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Neuroscience

Analisi citometrica a flusso di parametri mitocondriali multipli in cellule staminali pluripotenti indotte umane e loro derivati neurali e gliali

Published: November 8, 2021 doi: 10.3791/63116
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3,4, 1,2, 1,2
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling
* These authors contributed equally

Summary

Questo studio riporta un nuovo approccio per misurare più parametri funzionali mitocondriali basati sulla citometria a flusso e sulla doppia colorazione con due reporter fluorescenti o anticorpi per rilevare cambiamenti nel volume mitocondriale, potenziale di membrana mitocondriale, livello di specie reattive dell'ossigeno, composizione della catena respiratoria mitocondriale e DNA mitocondriale.

Abstract

I mitocondri sono importanti nella fisiopatologia di molte malattie neurodegenerative. I cambiamenti nel volume mitocondriale, il potenziale di membrana mitocondriale (MMP), la produzione mitocondriale di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il numero di copie del DNA mitocondriale (mtDNA) sono spesso caratteristiche di questi processi. Questo rapporto descrive un nuovo approccio basato sulla citometria a flusso per misurare più parametri mitocondriali in diversi tipi di cellule, tra cui cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e cellule neurali e gliali derivate da iPSC. Questa strategia basata sul flusso utilizza cellule vive per misurare il volume mitocondriale, i livelli di MMP e ROS, nonché cellule fisse per stimare componenti della catena respiratoria mitocondriale (MRC) e proteine associate al mtDNA come il fattore di trascrizione mitocondriale A (TFAM).

Co-colorando con reporter fluorescenti, tra cui MitoTracker Green (MTG), tetrametilrodamina estere etilico (TMRE) e MitoSox Red, i cambiamenti nel volume mitocondriale, MMP e ROS mitocondriale possono essere quantificati e correlati al contenuto mitocondriale. La doppia colorazione con anticorpi contro le subunità del complesso MRC e la translocasi della membrana mitocondriale esterna 20 (TOMM20) consente la valutazione dell'espressione della subunità MRC. Poiché la quantità di TFAM è proporzionale al numero di copie del mtDNA, la misurazione del TFAM per TOMM20 fornisce una misurazione indiretta del mtDNA per volume mitocondriale. L'intero protocollo può essere eseguito entro 2-3 ore. È importante sottolineare che questi protocolli consentono la misurazione dei parametri mitocondriali, sia a livello totale che a livello specifico per volume mitocondriale, utilizzando la citometria a flusso.

Introduction

I mitocondri sono organelli essenziali presenti in quasi tutte le cellule eucariotiche. I mitocondri sono responsabili dell'approvvigionamento energetico producendo adenosina trifosfato (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa e agiscono come intermediari metabolici per la biosintesi e il metabolismo. I mitocondri sono profondamente coinvolti in molti altri importanti processi cellulari, come la generazione di ROS, la morte cellulare e la regolazione intracellulare di Ca2+. La disfunzione mitocondriale è stata associata a varie malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson (PD), il morbo di Alzheimer (AD), la malattia di Huntington (HD), l'atassia di Friedreich (FRDA) e la sclerosi laterale amiotrofica (SLA)1. Si ritiene inoltre che l'aumento della disfunzione mitocondriale e l'anomalia del mtDNA contribuiscano all'invecchiamento umano 2,3.

Vari tipi di disfunzione mitocondriale si verificano nelle malattie neurodegenerative e cambiamenti nel volume mitocondriale, depolarizzazione MMP, produzione di ROS e alterazioni nel numero di copie del mtDNA sono comuni 4,5,6,7. Pertanto, la capacità di misurare queste e altre funzioni mitocondriali è di grande importanza quando si studiano i meccanismi della malattia e si testano potenziali agenti terapeutici. Inoltre, in considerazione della mancanza di modelli animali che replicano fedelmente le malattie neurodegenerative umane, stabilire adeguati sistemi modello in vitro che ricapitolino la malattia umana nelle cellule cerebrali è un passo importante verso una maggiore comprensione di queste malattie e lo sviluppo di nuove terapie 2,3,8,9.

Le iPSC umane possono essere utilizzate per generare varie cellule cerebrali, comprese le cellule neuronali e non neuronali (cioè le cellule gliali), e il danno mitocondriale associato alla malattia neurodegenerativa è stato trovato in entrambi i tipi di cellule 3,10,11,12,13. I metodi appropriati per la differenziazione delle iPSC in linee neurali e gliali sono disponibili14,15,16. Queste cellule forniscono una piattaforma uomo/paziente unica per la modellazione in vitro della malattia e lo screening dei farmaci. Inoltre, poiché questi sono derivati dai pazienti, i neuroni derivati da iPSC e le cellule gliali forniscono modelli di malattia che riflettono ciò che sta accadendo negli esseri umani in modo più accurato.

Ad oggi, sono disponibili pochi metodi convenienti e affidabili per misurare più parametri funzionali mitocondriali nelle iPSC, in particolare i neuroni viventi e le cellule gliali. L'uso della citometria a flusso fornisce allo scienziato un potente strumento per misurare i parametri biologici, compresa la funzione mitocondriale, in singole cellule. Questo protocollo fornisce dettagli per la generazione di diversi tipi di cellule cerebrali, tra cui cellule staminali neurali (NSC), neuroni e astrociti gliali da iPSC, nonché nuovi approcci basati sulla citometria a flusso per misurare più parametri mitocondriali in diversi tipi di cellule, tra cui iPSC e cellule neurali e gliali derivate da iPSC. Il protocollo fornisce anche una strategia di co-colorazione per l'utilizzo della citometria a flusso per misurare il volume mitocondriale, MMP, livello di ROS mitocondriale, complessi MRC e TFAM. Incorporando misure del volume o della massa mitocondriale, questi protocolli consentono anche la misurazione sia del livello totale che del livello specifico per unità mitocondriale.

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Protocol

NOTA: Vedere la tabella dei materiali e la tabella supplementare S1 per le ricette di tutti i supporti e le soluzioni utilizzate in questo protocollo.

