Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Uracil-DNA Glycosylase בדיקה על ידי טיהור לייזר בסיוע מטריקס / יינון זמן טיסה ניתוח ספקטרומטריה מסה

Published: April 22, 2022 doi: 10.3791/63089
Automatic Translation
*1, *1,2, 3, 2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

שיטה לא מתויגת, לא רדיו-איזוטופית כדי לבדוק פעילות גליקוסילאז uracil-DNA פותחה באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF לניתוח מוצר ישיר apurinic / apyrimidinic המכיל אתרים. הבדיקה הוכיחה להיות די פשוט, ספציפי, מהיר, וקל לשימוש עבור מדידת גליקוזילאאז DNA.

Abstract

Uracil-DNA גליקוסילאז (UDG) הוא מרכיב מפתח במסלול תיקון כריתת הבסיס לתיקון של אורסיל שנוצר מ deamination הידרוליטי של ציטוזין. לכן, זה חיוני לתחזוקת שלמות הגנום. פותחה שיטה ספציפית מאוד, שאינה מתויגת, שאינה רדיו-איזוטופית, למדידת פעילות UDG. דופלקס דנ"א סינתטי המכיל אורסיל ספציפי לאתר נבקע על ידי UDG ולאחר מכן היה נתון לפירוק לייזר בסיוע מטריקס / יינון זמן טיסה ספקטרומטריה מסה (MALDI-TOF MS) ניתוח. הוקם פרוטוקול לשימור המוצר של האתר האפוריני/אפירימידיני (AP) בדנ"א ללא שבירת גדילים. השינוי בערך m/z מהמצע למוצר שימש להערכת הידרוליזת אורסיל על ידי UDG. מצע G:U שימש לניתוח קינטי של UDG שהניב את ה- Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/ s, ו- Kcat = 9.31 s-1. יישום של שיטה זו למעכב גליקוסילאז uracil (UGI) בדיקה הניבה ערך IC50 של 7.6 pM. הספציפיות של UDG באמצעות uracil בעמדות שונות בתוך מצעים DNA חד גדילי כפול תקוע כפול הדגים יעילות מחשוף שונה. לפיכך, שיטת MALDI-TOF MS פשוטה, מהירה ורב-תכליתית זו יכולה להיות שיטת התייחסות מצוינת לגליקוסילות DNA מונו-תעשייתיות שונות. יש לו גם את הפוטנציאל ככלי עבור DNA גליקוסילאז מעכב הקרנה.

Introduction

למרות uracil הוא בסיס נורמלי ב RNA, זה נגע נפוץ מאוד mutagenic מאוד בדנ"א גנומי. אורסיל יכול לנבוע מזיהום הידרוליטי ספונטני/אנזימטי של דיאוקסיציטדין. בכל תא חי, זיהום זה מתרחש 100-500 פעמים ביום בתנאים פיזיולוגיים1,2. אם שינויים אלה אינם מתוקנים, יכול להיות שינוי בהרכב רצף ה- DNA, גרימת מוטציה. כמו uracil ב- DNA מעדיף לזווג עם dATP במהלך השכפול, אם ציטוסין deaminates כדי uracil, בשני אירועי שכפול, תהיה מוטציה חדשה G:C כדי A:T מעבר במחצית DNA הצאצאים3.

בין האסטרטגיות התאיות לשמירה על יציבות גנטית, תיקון כריתת בסיס (BER) הוא מנגנון חיוני המתקנת בסיסים פגומים, כגון אורסיל, ב- DNA4. BER הוא תהליך שמור מאוד אבולוציונית. ישנם שני מסלולי BER כלליים: מסלול התיקון הקצר המוביל למערכת תיקון של נוקלאוטיד יחיד ומסלול התיקון הארוך המייצר מערכת תיקון של לפחות שני נוקלאוטידים5. BER הוא מנגנון מתואם המתרחש במספר שלבים. הצעד הראשון ב- BER הוא ההידרוליזה האנזימטית של בסיס הנוקלאוטיד הפגוע על ידי גליקוסילאז DNA ספציפי לנזק כדי ליצור אתר ביניים אפורני /אפירימידיני (AP)6. זה ואחריו המחשוף של עמוד השדרה סוכר-פוספט באתר AP על ידי אנדונוקלאז, ניקוי של ה- DNA מסתיים על ידי ליאז, מילוי פערים על ידי פולימראז DNA, ואיטום הניק הסופי על ידי ligase5.

גליקוסיל-DNA (UDG) עובר הידרוליזה של האורסיל מדנ"א המכיל אורסיל עבור BER באשריצ'יה קולי. בדיקות UDG קונבנציונליות באמצעות DNA עם תווית רדיואקטיבית הכוללות טכניקות הפרדה שונות6,7,8,9,10,11,11,12,13 הן בדרך כלל גוזלות זמן, דורשות עבודה אינטנסיבית, עתירות עבודה, עם ריאגנטים יקרים לתיוג, הליכים מסובכים, ודורש הכשרה ותרגול אינטנסיביים כדי להפחית את הסיכונים של חשיפה לחומרים רדיואקטיביים. בדיקות oligonucleotide פלואורומטריות פותחו כתחליף לתיוג רדיואיזוטופ14, בנוסף למשואות מולקולריות וטכנולוגיית העברת אנרגיה תהודה של Förster15,16,17,18,19,20. עם זאת, תיוג ספציפי נדרש עבור כל השיטות הנ"ל. לאחרונה פותחו ביו-סנסורים נטולי תוויות21,22,23 ושיטות צבע המבוססות על היווצרות של G-quadruplex24,25,26. עם זאת, זוגות A:U מרובים או רצפים שתוכננו במיוחד בבדיקות מסבכים את הגדרת יחידת האנזים.

