Summary
ウラシル-DNAグリコシラーゼ活性をアッセイするための非標識、非放射性同位体法が、直接アプリン/アピリミジン部位含有生成物分析のためのMALDI-TOF質量分析法を用いて開発された。このアッセイは、DNAグリコシラーゼ測定に非常にシンプルで、特異的で、迅速で、使いやすいことが証明されました。
Abstract
ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)は、シトシンの加水分解脱アミノ化から形成されるウラシルの補正のための塩基切除修復経路における重要な成分である。したがって、ゲノムの完全性の維持には極めて重要です。UDG活性を測定するために、高度に特異的で非標識の非放射性同位体法が開発された。部位特異的ウラシルを含む合成DNA二重鎖をUDGにより切断し、次いでマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間質量分析(MALDI-TOF MS)分析を行った。鎖切断なしにDNA中の非熟菌/アピリミジン部位(AP)産物を保存するためのプロトコルが確立されました。基質から生成物までのm/z値の変化を用いて、UDGによるウラシル加水分解を評価した。UDG速度論的解析にG:U基板を用い、Km = 50 nM、Vmax = 0.98 nM/s、Kcat = 9.31 s-1を得た。ウラシルグリコシラーゼ阻害剤(UGI)アッセイへのこの方法の適用は、7.6pMのIC50値をもたらした。一本鎖および二本鎖DNA基質内の様々な位置でウラシルを用いたUDG特異性は、異なる切断効率を実証した。したがって、この単純で迅速で汎用性の高いMALDI−TOF MS法は、様々な単官能DNAグリコシラーゼの優れた参照法となり得る。また、DNAグリコシラーゼ阻害剤スクリーニングのツールとしての可能性も秘めています。
Introduction
ウラシルはRNAの正常な塩基であるが、ゲノムDNAにおいて一般的で変異原性の高い病変である。ウラシルは、デオキシシチジンの自発的/酵素的加水分解脱アミノ化から生じ得る。各生細胞において、この脱アミノ化は生理学的条件下で1日100〜500回起こる1,2。これらの変化が修復されない場合、DNA配列組成に変化があり、突然変異を引き起こす可能性がある。DNA中のウラシルは複製中にdATPと対合することを好むので、シトシンがウラシルに脱アミノ化する場合、2つの複製事象において、子孫DNAの半分に新しいG:CからA:Tへの移行変異が存在する3。
遺伝的安定性を維持するための細胞戦略の中で、塩基切除修復(BER)は、DNA4のウラシルなどの損傷した塩基を修復する重要なメカニズムである。BERは高度に進化的に保存されたプロセスです。2つの一般的なBER経路がある:単一ヌクレオチドの修復路に至る短いパッチ経路と、少なくとも2ヌクレオチドの修復経路を生成するロングパッチ経路5。BERは、いくつかのステップで発生する調整されたメカニズムです。BERの最初のステップは、損傷特異的DNAグリコシラーゼによる損傷ヌクレオチド塩基の酵素加水分解であり、アプリニン/アピリミジン(AP)中間部位を生成する6。これに続いて、エンドヌクレアーゼによるAP部位の糖リン酸骨格の切断、リアーゼによるDNA末端のクリーンアップ、DNAポリメラーゼによるギャップ充填、およびリガーゼによる最終ニックの封止が続きます5。
ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)は、大腸菌中のBERのウラシル含有DNAからウラシルを加水分解する。異なる分離技術を含む放射性標識DNAを用いた従来のUDGアッセイ6、7、8、9、10、11、12、13は、通常、時間がかかり、労働集約的であり、高価な標識試薬、複雑な手順、および放射性物質への曝露のリスクを低減するために集中的な訓練と実践を必要とする。蛍光測定オリゴヌクレオチドアッセイは、分子ビーコンおよびフェルスター共鳴エネルギー移動技術に加えて、放射性同位元素標識14の代替として開発されている15,16,17,18,19,20。しかしながら、前述の方法の全てに特定の標識が必要である。近年、ラベルフリーバイオセンサアッセイ21、22、23およびG−quadruplex24、25、26の形成に基づく比色法が開発されている。しかし、プローブ内の複数のA:Uペアまたは特別に設計された配列は、酵素単位の定義を複雑にします。
MALDI-TOF MS は、DNA 解析に非常に役立つ可能性のある技術です。開発されたアプリケーションには、一塩基多型ジェノタイピング27,28、改変ヌクレオチド解析29、DNA修復中間体同定30,31,32,33,34が含まれる。MALDI-TOF MS は、AP 部位含有 DNA 産物を検出するための DNA グリコシラーゼ分析に容易に採用する必要があります。しかし、DNA中のAP部位は、多くの実験条件下で鎖が切断されやすい33。ここでは、MALDI-TOF MS を使用して UDG アッセイを行い、大きなストランドブレークノイズなしで AP サイト生産を直接測定します。このラベルフリー法は、取り扱いが容易であり、DNAグリコシラーゼ阻害剤スクリーニングの医薬応用に高い可能性を秘めています。
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Protocol
1. 基板/テンプレートの準備
- ウラシル基板/テンプレート二重膜は、約50 ± 10%のバランスのとれたG + C含有量と、二重鎖領域の最低溶融温度50°Cで設計します。
