Summary
거의 UV 리소그래피 및 견인력 현미경 검사법은 마이크로패턴 하이드로겔의 세포력을 측정하기 위해 결합됩니다. 단일 셀의 표적 광 유도 방출은 동일한 샘플에서 많은 수의 측정을 가능하게 합니다.
Abstract
견인력 현미경 검사법(TFM)은 세포력을 측정하기 위해 메카노생물학에 사용되는 주요 방법입니다. 일반적으로 이것은 세포 견인력 (2D-TFM)의 밑에 변형되는 평평한 연약한 기판을 고수하는 세포에 이용되고 있습니다. TFM은 폴리디메틸실록산(PDMS) 또는 폴리아크릴아미드(PA)와 같은 선형 탄성 물질의 사용에 의존한다. PA에서 2D-TFM의 경우, 주로 세포 모양과 견인력의 큰 가변성에서 높은 처리량 결과를 달성하는 데 어려움을 겪고 표준화를 요구합니다. 우리는 2D-TFM 연구를 위해 마이크로 패턴 PA 하이드로겔을 신속하고 효율적으로 제조하는 프로토콜을 제시합니다. 마이크로 패턴은 세포외 매트릭스 단백질이 마이크로 패턴 부위에만 결합하는 거의 UV 빛을 사용하여 마스크없는 광석 촬영에 의해 처음 만들어지며 나머지 표면은 세포에 대한 비 접착제로 남아 있습니다. 세포외 매트릭스 단백질의 마이크로패턴은 활성 알데히드 그룹의 존재로 인해 단일 세포 또는 세포 그룹을 수용하기 위해 상이한 모양의 접착제 영역이 발생합니다. TFM 측정의 경우 아크릴아미드와 비스 아크릴아미드의 양을 다양화하고 임베디드 형광구의 변위를 추적하여 정규화된 Fourier Transform Traction Cytometry(FTTC)로 세포 견인력 필드를 재구성하여 다양한 탄성의 PA 하이드로겔을 사용합니다.
세포력의 정확한 기록을 더욱 달성하기 위해, 우리는 단일 세포 또는 세포 그룹을 위한 정의된 지구에 있는 세포 견인력을 풀어 놓기 위하여 패턴빛의 통제된 복용량의 사용을 기술합니다. 우리는이 방법을 로컬 UV 조명 견인력 현미경 검사법 (LUVI-TFM)이라고 부릅니다. 효소 처리를 사용하면, 모든 세포는 시료로부터 동시에 분리되는 반면, 샘플의 상이한 영역에서 세포의 LUVI-TFM 견인력은 순서대로 기록될 수 있다. 당사는 기판에 대한 제어된 접착의 함수로서 세포 견인력을 연구하고,(ii) 동일한 샘플로부터 더 많은 수의 실험 관측을 달성하기 위해 이 프로토콜(i)의 적용가능성을 입증한다.
Introduction
세포 외 환경과 상호 작용할 때, 부착 세포세포는 주로 세포외 매트릭스(ECM)를 액틴 세포골격에 연결하는 통합 기반 초점 접착력에 의해 매개되는 힘을 발휘합니다. 초점 접착은 섬유넥틴과 콜라겐과 같은 ECM 단백질에 대한 통합의 결합을 중심으로 하는 다단백 어셈블리입니다. 초점 접착의 통합 클러스터링 및 성장은 기계적으로 안정적인 연결의 확립뿐만 아니라 세포 수축의 조절을 위한 RhoA 경로를 활성화하는 것을 포함하여 다른 초점 접착 단백질의 모집에 매우 중요합니다1. Actin 세포골격의 RhoA 의존적 수축성은 세포가 기본 ECM에 퍼지고 마이그레이션할 수 있게 하고, 또한 그것의 강성을 감지하기 위하여 2. 견인력의 분포는 세포의 확산 영역과 모양에 크게 좌우되며, 이 두 가지 모두 매트릭스 특성에 의존하여 사이토스켈레탈 조직에 영향을 미치며, 결국 행렬 역학과 사이토스켈레탈 조직 3,4 사이에 폐쇄된 피드백 루프를 형성합니다.
표면 미세 패턴화 기술은 ECM 접착제 단백질을 제시하는 미크론 크기의 영역을 만들어 세포 모양의 정의된 제어를 허용합니다. 이러한 영역의 크기에 따라, 단일 세포, 또는 마이크로 패턴5를 부착하는 세포의 그룹. ECM 단백질은 마이크로컨택트 인쇄, 사진 패터닝 또는 레이저 패터닝6와 같은 다른 접근법에 의해 유리 기판에 패킹될 수 있다. 표면 안티폴링 전략과 결합된 UV 라이트(λ = 185 또는 375 nm)를 사용하면 다양한 모양과 크기 설계및 표면 가장자리 근처의 고정밀로 다중 단백질 유형의 고정화를 위한 유연성을 제공한다7,8. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 단백질 방충제 화학 물질로 코팅된 영역은 크롬 포토마스크 또는 디지털 미러 장치(DMD)기반 마스크리스 리소그래피 시스템으로 보호됩니다. 마스크의 패턴은 다음 ECM 단백질패턴이 될 영역의 UV 빛에 노출을 허용합니다. ECM 단백질을 가진 하이드로겔 표면의 패터닝은 유리 표면에서 단백질을 제거하고 패턴에 교차 연결하는 전달 단계가 필요합니다. 또는, 부드러운 재료에 대한 패터닝은 먼저 방충제 단백질로 포토마스크를 코팅한 다음 깊은 UV 조명을 사용하여 마스크되지 않은 부위를 연소함으로써 달성될 수 있다. 딥 UV는 오존을 생성하고 단백질 결합에 대한 표면 반응성되기 때문에 마스크되지 않은 영역은 ECM 단백질로 코팅되고 마지막으로 겔은 마스크되지 않은 영역의 바로 위에 중합됩니다9,10.
패턴 하이드로겔은 세포 재료 인터페이스11에서 세포력을 측정하는 기술인 TFM을 수행하는 데 사용될 수 있다. 2D-TFM에서, 하나는 마커 구슬이 변형을 추적하기 위해 내장 된 두꺼운 폴리머 필름의 평평한 표면을 사용12,13,14,15. 변위 벡터를 추출하기 위해서는 변형 된 상태 중 하나와 변형없이 하나의 참조 이미지 인 두 개의 이미지를 결합하는 것이 필수적입니다. 그런 다음 두 이미지가 이미지 처리를 통해 서로 매핑됩니다. 높은 마커 밀도에서, 이것은 일반적으로 유체 역학 흐름을 재구성하는 잘 확립 된 방법입니다 입자 이미지 Velocimetry (PIV)로 수행됩니다. 낮은 마커 밀도와 3D-TFM에서는 일반적으로 실험 데이터 세트의 특정 기능을 포함하는 입자 추적 속도 측정(PTV)으로 수행됩니다. 계산적으로 저렴한 대안의 예는 카나데-루카스-토마시(KLT) 알고리즘16과 같은 광학 흐름입니다. 하이드로겔 기판의 경우, 형광 구슬은 일반적으로 물질 중합 중에 고밀도로 내장되며, 심진 분리 시 세포 방출 전후에 이미지가 기록된다. 부착 셀의 효소 분리, 예를 들어 트립시화에 의하면 하이드로겔의 모든 세포로부터 세포 견인력의 동시 방출로 이어지므로 많은 수의 세포로부터 상세한 분석을 얻기가 어려워집니다.
