़ें, एक महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने वाले डिवाइस में सुखाने, बढ़ते, sputter कोटिंग, और एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके परीक्षा।

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Representative Results

प्रयोगात्मक schematics और उपकरण स्थापित:
इस प्रोटोकॉल में, माउस जिगर को एक बंद परफ्यूजन सर्किट का उपयोग करके पचाया गया था, फिर गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाओं और हेपेटोसाइट्स को 2 मिनट के लिए 50 x g पर कम गति सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया गया था। प्राथमिक LSECs को cd146 चुंबकीय मोतियों के चयन का उपयोग करके अलग किया गया था nonparenchymal अंश से। प्रयोगात्मक योजनाओं को चित्र 1A में दिखाया गया है। प्रवेशनी को पीवी के माध्यम से रखा गया था, जबकि अवर वेना कावा को जिगर के माध्यम से कोलेजेनेस के यूनिडायरेक्शनल परफ्यूजन को सुनिश्चित करने के लिए बांधा गया था (चित्रा 1 बी)। इन-हाउस परफ्यूजन चैंबर एक हीटिंग और ह्यूमिडिफिकेशन सिस्टम से सुसज्जित है ताकि 37-40 डिग्री सेल्सियस गर्म और ह्यूमिडिफाइड उपकरण हवा सुनिश्चित की जा सके। perfused कोलेजनेस एक बंद प्रणाली के माध्यम से प्रसारित होता है और अलगाव दिन के दौरान दो या तीन चूहों के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है ताकि अलगाव को अधिक लागत प्रभावी बनाया जा सके।

प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पृथक LSECs शुद्धता और सतह मार्करों का मूल्यांकन:
पृथक LSECs की शुद्धता का मूल्यांकन अच्छी तरह से विशिष्ट LSEC सतह मार्करों CD146 और stabilin-216,17,18 को नियोजित करके किया गया था। दाग कोशिकाओं का विश्लेषण एक प्रवाह साइटोमीटर पर किया गया था; FlowJo सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था।

LSEC जनसंख्या गेटेड (चित्रा 2A) और निम्नलिखित गेटिंग रणनीति के लिए singlets का विश्लेषण किया गया था; व्यवहार्य कोशिकाओं को विशिष्ट मार्करों (चित्रा 2 बी) के साथ कोशिकाओं को लेबल करने से पहले व्यवहार्यता डाई धुंधला का उपयोग करके परिभाषित किया गया था। फिर CD45- जनसंख्या को किसी भी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संदूषण को बाहर करने के लिए गेटेड किया गया था। पृथक LSECs 94.8% व्यवहार्यता (चित्रा 2C) तक पहुंच गया। CD45- कोशिकाओं का प्रतिशत 89.7% (चित्रा 2D) था, और 92.3% कोशिकाएं CD146 और stabilin-2 डबल-पॉजिटिव (CD45-CD146+stabilin-2+) LSECs (चित्रा 2E) थीं।