מלדי-TOF טרשת נפוצה היא טכנולוגיה שיכולה להיות שימושית מאוד בניתוח DNA. יישומים שפותחו כוללים גנוטיפינג נוקלאוטיד יחיד-נוקלאוטיד27,28, ניתוח נוקלאוטיד שונה29, וזיהוי ביניים של תיקון DNA30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS צריך להיות מאומץ בקלות לניתוח גליקוסילאז DNA כדי לזהות מוצרי DNA המכילים אתר AP. עם זאת, אתרי AP בדנ"א נוטים להישבר בתנאים ניסיוניים רבים33. בדיקת UDG מוצגת כאן באמצעות MALDI-TOF MS כדי למדוד ישירות את הייצור באתר AP ללא רעש משמעותי של שבירת גדילים. שיטה זו ללא תוויות קלה לעבודה ויש לה פוטנציאל גבוה ליישום התרופות של הקרנת מעכבי גליקוזילאאז DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מצע/תבנית

  1. עיצוב מצע /תבנית דופלקס עם תוכן G+C מאוזן של ~ 50 ± 10% וטמפרטורת ההיתוך המינימלית של 50 °C (50 °F) עבור אזור הדופלקס.
    הערה: הבדל נוקלאוטיד אחד בין מצעים של 18 nt לבין תבניות 19 nt (טבלה 1 ואיור 1) מסייע לפרשנות טובה יותר של אותות טרשת נפוצה וחישול מתאים. גדיל התבנית משמש כ- DNA משלים ליצירת אי-התאמות A-U או G-U (טבלה 1) אך יכול לשמש גם כאות ייחוס במדידות MS. השימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים מטוהרים HPLC משביע רצון למחקר זה.
  2. להמיס DNA ב 1 mM EDTA ו 10 mM Tris-HCl (pH 8.0 ב 25 °C (TE) בריכוז של 100 מיקרומול / L כמו מלאי ולאחסן ב -20 °C (60 °F). דלל את מלאי 20 הμL הזה עם TE לנפח סופי של 800 μL (דילול של פי 25 ל-4 מיקרומול/ליטר). למדוד את הספיגה של פתרון ה- DNA בספקטרופוטומטר גלוי UV ב λ = 260 ננומטר כדי להבטיח את הריכוז שהוקצה ליצרן. לדוגמה: A260 = 0.204 עבור 4 מיקרומול / ליטר של U + 9 ו- A260 = 0.192 עבור 4 מיקרומול / L של T1 (טבלה 1).
  3. בצע ניתוח MALDI-TOF MS (סעיפים 4.6) עבור בקרת איכות oligonucleotide על-ידי בדיקת אותות שיא ייחודיים בערכי m/z ייעודיים וכן על-ידי בדיקה שיחס האות לרעש הוא >100 (איור 1B ואיור 1D).

2. בדיקת גליקוזילאאז DNA

  1. באמצעות מצע G:U של T1/U +9 דופלקס (טבלה 1 ואיור 1A) לתגובת הגליקוסילאז, לדוגמה, בצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל, הוסף 70 μL של H2O, 10 μL של מאגר תגובת UDG 10x, 5 μL של מלאי T1, ו 5 μL של מלאי U +9 (שלב 1.2.).
    הערה: בחר את הסוג הנכון של micropipette ובצע את הוראות היצרנים כדי לטפל באמצעי האחסון הנדרש. לדוגמה, השתמש פיפטה 2 μL לוותר 0.1-2 μL של נוזל, להשתמש פיפטה 10 μL לחלק 2-10 μL של נוזל, ולהשתמש 100 μL pipette לחלק 20-100 μL של נוזל כדי להבטיח דיוק ודיוק של התוצאות. הנפח המתואר של תערובת הריאגנט הוא עבור 10 בדיקות; כוונן את עוצמת הקול עבור מספר התגובות הרצוי. מאגר התגובה 1x UDG מכיל 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, ו 20 mM Tris-HCl (pH 8.0 ב 25 °C (25 °C). עיין בטבלת החומרים לקבלת המקור של מאגר תגובת UDG 10x.
  2. סגור את הצינור בצורה מאובטחת; דגירה באמבט מים במשך 30 דקות ב 65 °C (65 °F), ולאחר מכן במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F), ולבסוף על קרח במשך 3 דקות כדי להבטיח חישול נאות של דופלקס המצע / תבנית.
  3. בצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי 1.5 מ"ל, הוסף 49 μL של מאגר תגובה UDG קר כקרח 1x ו 1 μL של UDG (5,000 יחידות / מ"ל; ראה את טבלת החומרים), דילול ל 0.1 יחידות / μL. בצע דילול סדרתי עם חיץ UDG 1x לריכוזי האנזים הרצויים של 0.05, 0.02, או 0.01 יחידות / μL. תמיד לשמור על UDG מדולל על קרח.
    הערה: בתגובה של 10 μL, 0.1 יחידות של UDG יכול לבקע יותר מ 30 pmol של uracil מדופלקס T1 / U + 9 ב 3 דקות.
  4. בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי בגודל 1.5 מ"ל, הוסיפו 9.0 μL של תערובת מצע משלב 2.2 והקדימו את הצינור ל-37 מעלות צלזיוס. הוסף 1.0 μL של UDG מדולל משלב 2.3. השתמש טיימר כדי לתזמן את התגובה ולהעיף את הצינור לערבב תוכן.
    הערה: עבור בדיקת הגדרת יחידה, זמן הדגירה הוא 30 דקות. לקבלת בדיקה קינטית, השתמש בניתוח קורס זמן של 0.5, 1, 2, 2, 3, 5 דקות כדי להשיג את התעריף ההתחלתי. לקבלת בדיקת עיכוב UGI, זמן התגובה במשך 15 דקות.
  5. צנטריפוגה הצינורות עם תערובת התגובה עבור 3-5 s ב 3,200 × גרם בטמפרטורת הסביבה. לאחר מכן, להעביר את התגובה מיד ל 37 °C (50 °F).
  6. סיום תגובה
    1. הכן פתרונות של 0.25 M HCl ובסיס 0.23 M Tris. במבחנה של 15 מ"ל, הוסף 10 מ"ל של פתרון של 1 מ"מ EDTA ו 20 mM Tris-HCl (pH 8.0 ב 25 °C (25 °C )) כדי לחקות 1x מאגר תגובה UDG. חומצי עם 1 מ"ל של 0.25 M HCl ולבדוק עם מונה pH כדי להבטיח את ה- pH הוא ~ 2 ± 0.5. נטרלו עם 1 מ"ל של בסיס 0.23 M Tris ובדקו עם מד pH לקבלת pH סופי של 6.5 ± 0.5.
      הערה: שימוש ברצועות בדיקת pH הוא דרך מהירה וקלה לאשר מחדש את רמות החומציות של תערובת הריאגנט.
    2. הוסף 1 μL של 0.25 M HCl כדי חומצי את תערובת התגובה 10 μL כדי להשבית את האנזים ולהניח אותו על קרח במשך 6 דקות. הוסף 1 μL של בסיס 0.23 M Tris כדי לנטרל את מוצרי ה- DNA כדי למנוע שבירה של אתר AP על ידי חשיפה ממושכת לחומצה. הוסף 13 μL TE כדי להגדיל את הנפח של תערובת המוצר להעברת שבב מטריצה ולאחר מכן למקם אותו על קרח.
      הערה: מוצר AP אינו יציב מבחינה כימית ויש לנתח אותו על ידי MALDI-TOF MS תוך יומיים. לאחר אחסון ממושך במשך יותר משבוע, הצטברות של חלק ניכר מהפסקות גדיל מתרחשת עקב תגובות חיסול β/δ של מוצרי AP (איור 1D-G).
  7. העבר את כל מוצרי התגובה UDG 25 μL מצינורות microcentrifuge לצלחת מיקרוטיטר 384 well.
    הערה: ריכוזים גבוהים של cations, כגון נתרן או אשלגן במאגרים, ליצור הפרעה בניתוח MALDI-TOF MS ולכן דורשים התפלה. כמו E. coli UDG מאגר תגובה מכיל ריכוזים נמוכים מאוד של cations, התפלה אינה הכרחית. עם זאת, שנה פרוטוקול זה כדי למדוד תגובות גליקוסילאז DNA אחרות המכילות cations מתכת הדורשים התפלה כפי שתואר בעבר 35.