注:18 nt基板と19 ntテンプレート(表1および図1)の間の1つのヌクレオチド差は、MSシグナルの解釈と適切なアニーリングの改善に役立ちます。鋳型鎖は、A-UまたはG-Uミスマッチを生成するための相補的DNAとして機能するが(表1)、MS測定における参照シグナルとして使用することもできる。HPLC精製合成オリゴヌクレオチドの使用は、この研究にとって満足のいくものである。 - DNAを1 mM EDTAおよび10 mM Tris-HCl(25°CでpH 8.0)(TE)に100 μmol/Lの濃度でストックとして溶解し、-20 °Cで保存します。 この 20 μL ストックを TE で最終容量 800 μL (25 倍希釈して 4 μmol/L) に希釈します。DNA溶液の吸光度を紫外可視分光光度計でλ = 260nmで測定し、メーカーが割り当てた濃度を確認します。たとえば、U+9 の 4 μmol/L の場合は A260 = 0.204、T1 の 4 μmol/L の場合は A260 = 0.192 です(表 1)。
- オリゴヌクレオチド品質管理のためのMALDI-TOF MS 分析(セクション4~6)を実行し、指定されたm/z値で固有のピークシグナルを検査し、信号対雑音比が>100であることを確認します(図1Bおよび図1D)。
DNAグリコシラーゼアッセイ
- グリコシラーゼ反応にT1/U+9二重鎖のG:U基質(表1および図1A)を用い、例えば、1.5mL滅菌微量遠心管に、70μLのH2O、10μLの10x UDG反応緩衝液、5μLのT1ストック、および5μLのU+9ストックを加える(ステップ1.2)。
メモ: 正しいタイプのマイクロピペットを選択し、メーカーの指示に従って必要な容量を取り扱います。たとえば、2 μL のピペットを使用して 0.1 ~ 2 μL の液体を分注し、10 μL のピペットを使用して 2 ~ 10 μL の液体を分注し、100 μL のピペットを使用して 20 ~ 100 μL の液体を分注し、結果の精度と精度を確保します。試薬混合物の記載された体積は、10アッセイ用である;所望の反応数のために体積を調整する。1x UDG 反応バッファーには、1 mM EDTA、1 mM ジチオスレイトール、および 20 mM トリス塩酸 (25 °C で pH 8.0) が含まれています。10x UDG反応緩衝液の供給源については 、材料表 を参照してください。 - チューブをしっかりと閉じます。65°Cで30分間、次いで37°Cで30分間、最後に氷上で3分間インキュベートして、基板/テンプレート二重鎖の適切なアニーリングを確実にする。
- 1.5 mL の滅菌微量遠心管に、氷冷した 1x UDG 反応バッファー 49 μL と UDG 1 μL (5,000 単位/mL; 材料表を参照) を加え、0.1 単位/μL に希釈します。1x UDG バッファーで、0.05、0.02、または 0.01 単位/μL の所望の酵素濃度まで段階希釈します。希釈した UDG は必ず氷上に保管してください。
注: 10 μL の反応では、0.1 単位の UDG が T1/U+9 二重鎖から 30 pmol を超えるウラシルを 3 分で切断できます。 - 1.5 mL滅菌微量遠心チューブに、ステップ2.2から9.0 μLの基質混合物を加え、チューブを37°Cに予温する。 ステップ2.3から希釈したUDGを1.0 μL加える。タイマーを使用して反応を計り、チューブをフリックして内容物を混ぜます。
注: 単位定義アッセイの場合、インキュベーション時間は 30 分です。動態アッセイの場合、0.5、1、2、3、5分のタイムコース分析を使用して初期速度を求めます。UGI阻害アッセイのために、反応を15分間時間処理する。 - 反応混合物を含むチューブを周囲温度で3,200 × g で3〜5秒間遠心分離する。その後、反応物を直ちに37°Cに移した。
- 反応停止
- 0.25 M HClおよび0.23 M Tris塩基の溶液を調製する。15 mL 試験管に、1 mM EDTA および 20 mM Tris-HCl (25 °C で pH 8.0) の溶液を 10 mL 加えて、1x UDG 反応バッファーを模倣します。1 mL の 0.25 M HCl で酸性にし、pH メーターで pH が 0.5 ~ 2 ±あることを確認します。1 mL の 0.23 M トリス塩基で中和し、pH メーターで最終 pH が 6.5 ± 0.5 であることを確認します。
注: pHテストストリップを使用すると、試薬混合物のpHレベルをすばやく簡単に再確認できます。 - 1 μL の 0.25 M HCl を加えて 10 μL の反応混合物を酸性にし、酵素を失活させ、氷上に 6 分間置きます。1 μL の 0.23 M トリス塩基を加えて DNA 産物を中和し、酸への長時間の曝露による AP 部位の切断を回避します。13 μL TE を追加して、 マトリックスチップ 転送用の製品混合物の体積を増加させ、氷の上に置きます。
注: AP プロダクトは化学的に不安定であり、2 日以内に MALDI-TOF MS によって分析されるべきです。1週間以上長期間保存した後、AP生成物のβ/δ除去反応により、鎖切断のかなりの部分の蓄積が起こる(図1D-G)。
- 0.25 M HClおよび0.23 M Tris塩基の溶液を調製する。15 mL 試験管に、1 mM EDTA および 20 mM Tris-HCl (25 °C で pH 8.0) の溶液を 10 mL 加えて、1x UDG 反応バッファーを模倣します。1 mL の 0.25 M HCl で酸性にし、pH メーターで pH が 0.5 ~ 2 ±あることを確認します。1 mL の 0.23 M トリス塩基で中和し、pH メーターで最終 pH が 6.5 ± 0.5 であることを確認します。
- すべての25 μL UDG反応産物を微量遠心チューブから384ウェルマイクロタイタープレートに移す。