여기서는 세포 형상 및 국소화를 제어하는 마이크로패턴 하이드로겔을 제조하는 프로토콜과 UV를 이용하여 서열적으로 견인력을 효율적으로 측정하여 기판으로부터 개별 세포를 분리하는 방법을 제시한다. 견인력 측정을 위해 형광 구슬이 위층에만 내장되어 밀도를 높이고 수직 확산을 줄이는 이중 계층 PA 하이드로겔을 생산하는 기술을 제시합니다. 세포 견인력과 마이크로패터닝의 UV 매개 방출을 결합하면 패턴 세포 사이에 충분한 거리가 있는 경우 세포 분리(예를 들어, 관심 영역에서 다른 세포의 접착에 영향을 주지 않고 단일 세포의 단일 세포)에 대한 공간 제어를 얻을 수 있게 된다. 그런 다음 셀룰러 견인은 2D-TFM, 즉 정규화로 포리에 변환 트랙션 세포측정법(FTTC)에 가장 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법을 사용하여 재구성됩니다.
Protocol
1. 메타크릴레이션 커버립 준비
참고: 유리 커버립은 PA 하이드로겔을 공유하여 세포와 배양하는 동안 분리를 방지하기 위해 메타크릴링됩니다. 현미경 유리 커버립은 높은 화질을 달성하는 데 사용됩니다.
- 300mL 용액을 준비하려면 깨끗한 400mL 유리 비커를 가지고 연기 후드 안에 넣습니다.
- 비커에 10mL의 이중 증류수(ddH2O)를 넣습니다. 아세트산 18.75mL(≥99.8% 프로 분석, p.a.), 18.75mL 3-(트리메톡실릴)의 프로필 메타크릴레이트, 252.5mL의 에탄올(≥99.8% p.a.)을 첨가한다. 액액을 결정화 접시에 붓습니다.
- 정밀 한 물티슈와 24mm 둥근 유리 커버립을 청소합니다. 커버립을 맞춤 제작된 폴리테트라플루오레틸렌 랙에 넣습니다.
- 랙을 용액에 담그고 실온(RT)에서 15분 동안 배양합니다.
- 랙을 가지고 에탄올 (99.8 % p.a.a.)으로 모든 커버립을 헹구십시오. 공기 흐름 에서 커버립을 건조시다.
참고: 메타크릴레이션 커버립은 RT에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
2. 유리 커버립에 세포외 매트릭스 단백질의 마이크로 패턴화
참고: 유리 커버립은 먼저 단백질과 세포 구충제로 구성된 분자 층으로 코팅됩니다. 이 층은 다음 광패턴 기술을 사용하여 제거, 마이크로 패턴 된 지역에서 세포 외 매트릭스 단백질의 후속 증착을 허용하기 위해.
- 15mm 원형 유리 커버슬립을 가지고 페트리 접시에 놓습니다. 다이아몬드 펜을 사용하여 커버슬립의 위쪽을 표시합니다. 이어서 산소 플라즈마 처리를 통해 0.4mbar, 200W에서 2분 동안 세척을 진행한다.
- 각 커버슬립의 표면에 0.01% 폴리 L-리신 용액의 파이펫 100 μL. RT에서 30분 동안 배양하여 10mM 4-(2-하이드록스테틸)-1-파이프라진에탄탈레술포닉산(HEPES) pH 8.5로 커버립을 세척한다. 여분의 액체를 제거하지만 표면을 젖게하십시오.
- 파이펫 100 μL 의 50 mg/mL 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 succinimidyl valeric acid (mPEG-SVA) 10 mM HEPES pH 8.5 각 커버 슬립의 표면에. RT에서 1h에 대한 인큐베이션을 10m HEPES pH pH 8.5로 커버립을 헹구고 공기 흐름 하에서 건조시.
- UV에 민감한 광신염기(예: PLPP-gel)의 2μL을 넣고 표면에 에탄올 40μL(≥99.8%p.a.)를 넣습니다. 표면에 젤과 에탄올의 균일한 분포를 얻으려면 페트리 접시를 앞뒤로 부드럽게 기울이십시오. 중합용으로 5분 동안 기다립니다.
- 35mm 페트리 접시 에 20mm 구멍이 있는 커버슬립 한 개를 바닥에 놓습니다. 이를 통해 아래에서 나오는 레이저 빔이 유리 표면에 직접 도달할 수 있습니다.
- 현미경 및 라이트 패터닝 모듈을 켭니다(이 장치로 작업하는 것은 레이저 안전 책임자의 안전 도입 후에만 허용됩니다). 20배 공기 목표에 UV-A 레이저를 보정합니다. 무대에 포토니티에이터와 샘플을 넣어. 유리 표면에 초점을 조정하고 초점 제어를 켭니다. 미리 그려진 패턴을 로드하고 잠급합니다.
- Inkscape와 같은 그래픽 소프트웨어를 사용하여 패턴을 준비합니다. 패턴 파일이 DMD 치수(1824 x 1140 px)를 초과하지 않는지 확인하여 20x 렌즈(0.28 μm/px)에서 552 x 325 μm에 해당합니다.
참고: 패턴 파일 크기로 DMD 크기(1824 x 1140 픽셀)를 사용하는 것이 좋습니다. 예를 들어 1830 x 1130 픽셀 차원의 패턴 파일을 생성하지 마십시오. - 폴리아크릴아미드로 패턴 전송을 위해, 패턴이 유리 의 중심에서 가장자리까지 반경의 최대 60%-70%만 수행되도록 하십시오.
- 단일 셀을 패터링하기 위해, 패턴 사이의 거리와 세포 군의 경우 150-300 μm의 직경으로 50-100 μm의 직경을 사용합니다. 적절한 패턴 크기는 일반적인 세포 크기에 따라 크게 달라지며 셀이 부착할 수 있도록 충분히 커야 합니다.
- Inkscape와 같은 그래픽 소프트웨어를 사용하여 패턴을 준비합니다. 패턴 파일이 DMD 치수(1824 x 1140 px)를 초과하지 않는지 확인하여 20x 렌즈(0.28 μm/px)에서 552 x 325 μm에 해당합니다.
- 30mJ/mm2의 UV 용량으로 패터닝을 시작합니다. 패터닝 기간은 패턴 수에 따라 다릅니다. 단일 패턴을 만드는 데는 약 1s가 걸립니다.
- 패터닝 단계를 완료한 후 인산염 완충식식염수(PBS)로 표면을 세 번 헹구세요. 1x PBS및 25 μg/mL 피브리노겐 알렉사488 컨쥬게이트에 용해된 25 μg/mL 섬유네틴의 100 μL을 PBS에서 1시간 동안 PBS에 배양한다. 다른 ECM 단백질의 경우 패턴 영역을 완전히 덮는 최적의 농도를 찾습니다.