1. Differenziazione delle iPSC umane in NCS, neuroni dopaminergici (DA) e astrociti

  1. Preparare piastre rivestite di matrice.
    1. Scongelare un flaconcino di 5 mL di matrice sul ghiaccio durante la notte. Diluire 1 mL di matrice con 99 mL di freddo Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (Advanced DMEM/F12) (concentrazione finale 1%). Preparare 1 mL di aliquote e conservarle a -20 °C.
    2. Scongelare la soluzione della matrice a 4 °C (tenerla fredda) e rivestire 6 pozzetti (1 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
    3. Posizionare la piastra rivestita di matrice in un incubatore d'aria umidificato al 5% di CO2/95% a 37 °C per 1 ora. Estrarre la piastra dall'incubatore e lasciarla equilibrare a temperatura ambiente (RT).
      NOTA: Si consiglia di utilizzare la piastra entro 3 giorni dal rivestimento. Tuttavia, la piastra rivestita può essere conservata fino a 2 settimane a 4 °C. Ricordati solo di estrarlo e lasciarlo riscaldare a RT prima dell'uso. Per una conservazione prolungata, aggiungere 1 mL di terreno di coltura iPSC alla piastra rivestita per evitare l'essiccazione della matrice.
  2. Scongelamento delle iPSC
    1. Preriscaldare le piastre rivestite di matrice a RT o nell'incubatore a 37 °C per 20-30 minuti. Preriscaldare la quantità richiesta di terreno di coltura iPSC a RT.
    2. Miscelare 6 ml di terreno di coltura iPSC preriscaldato con 12 μL di inibitore ROCK Y-27632 per ottenere una concentrazione finale di 10 μM.
    3. Scongelare parzialmente il flaconcino congelato di iPSC a 37 °C a bagnomaria fino a quando rimane un piccolo pezzo di ghiaccio.
    4. Aggiungere lentamente 1 mL di terreno di coltura iPSC preriscaldato con 12 μL di inibitore ROCK a goccia per goccia alle cellule. Trasferire il contenuto liquido del flaconcino con iPSC goccia a goccia in un pozzetto di una piastra preverniciata a 6 pozzetti utilizzando una pipetta da 5 ml.
    5. Spostare la piastra in direzioni perpendicolari per mescolare il contenuto del pozzetto e riportare la piastra nell'incubatore. Cambiare il terreno di coltura iPSC dopo 24 ore dopo il lavaggio con soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco (DPBS) (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
      NOTA: Non aggiungere inibitore ROCK alle poppate successive. Cambiare il terreno di coltura iPSC ogni giorno.
  3. Subcoltura di iPSC
    1. Preriscaldare le piastre rivestite di matrice a RT o nell'incubatore a 37 °C per 20-30 minuti. Preriscaldare la quantità richiesta di terreno di coltura iPSC a RT.
    2. Aspirare il terreno di coltura dalle piastre contenenti le cellule. Risciacquare le iPSC con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
    3. Aggiungere EDTA (0,5 mM) (1 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti). Incubare le placche a 37 °C fino a quando i bordi delle colonie iniziano a sollevarsi dal pozzo (di solito 3-5 minuti). Aspirare l'EDTA.
    4. Aggiungere terreno di coltura iPSC preriscaldato (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e staccare con forza le colonie di iPSC usando una pipetta sterile da 10 mL una volta. Non pipetta su e giù in quanto ciò potrebbe rompere i grumi di cellule in singole cellule.
    5. Trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in due singoli pozzetti in una piastra a 6 pozzetti rivestita di matrice (2 ml per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e incubare a 37 °C. Non generare bolle nella sospensione durante il pipettaggio.
      NOTA: Agitare delicatamente la piastra prima di tenerla nell'incubatore. Il rapporto di divisione può essere 1:2 (un pozzo in 2 nuovi pozzi) a 1:4 (un pozzo in 4 nuovi pozzi).
    6. Sostituire il mezzo ogni giorno fino a quando le colonie raggiungono il 60% di confluenza con buone dimensioni e connessioni.
  4. Induzione neurale e generazione di progenitori neurali
    1. Preparare 500 ml di terreno definito chimicamente (CDM), 500 ml di mezzo di induzione neurale (NIM) e 500 ml di mezzo privo di siero di cellule staminali neurali (NSC SF).
    2. Risciacquare le cellule con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e aggiungere NIM (3 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti). Imposta come Giorno 0.
    3. Sostituire il NIM (3 ml per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) il giorno 1, il giorno 3 e il giorno 4 e osservare al microscopio ogni giorno.
    4. Il giorno 5, staccare le rosette neurali in coltura di sospensione come descritto di seguito.
      1. Lavare una volta delicatamente con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti). Aggiungere collagenasi IV (1 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e conservare in un incubatore per 1 minuto. Aspirare delicatamente la collagenasi IV e lavare una volta con DPBS (1x) (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
      2. Aggiungere 2 ml di NSC SF Medium per pozzetto a una piastra a 6 pozzetti. Staccare le celle raschiando il fondo dei pozzetti disegnando griglie utilizzando una punta per pipetta da 200 μL.
      3. Raccogliere la sospensione cellulare dalla piastra a 6 pozzetti in un piatto non aderente da 10 cm. Portare il volume a 12 mL con NSC SF Medium.
      4. Agitare il piatto non aderente a 65-85 giri / min su uno shaker orbitale in un'incubatrice per evitare l'aggregazione.
  5. Differenziazione dei neuroni DA
    1. Il giorno 7, aggiungere 12 ml di CDM integrato con 100 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti-8b (FGF-8b) e posizionare il piatto sullo shaker orbitale nell'incubatore.
    2. Nei giorni 8-13, cambiare il mezzo ogni 2 giorni e osservare al microscopio ogni giorno.
    3. Il giorno 14, aggiungere 12 ml di CDM integrato con 100 ng/mL FGF-8b e 1 μM di purmorfinamina (PM). Posizionare il piatto sullo shaker orbitale nell'incubatore.
    4. Nei giorni 15-20, cambiare il mezzo ogni 2 giorni e osservare quotidianamente le cellule al microscopio.
    5. Far passare meccanicamente le sfere utilizzando punte da 1000 μL per rompere le sfere più grandi.
      NOTA: Il rapporto può essere 1:2 (un piatto in 2 nuovi piatti).
  6. Cessazione della differenziazione
    1. Rivestire una piastra a 6 pozzetti o coprivetrini con poli-L-ornitina (PLO) e laminina come descritto di seguito.
      1. Rivestire una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di PLO per pozzetto e incubare la piastra a 37 °C per 20 minuti. Aspirare la soluzione OLP.
      2. Sterilizzare la piastra sotto UV per 20 minuti. Risciacquare i pozzetti due volte con DPBS (1x) (4 ml per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
      3. Aggiungere 5 μg/mL di soluzione di laminina (1 mL per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti) nel pozzetto e incubare a 37 °C per 2 ore. Aspirare la laminina e lavare brevemente i pozzetti con DPBS (1x) (4 ml per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) una volta prima della placcatura.
    2. Raccogliere tutte le sfere (dal punto 1.5.5) in provette da 50 mL e rabboccare con DPBS (1x). Girare a 300 × g per 5 min. Aspira il surnatante.
    3. Incubare con 2 mL di reagente di dissociazione cellulare (vedere la tabella dei materiali) per 10 minuti a 37 °C a bagnomaria, seguita da una leggera triturazione con una pipetta da 200 μL (20-50 volte a seconda delle dimensioni delle sfere, evitando la formazione di bolle).
    4. Neutralizzare il reagente di dissociazione cellulare con 2 mL di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco con siero bovino fetale al 10% (FBS) e centrifugare il tubo conico da 50 mL contenente le cellule a 300 × g per 5 minuti a RT. Aspirare il surnatante.
    5. Aggiungere 1 mL di CDM integrato con 10 ng/mL Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) e 10 ng/mL Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor (GDNF) per risospendere i pellet cellulari pipettando delicatamente su e giù per ottenere sospensioni monocellulari.
    6. Aspirare la soluzione di laminina dalla piastra (punto 1.6.1.3), lavare brevemente con DPBS (1x) (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e seminare le cellule (dal punto 1.6.5) nelle piastre prerivestite o nei vetrini di copertura in 3 mL di CDM integrato con 10 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF. Nutrire le cellule ogni 4 giorni.
      NOTA: Le colture differenzianti possono essere mantenute per molte settimane fino a 3 mesi. La morfologia neurale di solito appare dopo 2 settimane dalla terminazione e può essere utilizzata per analisi a valle da quel punto in poi. BDNF e GDNF non sono necessari per la coltura per una manutenzione più lunga (fino a 2 mesi).
  7. Generazione NSC
    1. Piastre a matrice di rivestimento.
    2. Raccogliere tutte le sfere neurali (generate dal punto 1.4) in provette da 50 mL e rabboccare con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free). Girare a 300 × g per 5 min. Aspirare i surnatanti
    3. Incubare i pellet con 2 ml di reagente di dissociazione cellulare per 10 minuti a 37 °C a bagnomaria, seguito da una triturazione delicata con una pipetta da 200 μL (20-50 volte a seconda delle dimensioni delle sfere, evitando la formazione di bolle).
    4. Neutralizzare con 2 mL di DMEM con FBS al 10% e centrifugare le provette coniche da 50 mL contenenti le cellule a 300 × g per 5 minuti a RT. Aspirare i surnaanti. Risospendere i pellet cellulari mediante pipettaggio delicato su e giù per ottenere sospensioni monocellulari.
    5. Aspirare la soluzione della matrice da una piastra preverniciata e seminare le cellule nelle piastre prerivestite in NSC SF Medium (3 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti). Nutrire le cellule ogni 2-3 giorni e dividere le cellule quando confluenti.
      NOTA: da questa fase in poi, i NSC possono essere espansi e congelati.
  8. Differenziazione degli astrociti glia
    1. Differenziazione degli astrociti dalle NSC
      1. Preparare 500 ml di terreno di differenziazione astrocitaria.
      2. NSC di semi su piastre/coprivetrini rivestiti di poli-D-lisina (PDL) con NSC SF Medium.
      3. Il giorno seguente, sciacquare le cellule con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e aggiungere Astrocyte Differentiation Medium (3 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti). Imposta come Giorno 0.
      4. Osservare quotidianamente le NSC al microscopio e sostituire il mezzo di differenziazione degli astrociti (3 ml per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) ogni 2 giorni dai giorni 1 ai giorni 27.
    2. Maturazione degli astrociti
      1. Preparare il mezzo di maturazione degli astrociti.
      2. Il giorno 28, sciacquare le cellule con DPBS (1x) (4 ml per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) e aggiungere il mezzo di maturazione degli astrociti (3 ml per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
      3. Dal giorno 29 in poi, osservare quotidianamente le cellule al microscopio e sostituire il terreno di maturazione degli astrociti (3 ml per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) ogni 2 giorni.
      4. Dopo un mese di maturazione, espandere le cellule e crioconservarle da questa fase in poi.
        NOTA: Durante questa fase, il numero di celle aumenterà. Quando si dividono le celle, i coprivetrini rivestiti in PDL non sono necessari per la coltivazione.