注: バッファー中のナトリウムやカリウムなどの高濃度の陽イオンは、MALDI-TOF MS 分析で干渉を発生させるため、脱塩が必要です。 大腸菌 UDG反応バッファーは、非常に低濃度の陽イオンを含むため、脱塩は不要である。ただし、このプロトコールを変更して、前述のように脱塩を必要とする金属カチオンを含む他のDNAグリコシラーゼ反応を測定します35。
3. UDG反応生成物をマトリックスチップに転写する
- ナノリットルディスペンサーのドアを開き( 材料表を参照)、ステップ2.7から384ウェルマイクロタイタープレートをデッキのプレートホルダーにロードします。
- マトリックスチップアレイを対応するスカウトプレートの位置に挿入します。装填されたスカウトプレートをナノリットルディスペンサーの処理デッキに置き、ドアを閉じます。
- 転写画面の ラン ボタンをタッチし、装置が384ウェルマイクロタイタープレートからマトリックスチップへのサンプルの分配を開始するのを待ちます。
- 「ビジョン」(Vision) タブオプションを使用して、ディスペンス中のチップの画像と各スポットのディスペンスボリュームを表示します。チップ上の斑点のあるボリュームが5~10 nLの範囲であることを確認します。
4. 質量分析計のアッセイパラメータの設定
- アプリケーションプログラム( 材料表を参照)を使用して、インポートする予測信号m/z値を含む.xlsxファイルを準備します。
注: FILE I.xlsx (表 2) の設定は、セクション 2 の G:U 基質の UDG アッセイの設定例です。 - アプリケーションプログラムを使用して、 デザイナーフォーマットでアッセイグループをインポート オプションを右クリックし、ドロップダウンリストから.xlsxファイル(ステップ4.1の FILE I.xlsx など)を選択して、新しいUDGアッセイを作成および定義します。
- 「顧客:プロジェクト:プレート」ボタンを右クリックし、ドロップダウンオプションツリーの上部をクリックして、新しいアッセイプレートを確立します。ダイアログボックスで、ファイル名(ラボコードとアッセイ日を表すCTT20210620など)を入力し、プレートタイプドロップダウンで384ウェルプレートタイプを選択してOKを押します。画面の右側に表示される空白のプレートを探します。
- 「アッセイ」オプションをクリックします。ドロップダウンリストからアッセイ(FILE I.xlsxなど)を選択します。
- 選択したアッセイ(FILE I.xlsxなど)をプレート上の各サンプルスポット位置に割り当てるには、ブランクプレートの各位置にカーソルを移動し、ウェルをクリックして強調表示し、右クリックしてAdd Plexを選択します。
- デスクトップまたはラップトップコンピュータを使用して、ステップ2.7のチップ上のすべてのサンプルについて、ヘッダーのない.xlsx形式(例:表3の0620.xlsx)の作業リストを準備します。「新規サンプルプロジェクトを追加」ボタンをクリックします。ドロップダウンリストからファイル(0620.xlsxなど)を選択して、作業リストをインポートします。
- 画面の左側にある作業リスト(0620.xlsxなど)ですべてのテストサンプルコードを探します。作業リストのサンプルコードをクリックし、プレートの対応する位置を右クリックして、テストを各位置にリンクします。
5. 質量分析計の動作
- アプリケーションプログラムを使用して、質量分析計( 材料表を参照)を分析対象のサンプルチップ(セクション3から)にリンクします。
- デフォルト設定をクリックします。ダイアログボックスで、手順4.3のファイル名を入力します(CTT20210620など)。[実験名] に、チップ バーコードにチップ ID を入力し、設定を保存します。
- 質量分析計制御プログラムを起動します( 材料表を参照)。
- 質量分析計の 入出力 ボタンを押し、デッキを伸ばします。チップホルダーを取り出し、ステップ3.4のサンプルチップをチップホルダーに挿入します。ロードされたチップホルダーを拡張デッキに置き、サンプルチップが装置に入るための入力/出力ボタンを押します。
- アプリケーション・プログラムの 「取得」 アイコンをダブルクリックします。 集録 ウィンドウで、 自動実行 タブをクリックして装置を起動し、チップ上のサンプルから質量スペクトルを取得します。
6. マススペクトルの表示とデータの分析
- データ分析プログラムを実行します ( 材料表を参照)。
- データベースツリーを参照し、ステップ5.2のチップIDを選択します。チップ上のターゲットウェルをクリックしてハイライトし、スペクトルアイコンをクリックしてマス スペクトル を表示します。
- 右クリックして 「カスタマイズダイアログ」 を選択すると、新しいウィンドウで特定の範囲のスペクトルがトリミングされます。 X軸 をクリックしてm/zの上限と下限を入力し、 OK を押して目的の信号を含む指定範囲スペクトルを表示します。
注:DNAの量は、各m/z値単位におけるピーク強度に比例する。 - U基板、APプロダクト、およびテンプレートに対応する信号のm/z値のピーク高さを測定します。ピークをクリックし、画面の左上隅にピークの高さを表示します。
メモ:1,600幅/1,200ユニットのスペクトルは、コンピュータ画面上の検査や記録管理に妥当な寸法です。 - 記録保持のためにスペクトルを保存するには、[ エクスポート ] を右クリックし、ドロップダウン リストで [ JPEG ファイル の種類] を選択します。 [保存先 ]をクリックし、[ディスクの 参照] をクリックして、ドロップダウンリストで ストレージデバイス (フラッシュディスクE:など)を選択します。 ファイル名 (0620_1-2.jpg など) を入力し、[ エクスポート] をクリックします。
- 必要に応じて、書き出したJPEGファイルを印刷し、ルーラーを使用してピークの高さを手動で測定します。