3. העבר מוצרי תגובה UDG לשבב מטריצה

  1. פתח את הדלת של מתקן הננו-ליטר (ראה טבלת החומרים) וטען את צלחת המיקרוטיטר בעלת 384 הבאר משלב 2.7 למחזיק הצלחת של הסיפון.
  2. הכנס את מערך שבב המטריצה למיקום לוחית הסיור המתאימה. מניחים את צלחת הסקאוט הטעונה על סיפון העיבוד של מתקן הננו-ליטר וסוגרים את הדלת.
  3. גע בלחצן הריצה במסך ההעברה, והמתן שהמכשיר יתחיל לחלק דגימות מלוח המיקרוטיטר של 384 well לשבב המטריצה.
  4. השתמש באפשרות הכרטיסיה 'חזון' כדי להציג את התמונה של השבב ואת אמצעי האחסון של חלוקה עבור כל נקודה במהלך ההפצה. ודא שהנפח המנוקד על השבב נמצא בטווח של 5-10 nL.

4. הגדר את פרמטרי הבדיקה על ספקטרומטר המסה

  1. השתמש בתוכנית היישום (עיין בטבלת החומרים) כדי להכין קובץ .xlsx המכיל את ערך האות m/z החזוי לייבוא.
    הערה: ההגדרות בקובץ I.xlsx (טבלה 2) הן הגדרות לדוגמה עבור בדיקת UDG של מצע G:U בסעיף 2.
  2. השתמש בתוכנית היישום כדי ליצור ולהגדיר בדיקת UDG חדשה על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על האפשרות ייבוא קבוצת חיפוש בתבנית מעצב ובחירה בקובץ .xlsx מהרשימה הנפתחת (לדוגמה, FILE I.xlsx משלב 4.1).
  3. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על לחצן לקוח:פרוייקט:צלחת ולחץ על החלק העליון של עץ האפשרויות הנפתח כדי ליצור לוח בדיקה חדש. בתיבת הדו-שיח , הקלד שם קובץ (לדוגמה, CTT20210620 עבור קוד המעבדה ותאריך הבדיקה), וברשימה הנפתחת סוג לוחית , בחר את סוג הלוח 384-well ולחץ על אישור. חפש לוח ריק שיופיע מימין למסך.
  4. לחץ על האפשרות 'בדיקה '; בחר את הבדיקה (לדוגמה, קובץ I.xlsx) מהרשימה הנפתחת.
  5. כדי להקצות את הבדיקה שנבחרה (לדוגמה, FILE I.xlsx) לכל מיקום נקודה לדוגמה בלוח, הזז את הסמן לכל מיקום של הלוח הריק, לחץ כדי לסמן את הבאר ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור הוסף Plex.
  6. השתמש במחשב שולחני או מחשב נישא כדי להכין רשימת עבודה בתבנית .xlsx ללא כותרת עליונה (לדוגמה, 0620.xlsx של טבלה 3) עבור כל הדוגמאות על השבב משלב 2.7. לחץ על לחצן הוסף פרוייקט לדוגמה חדש ; בחר את הקובץ (לדוגמה, 0620.xlsx) מהרשימה הנפתחת כדי לייבא את רשימת העבודה.
  7. חפש את כל קודי מדגם הבדיקה ברשימת העבודה (לדוגמה, מ - 0620.xlsx) בצד שמאל של המסך. לחץ על הקוד לדוגמה ברשימת העבודה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על המיקום המתאים של הצלחת כדי לקשר את הבדיקות לכל מיקום.