2. Caratterizzazione cellulare mediante immunocitochimica e colorazione con immunofluorescenza

  1. Alla fine del periodo di coltura, trasferire i vetrini di copertura con le cellule su una piastra a 12 pozzetti.
    Risciacquare le cellule con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) (1x) due volte e incubare per 10 minuti in paraformaldeide al 4% (PFA) (0,5 ml per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti) a RT.
    NOTA: Il campione fisso può essere coperto con 2 ml di PBS (1x) e conservato a 4 °C fino a quando non è necessario per l'immunocolorazione. Il PFA è tossico ed è sospettato di causare il cancro. Prevenire l'esposizione della pelle e degli occhi e lavorare sotto una cappa aspirante chimica.
  2. Bloccare e permeabilizzare le cellule e incubare con tampone bloccante contenente PBS (1x), 0,3% Triton X-100 e 10% siero di capra normale per 1 ora a RT.
  3. Incubare con anticorpi primari nel tampone bloccante per una notte a 4 °C: iPSC coloranti con fattore di trascrizione 4 anti-ottamero-legante (Oct4) e anti-antigene-embrionale specifico anti-stadio (SSEA4), NSC con regione anti-determinazione del sesso Y box-2 (Sox2) e anti-Nestin, sfere neurali con anti-accoppiato box-6 (Pax6) e anti-Nestin, astrociti con proteina acida fibrillare anti-gliale (GFAP) e proteina legante il calcio anti-S100 β (S100β) e neuroni DA con anti-tirosina idrossilasi (TH), tubulina anti-β III (Tuj 1), anti-sinaptofisina e anti-PSD-95 (0,5 ml di soluzione anticorpale primaria per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti; vedere la tabella dei materiali per i dettagli).
  4. Lavare i campioni con PBS (1x) tre volte per 10 minuti ciascuno con un leggero dondolo.
  5. Incubare con soluzione anticorpale secondaria (1:800 in tampone bloccante, 0,5 ml di soluzione di anticorpi secondari Alexa Fluor per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti) per 1 ora a RT con un leggero dondolio.
  6. Incubare le cellule con Hoechst 33342 (1:5.000, 0,5 mL per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti) in PBS (1x) per 15 minuti a RT per marcare i nuclei.
  7. Montare le cellule con il mezzo di montaggio e asciugarle durante la notte a RT per l'imaging al microscopio a fluorescenza al buio. Vedere la Figura supplementare S1 per le impostazioni e i parametri del microscopio.