अलग LSECs की आकृति विज्ञान:
अलग-थलग LSECs को 1 x 10 6 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक6-अच्छी तरह से प्लेट में बीज दिया गया था, एक पूर्ण विकास माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था, और संस्कृति के 6 ज के बाद प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की गई थी (चित्रा 3 ए)। LSECs को इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) स्कैन करके LSECs fenestrae की कल्पना करने के लिए एक 3 μm रंध्र-आकार की संस्कृति सम्मिलित करने पर मढ़वाया गया था। निर्धारण और प्रसंस्करण के बाद, फेनेस्ट्री की पहचान की गई थी, जैसा कि चित्र 3 बी में दिखाया गया है। जैसा कि पहले बताया गया था, LSECs रातोंरात19 संस्कृति में अपने फेनेस्ट्रा को खो देते हैं; इसलिए, विट्रो में विभेदन से बचने के लिए डाउनस्ट्रीम अध्ययनों के लिए अलगाव के बाद जितनी जल्दी हो सके कोशिकाओं को संसाधित करने की सिफारिश की जाती है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक schematics और उपकरण स्थापित. (ए) प्रायोगिक योजनाओं को बायो रेंडर का उपयोग करके डिजाइन किया गया था। (बी) उपकरण सेटअप और प्रक्रिया। जिगर काटा गया था और एक बंद कोलेजनेस परफ्यूजन उपकरण में perfused. जिगर को तब एक डिश में स्थानांतरित कर दिया गया था और अलग कर दिया गया था। जिगर निलंबन एकत्र किया गया था। नॉनपैरेन्काइमल सेल अंश को 2 मिनट के लिए 50 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया गया था। LSECs को चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके शुद्ध किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पृथक LSECs शुद्धता और सतह मार्करों का मूल्यांकन। डेटा विश्लेषण और गेटिंग रणनीति जैसा कि दिखाया गया है, (ए) गेटेड एलएसईसी और (बी) फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) / साइड स्कैटर (एसएससी) के आधार पर सिंगल्स। अलग-थलग LSECs को एक व्यवहार्यता डाई और CD45, CD146, और stabilin-2 एंटीबॉडी के संयोजन के साथ दाग दिया गया था। Singlets गेटेड और विश्लेषण किया गया था, (सी) व्यवहार्य LSECs (डी) CD45 आबादी पर गेटेड थे और (ई) CD146 और stabilin-2 अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया गया था। सभी द्वारों को प्रतिदीप्ति माइनस वन (एफएमओ) द्वारा निर्धारित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: अलग-थलग LSECs की आकृति विज्ञान(A) सुसंस्कृत LSECs की उज्ज्वल क्षेत्र तस्वीर। पृथक LSECs को 6 h के लिए पूर्ण विकास माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था और प्रकाश माइक्रोस्कोपी (स्केल बार 100 μm) द्वारा जांच की गई थी। (बी) एलएसईसी की जांच स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) द्वारा की गई थी। सफेद तीर LSEC fenestrae (स्केल बार, बाएं पैनल 5 μm, दाएं पैनल 1 μm) का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

KRH स्टॉक समाधान (10x)
अभिकर्मकों एकाग्रता
NaCl 1.15 मीटर
HEPES (मुक्त एसिड) 0.2 मीटर
KCl 0.05 मीटर
KH2PO4 0.01 मीटर
बफ़र A
अभिकर्मकों एकाग्रता
KRH समाधान, PH = 7.4 1x
EGTA 0.5 mM
पीएच को 7.4 पर समायोजित करें, उपयोग करने से पहले 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
6 महीने तक कमरे के तापमान पर संग्रहीत।
बफर B
KRH समाधान, PH = 7.4 1x
CaCl2 1 mM
पीएच को 7.4 पर समायोजित करें, उपयोग करने से पहले 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
6 महीने तक कमरे के तापमान पर संग्रहीत।
कोलेजेनेस समाधान
अभिकर्मकों एकाग्रता
बफ़र B, PH = 7.4 125 mL
कोलेजेनेस 35-40 मिलीग्राम, 100 मिलीग्राम तक बीएसए जोड़ें
Percoll समाधान
अभिकर्मकों एकाग्रता
Percoll 22.5 मिलीलीटर
PBS (10x), PH = 7.4 2.5 mL
Isoaltion/
अभिकर्मकों एकाग्रता
MACS रिंसिंग बफर 1250 mL
बीएसए स्टॉक 125 mL

तालिका 1: बफ़र्स नुस्खा. तालिका में इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स और समाधानों की संरचना शामिल है।

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Discussion

वर्तमान पांडुलिपि में, हम माउस जिगर से LSEC अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसमें दो-चरणीय कोलेजनेज परफ्यूजन और बाद में चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल में निम्नलिखित तीन चरण होते हैं: (1) कैल्शियम-मुक्त बफर के साथ पीवी के माध्यम से परफ्यूजन के बाद जिगर सेल फैलाव प्राप्त करने के लिए एक कोलेजनेज युक्त बफर द्वारा पीछा किया जाता है; (2) कम गति सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ हेपेटोसाइट्स का बहिष्करण; और (3) MACS-आधारित गैर-समचतुर कोशिकाओं (NPCs) से LSECs का सकारात्मक चयन विरोधी CD146 चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर. पूरी प्रक्रिया 3 घंटे के भीतर पूरी की जा सकती है। इसके अलावा, इस प्रक्रिया के लिए लागत, सभी उपभोग्य आपूर्ति सहित, प्रति माउस लगभग 150 अमरीकी डालर है, यह सुझाव देते हुए कि एलएसईसी अलगाव की यह विधि समग्र कुशल और लागत प्रभावी है। हम प्राथमिक माउस हेपेटोसाइट्स के अलगाव के लिए चरणों (1) और (2) का उपयोग करते हैं, जो वर्तमान पांडुलिपि के दायरे से परे है।