5. פעולת ספקטרומטר מסה

  1. השתמש בתוכנית היישום כדי לקשר את ספקטרומטר המסה (ראה טבלת החומרים) לשבב המדגם (מסעיף 3) שיש לנתח.
  2. לחץ על הגדרת ברירת המחדל. בתיבת הדו-שיח , הקלד שם קובץ משלב 4.3 (לדוגמה, CTT20210620); בתיבה שם הניסוי, הקלד את מזהה השבב בברקוד השבב ושמור את ההגדרות.
  3. התחל את תוכנית בקרת ספקטרומטר המסה (ראה טבלת החומרים).
  4. לחצו על כפתור הכניסה/יציאה של ספקטרומטר המסה ותנו לסיפון להתרחב. הוציאו את מחזיק השבב והכניסו את שבב הדגימה משלב 3.4 למחזיק השבב. הניחו את מחזיק השבב הטעון על הסיפון המורחב ולחצו על כפתור הכניסה/יציאה כדי שהשבב לדוגמה ייכנס למכשיר.
  5. לחץ פעמיים על סמל רכישה של תוכנית היישום. בחלון רכישה , לחץ על כרטיסיית ההפעלה האוטומטית כדי להפעיל את המכשיר ולקבל ספקטרום מסה מהדגימות על השבב.

6. צפייה בספקטרום המסה וניתוח הנתונים

  1. הפעל את תוכנית ניתוח הנתונים (עיין בטבלת החומרים).
  2. עיין בעץ מסד הנתונים ובחר את מזהה השבב משלב 5.2. לחץ כדי להדגיש היטב יעד על השבב, ולחץ על סמל הספקטרום כדי להציג את ספקטרום המסה.
  3. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור תיבת דו-שיח של התאמה אישית כדי לחתוך טווח מסוים של ספקטרום בחלון חדש. לחץ על ציר ה- X כדי להקליד את הגבולות העליונים והתחתונים של m/z, ולחץ על אישור כדי להציג את ספקטרום הטווח שצוין, כולל אותות העניין.
    הערה: כמות הדנ"א פרופורציונלית לעוצמת השיא בכל יחידת ערך m/z.
  4. מדוד את גובה השיא של ערכי m/z של אותות התואמים למצע U, מוצר AP ותבנית. לחץ על הפסגה והצג את גובה השיא בפינה הימנית העליונה של המסך.
    הערה: ספקטרום של 1,600 רוחב /1,200 יחידה הוא ממד סביר לבדיקה על מסך מחשב, כמו גם עבור תיעוד.
  5. כדי לשמור את הספקטרום עבור תיעוד, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ייצוא ובחר סוג קובץ JPEG ברשימה הנפתחת. לחץ על דיסק יעד ועיון כדי לבחור את התקן האחסון ברשימה הנפתחת (לדוגמה, דיסק הבזק E:). הקלד את שם הקובץ (לדוגמה, 0620_1-2.jpg) ולחץ על ייצוא.
  6. במידת הצורך, הדפס קובץ JPEG מיוצא ומדוד את גובה השיא באופן ידני באמצעות סרגל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תבניות ומצעים
אם ניקח אוליגונוקלאוטידים סינתטיים עם U במרכז (U+9) בשילוב עם תבנית G כדוגמה (איור 1A), בקרה ריקה של כמויות שיווימולריות של תבנית ומצע המכיל אורסיל יכולה לשמש לבקרת איכות של טוהר אוליגונוקלאוטיד סינתטי (איור 1B; האותות תואמים ל- m/z המיועד ולרעשי הרקע הנמוכים). בניתוח נתוני טרשת נפוצה נמדדו שיאי השיא (איור 2). ה- DNA של תבנית 19 nt היה צפוי להישאר ללא שינוי לאחר הידרוליזה גליקוסילאז; לכן, האות יכול לשמש התייחסות לכמות של מוצר AP (איור 1C).

מצב תגובה וספקטרה מסה
בדיקת גליקוסילאז DNA זו פשוטה וקלה לביצוע באמצעות אוליגונוקלאוטיד שאינו מסומן לתגובה סטנדרטית לקבלת תוצאות נקיות ואמינות (איור 1). הטווח של ספקטרום MS צריך לכסות את כל האותות הנוצרים ממצעים, תבניות ומוצרי תגובה (איור 1B). ההבדל של 1 nt בין המצע לבין התבנית המתאימה יצר פרופיל אות מופרד היטב הן עבור התבנית והן עבור המצע (איור 1B). הפריימרים equimolar U +9 ו- T1 הראו עוצמות שיא דומות ללא הבדלים משמעותיים. עיכול נרחב של UDG (0.5 יחידות לתגובה של 30 דקות) הפגין מחשוף אורסיל מלא. האות של מוצר ה-AP הופרד היטב גם מזה של המצע המכיל אורסיל (איור 1C d+9 AP-product m/z = 5447.6 לעומת איור 1B U+9 מצע m/z = 5541.6). טכניקת היוניזציה המתונה יחסית של MALDI36 ששימשה במחקר זה מזערה את האותות הקשורים להפסקות גדיל שנגרמו על ידי תגובת חיסול β באתרי AP37, שלא היו משמעותיים בספקטרום המסה. בסך הכל, רקע התגובה נקי מאוד ללא רעש מורגש (איור 1C).

בתנאים אקלימיים, עוצמת האות היחסית של מוצר ה-AP הייתה דומה לזו של מצע ה-U באמצעות תבנית T1 כהפניה (איור 1B, U+9/T1 לעומת d+9/T1). לכן, החישוב של פעילות UDG מבוסס על הקלט המדויק של המצע המכיל U (50 pmol או 20 pmol) על פי Eq (1).