3. Misurazione della citometria a flusso del volume mitocondriale, MMP e ROS mitocondriale in cellule vive

  1. Seminare le cellule separatamente in 4 pozzetti in una piastra a 6 pozzetti fino a quando le cellule raggiungono il 50% -60% di confluenza. Etichetta questi quattro pozzi come #1, #2, #3 e #4.
  2. Alla fine del periodo di coltura, preparare 5 singole soluzioni coloranti (500 μL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) come segue: #1 solo terreno di coltura (al pozzetto #1 contenente solo cellule per il controllo); #2-1 contenente FCCP (100 μM); #2-2 contenente FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) in terreno di coltura; #3 contenente TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) in terreno di coltura; #4 contenente MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) in PBS (1x) con il 10% di FBS. Vedere la Figura 1A, la Tabella supplementare S2 e la Tabella dei materiali per i dettagli su questi composti e la configurazione della citometria a flusso.
    NOTA: Utilizzare il terreno di coltura per preparare la soluzione colorante. Riscaldare il mezzo e PBS (1x) a RT prima dell'uso. FCCP è tossico; prevenire l'esposizione della pelle e degli occhi e lavorare sotto una cappa di fumi chimici.
  3. Aspirare il mezzo dal pozzetto #2 e aggiungere la soluzione #2-1 (solo FCCP). Incubare le cellule a 37 °C per 10 minuti.
  4. Aspirare il mezzo dai pozzetti #2 e #3 e aggiungere la soluzione #2-2 (FCCP + TMRE + MTG) nel pozzetto #2 e la soluzione #3 (TMRE + MTG) in #3. Incubare le cellule a 37 °C per 45 minuti.
  5. Aspirare il mezzo dal pozzetto #4 e aggiungere la soluzione #4 (MitoSox Red + MTG). Incubare le cellule a 37 °C per 15 minuti.
  6. Aspirare il mezzo da tutti i pozzi. Lavare con PBS (1x) (4 ml per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti). Staccare le cellule usando 1 mL di reagente di dissociazione cellulare (1 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti) a 37 °C per 5 minuti. Neutralizzare il reagente di dissociazione cellulare in 1 mL di DMEM con FBS al 10% (2 mL per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti).
  7. Raccogliere il contenuto di tutti i pozzetti in tubi conici da 15 ml. Centrifugare i tubi a 300 × g per 5 min. Lavare il pellet con PBS (1x) una o due volte.
  8. Aspirare i surnatanti ma lasciare circa 100 μL nelle tube. Risospendere i pellet cellulari in 300 μL di PBS (1x). Trasferire le cellule in provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Tieni i tubi al buio a RT.
  9. Analizzare le cellule utilizzando un citometro a flusso (con una configurazione laser 3 blu e 1 rosso). Rileva MTG nel filtro 1 (FL1) utilizzando un filtro passa banda 530/30, TMRE nel filtro 2 (FL2) utilizzando il filtro passa-banda 585/40 e MitoSox Red nel filtro 3 (FL3) utilizzando un filtro passa banda 510/580.

4. Misura della citometria a flusso di subunità del complesso MRC e TFAM in celle fisse

  1. Alla fine del periodo di coltura, staccare le cellule (~106) aggiungendo il reagente di dissociazione cellulare; quindi, pellet e raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml. Lavare le celle mediante centrifugazione con PBS (1x) due volte centrifugando a 300 × g per 5 minuti.
  2. Fissare le cellule in 1,6% PFA (1 mL di 1,6% PFA in un tubo da 15 ml) a RT per 10 minuti. Lavare le celle mediante centrifugazione con PBS (1x) due volte centrifugando a 300 × g per 5 minuti.
  3. Permeabilizzare le cellule con metanolo ghiacciato al 90% (1 mL di metanolo al 90% in un tubo da 15 ml) a -20 °C per 20 minuti.
  4. Bloccare i campioni in tampone bloccante contenente 0,3 M di glicina, siero di capra al 5% e albumina sierica bovina all'1% (BSA) - Frazione V in PBS (1x) (1 mL di tampone bloccante in una provetta da 15 ml). Lavare le celle mediante centrifugazione con PBS (1x) due volte (come al punto 3.7).
  5. Incubare le cellule con i seguenti anticorpi primari per 30 minuti: anti-NDUFB10 (1:1.000) per la misurazione della subunità del complesso I, subunità A del complesso flavoproteico del complesso anti-succinato deidrogenasi (SDHA, 1:1.000) per la misurazione della subunità del complesso II e anti-COX IV (1:1.000) per la misurazione della subunità IV complessa e anticorpo anti-TFAM coniugato con Alexa Fluor 488 (1:400). Colorare lo stesso numero di cellule separatamente con l'anticorpo anti-TOMM20 coniugato con Alexa Fluor 488 (1:400) per 30 minuti (1 mL di soluzione anticorpale primaria in un tubo da 15 ml; vedere la Tabella dei materiali per i dettagli sugli anticorpi).
  6. Lavare le celle con PBS (1x) una volta con centrifugazione a 300 × g per 5 minuti. Aggiungere anticorpi secondari (1:400) in provette di NDUFB10, SDHA e COX IV e incubare le cellule con queste soluzioni per 30 minuti.
  7. Lavare le celle con PBS (1x) una volta centrifugando a 300 × g per 5 minuti. Aspirare i surnatanti lasciando circa 100 μL nelle tube. Risospendere i pellet cellulari in 300 μL di PBS (1x). Trasferire le cellule in provette di microcentrifuga da 1,5 ml tenute al buio sul ghiaccio.
  8. Analizzare le cellule sul citometro a flusso (con una configurazione laser 3 blu e 1 rossa). Rileva i segnali nel filtro 1 (FL1) utilizzando un filtro passa banda 530/30. Vedere la Figura supplementare S2 per le impostazioni e i parametri del microscopio.

5. Acquisizione e analisi della citometria a flusso

  1. Utilizzare il tubo di controllo non colorato per impostare i grafici di dispersione dell'area di dispersione diretta (FSC-A) e dell'area di dispersione laterale (SSC-A) in base alle dimensioni e alla complessità della popolazione cellulare analizzata. Vedere la Figura supplementare S2 per le impostazioni e i parametri del microscopio.
    NOTA: impostare controlli non colorati per i singoli tipi di celle.
  2. Utilizzare i tubi di controllo antimacchia per selezionare i gate positivi e utilizzare tubi di controllo monocolore per compensare la sovrapposizione spettrale di fluorescenza tra MTG (fluoroforo-1 [FL-1]) e TMRE (FL-2) nella citometria a flusso multicolore. Utilizzare il controllo isotipo per il controllo negativo per monitorare la colorazione di sfondo nei campioni MRC e TFAM. Utilizzare il tubo FCCP come controllo di depolarizzazione per la colorazione TMRE.
  3. Eliminare i detriti estranei per selezionare le celle vive e il gating principale dal grafico a dispersione anteriore e laterale (Figura 2A). Gate out doppiette utilizzando un grafico di densità FSC-A (FSC-H) rispetto a (vs.) FSC-A per escludere doppietti e costruire anche un'altezza di dispersione laterale (SSC-H) rispetto al grafico SSC-A (Figura 2A).
  4. Acquisizione dati (citometro a flusso)
    1. Utilizzando i campioni non colorati o isotipi come controllo negativo, creare un gate sopra la popolazione principale degli eventi a cella singola durante la visualizzazione di SSC-A e dei vari filtri (FL1, FL2, FL3, FL4) (Figura 1B e Figura 2B).
  5. Analisi dei dati (software CFlow)
    1. Copiare la posizione delle porte sui campioni di cellule colorate e registrare la quantità di cellule colorate positivamente per la colorazione positiva.
    2. Per ogni sottopopolazione cellulare, selezionare un grafico a istogramma e analizzare l'intensità mediana della fluorescenza (MFI) dei diversi canali filtranti (FL1, FL2, FL3, FL4) (asse x).
      1. Calcolare i livelli di TMRE sottraendo l'MFI di FL2 di #2 cellule trattate con FCCP dall'MFI di FL2 da #3 campioni colorati con TMRE in un istogramma, come in Eq (1) di seguito.
        Livelli di TMRE = MFI di FL2 da #3 campioni colorati con TMRE - MFI di FL2 di #2 cellule trattate con FCCP (1)
      2. Calcolare i valori specifici per MMP e ROS mitocondriale mediante MFI in TMRE o MitoSox Red, dividendo l'indicatore di volume mitocondriale MTG.
      3. Calcolare il valore specifico per la subunità complessa e la TFAM utilizzando MFI in espressione complessa o TFAM, dividendo l'indicatore di volume mitocondriale TOMM20.