- 1x PBS로 표면을 세 번 헹구는 다. 패턴 유리가 유리 PA 전송에 즉시 사용되었는지 확인합니다. 하이드로겔 제조 중에 RT에서 패턴 유리를 PBS에 보관합니다.
3. 패턴 폴리 아크릴아미드 하이드로겔의 제조
참고: 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 산화된 N-하이드록시틸 아크릴아미드(HEA)를 포함하여 표면에 매트릭스 단백질의 공유 결합을 위한 반응성 알데히드 군을 제시하도록 제조된다. 또한, 하이드로겔의 상부 층에만 형광 구슬을 포함시키기 위한 이중층 접근법이 견인력 현미경 실험 중 비드 변위 기록을 개선하는 데 사용된다.
- 메타크릴드 유리 커버립을 페트리 접시에 넣습니다.
- 신선한 산화 HEA 용액을 준비하려면 9.55mL의 이중 증류수를 15mL 원심분리기 튜브에 넣습니다. 이어서, HEA의 0.5mL를 추가하고, 42 mg의 나트륨(메타)을 주기화하여 10mL의 용액을 얻습니다. 4시간 동안 어둠 속에서 용액을 지속적으로 저어줍니다.
- 표 1에 따라 아크릴아미드, 비스 아크릴아미드 및 이중 증류수를 혼합하여 10mL의 스톡 용액 하이드로겔을 얻습니다(연기 후드 아래에서, 단홍체는 신경독성). 데가스와 밀폐 씰에 뚜껑을 닫습니다.
참고: 스톡 솔루션은 4°C에서 최대 1년 동안 알리쿼트에 보관할 수 있습니다. 사용 전에 항상 영의 하이드로겔 계수를 특성화하십시오. - 이중 층 PA 하이드로겔을 준비하십시오 (연기 후드 에서 수행, 단량은 신경 독성입니다).
- 스톡 용액 99.3 μL, 1% 암모늄 감산염(APS)의 0.5 μL, 테트라메틸레틸레틸렌디아민(TEMED)을 1.5mL 튜브에 부드럽게 혼합하여 바닥층으로 시작합니다. 용액에서 10 μL을 가지고 메타크릴드 커버슬립의 중앙에 있는 파이펫을 떨어뜨립니다.
- 조심스럽게 물방울에 15mm 둥근 커버 슬립을 배치하고 중합을 위해 45 분 기다립니다. 상단 커버슬립을 메스로 부드럽게 분리합니다.
- 상단 층의 경우 93.3 μLof 스톡 용액을 신선한 산화 HEA 용액 1μL, 형광 구슬 5 μL(200nm 크기의 비드의 경우 평방 미크로인 당 3개의 비드 에 해당), 1.5m 크기의 비드의 0.5 μL, 1.5m의 TEMED0.2 μL을 부드럽게 혼합합니다. 용액에서 5 μL을 가지고 파이펫은 이미 중합 된 바닥 층의 중심에 드롭 와이즈.
- 마이크로 패턴의 커버슬립을 물방울에 부드럽게 놓습니다. 합체가 중합될 때까지 RT에서 45분 동안 기다립니다. 패턴이 있는 측면이 물방울에 닿는지 확인합니다. 커버슬립을 메스로 부드럽게 분리합니다.
- 24mm 커버립을 2성분 실리콘 접착제를 사용하여 맞춤형 드릴 6웰 플레이트의 바닥에 붙입니다. 5 분 후, 우물에 PBS를 추가합니다.
- 원자력 현미경검사(AFM)에 의한 폴리아크릴아미드 하이드로겔 샘플의 영의 계수를 특성화한다.
- AFM 홀더에 구형 팁 캔틸레버를 장착합니다.
- 하드 기판(예: 유리 또는 운하)에 힘 거리 곡선(3-4 V setpoint)을 획득하여 각 캔틸레버를 교정하고 캔틸레버 감도를 추정하고 표면에서 후퇴하며 스프링 상수를 얻기 위해 열 조정을 수행합니다.
- 보정된 캔틸레버를 하이드로겔 샘플 위에 놓고 PBS 버퍼에서 힘 곡선을 획득하여 다음 매개변수인 20-30 nN 힘 설정점, 5 또는 10 μm/s 접근 및 철회 속도, 5 μm 램프 크기입니다.
참고: 공기 40배 목표와 녹색 형광단백질(GFP) 필터를 장착한 반전 된 광학 현미경은 PA 하이드로겔 샘플 내에서 ECM 마이크로 패턴 영역을 시각화하고 표적으로 하는 데 사용되었습니다. - AFM 분석 소프트웨어를 통해 획득된 힘 대 거리 곡선을 플롯합니다.
- 접점을 찾고 힘 대 거리 곡선을 힘대 들여쓰기 곡선으로 변환합니다.
- 0.2와 0.5 사이의 푸아송 비율을 사용하여 곡선의 들여쓰기 부분(또는 팁 형상의 기능에 적합한 역학 모델)을 입력합니다.
4. UV-A 레이저 조명에 의한 세포 견인력의 로컬 방출(LUVI-TFM)
참고: UV-A 레이저는 하이드로겔의 정의된 영역에서 국소화된 세포에서 견인력을 방출하기 위해 적용된다. UV-A 레이저(즉, λ = 375 nm 솔리드 스테이트 레이저, <15mW)는 클래스 3B 레이저이다. 차폐되지 않은 레이저 빔은 눈과 종종 피부에 위험합니다. 반사및 산란된 빛과 방사선은 위험할 수 있습니다. 또한, UV 방사선은 피부암을 일으킬 수 있습니다. 레이저 안전 책임자의 안전 소개 후에만 장치 작업이 허용됩니다.
- 우물에서 PBS를 흡인.
- 종자 3 x 106 성장 배지에서 6 웰 플레이트 당 세포. 섬유아세포의 경우, L-글루타민을 함유하고 10% 태아 보빈 혈청(FBS)과 1% 페니실린/연쇄절제술을 함유한 고혈당 덜벡코의 수정된 이글 배지(DMEM)를 사용하십시오. 세포를 37°C/5% CO2에서 하룻밤 동안 배양합니다. 미세 검사를 시작하기 전에 부동 세포를 제거하기 위해 샘플을 세척합니다.
- 현미경 인큐베이션 챔버 및 가스 공급을 켜서 37°C 및 5% CO2 대기의 온도를 얻습니다.
- 현미경 및 레이저 패터닝 모듈을 켭니다. 필요한 경우 레오나르도 소프트웨어를 사용하여 20배 공기 목표에 UV-A 레이저를 다시 보정합니다. 주문 제작 된 6 웰 플레이트를 무대에 샘플을 놓습니다. PA 의 표면에 초점을 조정합니다.