פעילות UDG = (אות של מוצר AP) / (אות של מצע U + אות של מוצר AP) × [U] (1)

פרמטרים קינטיים UDG נקבעו על ידי בדיקת MS MALDI-TOF
כפי שניתן לראות באיור 2, לאורך כל 3 הדקות של התגובה, תגובות UDG מ-0.01 יחידות ל-0.1 יחידות הדגימו תלות במינון ובזמן. ריכוז של 3.2 pM (0.1 יחידות לכל תגובת 100 μL) שימש לקביעת הפרמטרים הקינטיים, Km ו- kcat, עבור מצע G:U (טבלה 1). האליקוטים של תגובת UDG הוסרו ומרווים במשך 30 שניות ו -60 שניות. נתונים קינטיים התקבלו בתנאים כאשר המצע המכיל אורסיל היה פחות מ 50% מתעכל, וחמישה ריכוזי מצע הנעים בין 10 ל 200 nM היו נתונים לניתוח. קורס הזמן של המדינה הקדם-יציבה הראה ליניאריות מצוינת לניתוח שיעורים. דוגמה לעליית קצב תגובה מוצגת באיור 3A, שבו עוצמת אות הטרשת הנפוצה היחסית של המוצר והמצע מומרים לריכוז (nM). קצב התגובה של UDG (v) מוצג כ- nM של אתר AP המיוצר לשניה. ה-Km וה-Vmax חושבו מתוך עלילת Lineweaver-Burk (איור 3B). הפרמטרים הקינטיים של UDG הנגזרים מבדיקת MS MALDI-TOF נקבעו לפיכך כ- Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM s-1, ו- Kcat = 9.31 s-1. הערכים דומים לתוצאות של בדיקות קודמות לשחרור 3H-uracil שבו Km = 40 nM ו- Kcat = 13.3 s-138. 

דופלקס G:U +9 היה נתון לבדיקות רגישות UDG. היחידה שנמדדה על ידי MALDI-TOF MS assay שורטטה נגד היחידה המוגדרת של היצרן על ידי שיטה קונבנציונלית לשחרור 3H-uracil-uracil 38. כפי שניתן לראות באיור 3C, היחידה הנמדדת MALDI-TOF MS הייתה פרופורציונלית ליחידה המוגדרת מ- 0.001 יחידות ל- 0.02 יחידות עם משוואת המתאם של y = 0.933x + 0.0003 ומקדם הקביעה R2 = 0.9974. מגבלת הזיהוי היא 0.001 יחידות כמקדם וריאציה = 9.2%, ~ פי 5 מיחס האות לרעש. לכן, בדיקת MALDI-TOF MS זו מספקת רגישות מספקת כמו UDG משמש בעיקר ברמת היחידה39.

ספציפיות מצע של UDG
אחת התכונות האופייניות של בדיקת UDG MALDI-TOF MS זו היא שהיא נטולת תוויות, מה שהופך רב-תכליתיות גבוהה לעיצוב מצע. תכונה זו שימושית מאוד לניתוח הספציפיות של המצע של UDG. כפי שהודגם בטבלה 1, ניתן להכניס אורסיל בכל מקום ליד קצה ה-5 או ה-3' של דנ"א חד-גדילי או כפול לבדיקת פרטים. עבור ספציפיות מצע, ידוע כי UDG פעיל מאוד בהסרת uracil מ- DNA תקוע יחיד38. ואכן, כפי שניתן לראות בטבלה 1, כריתת אורסיל מהמצע החד-גדילי (ssU) ירדה פי 3.7 כאשר היא מחושלת לגדיל ה- DNA המשלים, ויוצרת דופלקס G:U. עבור דופלקס A:U הנפוץ 6,7,8, שיעור התגובה הופחת עוד יותר על ידי כמעט פי 10 ביחס SSU. ה- UDG לא פעל על U בטרמינל ה- DNA (מצעים טבלה 1 של G:U + 1, G:U-1 ו- G:U-2), אשר עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים40,41. באופן מעניין, U במיקומים 2 ו -3 מהטרמינל 5'-terminus הציג שיעור קטליטי UDG גבוה יותר מאשר U במרכז על ידי פי 2 ו 1.5- פי 1, בהתאמה (טבלה 1, G:U + 2 ו G:U + 3 לעומת G:U). UDG הוציא U 3-nt מן 3'end עם 8% פחות פעילות מאשר U במרכז (טבלה 1, G:U-3 לעומת G:U).

מעכבי אורסיל גליקוסילאז של תגובת UDG
Uracil glycosylase מעכב (UGI) הוא חלבון בקטריופאג ', אשר מעכב E. coli UDG על ידי חלבון הפיך מחייב עם stoichiometry של 1:142. עיכוב פעילות UDG על ידי UGI מוצג באיור 4. בנוכחות 0.05 יחידות (100 pM) של UGI, הפעילות של 0.05 יחידות של UDG (8 pM) נבלמה לרמה בלתי ניתנת לגילוי. IC50 היה 7.6 pM. לכן, בדיקת UDG MALDI-TOF MS ניתן לשנות בקלות לבדיקת סינון המונית לגילוי מעכבים של גליקוסילות DNA אחרות.