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Representative Results

Una descrizione schematica del metodo di differenziazione e delle strategie citometriche a flusso è mostrata nella Figura 3. Le iPSC umane sono differenziate in rosette neurali e quindi sollevate in coltura di sospensione per la differenziazione in sfere neurali. Le sfere neurali sono ulteriormente differenziate e maturate in neuroni DA. Le sfere neurali sono dissociate in singole cellule per generare astrociti gliali, riplaccate in monostrati come NSC e quindi differenziate in astrociti. Questo protocollo fornisce le strategie necessarie per l'acquisizione e l'analisi dei campioni mediante citometria a flusso per la misurazione di MMP, volume mitocondriale, livelli di ROS mitocondriale, livelli di espressione di subunità complesse MRC e TFAM (una misura indiretta del numero relativo di copie del mtDNA). In particolare, la co-colorazione con reporter fluorescenti, TMRE e MTG, è stata utilizzata per rilevare e quantificare i cambiamenti nel volume MMP e mitocondriale. La co-colorazione con MitoSox Red e MTG consente di misurare la produzione di ROS mitocondriale nelle cellule vive. La colorazione con anticorpi contro le subunità del complesso MRC insieme a TOMM20 consente la valutazione della MRC e la colorazione di TFAM e TOMM20 per la valutazione indiretta del numero di copie del mtDNA. È importante sottolineare che MTG e TOMM20 consentono la misurazione per volume mitocondriale, contrastando l'influenza del volume mitocondriale su questi parametri.

I neuroni DA sono generati da iPSC attraverso la doppia inibizione SMAD ed esposti a FGF-8b e all'agonista Sonic hedgehog (SHH) PM, come mostrato in Figura 4A. Le iPSC umane sono seminate in terreno di coltura iPSC su piastre rivestite di matrice. Quando le cellule raggiungono il 50% -80% di confluenza, il mezzo viene cambiato in NIM utilizzando un CDM integrato con SB431542, inibitore AMPK, composto C e N-acetilcisteina per 5 giorni. Dopo 5 giorni, le iPSC (Figura 4B, a) progrediscono verso uno stadio epiteliale neurale che mostra chiare strutture di rosetta neurale (Figura 4B, b). Il giorno 5, le sfere neurali vengono generate sollevando l'epitelio neurale in coltura di sospensione e coltivandole nel mezzo NSC SF su uno shaker orbitale all'interno dell'incubatore. Le sfere rotonde e ben definite sono mostrate nella Figura 4B, c. Il giorno 7, il terreno viene cambiato in CDM integrato con 100 ng / mL FGF-8b. Il giorno 14, il terreno viene trasformato nel CDM integrato con 100 ng / mL FGF-8b e 1 μM PM. Il giorno 21, le sfere vengono dissociate in neuroni DA in un monostrato dissociandoli in singole cellule e coltivandoli in CDM integrato con 10 ng / mL BDNF e 10 ng / mL GDNF in PLO e piastre / coprivetrini rivestiti di laminina. I neuroni (Figura 4B, e) maturati per 15-30 giorni sono ulteriormente utilizzati per misurazioni funzionali mitocondriali.

Le NSC sono prodotte dissociando le sfere neurali in singole cellule e quindi riplaccandole in monostrati per generare astrociti. Queste NSC mostrano un classico aspetto progenitore neurale (Figura 4B, d). Le NSC in questa fase possono essere facilmente ampliate e depositate per un ulteriore utilizzo. Per avviare la differenziazione degli astrociti, le NSC sono placcate su coprivetrini rivestiti di PDL in mezzo NSC SF. Il giorno seguente, il mezzo viene trasformato in mezzo di differenziazione astrocitaria per 28 giorni. Dopo 28 giorni, gli astrociti differenziati sono ulteriormente maturati nel mezzo di maturazione degli astrociti. In questa fase, gli astrociti dovrebbero mostrare una morfologia a forma di stella (Figura 4B, f), e queste cellule possono essere espanse e depositate per un ulteriore utilizzo, compresa la valutazione funzionale mitocondriale.

Durante la differenziazione, l'identità cellulare viene confermata utilizzando la colorazione a immunofluorescenza. Nella Figura 5A, l'immunocolorazione mostra che le iPSC esprimono i marcatori pluripotenti specifici, SSEA4 e Oct4. La Figura 5B mostra che le sfere neurali mostrano una colorazione positiva di Nestin e Pax6, mentre la Figura 5C mostra che le NSC derivate da iPSC nei monostrati mostrano una colorazione positiva di Nestin e Sox2. Per identificare i neuroni DA, le cellule vengono colorate con il marcatore neurale β tubulina III (Tuj 1) e il marcatore neuronale DA tirosina idrossilasi (TH) (Figura 6B). Inoltre, i neuroni DA mostrano colorazione per i marcatori sinaptici, sinaptofisina e PSD-95, confermando le loro connessioni sinaptiche funzionali (Figura 5B). L'immunocolorazione degli astrociti derivati da iPSC mostra l'espressione dei marcatori astrocitari, della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e della proteina legante il calcio S100 β (S100β).

Lo studio della funzione mitocondriale nei neuroni differenziati e negli astrociti mediante citometria a flusso viene eseguito come descritto sopra nelle sezioni 3 e 4 del protocollo. Per l'acquisizione dei dati è stato utilizzato un citometro a flusso e un campionatore CFlow per l'analisi dei dati, come mostrato nella Figura 1B.

Nella Figura 2 viene illustrato il metodo per il gating di singole celle vive. Le cellule morte e i detriti cellulari sono esclusi utilizzando un grafico FSC vs. SSC (Figura 2A, a). I doppietti di cella sono esclusi utilizzando un grafico FSC-H vs. FSC-A (Figura 2A, b) seguito da un grafico SSC-H vs. SSC-A (Figura 2A, c). La fluorescenza di fondo è correttamente valutata se la popolazione negativa di un particolare tipo di cellula viene confrontata con la popolazione positiva all'interno dello stesso tipo di cellula (Figura 2B, a). Per i campioni MMP, il trattamento delle cellule con FCCP elimina le interferenze dovute al potenziale della membrana mitocondriale e alla colorazione TMRE (Figura 2B, b).

Questi approcci citometrici a flusso sono stati utilizzati per studiare i neuroni DA generati dalle iPSC umane portatrici di mutazioni nella subunità catalitica della DNA polimerasi mitocondriale, POLG (W748S), e confrontarli con campioni liberi da malattia generati da fibroblasti Detroit 551. Come riportato in precedenza4, questo studio ha anche dimostrato una diminuzione della MMP e un aumento dei livelli specifici di ROS mitocondriale nei neuroni POLG DA (Figura 7). Tuttavia, il volume mitocondriale, l'MMP totale e il livello totale di ROS mitocondriale sono rimasti invariati. Nella Figura 8, i risultati mostrano una diminuzione dei livelli specifici del complesso I, livelli totali e specifici di TFAM inferiori, ma livelli specifici di II complessi II simili nei neuroni DA mutanti rispetto ai controlli.

Questo approccio è stato utilizzato anche per studiare gli astrociti generati dalle stesse linee iPSC. Come riportato in precedenza7 e mostrato nella Figura 9, i risultati mostrano che gli astrociti POLG-mutati avevano MMP totale e specifico inferiore ma volume mitocondriale e ROS mitocondriale simili rispetto ai controlli, nonché livelli ridotti di complessi specifici I e IV (Figura 10). Tuttavia, non ci sono stati cambiamenti nei livelli totali dei complessi I e IV e nessun cambiamento nei livelli totali e specifici del complesso II negli astrociti POGG. Nel complesso, questi dati suggeriscono che l'analisi citometrica a flusso di più parametri mitocondriali fornisce un'approssimazione di primo passo che è preziosa nella valutazione della funzione mitocondriale in cellule come le iPSC e i loro derivati neurali e gliali.

Figure 1
Figura 1: Impostazione per la citometria a flusso. (A) MMP, volume mitocondriale e colorazione dei ROS mitocondriali; (B) un esempio di acquisizione di dati in un citometro a flusso C6. Abbreviazioni: MMP = potenziale di membrana mitocondriale; ROS = specie reattive dell'ossigeno; FCCP = cianuro di carbonile p-trifluorometossifenilidrazone; TMRE = tetrametilrodamina estere etilico; MTG = MitoTracker Verde. Vedere anche la tabella supplementare S2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Strategie di gating. (A) Acquisizione dei dati; (B) gli istogrammi della fluorescenza con colorazione MTG e TMRE in cellule vive. Abbreviazioni: SSC-A = area di dispersione laterale; FSC-A = area di dispersione diretta; SSC-H = altezza di dispersione laterale; FSC-H = altezza di dispersione in avanti; FL#-A = area fluoroforo #; MTG = MitoTracker Verde; FCCP = cianuro di carbonile p-trifluorometossifenilidrazone; TMRE = tetrametilrodamina estere etilico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Rappresentazione schematica del flusso di lavoro del protocollo. Abbreviazioni: DA = dopaminergico; MMP = potenziale di membrana mitocondriale; ROS = specie reattive dell'ossigeno; NDUFB 10 = NADH: subunità 10 dell'ubichinone ossidoreduttasi; SDHA = subunità A della flavoproteina del complesso della succinato deidrogenasi; COX IV = complesso della citocromo c ossidasi IV; mtDNA = DNA mitocondriale; TFAM = fattore di trascrizione mitocondriale A. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Differenziazione iPSC. (A) Diagramma di flusso e (B) immagini rappresentative per le cellule di diversi stadi durante il differenziamento, tra cui iPSC (a), rosetta neurale (b), sfere neurali (c), NSC (d), neuroni DA (e) e astrociti (f). Barre di scala = 25 μm. Abbreviazioni: iPSC = cellula staminale pluripotente indotta; NSC = cellula staminale neurale; DA = dopaminergico; SFM = mezzo privo di siero; CDM = mezzo chimicamente definito; FGF-8b = fattore di crescita dei fibroblasti-8b; PM = purmorfamina; BDNF = fattore neurotrofico derivato dal cervello; GDNF = fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale; PLO = poli-L-ornitina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Immagini confocali rappresentative delle iPSC e dei loro derivati neurali . (A) Immunocolorazione di SSEA4 (rosso) e Oct4 (verde) nelle iPSC. (B) Immunocolorazione di Nestina (rosso) e Pax6 (verde) in sfere neuronali derivate da iPSC. (C) Immunocolorazione di Nestina (rosso) e Sox2 (verde) in NSC derivate da iPSC. I nuclei sono colorati con DAPI (blu). Barre della scala = 50 μm. Abbreviazioni: iPSCs = cellule staminali pluripotenti indotte; NSC = cellule staminali neurali; SSEA4 = antigene embrionale 4 stadio-specifico; Oct4 = fattore di trascrizione legante l'ottamero 4; Pax6 = scatola accoppiata-6; Sox2 = regione che determina il sesso Y box-2; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Immagini confocali rappresentative degli astrociti derivati da iPSC e dei neuroni DA. (A) Immunocolorazione di GFAP (rosso) e S100β (verde) in astrociti derivati da iPSC. (B) Immunocolorazione del marcatore della linea neurale TH (verde), Tuj 1 (rosso) e del marcatore funzionale neurale Synaptophysin (verde) e PSD-95 (rosso) nei neuroni DA derivati da iPSC. I nuclei sono colorati con DAPI (blu). Barre di scala = 25 μm. Abbreviazioni: iPSCs = cellule staminali pluripotenti indotte; GFAP = proteina acida fibrillare gliale; S100β = S100 β proteica legante il calcio; Tuj 1 = β III tubulina; PSD-95 = proteina di densità postsinaptica 95; DA = dopaminergico; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Analisi citometrica a flusso per neuroni DA derivati da un clone di iPSC di pazienti POLG e un clone di iPSC di controllo Detroit 551. (A) Volume mitocondriale misurato da MTG, (B) MMP totale misurato da TMRE, (C) livello specifico di MMP calcolato da TMRE/MTG totale, (D) ROS mitocondriale totale misurato da MitoSox Red e (E ) livello specifico di ROS mitocondriale calcolato dal totale MitoSox Red/MTG. Dati presentati come media ± errore standard della media (SEM) per il numero di campioni (n ≥ 3 per clone). Dati analizzati e prodotti utilizzando il software GraphPad Prism. Il test U di Mann-Whitney è stato utilizzato per valutare la significatività statistica delle variabili. La significatività è indicata per P < 0,05. *P < 0,05; ns, non significativo. Abbreviazioni: DA = dopaminergico; POLG = subunità gamma della DNA polimerasi; iPSCs = cellule staminali pluripotenti indotte; MMP = potenziale di membrana mitocondriale; ROS = specie reattive dell'ossigeno; MTG = MitoTracker Verde; TMRE = tetrametilrodamina estere etilico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Analisi citometrica a flusso per astrociti derivati da un clone di iPSC di pazienti POLG e un clone di iPSC di controllo Detroit 551. (A) Volume mitocondriale misurato da MTG, (B) MMP totale misurato da TMRE, (C) livello specifico di MMP calcolato da TMRE/MTG totale, (D) ROS Rmitocondriale totale misurato da MitoSox Red, e (E ) livello specifico di ROS mitocondriale calcolato dal totale MitoSox Red/MTG. Dati presentati come media ± errore standard della media (SEM) per il numero di campioni (n ≥ 3 per clone). Dati analizzati e prodotti utilizzando il software GraphPad Prism. Il test U di Mann-Whitney è stato utilizzato per valutare la significatività statistica delle variabili. La significatività è indicata per P < 0,05. *P < 0,05; ns, non significativo. Abbreviazioni: POLG = DNA polimerasi subunità gamma; iPSC = cellula staminale pluripotente indotta; MMP = potenziale di membrana mitocondriale; ROS = specie reattive dell'ossigeno; MTG = MitoTracker Verde; TMRE = tetrametilrodamina estere etilico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Analisi citometrica a flusso per neuroni DA derivati da un clone di iPSC di pazienti POLG e un clone di iPSC di controllo Detroit 551. (A) complesso totale I misurato da NDUFB10, (B) livello specifico del complesso I calcolato dal totale NDUFB10/TOMM20, (C) complesso totale II misurato da SDHA, (D) livello specifico del complesso II calcolato dal totale SDHA/TOMM20, (E) TFAM totale misurato dal TFAM totale e (F) livello TFAM specifico calcolato dal TFAM/TOMM20 totale. Dati presentati come media ± errore standard della media (SEM) per il numero di campioni (n ≥ 3 per clone). Dati analizzati e prodotti utilizzando il software GraphPad Prism. Test U di Mann-Whitney utilizzato per valutare la significatività statistica delle variabili. La significatività è indicata per P < 0,05. *P < 0,05; ns, non significativo. Abbreviazioni: DA = dopaminergico; POLG = subunità gamma della DNA polimerasi; iPSC = cellula staminale pluripotente indotta; NDUFB10 = NADH: subunità 10 dell'ubichinone ossidoreduttasi; TOMM20 = translocasi della membrana mitocondriale esterna 20; SDHA = subunità A della flavoproteina del complesso della succinato deidrogenasi; TFAM = fattore di trascrizione mitocondriale A. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 10
Figura 10: Analisi citometrica a flusso per astrociti derivati da un clone di iPSC di pazienti POLG e un clone di iPSC di controllo Detroit 551. (A) Complesso totale I misurato da NDUFB10, (B) livello specifico del complesso I calcolato dal totale NDUFB10/TOMM20, (C) complesso totale II misurato da SDHA, (D) livello specifico del complesso II calcolato dal totale SDHA/TOMM20, (E) complesso IV totale misurato con COX IV, (F) livello IV complesso specifico calcolato con COX IV/TOMM20, (G) TFAM totale misurato con TFAM e (H) livello TFAM specifico calcolato con TFAM/TOMM20 totale. Dati presentati come media ± errore standard della media (SEM) per il numero di campioni (n ≥ 3 per clone). Dati analizzati e prodotti utilizzando il software GraphPad Prism. Il test U di Mann-Whitney è stato utilizzato per valutare la significatività statistica delle variabili. La significatività è indicata per P < 0,05. *P < 0,05; ** P < 0,01; ns, non significativo. Abbreviazioni: POLG = DNA polimerasi subunità gamma; iPSC = cellula staminale pluripotente indotta; NDUFB10 = NADH: subunità 10 dell'ubichinone ossidoreduttasi; TOMM20 = translocasi della membrana mitocondriale esterna 20; SDHA = subunità A della flavoproteina del complesso della succinato deidrogenasi; TFAM = fattore di trascrizione mitocondriale A; COX IV = complesso della citocromo c ossidasi IV. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare S1: Impostazioni del microscopio a fluorescenza a scansione laser confocale e passaggi per scattare immagini. (A) Scegliere lo strumento Configurazione e selezionare il tipo di laser corretto da Laser attualmente disponibile e impostarne la potenza. (B) Scegliere Acquire-Acquisition Mode-SEQ e selezionare la corrispondente modalità foto lunghezza d'onda a fluorescenza dal database. (C) Scegliere Sequential Scan-Load e importare la modalità corrispondente. (D) Scegli l'obiettivo 40x e aggiungi goccia. (E) Parametri di impostazione specifici per scattare foto a diverse lunghezze d'onda. (F) Imposta i parametri della foto, visualizza l'anteprima e salva la foto. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Passaggi e impostazioni per la citometria a flusso. (A) Apri il software Cflow, scegli lo strumento File e seleziona Apri file o modello CFlow. (B) Impostate 40000 eventi e selezionate il gate contenente solo le singole celle attive nel pannello Run Limits. Scegliete Velocità media nel pannello Fluidica. (C) Scegliere FSC-A vs. FSC-A plot (a) per impostare il gating principale. Scegliete il grafico FSC-A rispetto al grafico FSC-H (b) e il grafico SSC-A rispetto al grafico SSC-H (c) per escludere i doppietti. Scegliere i filtri corrispondenti, ad esempio FL1 o FL2, e utilizzare il grafico FL1-A vs. FSC-A plot (d) o FL2-A vs. FSC-A plot per disegnare gli eventi positivi durante l'esecuzione delle celle non colorate. (D) Impostare gli stessi parametri, visualizzare l'anteprima, eseguire i campioni macchiati e salvare la foto. Vedere anche la tabella supplementare S2. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S1: Ricette di supporti e soluzioni. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare S2: Impostazione per la colorazione citometrica a flusso. Clicca qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Qui sono protocolli per generare neuroni e astrociti derivati da iPSC e valutare molteplici aspetti della funzione mitocondriale utilizzando la citometria a flusso. Questi protocolli consentono un'efficiente conversione delle iPSC umane sia in neuroni che in astrociti gliali e la caratterizzazione dettagliata della funzione mitocondriale, principalmente nelle cellule viventi. I protocolli forniscono anche una strategia basata sulla citometria a flusso di co-colorazione per l'acquisizione e l'analisi di più funzioni mitocondriali, tra cui volume, MMP e livelli di ROS mitocondriale in cellule vive e complessi MRC e TFAM in cellule fisse. In particolare, questi protocolli consentono la stima sia dei livelli totali che specifici per volume mitocondriale. Mentre questa strategia rileva la disfunzione mitocondriale in una malattia mitocondriale nota (POLG) nei neuroni DA e negli astrociti, queste tecniche sono applicabili a qualsiasi tipo di cellula e malattia. Inoltre, il protocollo è robusto e riproducibile. Diversi studi precedenti hanno applicato con successo questo protocollo per analizzare i cambiamenti mitocondriali in fibroblasti, iPSC, NSC, neuroni DA e astrociti 2,3,13,17.

Ci sono alcuni punti critici da considerare durante l'esecuzione di questo protocollo. Per garantire una differenziazione coerente e ad alta efficienza, è fondamentale avviare la conversione con iPSC di alta qualità (cellule contenenti il <5% di cellule differenziate). Sebbene altri media definiti disponibili in commercio possano essere valide alternative, questo studio non ha affrontato le alternative. Poiché la composizione del mezzo e le differenze clonali delle linee iPSC possono influenzare sia la proliferazione della popolazione cellulare di partenza che l'efficienza di differenziazione, l'adattamento di questo protocollo ad altri mezzi di manutenzione richiederà probabilmente un'ottimizzazione.

La relazione tra fluorescenza MTG e MMP è stata studiata in precedenza3. Questo è importante in quanto la fluorescenza MTG è sia indipendente da18 che sensibile a MMP 19,20. In studi precedenti in cui le iPSC sono state titolate con diverse concentrazioni di TMRE e co-colorate con 150 nM MTG, il livello di MTG è rimasto lo stesso a concentrazioni più basse di TMRE (5-100 nM), mentre è stata osservata una diminuzione del segnale MTG per concentrazioni TMRE più elevate (oltre 100 nM). Pertanto, sono stati scelti 100 nM TMRE e 150 nM MTG per misurare l'MMP specifico. Poiché questa relazione può essere cellulo-specifica, la correlazione tra fluorescenza MTG e MMP deve essere valutata prima di utilizzare la doppia colorazione MTG e TMRE per misurare MMP.

La densità cellulare può anche influenzare la funzione mitocondriale e il metabolismo cellulare. In questo studio sono stati osservati cambiamenti dipendenti dalla densità cellulare nella MMP, che è stato dimostrato anche in altri studi21. Pertanto, è importante scegliere una densità cellulare simile in tutti i campioni, non troppo alta o bassa, per ridurre al minimo la variazione quando si stabilisce il protocollo di co-colorazione per diversi tipi di cellule. Rispetto ad altri saggi basati sulla microscopia, la citometria a flusso presenta i vantaggi della velocità e della riproducibilità quando si analizza un gran numero di cellule. Nell'analisi delle immagini microscopiche, il pregiudizio dei ricercatori distorcerà i risultati in una certa misura, il che non è un problema quando si utilizza la citometria a flusso. Inoltre, l'analisi della citometria a flusso richiede meno di un milione di cellule e l'analisi di un campione richiede solo pochi minuti, il che significa che decine di campioni possono essere analizzati in 1-2 ore. Questa tecnica può anche essere applicata a un'ampia varietà di tipi di cellule, comprese quelle di altre malattie neurodegenerative, e dovrebbe quindi essere utile per comprendere i meccanismi e testare potenziali terapie in diverse malattie neurodegenerative.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo il Molecular Imaging Centre e la Flow Cytometry Core Facility dell'Università di Bergen in Norvegia. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Consiglio norvegese per la ricerca (numero di sovvenzione: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat e il China Scholarship Council (numero di progetto: 201906220275).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-Oct4 Abcam ab19857, RRID:AB_445175 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-SSEA4 Abcam ab16287, RRID:AB_778073 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Sox2 Abcam ab97959, RRID:AB_2341193 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Pax6 Abcam ab5790, RRID:AB_305110 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Nestin Santa Cruz Biotechnology sc-23927, RRID:AB_627994 Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-GFAP Abcam ab4674, RRID:AB_304558 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-S100β  conjugated with Alexa Fluor 488 Abcam ab196442, RRID:AB_2722596 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution;
anti-TH Abcam ab75875, RRID:AB_1310786 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Tuj 1 Abcam ab78078, RRID:AB_2256751 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Synaptophysin Abcam ab32127, RRID:AB_2286949 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-PSD-95 Abcam ab2723, RRID:AB_303248 Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 Abcam ab198308 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-NDUFB10 Abcam ab196019 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-SDHA Abcam ab137040 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-COX IV Abcam ab14744, RRID:AB_301443 Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use  Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.
Activin A PeproTech 120-14E Astrocyte differentiation medium ingredient
ABM Basal Medium Lonza CC-3187 Basal medium for astrocyte culture
AGM SingleQuots Supplement Pack Lonza CC-4123 Supplement for astrocyte culture
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240062 CDM ingredient
Advanced DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 12634010 Basal medium for dilute Geltrex
Bovine Serum Albumin Europa Bioproducts EQBAH62-1000 Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient
BDNF PeproTech 450-02 DA neurons medium ingredient
B-27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044 Astrocyte differentiation medium ingredient
BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer BD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid Concentrate Thermo Fisher Scientific 11905031 CDM ingredient
Collagenase IV Thermo Fisher Scientific 17104019 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G Leica Microsystems, Germany
Corning non-treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430589 Suspension culture
DPBS Thermo Fisher Scientific 14190250 Used for a variety of cell culture wash
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565018 Astrocyte differentiation basal Medium
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium Thermo Fisher Scientific A1516901 Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50X) Thermo Fisher Scientific A1517101 Supplement for iPSC culture
EGF Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0314 Supplement for NSC culture
FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0024 Supplement for NSC culture
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12103C Medium ingredient
FGF-basic PeproTech 100-18B Astrocyte differentiation medium ingredient
FCCP Abcam ab120081 Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
Fluid aspiration system BVC control Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16% Thermo Fisher Scientific 28908 Cell fixation
Geltrex Thermo Fisher Scientific A1413302 Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 Supplement for NSC culture
GDNF Peprotech 450-10 DA neurons medium ingredient
Glycine Sigma-Aldrich G8898 Used for blocking buffer
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher Scientific 31765027 Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 human Sigma-Aldrich SRP3055 Astrocyte differentiation medium ingredient
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H1399 Stain the nuclei for confocal image
Heracell 150i CO2 Incubators Fisher Scientific, USA
IMDM Thermo Fisher Scientific 21980032 Basal medium for CDM
Insulin Roche 1376497 CDM ingredient
InSolution AMPK Inhibitor Sigma-Aldrich 171261 Neural induction medium ingredient
Insulin-like Growth Factor-I human Sigma-Aldrich I3769 Astrocyte differentiation medium ingredient
KnockOut DMEM/F-12 medium Thermo Fisher Scientific 12660012 Basal medium for NSC culture
Laminin Sigma-Aldrich L2020 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Leica TCS SP8 STED confocal microscope Leica Microsystems, Germany
Monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145 CDM ingredient
MitoTracker Green FM Thermo Fisher Scientific M7514 Used for mitochondrial volume indicator
MitoSox Red Thermo Fisher Scientific M36008 Used for mitochondrial ROS indicator
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A7250 Neural induction medium ingredient
N-2 Supplement Thermo Fisher Scientific 17502048 Astrocyte differentiation medium ingredient
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific PCN5000 Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1 Stuart Equipment, UK
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P7405 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Purmorphamine STEMCELL Technologies 72204 Promotes DA neuron differentiation
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36930 Mounting the coverslip for confocal image
PBS 1x Thermo Fisher Scientific 18912014 Used for a variety of wash
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein R&D Systems 423-F8-025/CF Promotes DA neuron differentiation
SB 431542 Tocris Bioscience TB1614-GMP Neural Induction Medium ingredient
StemPro Neural Supplement Thermo Fisher Scientific A10508-01 Supplement for NSCs culture
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific 12604013 Cell dissociation reagent
Transferrin Roche 652202 CDM ingredient
TRITON X-100 VWR International 9002-93-1 Used for cells permeabilization in immunostaining assays
TMRE Abcam ab113852 Used for mitochondrial membrane potential staining
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments Grant Instruments, USA

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References

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Neuroscienze Numero 177
Analisi citometrica a flusso di parametri mitocondriali multipli in cellule staminali pluripotenti indotte umane e loro derivati neurali e gliali
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Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, … More

Liang, K. X., Chen, A., Kristiansen, C. K., Bindoff, L. A. Flow Cytometric Analysis of Multiple Mitochondrial Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cells and Their Neural and Glial Derivatives. J. Vis. Exp. (177), e63116, doi:10.3791/63116 (2021).

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