- 조명 패턴을 설정하고 관심있는 세포를 표시합니다. 하이드로겔 표면에 다시 초점을 맞춥니다. 브라이트필드 채널에서 셀의 이미지를 획득합니다. Cy5 채널(극본 필터, 650nm 내분, 670nm 방출)으로 전환하고 변형된 상태에서 구슬의 이미지를 찍습니다.
- 레이저 채널로 이동합니다. 레이저를 3분 동안 켭니다. 우리의 특정 설정에서, 이것은 6,000 mJ / mm2의 가벼운 복용량에 해당.
- Cy5 채널로 전환하고 변형되지 않은 상태에서 구슬의 이미지를 획득합니다.
참고: 마우스 배아 섬유아를 사용한 실험의 경우 노출 후 15분 동안 기다렸다가 변형되지 않은 이미지를 기록합니다( 대표 결과 섹션 참조). 다른 유형의 셀에 대해 다를 수 있습니다. 다른 셀(들)을 위해 4.5-4.7 단계를 다시 반복합니다. - UV-A 조명 후 상승된 산화 스트레스를 측정하려면 시판되는 시약(CellRox)을 사용하십시오. CellRox는 감소된 상태에서 비형광이며, 반응성 산소 종에 의해 산화될 때, 방출 최대 ~665 nm의 형광이 있다.
- 제공된 프로토콜에 따르면, 이미징 미디어에 5 μM 시약을 추가하고 37°C/5% CO2에서 30분 동안 배양한다. 그런 다음, 따뜻한 1x PBS로 세포를 3배 세척하고 이미징 미디어를 대체한다. 유사한 광 노출을 사용하여 UV-A 조명 전후에 형광 이미징에 의해 Cy5 신호를 기록합니다.
5. 이미지 처리, 입자 이미지 속도 및 견인력 계산
참고: 세포 견인력은 형광구의 변위를 분석하고 입자 이미지 속도 측정을 기반으로 한 이미지 분석 도구를 사용하여 계산됩니다.
- 피지를 사용하여 형광 구슬 이미지를 엽니 다, 이전 (즉, 변형) 및 레이저 후 (즉, 변형되지 않은). 두 이미지를 하나의 스택으로 병합합니다(이미지 | 스택 | 스택에 이미지).
- StackReg 플러그인을 사용하여 두 이미지 사이의 측면 드리프트를 수정합니다 (P. 테베나즈, 스위스 연방 공과 대학 로잔). 이미지를 8비트로 변경(이미지 | | 유형 8비트) 및 1024 x 1024 픽스로 다시 확장(이미지 | 배율). 항상 처음에 참조 이미지와 함께 이미지 시퀀스(TIFF 형식)로 저장합니다.
- OpenPIV 프로젝트에서 구현된 PIV 필드에서 상호 상관 관계 기술19 를 사용하여 변위 벡터 필드를 획득한다.
- 편안한(변형되지 않은) 이미지와 변형된 이미지가 픽셀 단위로 크기 wR 및 wD의 검색 창으로 덮여 있는지 확인합니다. 각 검색 창에 대해 다음 수식을 사용하여 상호 상관 관계 함수를 정의합니다.
여기서 R(i,j) 및 D(i,j)는 선택한 검색 창으로 잘린 두 이미지의 강도 필드를 설명하고 이후에 는 패딩을 미러로 표시합니다.
그들의 
평균 값을 설명합니다. 창 크기는 wR = 32 및 wD = 32로 선택되고 70%의 중복이 인접 검색 창 간에 사용됩니다. - 각 검색 창에 대해 상호 상관 관계 기능을 최적화하고 검색 창의 중심 위치에 할당하는 변위 벡터
를 결정합니다. 서브픽셀 정확도는 설명된 바와 같이 최대영역 주위의 가우시안 핏을 사용하여 얻어진다20. - 모호한 변위 벡터를 찾아 제거합니다. 검색 창에 대응하는 변위 벡터는 임계값 1.5 미만의 상호 상관 함수의 두 가장 높은 로컬 최대값 사이의 비율이 모호한21로 간주됩니다.
- 잔류 임계값1.522에 대한 정규화된 중앙값 테스트에 실패하는 변위 벡터를 폐기합니다.
- (선택 사항) 모든 변위에서 고정된 벡터
를 빼서 나머지 측면 드리프트를 수정합니다. 이는 셀에서 멀리 떨어진 선택된 영역의 변위가 사라지기 때문에 수행됩니다. - 결과 변위 벡터 필드를 입방 다항보간 보간을 사용하여 입력 이미지의 4 px 간격을 사용하여 일반 그리드로 보간합니다. 누락된 데이터 포인트는 부드러운 바이바종 스플라인 외삽을 사용하여 채워집니다. 픽셀의 변위 벡터는 이미지의 픽셀 비율(20배 에어 렌즈의 경우 0.33 μm/px)에 의한 국소 변형과 관련이 있습니다.
- (선택 사항) 미러는 후속 해석에서 링링 아티팩트를 줄이기 위해 이미지를 패드로 처리합니다.
- 튜키 창 함수에 의해 변형 필드를 곱하여 0.2-0.3의 매개 변수를 사용하여 드리프트 보정으로 인한 에지 효과를 제거합니다. 이 실험에서 FOV의 중심에 있는 마이크로패턴 영역이 관심사입니다.
- 편안한(변형되지 않은) 이미지와 변형된 이미지가 픽셀 단위로 크기 wR 및 wD의 검색 창으로 덮여 있는지 확인합니다. 각 검색 창에 대해 다음 수식을 사용하여 상호 상관 관계 함수를 정의합니다.
- 정규화된 Fourier 트랜스포트 트랙션 세포측정(FTTC)18을 사용하여 견인력을 재구성합니다. 정규화로서 우리는 가장 간단한 합리적인 선택, 즉 0 차 Tikhonov (L2) 정규화를 사용합니다23,24,25. 26에 의해 정의된 일반화된 교차 유효성 검사(GCV) 함수를 최소화할 수 있도록 최적의 정규화 파라미터 λ가 선택됩니다.
여기서 θλ는 모든 Fourier 샘플링 모드및 G에 대한 λ의 주어진 값에 대한 재구성 된 견인 필드의 x 및 y 구성 요소를 포함하는 적층 벡터이며, FtTC에 대해 정의된 바와 같이 해당 변위 필드에 대한 선형 연산자 매핑 견인 필드입니다. 합계가 벡터 구성 요소를 통해 실행됩니다. ui는 모든 Fourier 샘플링 모드에 대한 변위 필드의 x 및 y 구성 요소입니다. GCV는 잘못된 역 문제의 분야에서 널리 사용되며 TFM에서 자주 사용되는 L 곡선 기준에 대한 좋은 대안입니다. 란즈코스 필터는 제한된 주파수 공간과 변위 필드 업샘플링으로 인해 도입된 아티팩트를 줄이는 데 사용됩니다. 견인 계산은 PA(예: 11.3 kPa)와 푸아송의 비율(예: 크로스링커 농도에 따라 0.2~0.5사이의 PA)의 영의 계수에 따라 달라집니다.
그들의 
평균 값을 설명합니다. 창 크기는 wR = 32 및 wD = 32로 선택되고 70%의 중복이 인접 검색 창 간에 사용됩니다.
를 결정합니다. 서브픽셀 정확도는 설명된 바와 같이 최대영역 주위의 가우시안 핏을 사용하여 얻어진다20.
를 빼서 나머지 측면 드리프트를 수정합니다. 이는 셀에서 멀리 떨어진 선택된 영역의 변위가 사라지기 때문에 수행됩니다.
Representative Results
PA 하이드로겔은 메타크릴드 유리 커버립에 중합되었으며, PA의 공유 연결에 대한 반응성 그룹을 제시합니다. 이러한 방식으로 하이드로겔을 수성 용액에 넣으면 기판에서 분리되는 것이 방지되었습니다(도 1A-D). 하이드로겔 표면 근처에서 고밀도의 수탁 마커를 얻기 위해 이중 계층 PA 하이드로겔의 제조를 개발했습니다. 형광 구슬이 없는 바닥층은 메타크릴드 커버슬립상에 중합되었다. 이어서, 비드를 함유한 또 다른 층은 하부 층(도 1E-H)의 상부에 중합되어, 단일 초점 평면에서 비드 분포를 달성하고 비드 밀도를 증가시키는 데 자주 사용되는 퇴적물의 필요성을 대체하였다. TFM 측정 중 세포 형상을 제어하기 위해 유리 커버슬립에서 미리 폴리머화된 PA(도 1F-F)로 섬유네틴 패턴 미세 구조의 직접 전달을 통해 마이크로패턴 PA 하이드로겔을 생산했습니다. 상단 하이드로겔 층 용액에 1% 비통상적인 크로스링커(산화 된 HEA)를 첨가하면 섬유네틴의 아민 그룹에 공유되는 알데히드 그룹을 제공한다.
우리는 두께약 60 μm인 PA 하이드로겔과 하이드로겔 표면에 가까운 상부 층의 제한된 형광 구슬을 준비했습니다. 하이드로겔의 이 모형은 반전된 현미경및 충분히 두꺼운 (TFM을 수행하기 위하여 최소 두께는 유리 기판의 어떤 충격을 방지하기 위하여 20-30 μm)18 로 보고되었습니다 화상 진찰 세포 견인을 위한 적당한 기판입니다. 형광 구슬의 국소화는 공초점 현미경 검사법에 의해 이미지되었다 (도 1I). 하이드로겔의 단백질 전달을 시각화하기 위해 형광으로 표지된 ECM 단백질을 사용하고 상피 현미경 검사법(그림 1J)에 의해 이미지화했습니다. 우리는 100 μm (왼쪽) 및 50 μm (오른쪽)의 직경을 가진 섬유 네크틴의 마이크로 패턴 원을 준비하여 부착 된 세포의 밝은 필드 이미지의 오버레이에 나타난 바와 같이 세포 또는 단일 세포의 그룹의 접착을 허용하고 형광성 라벨이 부착 된 신탁 구슬 및 섬유 네크 틴 마이크로 패턴을 준비했습니다. 상이한 시료에서, 마이크로패턴 섬유네크틴에 대한 단일 세포의 접착 반응은 파실린(도 1K)과 같은 초점 접착 단백질의 국소화를 이미지화하기 위해 간접면역형형 현미경검사법에 의해 검증되었다.
ECM 단백질 코팅과 하이드로겔 강성은 세포 접착26에 중요한 파라미터입니다. PA 하이드로겔의 기계적 특성을 특성화하기 위해 AFM27에 의한 나노 종양 인식 실험을 수행했으며, 이는 피광성 현미경과 결합되었습니다. 세 가지 강성의 하이드로겔 기판은 우리의 설정으로 준비및 테스트하였다(그림 2 및 표 1). 구형 AFM 캔틸레버는 패턴이 없는 PA 하이드로겔과 피브리노겐에서 순환적으로 접근하여 Alexa488 마이크로패턴 영역에 접목된 반면 힘 거리 곡선을 기록했습니다. 그 후, Hertz 모델의 접점 평가 및 적용을 통해 각 샘플의 영의 계수(E)를 추정할 수 있었습니다. ECM 마이크로패턴은 패턴이 없는 PA 하이드로겔각각과 비교할 수 있는 영의 변조기를 바꾸지 않았다.
기판에 부착된 세포에 의해 가해지는 견인력을 측정하기 위해, 가까운 UV 레이저 모듈(UV-A 6000 mJ/mm2)을 장착한 광시야 에피플루오스전 현미경에서 수행된 기준 기반 TFM을 위한 실험용 설정을 개발하여 세포 견인체를 방출하였다(그림 3A). 레이저 빔 조명이 스파티오-템포로 제어될 수 있으므로, 레이저 용량이 높은 단일 세포 나 세포 클러스터를 선택적으로 노출 할 수있을뿐만 아니라 더 중요한 것은 트립신과 같은 소화 효소를 사용하여 전체 샘플에서 세포 제거의 파괴적인 중간 단계는 더 이상 필요하지 않습니다. 이러한 높은 레이저 용량을 가진 일루미네이션 세포는 세포 사멸로 이어지는 높은 산화 스트레스를 유도했다(도 3B). 세포 사멸은 비드 변위(도 3A에 도시된)에 의해 표시된 바와 같이 기판으로부터의 견인체의 방출을 산출하였다. 우리는 UV-A 조명을 가벼운 패터닝 모듈과 결합하여 PA 하이드로겔의 미크론 크기의 영역을 선택적으로 조명합니다(도 3B-C). 이러한 방식으로 마이크로패턴 세포 클러스터(도 3C, F) 또는 단일 셀(도 3B)의 견인력을 방출할 수 있다. 중요한 것은, 우리 당시 ECM 패턴 하이드로겔의 기계적 특성을 스케일링하여 자외선 노출에 의해 크게 영향을 받지 않았다(도 2C). 산화 스트레스의 증가는 도 3D, E에 표시됩니다. 일반화된 교차 유효성 검사(그림 3B, F)에서 선택한 정규화 매개변수를 사용하여 트랙션 력을 재구성했습니다. 단일 세포에 대한 힘의 방출은 15분 동안 발생했으며, LUVI-TFM의 결과는 트립신 계 TFM(그림 3G-H)과 비슷하다.
도 1: TFM에 대한 패턴화된 섬유네틴 기판 제제의 방식. (A) 바닥 층을 위한 용액은 메타크릴드 표면에서 파이펫된다. (B) 더 작은 깨끗한 커버슬립이 물방울에 조심스럽게 놓입니다. (C) 겔화 시간은 45분(D) 상단 커버슬립이 분리된다. 하단 레이어가 준비되었습니다. (E) 상단 레이어용 용액은 하이드로겔에 파이펫이 됩니다. (F) 패턴 커버슬립은 조심스럽게 물방울에 놓입니다. (F') 유리에 접착 단백질의 마이크로 패턴은 UV-lithography 근처 마스크리스에 의해 생성된 다음 유리에서 PA 하이드로겔로 전달됩니다. 접착제 단백질의 무료 아민 그룹, 예를 들어, fibronectin, PA 표면에 알데히드 그룹에 공동으로 결합. (G) 겔화 시간은 45분(H) 상단 커버슬립이 분리된다. 패턴PA 하이드로겔이 준비되어 있습니다. (I) 표면 근처의 고밀도의 수피 구슬을 보여주는 공초점 xyz 현미경 그래프의 3D 표현. (J) 세포의 밝은 필드 이미지와 오버레이 포함 형광 구슬 (녹색)와 PA의 표면에 형광 표지 섬유 네틴 (마젠타)의 현미경 그래프. (K) 원 모양의 섬유넥틴 마이크로패턴(100 μm)을 준수하는 단일 세포의 간접 면역 형광 현미경 이미징. 핵(파란색), 팍실린(빨간색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: AFM에 의한 시료 기계적 특성의 특성화. (A) AFM 나노 들여쓰기 실험 설정. 구형 캔틸레버는 UV 처리 전후ECM 마이크로패턴을 프로브하는 데 사용되며, 이중 계층 PA(5% 아크릴아미드, 0.3% 비스 아크릴아미드) 영역의 비패턴 영역을 조사한다. (B) ECM 마이크로패턴(black)에 대한 대표적인 힘 대 들여쓰기 곡선. Hertz 맞춤(빨간색)은 샘플의 영의 계수(E)를 계산하는 데 사용됩니다. (C) UV-A 노출 후 패턴이 없는 이중 계층 PA 영역(ECM 없음), ECM 마이크로패턴 및 ECM 마이크로패턴에 대한 기계적 측정. 바는 s.E..M ± 것을 의미합니다(브라운 포사이드와 웰치 아노바 테스트). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 로컬 UV-A 조명 TFM(LUVI-TFM)은 넓은 시야 내에서 로컬 견인력 측정을 가능하게 합니다. (A) 로컬 UV-A 조명 TFM의 계획. 세포는 변형되지 않은 (참조) 이미지를 얻기 위해 UV-A 레이저의 고용량으로 처리됩니다. (B) UV-A 레이저 조명 전에 단일 셀의 밝은 필드 이미지. 중간: UV-A 레이저 조명 후 단일 셀의 밝은 필드 이미지. 오른쪽: 50 μm 직경UV-light 빔(빨간색 파선)으로 조명된 섬유네틴 코팅 PA 하이드로겔(E= 5.74 kPa)을 고수하는 단일 MEF의 견인력. (C) 왼쪽: 마이크로패턴 섬유네틴(원, 100 μm 직경)을 고수하는 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 클러스터의 견인력 기록. 클러스터는 200 μm 직경UV 라이트 빔 (빨간색 대시 라인)으로 조명되었다. 오른쪽: 마이크로패턴 섬유네틴(원, 300 μm 직경)을 고수하는 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 클러스터의 견인력 기록. 클러스터는 300 μm 직경UV-light 빔(빨간색 파선)으로 조명되었습니다. 스케일 바 = 200 μm. (D,E) 높은 UV-A 레이저 용량후 증가된 Cy5 신호 강도에 의해 표시된 세포내 산화 스트레스의 증가가 형광 현미경 검사법에 의해 검출된다. 산화 스트레스는 세포 사멸로 이어집니다. 스케일 바 = 200 μm. (F) 왼쪽: 마이크로 패턴 섬유네틴 (원, 100 μm 직경)에 준수 마우스 배아 섬유 아포트 아세포 (MEF)의 클러스터에서 응력 열지도. 오른쪽: 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 고부동에서 마이크로패턴 섬유네틴(원, 직경 300μm)에 응력 열맵을 부수고 있습니다. (G) 100 μm 섬유네틴 마이크로 패턴을 고수하는 MEF 세포는 UV-A 노출 후 서서히 견인력을 방출한다. 전체 릴리스는 15분 후에 달성됩니다(참조 이미지는 15분 후에 노출되었습니다). (H) 300 μm 직경 패턴을 고수하는 MEF 세포를 위한 종래의 트립신 기반-TFM과 비교한다. UV-A 조명(6,000mJ/mm2)이 15분 간 대기한 결과, 기존 트립신 치료(즉, 20분 동안 0.05%)와 크게 다르지 않습니다. 바는 S.E.M.(두 꼬리 학생의 t-테스트, ****P < 0.0001, * P < 0.05, ns P ≤0.5)를 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 아크릴아미드 (%) | 비스 아크릴아미드 (%) | 아크릴아미드에서 40% 스톡 솔루션(ml) | 비스 아크릴아미드로부터 2% 스톡 솔루션(ml) | 물 (ml) | 영의 변조기 (kPa) |
| 4 | 0.1 | 1 | 0.5 | 8.5 | 5,74 ± 0,53 |
| 5 | 0.15 | 1.25 | 0.75 | 8 | 9,69 ± 0,68 |
| 5 | 0.3 | 1.25 | 1.5 | 7.25 | 11,33 ± 1,06 |
표 1: 하이드로겔 스톡 솔루션 혼합물 및 그로 인한 탄력
모든 데이터는 최대 플랑크 소사이어티(Edmond)의 오픈 액세스 데이터 저장소에 입금되며 다음 주소를 통해 액세스할 수 있습니다 https://edmond.mpdl.mpg.de/imeji/collection/JTu8PlWqpbymN9Qf
Discussion
이 프로토콜에서, 우리는 TFM 연구를 위한 신탁 마커로 이용되는 형광 구슬을 포함하는 마이크로 패턴 PA 하이드로겔의 제조를 기술합니다. 우리의 접근 방식은 세 가지 단계를 기반으로합니다 : 1) 이중 계층 PA 하이드로겔의 준비; 2) ECM 단백질의 미세 패턴화 및 하이드로겔 표면으로의 이송; 3) TFM에 대한 패턴 근UV 빛의 사용. 기판에 세포 견인력을 분석하는 실험 설정은 형광 구슬26의 변위와 관련된 힘을 계산하기 위해 알려진 강성 값을 가진 선형 탄성 물질의 사용을 필요로 한다. PA 하이드로겔은 준비하기 쉽고 강성을 쉽게 조정할 수 있으며 일반적으로 강성 감지 및 TFM18,28에 사용됩니다. 그러나, 전체 하이드로겔의 재현 가능한 중합 시간 및 균일한 중합화를 얻으려면, 시약에 대한 조건과 시간을 저장하는 데 주의를 기울여야 한다, 예를 들어, APS는 그 활성을 잃지 않도록 건조기에 보관되어야 한다. TEMED는 직접 조명으로부터 보호되어야 합니다. 산화 된 HEA의 사용은 하이드로겔 표면에 매트릭스 단백질의 공유 결합을 허용, 이는 완전하고 안정적인 단백질 층의 형성을 달성하는 것이 유리할 수 있습니다. 산화 된 HEA 용액은 PA 하이드로겔을 제조 할 때마다 신선하게 준비해야합니다. 이중 계층 PA 하이드로겔은 세 가지 주요 장점을 제공합니다: 1) 젤을 매우 얇게 만들 필요 없이 하이드로겔 표면 근처의 상질 분포를 재현가능하게 얻을 수 있는 대안적 방법을 제공한다(즉, <20 μm). 하이드로겔 두께에 대한 제어는 TFM을 통해 정확한 측정을 얻는 데 매우 중요합니다. 탄성 기판이 너무 얇을 때, 섬유아세포와 같은 강한 부착 세포는 근본적인 단단한 유리 기판에 감지하고 기계적으로 반응할 수 있다29,30. 두꺼운 하이드로겔은 힘 재건을 위한 이미지 수집을 더욱 어렵게 만듭니다. 더욱이, 많은 현미경은 초박형 현미경 슬라이드를 사용하지 않는 한, 하이드로겔을 부착하는 데 사용되는 유리 기판의 추가 두께를 고려하여 수용 할 수있는 충분한 공간이 없습니다. 2) 이중 층 PA 하이드로겔에서 PA 하이드로겔 표면 근처의 피서식 구슬의 균일한 분포는 원심분리기를 사용하지 않고, 오히려 정확한 양의 하이드로겔 솔루션과 형광 구슬의 간단한 인큐베이션으로 달성된다. 높은 비드 밀도는 공초점 현미경 검사법의 필요 없이 견인력과 신호 대 잡음 비의 해상도를 증가시키기 때문에 PIV 분석을 수행할 때 상당한 이점이 있다. 3) 세포 재료 인터페이스에 가까운 얇은 층에 구슬을 제한하면 응광 현미경뿐만 아니라 공초점 현미경으로 견인력을 이미징 할 수 있습니다. 하이드로겔을 준비할 때 사용자는 프로토콜의 후속 단계를 진행하기 전에 하단 유리를 단단히 부착해야 합니다. 하이드로겔 표면을 손상시키지 않고 표면 상의 유리를 제거하기 어려울 수 있으므로 하이드로겔 층의 중합에 대해 표시된 인큐베이션 시간을 따르는 것이 좋습니다.
탄성 특성을 측정하는 가장 잘 알려진 기술은 AFM, 나노 핀덴티션, 인장 테스트 및 류메이트리입니다. 그러나, 나노 들여쓰기는 탄성 특성의 결정에 영향을 미칠 수있는 재료에 매우 높은 균주를 유도한다. 반면에 인장 검사 및 류경정법은 거시적인 측정 기술인 반면, 세포는 미세한 척도31,32에서 상호 작용한다. AFM은 생리학적 조건하에서 균주를 줄인 마이크로스케일에서 측정할 수 있습니다. 실험 상세(예: 들여쓰기 력 및 속도)가 없거나 데이터가 부족하거나 데이터가 부족하면 AFM 측정의 신뢰성에 부정적인 영향을 받을 수 있습니다27. Huth 외.는 AFM 데이터에서 영의 모툴리를 추출하는 알고리즘을 설명하며, 이는 측정 세부 정보를 일정하게 유지하는 것을 강조합니다27. 이 알고리즘은 영의 모툴리의 정확하고 신뢰할 수 있는 측정을 제공하며 실험에 사용되었습니다. 또한, 우리는 다른 일에 조작 된 샘플에 많은 곡선을 측정하고 매우 유사한 결과를 얻었다 (ca. 1-2 kPa의 평균 값의 변화). 이것은 우리의 젤의 강성을 안정적으로 예측할 수 있다는 것을 보여줍니다.
이 프로토콜에서는 광패턴 모듈을 사용하여 유리에 마이크로패턴 영역을 생성한 다음 하이드로겔 표면으로 전달됩니다. 이 프로토콜에 표시된 마이크로패턴은 DMD(디지털 마이크로 미러 장치)기반 마스크리스-UV 리소그래피(λ = 375 nm)7을 기반으로 합니다. DMD는 칩에 많은 수의 마이크로 미러로 구성됩니다. 단일 픽셀은 단일 마이크로 미러에 해당합니다. 컴퓨터에서 픽셀화 된 패턴 이미지 파일은 DMD를 통해 투사되고 객관적인 렌즈를 사용하여 표면에 초점을 맞췄습니다. 단백질의 미세 패턴화의 경우, 집중된 레이저 광은 광신염의 도움으로 방충제 폴리머 브러시를 갈라지는 데 사용됩니다. 그 후, 노출된 부위는 ECM 단백질로 채워져 있습니다. 이 마스크없는 절제 방법은 포토마스크 사용에 의존하지 않기 때문에 새로운 패턴을 디자인하는 데 큰 유연성을 제공합니다. 잉크스케이프와 같은 프리웨어를 사용하여 몇 분밖에 걸리지 않아 패턴을 디자인하고 적용하는 것은 매우 쉽습니다. 그러나, 짧은 시간 동안 생성된 패턴과 시료의 수는 큰 단점이며, 이 방법은 매번 단일 기판을 패턴화하는 데만 사용될 수 있기 때문이다. 포토패터닝 모듈은 여러 밀리와트를 방출하는 거의 UV 솔리드 스테이트 레이저 소스를 사용합니다. 차폐되지 않은 레이저 빔은 눈과 피부에 위험합니다. 반사 및 산란 된 빛과 방사선도 위험 할 수 있습니다. 취급은 레이저 장교의 안전 지시를 동반해야합니다. 포토패싱 모듈을 사용할 때 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 마이크로패터닝 과 절제 중에 레이저가 표면에 제대로 초점을 맞출 수 있도록 하는 것입니다. 패턴화 중 UV 광의 일관된 조명 용량 (강도는 시간을 곱한) 레이저가 표면에 초점을 맞추고있는 방법에 따라 달라집니다. 초점이 좋지 않아 표면의 약한 강도로 인해 하이드로겔 표면으로 ECM 이송이 실패하여 하이드로겔에 부착되는 세포가 없을 수 있다.
TFM 실험에서, 부착 된 세포와 fiducial 마커의 초기 이미징 후, 세포는 그들의 편안한 상태를 기록하기 위해 트립신 치료에 의해 PA 하이드로겔에서 방출된다. 이 단계를 수행하는 단점은 현미경 단계에서 샘플을 처리하는 것입니다. 관류 챔버없이, 접시의 뚜껑을 열고, 매체를 흡입, 헹구기, 및 피펫 트립신 솔루션은 초보자와 숙련 된 사용자를위한 도전을 나타냅니다. 사실, 이러한 절차는 xyz 축에서 드리프트의 주요 소스, 위치와 초점의 손실의 결과. 당사의 로컬 UV 조명 프로토콜은 TFM을 초보자에게 보다 쉽게 접근할 수 있는 기술입니다. 시판되는 현미경 기반 마스크리스 포토패터닝 모듈을 사용했지만 원칙적으로 모든 UV-A 조명 시스템을 사용할 수 있으며, 결국 에는 세포 견인력을 기록해서는 안 되는 기판 영역을 보호하기 위한 마스크와 함께 사용할 수 있습니다. 낮은 파장 가시광의 상당한 복용량으로 세포를 노출 (예를 들어, DAPI 방출을 흥분 보라색 빛) 증가 산화 스트레스로 이어질 것입니다, 광독성과 세포 사망을 초래할 수 있는. 따라서, 이 기술은 UV 레이저 모듈 없이 상피 현미경에서도 적용될 수 있다. 그러나 강도가 훨씬 약하기 때문에이 경우 효소 치료로 TFM을 수행하는 것이 훨씬 쉬울 것입니다.
LUVI-TFM을 사용하면 단일 세포 또는 작은 세포의 국소 분리로 인해 여러 측정에 동일한 샘플을 사용할 수 있습니다. 그러나, 주의는 이웃 세포에서 힘을 기록하지 않도록, 분리 세포의 선택에 지불해야한다. 따라서, 마이크로 패턴이 없는 단일 세포 측정의 경우, 혼잡한 영역은 피해야 한다; 단일 마이크로 패턴 셀에 대한 측정을 위해 단일 구조 사이의 거리가 패턴 영역의 직경의 적어도 두 배이기 때문에 패턴을 설계해야 합니다. 또한 인접한 패턴의 셀을 순서대로 사용하지 말고 기판의 먼 영역에서 샘플링하는 것이 좋습니다. 우리의 측정은 초점 제어 기능과 40 x air NA = 0.9 렌즈가 장착된 상피 현미경으로 잘 수행되며, 렌즈의 작동 거리가 충분히 길고 한 쪽에서 다른 렌즈로의 빠른 움직임은 매우 튜닝할 수 있습니다. TFM 응용 을 위한 세포의 표적 분리는 단일 세포 또는 전체 작은 세포 클러스터의 세포력을 측정하기 위해 효과적입니다 (예를 들어, 직경300 μm까지). 우리의 설정을 사용하여, 우리는 단일 세포의 UV 처리를 위한 세포 반올림 및 분리를 관찰했습니다 (그림 3A), 작은 세포 클러스터에 대한 분리는 거의 발생하지 않는 반면. 이 세포 견인력의 과소 평가로 이어질 수 있습니다. 더 큰 셀 클러스터의 경우 사용자가 20배 공기 목표를 사용하여 전체 클러스터를 이미지화해야 하고 포커스 제어 기능이 필요하기 때문에 효소 분리가 권장됩니다. 20x 에어 렌즈의 초점 깊이가 훨씬 길기 때문에 높은 배율 목표만큼 취급이 중요하지 않습니다. 사용자는 조명 용량이 표면에 레이저 초점에 따라 달라지므로 세포 절제에 초점을 올바르게 설정해야 합니다. 우리는 인접한 처리되지 않은 세포와의 가능한 기계적 상호 작용 때문에 세포 집단에서 LUVI-TFM을 사용하는 가능한 한계를 알고 있지만,이 측면은 실제로 상피 단층에서 표적 세포 압출의 역학에 대한 연구에 유용할 수 있습니다.
결론적으로, 당사의 TFM 접근 과 마이크로패턴 세포의 빛 유도 방출을 결합하여, 우리는 세포 접착력을 측정하기 위하여 강력하고 높은 처리량 프로토콜을 제공합니다. 이 방법의 다기능성은 해상도와 감도 를 향상시키기위한 현미경 검사법과 이미징 설정을 사용하여 더 악용 될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 프로토콜 비디오 제작에 대한 지원에 대한 레베카 알바라도 부인과 원고에 대한 건설적인 비판에 대한 스티븐 카살레 씨에게 감사드립니다. 우리는 유용한 토론을 위한 의학 연구를 위한 세포 생물물리학의 부, 막스 플랑크 연구소에서 동료를 감사합니다. 막스 플랑크-젤샤프트에서 E.A.C.-A까지의 재정 지원. 도이치 포르스충스게마인샤프트(DFG SFB1129, 프로제크트누머 240245660, P15에서 E.A.C-A. 및 P4에서 미국으로; DFG EXC 2082/1-390761711 - 미국) 또한 크게 인정된다. J.B. 재정 지원을 위한 칼 자이스 재단에 감사드립니다. E.A.C.-A., C.S. 및 미국 은 독일 연방 교육 연구부 (BMBF)가 지원하는 막스 플랑크 학교 문제를 통해 생명을 위한 기금을 인정합니다. C.S.는 유럽 연구 위원회의 지원을 받고 있습니다(통합자 그랜트 포토멕치, No.101001797).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | #440159 | Sigma Aldrich | |
| Acetic acid | #33209 | Honeywell | |
| Acrylamide 40 % | #1610140 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
| AFM cantilever | #CP-CONT-BSG-A-G | NanoAndMore | 5 μm spherical tip |
| AFM system | #NanoWizard3 | JPK | Coupled to optical microscope equipped with 40x air objective and GFP filter |
| Ammonium persulfate | #A3678 | Sigma | |
| Bis-acrylamide 2 % | #1610142 | Bio-Rad | CAUTION : toxic, work under a fume hood |
| Camera sCMOS | #C11440-42U30 | Hamamatsu | |
| Camera sCMOS | #ANDORZYLA4.2 | Oxford Instrument | |
| CellRox | #C10422 | Thermo Fisher | |
| Custom incubator chamber | EMBLEM | ||
| Dental glue | #1300 100 | Picodent | |
| DMEM | #41965 | Thermo Fisher | |
| Epifluorescence microscope | #Eclipse Ti2E | Nikon | |
| Epifluorescence microscope | #Axiovert200 | Zeiss | |
| Ethanol | #9065.3 | Carl Roth | |
| FBS South America | #S181T | Thermo Fisher | |
| Fibrinogen | #F13191 | Invitrogen | Alexa488 conjugate |
| Fibronectin | #F1141 | Sigma | |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8805 | Invitrogen | Carboxylated (365/415) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8848 | Invitrogen | Carboxylated (505/515) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8810 | Invitrogen | Carboxylated (580/605) |
| Fluorescent beads 200 nm | #F8807 | Invitrogen | Carboxylated (660/680) |
| Glass coverslip 15 mm round | #41001115 | Assistent | |
| Glass coverslip 24 mm round | #41001124 | Assistent | |
| Microscope Objective | #MRH08230 | Nikon | 20x air NA 0.45 |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | #CRL-2991 | ATCC | |
| mPEG-SVA | #MPEG-SVA-5000 | Laysan Bio | |
| N-Hydroxyethyl acrylamide | #697931 | Aldrich | |
| Plasma cleaner | #100-E | TePla | |
| PLPP gel | #PLPPgel | Alveole | |
| Poly-L-lysine | #P4823 | Sigma Aldrich | |
| Poly(L-lysine)-graft-poly(ethylene glycol) | #PLL(20-g[3.5]-PEG(2) | SuSoS | |
| Sodium(meta) periodate | #S1878 | Sigma Aldrich | |
| TEMED | #17919 | Thermo Scientific | |
| UV Patterning module | #PRIMO | Alveole | |
| UVO cleaner | #342-220 | Jelight |
References
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