Figure 1
איור 1: מערכת מודל לבדיקת גליקוסילאז DNA. (A) גדיל נגע המכיל אורידין יחיד (U+9) חושל בתבנית (T1), ויצר אי התאמה G:U (מודגש). Glycosylase Uracil-DNA מזהה ומסיר את uracil, ויוצר אתר AP (d). כאשר הוא נתון ל- MALDI-TOF MS, ניתן לפתור את ההבדל בערכי m/z בין מוצרי DNA המכילים U ומוצרי AP כפי שמוצג ב - B. (B) דנ"א של 18 nt המכיל אורידין יחיד (U+9) שחושל לתבנית 19 nt (T1) (טבלה 1) נבדק כאנזים ריק של 50 pmol של מצע ב 40 μL של מאגר תגובה נתון לניתוח טרשת נפוצה. (C) עיכול אנזים כמעט מלא של 50 pmol של מצע בתגובה 10 μL באמצעות 0.5 יחידות של UDG ב 37 °C (30 °C במשך 30 דקות. (D) DNA 18 nt המכיל uridine יחיד (U + 3) מחושל ל אנזים T1 ריק של 50 pmol מצע ב 40 μL מאגר תגובה היה נתון לניתוח MS. (E) עיכול אנזימים כמעט שלם של 50 pmol של מצע U+3 בתגובה של 10 μL באמצעות 0.5 יחידות של UDG ב 37 °C (37 °C) במשך 30 דקות כדי לייצר d +3 ו נתון לניתוח טרשת נפוצה בתוך 30 שעות. (F) מצב התגובה היה זהה ל- E למעט מוצר d +3 היה ב 0.1 M NaOH ב 95 °C (95 °C) במשך 30 דקות כדי להפעיל תגובת חיסול בטא המייצרת מוצר מקוטע B15 ונחשף לניתוח טרשת נפוצה. (ז) מצב התגובה היה זהה ל- E למעט מוצר d+3 שאוחסן בטמפרטורה של -20 °C (60 °F) במשך יותר מ-7 ימים; שבריר של d+3 שהומר למוצרים מקוטעים B15. נתון זה משתנה מ-43. קיצורים: nt = נוקלאוטיד; MS = ספקטרומטריית מסה; MALDI-TOF MS = פירוק לייזר בסיוע מטריקס/ זמן יינון טרשת נפוצה; AP = apurinic/apyrimidinic; UDG = אורסיל-DNA גליקוסילאז; T1 = תבנית המכילה G של 19 nt; U+9 = מצע המכיל U של 18 nt; d+9 = 18 nt AP מוצר המכיל אתר; U+3 = מצע המכיל U של 18 nt; d+3 = 18 nt AP מוצר המכיל אתר; B15 = 15 nt בטא-אלימינציה מוצר מקוטע. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח קורס זמן לפעילות UDG בריכוזי אנזימים שונים. דנ"א מצע, 50 pmol, המכיל נגע G:U היה דגירה עם 0.01, 0.02, 0.05, ו 0.1 יחידות של UDG ב 37 °C (37 °F). Aliquots (10 μL) נלקחו מתערובת התגובה ב 0, 0.5, 1, 2, ו 3 דקות, מרווה עם נפח שווה של פנול / כלורופורם. (A) ספקטרום המסה MALDI-TOF הממחיש את תלות הריכוז של עיבוד מצעים G:U על ידי UDG. (ב) כמות המוצר שורטטה כפונקציה של זמן. UDG: 0.01 (משולשים סגורים עם קו מלא), 0.02 (משולש פתוח עם קו מקווקו), 0.05 (עיגול סגור עם קו מלא) ו-0.1 יחידות (עיגולים פתוחים עם קו מלא). הנתונים הם הממוצעים של שלוש קביעות עצמאיות, וקווי השגיאה מייצגים 1 S.D. נתון זה משתנה מ-43. קיצורים: nt = נוקלאוטיד; MALDI-TOF = פירוק לייזר בסיוע מטריקס / זמן ינון של טיסה; AP = apurinic/apyrimidinic; UDG = אורסיל-DNA גליקוסילאז; T = תבנית המכילה G 19 nt; U = 18 nt U המכיל מצע; AP = 18 nt AP מוצר המכיל אתר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: קביעת פרמטרים קינטיים של UDG באמצעות ניתוח MALDI-TOF. עקומת מיכאליס-מנטון ו-Lineweaver-Burk מתכננים לקבוע את ה-Km וה-kcat עבור כריתת אנזים UDG מזורזת של אורסיל מהדנ"א. בדיקת DNA גליקוסילאז MALDI-TOF MS בוצעה באמצעות 0.1 יחידות של UDG וריכוזים שונים (10, 30, 60, 60, 100, 200 ננומטר) של מצעים ב 100 תגובת μL עבור 30 s ו 60 s. (A) עקומת מיכאליס-מטן שנוצרה משלושה ניסויים עצמאיים. קווי השגיאה מייצגים 1 SD. (B) תרשים Lineweaver-Burk עבור הבדיקה; חישוב היתר היירוטים שצוין Km ו- Vmax. (ג) בדיקת UDG על-ידי ניתוח MALDI-TOF MS בהשוואה ליחידה שהוקצתה על-ידי היצרן. פעילות אנזימים נמדדה על ידי הסרת uracil להרכיב אתר AP בתגובה 10 μL המכיל 50 pmol (0.56 מיקרוגרם) של G:U בתוך דופלקס DNA 18/19 nt במשך 30 דקות ב 37 °C (37 °F). UDG היה מדולל עם חוצץ [50% גליצרול, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 30 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol] על קרח. יחידה הוגדרה ככמות האנזים שהזניקה את שחרורו של 60 pmol של אורסיל לדקה. קווי שגיאה מציגים את סטיית התקן של שישה ניסויים. נתון זה משתנה מ-43. קיצורים: nt = נוקלאוטיד; MALDI-TOF = פירוק לייזר בסיוע מטריקס / זמן ינון של טיסה; UDG = אורסיל-DNA גליקוסילאז; AP = apurinic/apyrimidinic; V, מהירות תגובה nM/s. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: עקומת עיכוב אנזימי UDG על ידי תוספת של UGI. עקומת העיכוב נקבעה באמצעות תגובות של 20 μL עם 0.05 יחידות של UDG (8 pM) ו 50 pmol של מצע במשך 15 דקות בנוכחות UGI מ 0.001 יחידות (5 pM) כדי 0.1 יחידות (200 pM). נתונים הם הממוצעים של שלוש קביעות עצמאיות, וקווי השגיאה מייצגים 1 S.D. נתונים מתאימים למחשבון IC50 מקוון (עיין בטבלת החומרים). נתון זה משתנה מ-43. קיצורים: UDG = גליקוסיל-DNA אורסיל; UGI = מעכב גליקוסילאז אורסילאז. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מצעים של דנ"א Oligonucleotidesa רצף DNA ratec התחלתי k חתול
(pmol/sec) (s-1)
ssU+9 U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' 0.560 ± 0.098 35
ssU+3 U+3 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' 0.756 ± 0.083 47.3
ssU-3 U-3 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3' 0.448 ± 0.087 28
G:U T1 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0.149 ± 0.046 9.31
U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3'
A:U T2 3'-CTGGTCAGACCTGCAACCG-5' 0.053 ± 0.018 3.31
U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3'
G:U5'+3 T1 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0.256 ± 0.044 16
U+3 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U5'+2 T3 3'-CGGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0.567 ± 0.016 35.4
U+2 5'-GUCCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U5'+1 T4 3'-GTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' NDD ND
U+1 5'-UACCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U3'-3 T5 3'-CTGGTCAGGCCTGCAGCCG-5' 0.138 ± 0.015 8.63
U-3 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3'
G:U3'-2 T6 3'-CTGGTCAGGCCTGCAAGC-5' ND ND
U-2 5'-GACCAGTCCGGACGTTUG-3'
G:U3'-1 T7 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACGG-5' ND ND
U-1 5'-GACCAGTCCGGACGTTGU-3'