पोर्टल कैनुलेशन और लिवर परफ्यूजन में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं: (i) कैथेटर पोजिशनिंग: कैथेटर टिप को एक वयस्क माउस के पीवी विभाजन के लिए 3 मिमी से कम डिस्टल नहीं रखा जाना चाहिए, जिसे आमतौर पर जिगर के हिलम में पहचाना जाता है। पीवी में कैथेटर टिप का गहरा प्लेसमेंट जिगर के कुछ लोबों के परफ्यूजन से समझौता करेगा। एक लोब का खराब परफ्यूजन लोब के रंग परिवर्तन की अनुपस्थिति के रूप में प्रकट होता है और इसे ठीक किया जा सकता है यदि दूरस्थ पीवी में कैथेटर की थोड़ी सी पुनर्स्थापना द्वारा तुरंत देखा जाता है। यह पैंतरेबाज़ी संभवतः लोब परफ्यूजन को अनुकूलित कर सकती है। (ii) एयर बुलबुले: पंप और पीवी के बीच जलसेक मार्ग को हवा के बुलबुले से पूरी तरह से मुक्त रखा जाना चाहिए। पीवी में मिनट हवा में प्रवेश एक हवा एम्बोलिज्म का कारण बन सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अपूर्ण जिगर परफ्यूजन होता है। आंतरिक सुई को हटाने के बाद कैथेटर में हवा को खत्म करने के लिए, बफर ए को कैथेटर से जलसेक लाइन को जोड़ने से पहले किसी भी हवा को निष्कासित करने के लिए बुलबुले के समीपस्थ एक सिरिंज के साथ इंजेक्ट किया जाता है। (iii) कोलेजेनेस ताकत: परफ्यूजन के दौरान कोलेजेनेस गतिविधि को बनाए रखने के लिए, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि पीवी में संक्रमित बफर बी में कोलेजेनेस और पीएच की सटीक एकाग्रता है और इसे लगभग 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया है। जैसा कि चित्रा 1 में दिखाया गया है, एक अनुकूलित कक्ष का उपयोग पूरे परफ्यूजन सिस्टम को 37 डिग्री सेल्सियस गर्म और ह्यूमिडिफाइड वातावरण में रखने के लिए किया जाता है; इसके अलावा, ऑक्सीजन की आपूर्ति पूर्ण पाचन प्राप्त करने के लिए कोलेजेनेस परफ्यूजन के दौरान बनाए रखी जाती है। एक वैकल्पिक विकल्प में कोलेजेनेस समाधान20 को पूर्व-गर्म करने के लिए एक पानी का स्नान शामिल है, और सीटू में एक खुली कोलेजेनेस परफ्यूजन प्रणाली जहां कोलेजेनेस समाधान कट आईवीसी21 के माध्यम से जिगर से बाहर निकलता है।

यद्यपि प्रोटोकॉल पर्याप्त परफ्यूजन प्रवाह को सुरक्षित करने के लिए अपेक्षाकृत बोल्ड कैथेटर (20 जी) का उपयोग करता है, एक पतला कैथेटर भी पिछली रिपोर्टों 22,23,24 के आधार पर अच्छी तरह से काम करेगा। हालांकि, कभी-कभी पीवी को सफलतापूर्वक कैनुलेट करना मुश्किल होता है, खासकर जब चूहों का उपयोग विशिष्ट रोग मॉडल के लिए किया जाता है या यदि उनके पास पीवी विसंगतियां हैं। यदि पीवी कैनुलेशन विफल रहता है, तो एक एंजाइम किट और कोमल ऊतक पृथक्करण का उपयोग करके यांत्रिक और एंजाइमेटिक यकृत पाचन गैर-पैरारेन्काइमल सेल (एनपीसी) निलंबन प्राप्त करने के लिए चरणों (1) और (2) के लिए एक वैकल्पिक विधि है। हमने पुष्टि की है कि जिगर परफ्यूजन के बिना पृथक्करण की इस वैकल्पिक विधि में सेल उपज और व्यवहार्यता मूल विधि (डेटा नहीं दिखाया गया है) के बराबर थी। जिगर पाचन के लिए पोर्टल शिरा परफ्यूजन दूसरों और हमें 13,16,20 द्वारा नियोजित किया गया है। इसके अलावा, यह विधि जिगर पाचन के दौरान यांत्रिक बल द्वारा प्रेरित LSECs फेनोटाइपिक या कार्यात्मक परिवर्तनों के सैद्धांतिक जोखिम से बचती है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में दर्शाए गए पीवी परफ्यूजन-आधारित विधि का उपयोग अब तक अत्यधिक अनुशंसित है।

यहां, वर्तमान प्रोटोकॉल को नियोजित करते समय इष्टतम LSEC उपज और शुद्धता दिखाई जाती है। हमने वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके आहार-प्रेरित NASH के साथ स्वस्थ चूहों और चूहों दोनों से प्रति माउस लगभग 2-5 x 106 कोशिकाएं प्राप्त कीं। शुद्धता के लिए, इम्यूनोमैग्नेटिक अलगाव (सीडी 146) के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही सतह मार्कर की सकारात्मकता हमारी अलगाव तकनीक की सटीकता का समर्थन करती है। इसके अलावा, कई अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त LSEC सतह मार्कर हैं, जैसे कि लसीका पोत एंडोथेलियल हाइलूरोनिक एसिड रिसेप्टर 1 (LYVE-1), CD32b, और stabilin-2। इन मार्करों के आसपास विवाद अभी भी मौजूद हैं; उदाहरण के लिए, i) LYVE-1 लसीका एंडोथेलियल कोशिकाओं में भी मौजूद है, और ii) एक पेरिपोर्टल क्षेत्र में LSECs में CD32b अभिव्यक्ति18 की कमी है। इस प्रकार, प्रवाह साइटोमेट्री के साथ इन पृथक एलएसईसी की शुद्धता की जांच करने के लिए, स्टैबिलिन -2 को सीडी 146 के अलावा एक स्थापित विशिष्ट एलएसईसी मार्कर के रूप में नियोजित किया गया था। इस पद्धति का उपयोग करते हुए, हमने पुष्टि की कि अलग-थलग LSECs में >94% व्यवहार्यता और >90% शुद्धता (चित्रा 2) थी। अलग-थलग कोशिकाओं के एलएसईसी-विशिष्ट फेनोटाइप को एसईएम का उपयोग करके आगे की पुष्टि की गई थी, जहां अधिकांश कोशिकाओं में फेनेस्ट्रे (चित्रा 3 बी) होता है, जो एलएसईसी की विशिष्ट रूपात्मक विशेषता है।

LSECs अलगाव पद्धतियों में से, immunomagnetic मोतियों का चयन तकनीक है जिसका उपयोग NPC अंश 24,25,26,27 से LSECs को अलग करने के लिए सबसे अधिक किया जाता है। इसके विपरीत, अन्य तरीकों में केन्द्रापसारक एल्यूट्रियेशन और चयनात्मक आसंजन-आधारित पृथक्करण 22,28,29 शामिल हैं। गैर-इम्युनोमैग्नेटिक विधियों को LSECs (लगभग 9 x 106 कोशिकाओं प्रति माउस) की उच्च पैदावार प्रदान करने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, अलग-थलग एलएसईसी की अपेक्षाकृत कम उपज वर्तमान प्रोटोकॉल की सीमा हो सकती है। दूसरी ओर, गैर-इम्युनोमैग्नेटिक चयन-आधारित विधियों को उच्च तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है और कभी-कभी सेल पैदावार और शुद्धता11 पर असंगत परिणाम दिखाते हैं, जबकि इम्यूनोमैग्नेटिक चयन-आधारित विधि अन्य मौजूदा तरीकों पर लगातार उपज और शुद्धता का लाभ रखती है। इसके अलावा, इम्यूनोमैग्नेटिक मोतियों के चयन-आधारित सेल अलगाव के लिए, उपयोग किए जाने वाले सेल सतह मार्करों की विशिष्टता हमेशा चिंता का विषय होती है। उदाहरण के लिए, CD31, जिसे पहले immunomagnetic LSEC पृथक्करण के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है, PV एंडोथेलियम और कैपिलरिज़्ड LSECs3 पर प्रमुख रूप से व्यक्त किया गया है। यद्यपि CD146 को प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं और यकृत ताराकार कोशिकाओं30,31 पर भी व्यक्त करने की सूचना दी गई है, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग किए गए LSECs की उच्च शुद्धता एंडोथेलियल मार्कर CD146 की विशिष्टता के बारे में चिंताओं को कम करती है। LSEC अलगाव के लिए विभिन्न तरीकों के पेशेवरों और विपक्षों की तुलना कहीं और 11,18,32 पर चर्चा की गई है। अन्य तरीकों और इस विधि के बीच सेल पैदावार और शुद्धता की तुलना वर्तमान पांडुलिपि के दायरे से परे है और भविष्य की जांच को वारंट करती है।

अंत में, हम सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले और स्वीकृत दृष्टिकोणों में से एक के आधार पर एक प्राथमिक माउस एलएसईसी अलगाव प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। पृथक LSECs उच्च शुद्धता और संरक्षित समारोह प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल कुशल है और स्वस्थ माउस जिगर के साथ-साथ विभिन्न रोग माउस मॉडल से जिगर पर भी लागू होता है। इन चूहों से उच्च गुणवत्ता वाले LSECs को multiomics डेटा सेट पीढ़ी13,14 के लिए नियोजित किया जा सकता है। इस प्रकार, यह दृष्टिकोण एलएसईसी के कार्य को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र की पहचान की सुविधा प्रदान करता है और स्वास्थ्य और बीमारी में जिगर में अंतरकोशिकीय संचार में उनकी भूमिकाओं की हमारी समझ में सुधार करता है।

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Disclosures

सभी लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज (1RO1DK122948 से SHI) और NIH Silvio O. Conte Digestive Diseases Research Core Centers P30 अनुदान तंत्र (DK084567) द्वारा समर्थित किया गया था। जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) ओवरसीज रिसर्च फैलोशिप द्वारा केएफ को भी सहायता प्रदान की गई थी। हम डॉ ग्रेगरी जे गोर्स और स्टीवन ब्रोंक को उनके मूल डिजाइन और कोलेजेनेस परफ्यूजन उपकरण के अनुकूलन के लिए भी स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0-inch 20 G Intra Venous (IV) catheter Terumo, SOmerset, NJ, USA SR-OX2051CA
2–3-inch perfuion tray with a hole in the center customized; made in house
405/520 viability dye Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany 130-110-205
4-inch regular curved dressing forceps Fisher Brand FS16-100-110
5-0 Perma-Hand silk suture Ethicon, Raritan, NJ, USA A182H
Anti-stabilin-2 (Mouse) mAb-Alexa Fluorà 488 MBL International, Woburn, MA, USA D317-A48
BSA stock Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany 130-091-376
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-mouse Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany 130-118-407
CD146 (LSEC) MicroBeads, mouse Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-007
Anti-CD45-Viogreen, anti-mouse Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany 130-110-803
Collagen type I Corning, Corning, NY, USA 354236
Collagenase II Gibco, Waltham, MA, USA 17101-015
Endothelial cells growth medium ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA 211-500
FcR blocking reagent, mouse Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-575
FlowJo software, version 10.6 Becton, Dickinson and Company
Hardened Fine scissors F.S.T, Foster city, CA, USA 14091-11
Heated (37 °C) and humidified recirculating perfusion apparatus equipped with Oxygen injection at a rate of 10psi. customized; made in house
Hitachi S 4700 scanning electron microscope Hitachi Inc, Pleasanton, CA, USA SEM096
LS columns Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-401
MACS pre-separation filters (70 μm) Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany 130-095-823
MACS rinsing buffer Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany 130-091-222
MACS Smart Strainer (70 μm) Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany 130-098-462
MACSQunt flow cytometer Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany
Millicell Cell Culture Insert Millipore Sigma, Burlington, MA, USA PITP01250
Nexcelom cell counter Nexcelom bioscience, Lawrence, MA, USA Cellometer Auto T4 Plus
Percoll GE Healthcare, Chicago, IL, USA 17-0891-01
Surgical scissors F.S.T, Foster city, CA, USA 14001-12
Very small curved dressing forceps F.S.T, Foster city, CA, USA 11063-07

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References

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जीवविज्ञान अंक 178 जिगर sinusoidal endothelial कोशिकाओं (LSECs) कोलेजनेस परफ्यूजन चुंबकीय मोती सकारात्मक चयन प्रवाह cytometry immunohistochemistry स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
माउस प्राथमिक जिगर Sinusoidal endothelial कोशिकाओं के अलगाव और लक्षण वर्णन
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Guo, Q., Furuta, K., Aly, A., Ibrahim, S. H. Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (178), e63062, doi:10.3791/63062 (2021).

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