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Representative Results
テンプレートと基板
中央にU(U+9)をGテンプレートと対にした合成オリゴヌクレオチドを例にとると(図1A)、等モル量のテンプレートとウラシル含有基質のブランク制御を合成オリゴヌクレオチド純度の品質管理に使用できます(図1B;シグナルは指定されたm/zと一致し、低バックグラウンドノイズ)。MSデータ解析のために、ピーク高さを測定した(図2)。19ntの鋳型DNAは、グリコシラーゼ加水分解後も変化しないままであると予想された。したがって、この信号はAP生成物の定量の基準として役立つ可能性があります(図1C)。
反応条件と質量スペクトル
このDNAグリコシラーゼアッセイは、標準反応に非標識オリゴヌクレオチドを使用して行うのが簡単で簡単で、クリーンで信頼性の高い結果が得られます (図1)。MSスペクトルの範囲は、基質、テンプレート、および反応生成物から生成されるすべての信号をカバーする必要があります(図1B)。基板と対応するテンプレートとの間の1ntの差は、テンプレートと基板の両方について十分に分離されたシグナルプロファイルを生成した(図1B)。等モルプライマーU+9およびT1は、有意差なく同様のピーク強度を示した。UDGの広範な消化(30分間の反応で0.5単位)は、完全なウラシル切断を実証した。AP生成物のシグナルもウラシル含有基質のシグナルから良好に分離されていた(図1C d+9 AP生成物m/z = 5447.6対 図1B U+9基質m/z = 5541.6)。この研究で用いた比較的穏やかなMALDIイオン化技術36 は、APサイト37でのβ除去反応によって誘発される鎖切断に関連するシグナルを最小限に抑えたが、これは質量スペクトルにおいて有意ではなかった。全体として、反応の背景は非常にきれいで、ノイズは目立たない(図1C)。
等モル条件下では、AP生成物の相対シグナル強度は、T1テンプレートを基準として用いたU基板の相対シグナル強度に匹敵した(図1B、 U+9/T1対d+9/T1)。したがって、UDG活性の計算は、式(1)によるU含有基質(50pmolまたは20pmol)の正確な入力に基づいている。
UDGアクティビティ=(APプロダクトの信号)/(U基板の信号+APプロダクトの信号)×[U](1)
MALDI-TOF MS アッセイにより決定された UDG 動態パラメータ
図2に示すように、3分間の反応を通して、0.01単位から0.1単位までのUDG反応は、用量依存性および時間依存性の両方を示した。G:U基質の速度論的パラメータKmおよびkcatの決定には、3.2pM(反応100μLあたり0.1単位)の濃度を使用した(表1)。UDG反応のアリコートを除去し、30秒および60秒間クエンチした。ウラシル含有基質が50%未満消化された条件下で速度論的データが得られ、10〜200nMの範囲の5つの基質濃度が分析に供された。前定常状態のタイムコースは、レート分析に対して優れた線形性を示しました。反応速度プロットの一例を図3Aに示し、生成物および基質の相対MSシグナル強度を濃度(nM)に変換する。UDG反応速度(v)は、1秒間に生成されるAPサイトのnMとして表される。KmとVmaxは、ラインウィーバー-バークプロットから計算しました(図3B)。したがって、MALDI−TOF MSアッセイから導出されたUDG動態パラメータは、Km = 50nM、Vmax = 0.98nM s−1、およびKcat = 9.31 s−1であると決定された。この値は、Km = 40 nMおよびKcat = 13.3 s-138である以前の3H-ウラシル放出アッセイの結果に匹敵する。
G:U+9二重鎖をUDG感度アッセイに供した。MALDI−TOFのMSアッセイによって測定された単位を、従来の3H−ウラシル放出法によって製造業者が定義した単位に対してプロットした38。図3Cに示すように、MALDI−TOFのMS測定単位は、y=0.933x + 0.0003および決定係数R2 = 0.9974の相関式で、0.001単位から0.02単位まで定義された単位に比例していた。検出限界は、変動係数=9.2%として0.001単位であり、信号対雑音比の約5倍である。したがって、このMALDI−TOF MSアッセイは、UDGが主にユニットレベルで使用されるため、十分な感度を提供する39。
UDGの基質特異性
このUDG MALDI−TOF MSアッセイの特徴の1つは、ラベルフリーであり、基板設計に高い汎用性をもたらすことである。この特徴は、UDGの基質特異性を解析するのに非常に有用である。表1に実証されるように、ウラシルは、特異性アッセイのために、一本鎖または二本鎖DNAの5'末端または3'末端付近の任意の場所に挿入することができた。基質特異性のために、UDGが一本鎖DNA38からウラシルを除去する際に非常に活性であることはよく知られている。実際に、表1に示すように、一本鎖基質からのウラシル切除(ssU)は、相補的DNA鎖にアニールすると3.7倍減少し、G:U二重鎖を形成した。一般的に使用されるA:Uデュプレックス6、7、8の場合、反応速度はssUに対して約10倍低下した。UDGはDNA末端のUに作用しなかった(表1のG:U+1、G:U-1、およびG:U-2の基質)ことは、以前の研究と一致している40,41。興味深いことに、5'末端から2位と3位の位置のUは、中央のUよりもそれぞれ2倍および1.5倍高いUDG触媒率を示した(表1、G:U+2およびG:U+3対G:U)。 UDGは、中心のUよりも8%少ない活性で3'末端からU3-ntを切除した(表1、 G:U-3 対 G:U)。
ウラシルグリコシラーゼ阻害剤 UDG反応の阻害
ウラシルグリコシラーゼ阻害剤(UGI)は、バクテリオファージタンパク質であり、1:142の化学量論による可逆的なタンパク質結合によって大腸菌UDGを阻害する。UGIによるUDG活性の阻害を図4に示す。0.05単位(100pM)のUGIの存在下では、0.05単位のUDG(8pM)の活性が検出不可能なレベルまで阻害された。IC50は7.6pMであった。したがって、UDG MALDI−TOF MSアッセイは、他のDNAグリコシラーゼの阻害剤の発見のためのマススクリーニングアッセイに容易に改変することができる。
図1:DNAグリコシラーゼアッセイのモデル系。(A)単一のウリジン(U+9)を含む病変鎖を鋳型(T1)にアニーリングし、G:Uミスマッチ(太字)を形成した。ウラシルDNAグリコシラーゼは、ウラシルを検出して除去し、AP部位(d)を形成する。MALDI−TOFMSに供すると、U含有DNAとAP産物のm/z値の差をBに示すように解消することができる。(B)19 ntテンプレート(T1)にアニーリングされた単一のウリジン(U+9)を含む18 nt DNA(表1)を、40 μLの反応緩衝液中で50 pmolの基質の酵素ブランクとして試験し、MS分析を行った。(C)37°Cで0.5単位のUDGを用いて10 μLの反応で50 pmolの基質をほぼ完全に酵素消化し、(D)単一のウリジン(U+3)を含む18 nt DNAを40 μLの反応緩衝液中の50 pmol基質のT1酵素ブランクにアニーリングし、MS分析を行った。(E)0.5単位のUDGを37°Cで30分間、10μL反応で50pmolのU+3基質をほぼ完全な酵素消化してd+3を生成し、30時間以内にMS分析を行った。 (F)反応条件は、d+3生成物が95°Cで0.1M NaOH中30分間β脱離反応を起こし、B15断片化生成物を生成することを除いてEと同じであった。MS分析を行った。(g)反応条件は、d+3生成物を-20°Cで7日間以上保存した以外はEと同様とした;d+3 のほんの一部が B15 断片化された製品に変換されます。この数値は 43 から修正されています。略語: nt = ヌクレオチド;MS = 質量分析;MALDI-TOF MS = マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間 MS;AP = アプリニン/アピリミジン酸;UDG = ウラシル-DNAグリコシラーゼ;T1 = 19 nt G 含有テンプレート;U+9 = 18 nt U含有基質;d+9 = 18 nt AP サイト含有製品;U+3 = 18 nt U含有基質;d+3 = 18 nt AP サイト含有製品;B15 = 15 nt β除去断片化生成物。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:異なる酵素濃度でのUDG活性の経時変化分析。 G:U病変を含む基質DNA、50pmol、0.01、0.02、0.05、および0.1単位のUDGと共に37°Cでインキュベートした。 アリコート(10 μL)を反応混合物から0、0.5、1、2、および3分間で採取し、等量のフェノール/クロロホルムでクエンチした。(a)UDGによる処理G:U基質の濃度依存性を示すMALDI-TOFマススペクトル。(B)生成物の量を時間の関数としてプロットした。UDG: 0.01 (実線付きの閉じた三角形)、0.02 (破線付きの開いた三角形)、0.05 (実線付きの閉じた円)、および 0.1 単位 (実線付きの開いた円)。データは3つの独立した決定の平均であり、誤差範囲は1 S.D.を表します。この数値は 43 から修正されています。略語: nt = ヌクレオチド;MALDI-TOF = マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間;AP = アプリニン/アピリミジン酸;UDG = ウラシル-DNAグリコシラーゼ;T = 19 nt G 含有テンプレート;U=18nt U含有基質;AP = 18 nt AP サイト含有製品。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:MALDI−TOF分析を用いたUDGの動力学的パラメータの決定。ミカエリス・メンテン曲線およびラインウィーバー・バークプロットは、DNAからのウラシルのUDG酵素触媒による切除のためのKmおよびkcatを決定する。DNAグリコシラーゼMALDI−TOF MSアッセイは、30秒および60秒の100μL反応において、0.1単位のUDGおよび異なる濃度(10、30、60、100、200nM)の基質を用いて実施した。エラーバーは、アッセイのための1SD.(B)ラインウィーバー−バークプロットを表す。示された切片は、Km および Vmax の計算を許可します。(C)MALDI−TOFのMS分析によるUDGアッセイを製造業者が割り当てたユニットと比較した。酵素活性は、18/19 nt DNA二重鎖内で50 pmol (0.56 μg) の G:U を含む 10 μL 反応で AP 部位を形成するウラシル除去により、37 °C で 30 分間測定しました。 UDGを緩衝液[50%グリセロール、20mMトリス塩酸(pH7.5)、30mM NaCl、0.5mM EDTA、1mMジチオスレイトール]で氷上で希釈した。単位は、毎分60pmolのウラシルの放出を触媒する酵素の量として定義した。エラーバーは、6回の実験の標準偏差を示す。この数値は 43 から修正されています。略語: nt = ヌクレオチド;MALDI-TOF = マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間;UDG = ウラシル-DNAグリコシラーゼ;AP = アプリニン/アピリミジン酸;V、反応速度 nM/s。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:UGIの添加によるUDG酵素阻害曲線。 阻害曲線は、0.001単位(5pM)から0.1単位(200pM)までのUGIの存在下で、0.05単位のUDG(8pM)および50pmolの基質との20μLの反応を用いて15分間決定した。データは3つの独立した測定の平均であり、エラーバーはオンラインIC50 計算機との1 S.D.データ適合を表します( 材料表を参照)。この数値は 43 から修正されています。略語: UDG = ウラシル-DNAグリコシラーゼ;UGI=ウラシルグリコシラーゼ阻害剤。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| DNA基質 | オリゴヌクレオチド | DNAシーケンシングb | 初期レート | k 猫 | |
| (単位/秒) | (s-1) | ||||
| ssU+9 | U+9 | 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' | 0.560 ± 0.098 | 35 | |
| ssU+3 | U+3 | 5'-GAUCAGTCCGGAGGTTGG-3' | 0.756 ± 0.083 | 47.3 | |
| ssU-3 · | U-3 | 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3' | 0.448 ± 0.087 | 28 | |
| G:U | T1 · | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0.149 ± 0.046 | 9.31 | |
| U+9 | 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' | ||||
| A:U | ティッカー | 3'-CTGGTCAGACCTGCAACCG-5' | 0.053 ± 0.018 | 3.31 | |
| U+9 | 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' | ||||
| G:U5'+3 | T1 · | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0.256 ± 0.044 | 16 | |
| U+3 | 5'-GAUCAGTCCGGAGGTTGG-3' | ||||
| G:U5'+2 | T3 · | 3'-CGGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0.567 ± 0.016 | 35.4 | |
| U+2 | 5'-GUCCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G:U5'+1 | T4 · | 3'-GTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | ティッカー | ティッカー | |
| U+1 | 5'-UACCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G:U3'-3 | T5 · | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAGCCG-5' | 0.138 ± 0.015 | 8.63 | |
| U-3 | 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3' | ||||
| G:U3'-2 | T6 · | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAAGC-5' | ティッカー | ティッカー | |
| U-2 · | 5'-GACCAGTCCGGACGTTUG-3' | ||||
| G:U3'-1 | T7 · | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACGG-5' | ティッカー | ティッカー | |
| U-1 | 5'-GACCAGTCCGGACGTTGU-3' | ||||
表1:基質組成およびUDG特異性。 この表は、U±Nによって指定された18ntのU含有DNAを示す。'+'は5'末端からウラシル位置を数えることを示し、'-'は3'末端からウラシル位置を数えることを示す。たとえば、U+9 は 5' 末端から 9 番目の 位置、U-3 は 3' 末端から 3 番目の 位置です。T1〜T7の相補的な19ntテンプレートは、示されているように、G:UまたはA:Uミスマッチを形成するU含有DNAと対になるであろう。ウラシル基地は太字で表記されている。反応は、プロトコールセクション2に記載したように、50pmolのU基質、0.05単位のUDGを10μLで使用した。この表は 43 から変更されています。略語: UDG = ウラシルDNAグリコシラーゼ;nt = ヌクレオチド;ND、検出できません。
| 第2回 PCRP | 第1回PCRP | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | ティッカー | PcGC | プワーン | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | EXT1_コール | EXT1_質量 |
| ティッカー | ティッカー | ティッカー | ティッカー | ティッカー | ティッカー | ティッカー | F | 5789.8 | GCCAACGTCCGGACTGGTC | |||
| ティッカー | ティッカー | ティッカー | ティッカー | ティッカー | ティッカー | ティッカー | F | 5541.6 | GACCAGTCUGGACGTTGG | |||
表 2: ファイル I.xlsx ファイル。 この設定は、図 1B、C、および 図 2A に使用されました。0 分のエントリ。本研究で用いたMALDI−TOFのMS系は、増幅された遺伝子配列変動の領域への伸長プライマーの一塩基伸長による一塩基多型を解析するように特異的に設計された。UDGアッセイの場合、アッセイ群FILE I.略語を調製する際に使用されたのは6つのフィールドのみであった:WELL = アッセイに割り当てられたウェル番号;TERM = 終了ミックス;SNP_ID=一塩基多型の入力配列の名前;2nd-PCRP = フォワードアンプリコンプライマー;第1-PCRP = 逆アンプリコンプライマー;AMP_LEN = アンプリコン長;UP_CONF = ユニプレックス増幅スコア;MP_CONF = 多重増幅スコア;Tm=融解温度;PcGC = GC コンテンツの割合。PWARN = アッセイ設計の警告コード。UEP_DIR = プライマー伸長の方向;UEP_MASS = 非伸長プライマー質量;UEP_SEQ = 非拡張プライマー配列;EXT1_CALL=分析物1質量ピークに与えられた名称;EXT1_MASS = 分析物の質量 1.
| 0620_1-2 |
| 0620_1-3 |
| 0620_1-4 |
| 0620_1-5 |
| 0620_1-6 |
| 0620_1-7 |
| 0620_1-8 |
表 3: 0620.xlsx ファイル。 これらの設定を、 図4AのUGI阻害反応に使用した。略称:UGI=ウラシルグリコシラーゼ阻害剤。
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Discussion
このホワイトペーパーでは、UDG MALDI−TOF MSアッセイ法を使用してAP含有DNA産物を直接検出するための詳細な手順を提供する。この方法の主な利点は、ウラシル含有基質がラベルフリーで、スケーラブルで、取り扱いが容易で、基質設計においてより大きな柔軟性を有することである。
UDGサプライヤーが推奨するフェノール/クロロホルム抽出は、酵素の不活性化を可能にし、製品DNAの分解を防ぎます。しかし、フェノール抽出プロトコルには、有害な化学物質の退屈な相分離が含まれます。反応pHを2±0.5に下げるためにHClを使用する代替酸停止法もまた、効果的に失活したUDGである。その後のトリス塩基による中和は、DNA損傷を防ぐことができる。AP生成物を30時間以内にMS分析に供したところ、質量スペクトルに塩基損失または修飾の徴候はなかった(図1E)。反応中のトリス緩衝液には市販のUDGを付属させた。しかし、トリスを含む様々なアミンは、高い試薬濃度ではあるが、β除去を介してAP部位を切開することができる44。HEPESおよびリン酸緩衝液などのいくつかの代替手段は、β−排除によるAP部位の切断のリスクを回避するために考慮され得る。
潜在的なUDG参照法として、以下の理由から、中心G:U基質の二重鎖(表1、T1/U+9)が標準基質として推奨される:1.生理学的関連性のために、G:Uは、G:C対におけるシトシンの脱アミノ化がG:U病変をもたらすので、A:Uよりも優れている。 2. 大腸菌 UDGは一本鎖DNAからUを加水分解するためにより高い特異性を示すが、一本鎖DNAにおけるU病変の修復はまれである。3. 試験したすべてのG:U基質について、G:U+2およびG:U+3はG:U+9よりも高い反応速度を示した。しかし、鎖切断に隣接するDNA脱アミノ化病変は稀である。天然病変を模倣するには、DNA二重鎖の中心にG:Uを配置することがより適切であろう。
興味深いことに、MALDI−TOFのMS法はUDG動態パラメータを生成し、G:U反応の酵素単位(図3A−C)は、3H−ウラシル38を用いた従来の結果と非常によく似ていた。しかし、この研究における単一のG:U基質は、DNA合成エラーからの複数のA:Uを有する前述のPBS1バクテリオファージDNAとは大きく異なる38。さらに、UDGは、G:U基質よりもG:Uで3倍高い活性を示した(表1、G:U対A:UのKmおよびKcat)。 この一見矛盾する結果は、複数のA:U病変の形態で36%のUを含むPBS1基質のDNA配列に起因する可能性がある45が、G中のUのわずか3%と比較して:U基板(表1)。一方、UDGは非常に「プロセッシブ」な酵素であり、すなわち、単一のタンパク質-DNA結合事象が複数のウラシル切断を惹起する12。これら2つのUDG法の間にほぼ完全な1対1の相関関係が見いだされたため、このMS法は従来の放射性同位元素アッセイの代わりに魅力的な選択肢となります。
このアプローチは簡単に拡張できます。この研究におけるすべてのUDG反応は、マイクロピペットおよび微量遠心チューブを使用して手動で実施され、所与の日に〜30回の試験が実施された。したがって、セクション3〜5で説明したMALDI−TOFMSシステム用の384ウェルプレートフォーマットチップアレイ( 材料表を参照)の容量の10分の1未満を使用した。対照的に、384ウェルマイクロプレート用の自動ピペッティングシステムの適応は、酸終端法を使用することによって、このアプローチの毎日の生産量を容易に増加させることができる。したがって、300個のUDG反応には〜1時間かかるであろう。MALDI-TOF MS システム( 材料表を参照)は、1 時間で最大 300 回の反応の質量スペクトルデータを出力できます。したがって、合理化されたプロセスは、300 UDG MALDI−TOF MSアッセイを完了するために2時間を必要とする。
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Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
我々は、NCFPB機能ゲノミクス統合コアファシリティ(台湾・台北)及びNRPBファーマコゲノミクス・ラボ(台湾・台北)の技術支援に感謝する。この研究は、台湾科学技術部(R.O..C.の支援を受けた[助成金番号MOST109-2314-B-002-186からK.-Y.S.、ほとんどが107-2320-B-002-016-MY3からS.Y..C、MOST 110-2320-B-002-043からW.-h.F.へ]。H.-L.C.は国立台湾大学から博士研究員を授与されています。オープンアクセス料金のための資金:科学技術省、R.O..C。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) | J.T baker | Protocol 1,2 | |
| Autoclaved deionized water | MILLIPORE | Protocol 1,2 | |
| EDTA | J.T Baker | Protocol 1,2 | |
| Gloves | AQUAGLOVE | Protocol 1,2,3 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | SIGMA | Protocol 1,2 | |
| Ice bucket | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Low retention pipette tips(0.5-10 µL) | extra gene | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(1,250 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(200 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | Protocol 4, 5 Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process. |
|
| MassARRAY Nanodispenser | AAT Bioquest, Inc. | RS1000 | Protocol 3 |
| Microcentrifuge | Kubota | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge | Clubio | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | National scientific supply co, Inc. | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube rack | Taiwan.Inc | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P1000) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P2) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P10) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P100) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P200) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (SL2) | Rainin | Protocol 1,2 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Singapore) | Protocol 1,2 | |
| Quest Graph IC50 Calculator (v.1) | AAT Bioquest, Inc. | Fig. 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1 |
|
| Sodium hydroxide (NaOH) | WAKO | Protocol 2 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | Protocol 3, 5 |
| Timer | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | Protocol 6 Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer. |
| UDG Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs, MA | B0280S | Protocol 2 |
| Uracil Glycosylase Inhibitor | New England Biolabs, MA | M0281S | Protocol 2 |
| Uracil-DNA Glycosylase | New England Biolabs, MA | M0280L | Protocol 2 |
| UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 | SHIMADZU | Protocol 1 | |
| Water bath | ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) | Protocol 2 |
References
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