טבלה 1: קומפוזיציות מצע וספציפיות UDG. טבלה זו מציגה את ה- DNA המכיל U המכיל 18 nt המיועד על-ידי U±N. ה- '+' מציין ספירת מיקום האורסיל מטרמינל 5', וה- '-' מציין ספירת מיקום האורסיל מטרמינוס 3'. לדוגמה, U+9 הוא המיקום התשיעי מטרמינל 5', U-3 הוא המיקום השלישי מטרמינל 3'. התבנית המשלימה של 19 nt של T1 עד T7 תשויך ל- DNA המכיל U היוצר אי-התאמות G:U או A:U כפי שצוין. בסיסי אורסיל מודגשים. התגובות היו באמצעות 50 pmol של מצעים U, 0.05 יחידות של UDG, ב 10 μL כמתואר בפרוטוקול סעיף 2. טבלה זו משתנה מ - 43. קיצורים: UDG = אורסיל DNA גליקוסילאז; nt = נוקלאוטיד; ND, לא ניתן לגילוי.

PCRP שני 1st-PCRP AMP_LEN UP_CONF MP_CONF Tm PCGC PWARN UEP_DIR UEP_MASS UEP_SEQ שיחת EXT1_ EXT1_ מסצ'וסטס
נה נה נה נה נה נה נה F 5789.8 GCCAACGTCCGGACTGGTC
נה נה נה נה נה נה נה F 5541.6 GACCAGTCUGGACGTTGG

טבלה 2: קובץ I .xlsx קובץ. ההגדרות שימשו לאיור 1B, C ואיור 2A; 0 דקות ערכים. מערכת MALDI-TOF MS המשמשת במחקר זה תוכננה במיוחד כדי לנתח פולימורפיזם חד-נוקלאוטיד על ידי הרחבה נוקלאוטיד אחת של פריימר מורחב לאזור של וריאציה רצף גנים מוגברת. עבור בדיקת UDG, רק שישה שדות שימשו בעת הכנת קבוצת הבדיקה FILE I. קיצורים: WELL = מספר הבאר שהוקצה לבדיקה; TERM = תמהיל סיום; SNP_ID = שם רצף הקלט של פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד; 2nd-PCRP = פריימר אמפליקון קדמי; 1st-PCRP = פריימר אמפליקון הפוך; AMP_LEN = אורך אמפליקון; UP_CONF = ציון הגברה של uniplex; MP_CONF = ציון הגברה מולטיפלקס; TM = טמפרטורת היתוך; PcGC = אחוז תוכן GC; PWARN = קודי אזהרה של עיצוב בדיקה; UEP_DIR = כיוון של הרחבת פריימר; UEP_MASS = מסה לא מורחבת-פריימר; UEP_SEQ = רצף פריימר לא מורחב; EXT1_CALL = שם שניתן לשיא מסה 1 ניתוח; EXT1_MASS = מסה של ניתוח 1.

0620_1-2
0620_1-3
0620_1-4
0620_1-5
0620_1-6
0620_1-7
0620_1-8

טבלה 3: 0620.xlsx קובץ. הגדרות אלה שימשו לתגובות העיכוב של UGI באיור 4A. קיצור: UGI = מעכב גליקוסילאז uracil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מספק הליך מפורט לשימוש בשיטת בדיקת MS UDG MALDI-TOF MS לזיהוי ישיר של מוצרי DNA המכילים AP. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם כי מצעים המכילים uracil הם ללא תוויות, מדרגי, קל לעבוד עם, ולאפשר גמישות רבה יותר בעיצוב מצע.

מיצוי פנול/כלורופורם המומלץ על ידי ספק UDG מאפשר השבתה של האנזים כדי למנוע השפלה של DNA המוצר. עם זאת, פרוטוקול החילוץ פנול כרוך בהפרדת פאזה מייגעת של כימיקלים מסוכנים. שיטת סיום חומצה חלופית באמצעות HCl כדי להוריד את pH התגובה ל 2 ± 0.5 גם ביעילות מושבתת UDG. נטרול מאוחר יותר עם בסיס טריס יכול למנוע נזק לדנ"א. כאשר מוצר AP היה נתון לניתוח טרשת נפוצה בתוך 30 שעות, לא היו סימנים של אובדן בסיס או שינוי בספקטרום המסה (איור 1E). חיץ טריס בתגובות סופק עם UDG המסחרי. עם זאת, אמינים שונים, כולל טריס, יכולים לכרות אתרי AP באמצעות חיסול בטא, אם כי בריכוזים גבוהים של ריאגנטים44. חלופות מסוימות, כגון HEPES וחיץ פוספט, ניתן לשקול כדי למנוע את הסיכון של מחשוף של אתר AP על ידי חיסול בטא.

כשיטת התייחסות פוטנציאלית ל- UDG, דופלקס של מצע G:U ממורכז (טבלה 1, T1/U+9) מומלץ כמצע הסטנדרטי מהסיבות הבאות: 1. לרלוונטיות פיזיולוגית, G:U עדיף על A:U כמו deamination של ציטוזין בזוגות G:C תוצאות נגעים G:U. 2. בעוד E. coli UDG מדגים ספציפיות גבוהה יותר כדי hydrolyze U מ- DNA חד גדילי, תיקון של נגע U בדנ"א חד גדילי הוא נדיר. 3. עבור כל מצע G:U שנבדק, G:U + 2 ו- G:U + 3 הדגימו שיעורי תגובה גבוהים יותר מאשר G:U + 9. עם זאת, נגע DEAMINATION DNA בסמוך להפסקת גדיל הוא נדיר. עבור חיקוי נגעים מקומיים, הצבת G:U במרכז דופלקס ה- DNA יהיה מתאים יותר.

באופן מעניין, שיטת MALDI-TOF MS יצרה פרמטרים קינטיים של UDG, ויחידות האנזים של תגובת G:U (איור 3A-C) היו דומות מאוד לתוצאות שמקורן באופן קונבנציונלי באמצעות 3H-uracil38. עם זאת, מצע G:U יחיד במחקר זה שונה מאוד מ- PBS1 bacteriophage DNA שתואר בעבר עם A:U מרובים משגיאות סינתזת DNA38. יתר על כן, UDG הראה פעילות גבוהה פי 3 עם G:U מאשר עם מצע A:U (טבלה 1, Km ו- Kcat של G:U לעומת A:U). תוצאה סותרת לכאורה זו ניתן לייחס לרצף ה- DNA של מצע PBS1 המכיל 36% של U בצורה של נגעים מרובים A:U45 לעומת רק 3% של U ב- G: מצע U (טבלה 1). בינתיים, UDG הוא אנזים 'תהליך' מאוד, כלומר, אירוע מחייב חלבון-DNA יחיד מעורר מחשופי אורסיל מרובים12. מציאת מתאם כמעט מושלם של אחד על אחד בין שתי שיטות UDG אלה הופכת את שיטת הטרשת הנפוצה הזו לאופציה אטרקטיבית במקום בדיקת הרדיואיזוטופ המסורתית.

גישה זו ניתנת להרחבה בקלות. כל תגובות UDG במחקר זה בוצעו באופן ידני באמצעות micropipettes וצינורות microcentrifuge, עם ~ 30 בדיקות שבוצעו ביום נתון. לכן, פחות מעשירית הקיבולת של מערך שבב פורמט צלחת 384-well עבור מערכת MALDI-TOF MS (ראה טבלת החומרים) המתואר בסעיפים 3-5 שימש. לעומת זאת, הסתגלות של מערכת צינורות אוטומטית למיקרו-לוחית 384 well יכולה בקלות להגדיל את התפוקה היומית של גישה זו באמצעות שיטת סיום החומצה. לכן, 300 תגובות UDG ייקח ~ 1 שעות. מערכת MALDI-TOF MS (ראה טבלת החומרים) יכולה להפיק נתוני ספקטרום מסה עבור עד 300 תגובות ב 1 שעות. לפיכך, תהליך יעיל ידרוש 2 שעות כדי להשלים 300 בדיקות MS MALDI-TOF UDG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים למתקן הליבה המשולב NCFPB לגנומיקה פונקציונלית (טאיפיי, טייוואן) ולמעבדת הפרמקוגנומיקה של NRPB (טאיפיי, טייוואן) על התמיכה הטכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן, R.O.C. [מספר מענק MOST109-2314-B-002-186 ל- K.-Y.S., רוב 107-2320-B-002-016-MY3 ל- S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 ל- W.h.F.]. H.-L.C. הוא מקבל מלגת דוקטורט מאוניברסיטת טייוואן הלאומית. מימון תשלום בגין גישה פתוחה: משרד המדע והטכנולוגיה, R.O..C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) J.T baker Protocol 1,2
Autoclaved deionized water MILLIPORE Protocol 1,2
EDTA J.T Baker Protocol 1,2
Gloves AQUAGLOVE Protocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl) SIGMA Protocol 1,2
Ice bucket Taiwan.Inc Protocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) extra gene Protocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CA Protocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY Nanodispenser AAT Bioquest, Inc. RS1000 Protocol 3
Microcentrifuge Kubota Protocol 2
Microcentrifuge Clubio Protocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL) National scientific supply co, Inc. Protocol 2
Microcentrifuge tube rack Taiwan.Inc Protocol 1,2
Micropipette  (P1000) Gilson Protocol 1,2
Micropipette  (P2) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P10) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P100) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P200) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (SL2) Rainin Protocol 1,2
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Singapore) Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) AAT Bioquest, Inc. Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH) WAKO Protocol 2
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509 Protocol 3, 5
Timer Taiwan.Inc Protocol 2
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145 Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x) New England Biolabs, MA B0280S Protocol 2
Uracil Glycosylase Inhibitor New England Biolabs, MA M0281S Protocol 2
Uracil-DNA Glycosylase New England Biolabs, MA M0280L Protocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 SHIMADZU Protocol 1
Water bath ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) Protocol 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochemistry. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O'Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochemistry. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

Tags

ביוכימיה בעיה 182 תיקון כריתת בסיס ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF גליקוסילאז אורסיל-DNA אתר אפורני/אפירימידיני מעכב גליקוסילאז
Uracil-DNA Glycosylase בדיקה על ידי טיהור לייזר בסיוע מטריקס / יינון זמן טיסה ניתוח ספקטרומטריה מסה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, H. L., Su, K. Y., Goodman, S. … More

Chang, H. L., Su, K. Y., Goodman, S. D., Cheng, W. C., Lin, L. I., Yang, Y. C., Chang, S. Y., Fang, W. h. Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63089, doi:10.3791/63089 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter