Summary
De metoder som beskrivs här beskriver ett förfarande som används för att optogenetiskt vända kokaininducerad plasticitet i en beteendemässigt relevant krets hos råttor. Ihållande lågfrekvent optisk stimulering av thalamo-amygdala synapser inducerar långvarig depression (LTD). In vivo optogenetiskt inducerad LTD hos kokainerfarna råttor resulterade i efterföljande försvagning av cue-motiverad läkemedelssökning.
Abstract
Detta protokoll visar de steg som behövs för att använda optogenetiska verktyg för att vända kokaininducerad plasticitet vid thalamo-amygdala-kretsar för att minska efterföljande kokainsökande beteenden hos råtta. I vår forskning hade vi funnit att när råttor självadministrerar intravenöst kokain parat med en audiovisuell signal, blir synapser bildade vid ingångar från den mediala geniculate kärnan i thalamus (MGN) på huvudneuronerna i lateral amygdala (LA) starkare när cue-kokainföreningen lärs. Vi antog att reversering av kokaininducerad plasticitet vid dessa synapser skulle minska cue-motiverat kokainsökande beteende. För att uppnå denna typ av neuromodulering in vivo ville vi inducera synaptisk långvarig depression (LTD), vilket minskar styrkan hos MGN-LA-synapser. För detta ändamål använde vi optogenetik, vilket möjliggör neuromodulering av hjärnkretsar med ljus. Det excitatoriska opsinet oChiEF uttrycktes på presynaptiska MGN-terminaler i LA genom att införa en AAV innehållande oChiEF i MGN. Optiska fibrer implanterades sedan i LA och 473 nm laserljus pulserades med en frekvens av 1 Hz i 15 minuter för att inducera LTD och omvänd kokaininducerad plasticitet. Denna manipulation ger en långvarig minskning av förmågan hos signaler associerade med kokain att inducera drogsökande handlingar.
Introduction
Drogmissbruk är ett mycket allvarligt folkhälsoproblem i USA och över hela världen. Trots årtionden av intensiv forskning finns det mycket få effektiva terapeutiska alternativ 1,2. Ett stort bakslag för behandlingen är det faktum att kronisk droganvändning genererar långsiktiga associativa minnen mellan miljösignaler och själva drogen. Återexponering för drogrelaterade signaler driver fysiologiska och beteendemässiga svar som motiverar fortsatt droganvändning och återfall3. En ny terapeutisk strategi är att anta minnesbaserade behandlingar som syftar till att manipulera kretsarna som är involverade i reglering av läkemedelsköföreningar. Nyligen observerades att synapser i lateral amygdala (LA), speciellt de som härrör från thalamus mediala geniculate nucleus (MGN), stärks genom upprepad cue-associerad kokain-självadministrering och att denna potentiering kan stödja kokainsökande beteende 4,5. Därför föreslogs att cue-inducerad återinförande kunde dämpas genom omvänd plasticitet vid MGN-LA-synapser.
Förmågan att exakt rikta den synaptiska plasticiteten hos en specifik hjärnkrets har varit en stor utmaning för fältet. Traditionella farmakologiska verktyg har haft viss framgång i att minska återfallsbeteenden, men begränsas av oförmågan att manipulera enskilda synapser. Den senaste utvecklingen av in vivo-optogenetik har dock gett de verktyg som behövs för att övervinna dessa begränsningar och kontrollera neurala vägar med tidsmässig och rumslig precision 6,7,8. Genom att uttrycka ljuskänsliga opsiner i en specifik hjärnkrets kan laserljus sedan användas för att aktivera eller hämma kretsen. Frekvensberoende optisk stimulering kan användas för att specifikt manipulera kretsens synaptiska plasticitet i ett uppträdande djur.
Detta manuskript beskriver proceduren för att manipulera den beteendemässigt relevanta MGN-LA-kretsen med hjälp av in vivo-optogenetik. Först uttrycktes det excitatoriska opsinet oChIEF i MGN och optiska fibrer implanterades bilateralt i LA. Djur tränades sedan för att självadministrera kokain på ett cue-beroende sätt, vilket förstärker MGN-LA-vägen. Därefter användes ihållande, lågfrekvent stimulering med 473 nm laserljus för att producera kretsspecifik LTD. Att vända plasticiteten inducerad av kokainanvändning genererade en långvarig minskning av signalernas förmåga att utlösa åtgärder som är förknippade med drogsökande beteende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten som beskrivs i detta protokoll överensstämde med riktlinjerna från National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och godkändes av University of Pittsburghs institutionella djurvårds- och användningskommitté. Alla procedurer utfördes med vuxna, naiva Sprague-Dawley-råttor som vägde 275-325 g vid ankomsten.
1. Konstruktion av optiska fiberimplantat och patchkablar
- Förbered optiska fiberimplantat enligt tidigare publicerade protokoll9. Experiment som beskrivs i detta protokoll använde 200 μm kärnfiber (0,5 NA) och Ø1,25 mm Multimode LC / PC keramisk hylsa, Ø230 μm hålstorlek.
- Använd ett Dremel-verktyg för att poängsätta den nedre tredjedelen av en hylsa (närmast den plana änden av hylsan). Att poängsätta hylsorna hjälper dem att hålla fast vid tandcement, vilket ökar sannolikheten för att de kommer att förbli säkra under hela experimentets omfattning.
- Använd trådskärare för att skära ~ 35 mm fiber. Använd fiberstrippverktyg för att remsa ~ 25 mm fiber och lämna 10 mm oexponerad.
- Förbered värmehärdbar epoxi enligt tillverkarens instruktioner. Lös upp 1 g hartspulver i 100 mg härdarförening. Sätt fast en trubbig 25-gauge nål på en 1 ml spruta. Fyll sprutan med epoxi och fäst en trubbig 25-gauge nålspets.
- Använd ett skruvstycke eller en klämma för att säkert hålla hylsan med den plana sidan uppåt och den konvexa sidan nedåt. Tillsätt en droppe epoxi på hylsans plana sida med den epoxifyllda sprutan, var försiktig för att torka bort överflödig epoxi från hylsans sidor.
- Sätt in den avskalade delen av fiber genom hylsan så att ytterligare 5 mm strippad fiber exponeras. När det gäller LA-implantat kommer fibern att implanteras 7,9 mm ventralt till bregma, så den exponerade längden på ostrippad fiber bör vara ~ 13 mm.
- Kurera epoxin med en värmepistol i ca 30-40 s tills den blir svart/bärnstensfärgad.
- Poängsätt fibern direkt vid gränssnittet för den konvexa änden av hylsan med diamantkniv och använd ett finger för att försiktigt knacka av fibern.
- Polera den konvexa änden av hylsan genom att hålla med en hemostat, se till att applicera jämnt tryck och göra 20 cirkulära rotationer vardera på en serie polerpapper (från hög kvalitet till låg kvalitet; 5, 3, 1, 0,3 μm).
- Säkra ostrippad fiber till bordet med tejp och skåra strippad fiber, vilket ger ytterligare 2 mm bortom den ventrala koordinaten (För LA-implantat är den slutliga fiberlängden ~ 10 mm). Använd en hemostat för att dra i hylsan och jämnt bryta fibern där den har gjorts. Var försiktig så att du inte skär fiber helt när du gör poäng, annars kommer fiberns kärna att skadas.
- Bygg patchkablar som är kompatibla med optiska fiberimplantat. Specialdesignade patchkablar köptes in (se Materialförteckning). Alternativt kan patchkablar konstrueras enligt tidigare publicerade protokoll9.
OBS: Diametern och NA för hylsfibern och patchkabelfibern måste matcha vid kopplingskorsningen för att förhindra överdriven ljusförlust, vilket kan leda till att man inte tillräckligt stimulerar neural aktivitet. - Mät ljuseffekten genom patchkabeln och optiska fiberimplantat genom att fästa patchkabel / optisk fiber till en lämplig laserljuskälla (473 nm, 1 mW utgång) och mäta effekten med en ljussensor. En framgångsrikt konstruerad fiber kommer att avge en koncentrisk cirkel av ljus och har inte mer än 30% ljusförlust.
2. Gnagare intravenös kateterisering, virusleverans och optisk fiberimplantation
- Förbered djuret för operation.
- Helt bedöva råttor med valfri bedövningsmedel baserat på institutionella riktlinjer. Ett alternativ är ketaminhydroklorid (87,5-100 mg/kg, i.m.) och xylazinhydroklorid (5 mg/kg, i.m.). Se till att råttan är helt sövd genom att kontrollera om det saknas tåklämreflex.
VARNING: Ketamin är ett kontrollerat ämne som måste hanteras enligt institutionella riktlinjer.
OBS: Intramuskulär injektion av anestetika används i denna studie eftersom det gav en snabbare och mer tillförlitlig anestesiinduktion än intraperitoneal injektion. Kontinuerligt övervaka råttans andning och lyhördhet och ge termiskt stöd under hela operationen. - Raka ett stort område av råttans rygg (övre delen av ryggen från strax ovanför skulderbladen till mitten av ryggen) samt området på nacken under höger framben och hårbotten.
- Placera råttan i operationsområdet och applicera puralube (konstgjorda tårar) på ögonen. Injicera en kroppsviktsvolym karprofen (smärtstillande) subkutant (s.c.) genom huden på övre delen av ryggen och injicera sedan 5 ml lakterad Ringerlösning s.c. genom huden på nedre delen av ryggen.
- Sanera alla kirurgiska platser genom att väta en bit steril gasväv med betadin och torka ner det rakade kirurgiska området med en cirkulär rörelse. Upprepa sedan processen med 70% etanol. Upprepa denna alternerande cykel tre gånger.
- Helt bedöva råttor med valfri bedövningsmedel baserat på institutionella riktlinjer. Ett alternativ är ketaminhydroklorid (87,5-100 mg/kg, i.m.) och xylazinhydroklorid (5 mg/kg, i.m.). Se till att råttan är helt sövd genom att kontrollera om det saknas tåklämreflex.
- Utför intravenös kateterimplantation enligt tidigare publicerade protokoll 4,10.
OBS: Ett kirurgiskt draperi används inte under denna operation för att undvika irritation under kateterimplantation. Sterilisera alla instrument och utrustning före användning. Använd sterila handskar och byt handskar om någon icke-steril yta kommer i kontakt. - Omedelbart efter kateterimplantationer, säkra råttan i en stereotaxisk ram för att utföra AAV-injektioner.
- Leverera en subkutan (s.c) injektion av 2% lidokain (0,2-0,3 ml) till hårbotten som lokalbedövning.
OBS: Lokalbedövning används inte under intravenös kateterimplantation för att undvika förändringar i de kirurgiska resultaten. - Anslut en 26-gauge injektionskanyl i rostfritt stål till en Hamilton-spruta fylld med 1 μL koncentrerad AAV-lösning: antingen AAV5-hSyn-tdTomato eller AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
OBS: oChIEF är en variant av den blåljuskänsliga opsinkanalenrhodopsin (ChR2), som kan svara på ett brett spektrum av frekvenser 8,11, och har därför nytta för de lågfrekventa LTD-experimenten som diskuteras i detta protokoll, men också för högfrekventa LTP-experiment (diskuteras inte här). oChIEF-konstruktionen donerades av Dr. Roger Tsien och bearbetades för förpackning och rening av Duke Viral Vector Core. Minst 3-4 veckor behövs mellan injektionsdagen och dagen för LTD-induktion för att möjliggöra optimalt virusuttryck i MGN-axonterminaler.
VARNING: I allmänhet betraktas AAV som en biosäkerhetsnivå 1 (BSL-1) organism, med låg risk för självinfektion om inte ett hjälparvirus används i dess produktion. Dess användning kräver IACUC-godkännande och korrekt personlig skyddsutrustning måste alltid användas i enlighet med institutionella riktlinjer för att begränsa onödig exponering. - Använd en skalpell, gör ett 0,5 mm snitt från framsidan till baksidan av skallen och ta bort överliggande vävnad för att exponera ytan på skallen.
- Jämna råttans huvud i den främre/bakre axeln och noll stereotaktiska koordinater till bregma.
- Borra tre små hål genom skallen med ett Dremel-verktyg utrustat med en liten borr. Använd skruvmejseln för att montera skruvar av rostfritt stål (M2x4 965-A2) på plats.
OBS: Skruvar är nödvändiga för korrekt bindning av tandcement och skapande av robusta, långvariga huvudkåpor. Skruvarnas placering ska spridas över skallens främre-bakre axel och bort från AAV-injektionsstället. - Borra bilaterala hål för injektion av AAV baserat på koordinaterna från Rat Brain Atlas (Watson och Paxinos)12 för den mediala delen av den mediala geniculate kärnan (MGN); i mm från bregma, AP: -5,4; ML: ±3.0; DV: -6,6. Sänk långsamt injektionskanylerna (4 mm/min) tills de placeras i MGN. Injicera koncentrerad AAV-lösning med en hastighet av 0,1 μl/min.
- Låt injektionskanylen sitta kvar i 5 minuter efter att infusionerna är klara för att möjliggöra diffusion bort från kanylen och dra sedan långsamt ut kanylen från hjärnan.
- Leverera en subkutan (s.c) injektion av 2% lidokain (0,2-0,3 ml) till hårbotten som lokalbedövning.
- Omedelbart efter virusinjektioner, fortsätt att implantera optiska fibrer 4,9 riktade mot MGN-LA-terminaler.
- Använd ett Dremel-verktyg för att borra bilaterala hål för optiska fiberimplantat riktade mot lateral amygdala (i mm från bregma, AP: -3.0; ML ±5.1).
- Använd pincett för att ta tag i hylsan på det optiska fiberimplantatet och fixera det på de stereotaxiska adaptrarna så att de hålls säkert på plats.
- Sänk långsamt fibrerna med en hastighet av 2 mm / min tills fiberspetsen sitter i den dorsala delen av LA (DV: -7,9 mm).
- Säkra hylsor till skallen först med ett tunt lager Loctite-snabblim följt av tandcement och täckhylsor med hylshylsor med 1,25 mm diameter och dammskydd.
OBS: Valet av lim för att fästa hylsorna på skallen bör godkännas av den lokala eller institutionella djurvårds- och användningskommittén. Loctite används för denna studie för att på ett tillförlitligt sätt säkra hylsorna till skallen efter försök och fel med flera lim; Tillgängliga alternativ kan dock övervägas.
- Efter kirurgiska ingrepp, husråttor individuellt och ger fri tillgång till mat och vatten. Ge postoperativ vård i enlighet med institutionella riktlinjer. Spola katetrar dagligen med saltlösning innehållande gentamicin (5 mg / ml) och heparin (30 USP / ml) för att upprätthålla patency. Minst 5 dagar efter operationen och 24 timmar före starten av beteendeexperiment begränsar maten råttor till ~ 90% av deras fria matningsvikt.
3. Självadministration av gnagarkokain och utrotning av instrumentella hävstänger
OBS: Alla beteendeprocedurer utförs i standard operanta konditioneringskammare, utrustade med två infällbara spakar på en vägg, ett stimulansljus ovanför varje spak, en tongenerator, ett husljus och en infusionspump.
- Utsätt råttor för dagliga 1-h kokain (2 mg / ml) självadministrerande träningspass under ett FR1-schema för förstärkning.
- Placera råttor i operant kammare varje dag och låt råttor spakpressa. Ett tryck på den angivna "aktiva spaken" (motvikt över vänster och höger spak) resulterar i en kokaininfusion (1,0 mg/kg/infusion) och en 10 s presentation av en sammansatt ljus- och tonsignal. Ett tryck på den angivna "inaktiva spaken" har inga programmerade effekter.
- Fortsätt självadministreringsförsöken i minst 10 d och tills råttorna framgångsrikt får minst 8 infusioner/dag under 3 på varandra följande dagar. Underlåtenhet att nå förvärvskriterier vid dag 20 resulterar i uteslutning från studien.
- Efter att förvärvskriterierna framgångsrikt har uppfyllts, utsätt råttor för 1 h instrumentella utrotningssessioner för 6-10 d.
- Placera råttor i operanta kammare och låt råttor fritt trycka på spaken. Svar på både aktiva och inaktiva spakar har dock inga programmerade konsekvenser.
- Låt råttor fortsätta instrumentell utrotning dagligen tills i genomsnitt < 25 spakpressar under två på varandra följande dagar inträffar.
4. Optogenetisk induktion av LTD in vivo
OBS: Optogenetiska hämningsexperiment äger rum 24 timmar efter den sista dagen av instrumentell utrotning.
- Anslut patchkablar till en 473-nm blå laserdiod via en roterande fog upphängd ovanför en ren, standard gnagarhusbur med locket borttaget. Denna inställning gör det möjligt för gnagare att fritt röra sig runt buret under den optogenetiska stimuleringen.
- Slå på laserdioden enligt bruksanvisningen och anslut till en pulsgenerator. Justera inställningarna, så att råttan får 900 2 ms ljuspulser vid 1 Hz när den slås på.
VARNING: Korrekt ögonskydd måste alltid användas när du använder laser. - Mät ljusintensiteten genom patchkabeln med hjälp av en ljussensor. Justera laserns intensitet så att ljusutgången genom patchkabeln är ~ 5-7 mW.
- Placera råttor i en ren husbur. Ta bort dammskydd och hylshylsor och exponera hylsorna. Anslut patchkablar bilateralt till optiska fiberimplantat. Låt råttor utforska miljön i 3 minuter före LTD-induktion.
- Slå på pulsgeneratorn för att initiera optogenetisk stimulering.
OBS: Även om det är osannolikt, om råtta upplever några biverkningar av stimulering, avslutas experimentet omedelbart och råttor avlivas korrekt baserat på institutionella riktlinjer. - Efter LTD-induktion, håll råttor i buren i 3 minuter och placera sedan tillbaka i sina hemburar.
- För kontrollexperiment, använd samma stimuleringsprocedur på råttor som uttrycker AAV5-tdTomato-kontrollviruset. För skenexperiment, fäst en patchkabel på den optiska fibern hos råttor som uttrycker AAV5-oChIEF-viruset, men ingen stimulering levereras under en 15 minuters session.
5. Testa effekten av optogenetisk stimulering på cue-inducerad kokainsökning
- 24 timmar efter optogenetiska stimuleringar in vivo, placera råttor tillbaka i operanta konditioneringskammare. Råttor utsätts för en 1-h standard cue-inducerad återinförande session för att bedöma kokainsökande beteende.
OBS: Under cue-inducerad återinsättning ger ett svar på den aktiva spaken en 10-s presentation av den kokainassocierade signalen, men inga kokaininfusioner. - Ge ett andra återanställningstest minst 1 vecka efter det första testet för att avgöra om optogenetisk LTD-induktion resulterar i en långvarig undertryckande av kokainsökande
6. Färgning, fluorescens och avbildning för histologisk verifiering av viralt uttryck och optisk fiberplacering
- Gör 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 4% paraformaldehyd (PFA). Förvara båda lösningarna på is. Den totala volymen beror på antalet råttor i studien (~ 100 ml PBS och 200 ml PFA kommer att användas per råtta).
VARNING: PFA är en giftig kemikalie och känt cancerframkallande. Var försiktig för att undvika inandning och kontakt med huden. Dess användning och bortskaffande bör ske i enlighet med institutionella riktlinjer, inklusive användning av lämplig personlig skyddsutrustning och en kemisk flödeshuv. - Ställ in peristaltisk pump med en flödeshastighet på 20 ml/min. Fyll slangen på pumpen med 1x PBS. Fäst en trubbig 20-gauge nål i slangens ände.
- Djupt bedöva råttor med natriumpentobarbital (100 mg/kg, i.p.). Bekräfta anestesidjupet genom brist på svar på tånypa innan du fortsätter vidare.
OBS: Natriumpentobarbital används eftersom perfusionen är ett terminalt förfarande. - Använd kirurgisk sax för att skära upp bukhålan hos råttan under membranet. Skär genom bröstkorgen rostralt längs sidokanterna för att exponera råttans hjärta. Använd hemostat för att klämma fast den rostrala delen av ribbburet bort från hjärtat. Skär bort all överliggande fettvävnad som omger hjärtat.
- För in den trubbiga nålen genom vänster kammare och upp i aortan. Skär ett litet hål i höger förmak för att dränera lösningen när den återvänder till hjärtat.
- Perfusera varje råtta med 1x PBS i 5 min följt av 4% PFA, pH 7,4 i 10 min.
- Halshugga råttan, extrahera hjärnan och postfixera den i 4% PFA i 24 timmar. Överför sedan hjärnan till 30% sackaroslösning för 2-3 d.
- Sektionshjärnor vid 50 μm med hjälp av en kryostat.
- Montera alla skivor som innehåller LA eller MGN på glasskivor och täckglas.
- Bildskivor med hjälp av ett epifluorescerande mikroskop för att verifiera AAV-oChIEF-tdTomato-uttryck i MGN och dess projektioner till LA, samt placering av optisk fiber ovanför LA.
7. Perfusion och akut hjärnskivberedning för elektrofysiologiska experiment
OBS: Elektrofysiologiska experiment utförs på en delmängd av djur för att validera framgången för in vivo LTD.
- Bered elektrofysiologiska lösningar med hjälp av de reagens som förtecknas i tabellerna 1–3 4,13. Justera pH-värdet för alla lösningar till 7,4 med HCl och justera osmolariteten till 300-310 mOsm/kgH2O. Gör lösningarna färska före experiment och förvara vid 4 °C i upp till 1 vecka. Mätta alla lösningar med carbogen (95% O2/5%CO2) hela tiden under användning.
- Med hjälp av isofluran enligt lokala eller institutionella riktlinjer för djurvård och användning, bedöva råttan djupt i en sluten dödshjälpskammare. Bekräfta att djuret är helt bedövat via tå-nypreflexen.
- Fyll en liten bägare med 50 ml iskall skärlösning. Fyll slangen på peristaltisk pump med lösning och justera flödeshastigheten till 20 ml/min. Fäst en trubbig 20-gauge nål i slangens ände.
- Öppna bukhålan (se steg 6.4 och 6.5) och perfusera råtta kort med skärlösning (max 1-2 min).
- Efter perfusion, halshugga omedelbart råtta. Ta bort hjärnan och placera den i en liten bägare fylld med 4 °C skärlösning i 30 s-1 min.
- Överför hjärnor med en spatel och fixa dem snabbt till kammaren i en vibratom. Ta bort pia med fina pincett. Fyll kammaren med 4 °C skärlösning och bereda akuta koronala skivor (250 μm tjocka) av amygdala med en hastighet av 0,37 mm/sek och en frekvens av 70 Hz.
- När skivorna erhålls, placera var och en i en uppsamlingskammare fylld med skärlösning och inkubera vid 37 °C i 10–12 minuter. Cirka 5-7 skivor innehållande LA kan erhållas per djur.
- Överför skivorna till en bägare med rumstemperaturlösning och låt dem återhämta sig i >30 minuter före experimentet.
OBS: Skivor förblir i allmänhet friska medan de förvaras i hålllösning i 4-6 timmar. På grund av AAV: s fluorescerande natur hålls skivor i svagt ljus.
8. Ex vivo elektrofysiologiska inspelningar
- Bered intracellulära lösningar med hjälp av de reagens som anges i tabellerna 4–5.
OBS: Intracellulära lösningar bör göras före experiment och kan lagras långsiktigt (3-12 månader) vid -80 ° C eller kortvarigt (1-2 månader) vid -20 ° C. Lösningarna justeras till 7,3 (med CsOH för Cs-baserad intracellulär lösning och med KOH för K-baserad intracellulär lösning). Justera till en slutlig osmolaritet på 290-300 mOsm/kgH2O. - Bered 500 mM pikrotoxinstamlösning upplöst i dimetylsulfoxid (DMSO).
Anmärkning: Pikrotoxinlagren alikvoteras och lagras vid -20 °C. På användningsdagen tinas alikvoterna och tillsätts till registreringslösningen till en slutlig koncentration av 100 μM.
VARNING: Picrotoxin är en icke-kompetitiv antagonist av GABAA-receptorer , så infusion av picrotoxin har en stimulerande effekt. Det är allvarligt giftigt vid oralt intag eller hudabsorption. Korrekt personlig skyddsutrustning måste alltid användas när du arbetar med picrotoxin. - Överför skivor till ett upprätt mikroskop utformat för elektrofysiologiska experiment.
- Under experiment, bada kontinuerligt perfuserade skivor med inspelningslösning som värms upp till 31-33 °C.
- Förstora LA med ett 4x-mål. Identifiera huvudsakliga neuroner genom morfologi med en 40x vattennedsänkningslins.
- Använd en glaspipett (3-5 MΩ) fylld med antingen en Cs-baserad intracellulär lösning (för spänningsklämexperiment) eller en K-baserad intracellulär lösning (för strömklämexperiment) för att få inspelningar av helcellspatchklämmor.
- Identifiera AAV-infekterade MGN-axonala projektioner under fluorescens (med hjälp av ett RFP-filter). Stimulera projektioner med hjälp av en DPSS-laser med blått ljus (473 nm) ansluten till en pulsgenerator.
VARNING: För att begränsa laserexponeringen kopplas kollimerat laserljus till en fluorescerande port på mikroskopet och fokuseras på skivan genom målet.
OBS: I spänningsklämläge framkallas excitatoriska postsynaptiska strömmar (EPSC) optiskt vid 0,1 Hz. Neuroner som tar emot ingångar från AAV-infekterade MGN-neuroner kommer att uppvisa tillförlitliga EPSC. - För att inducera ex vivo LTD, i nuvarande klämläge, registrera en stabil baslinje av excitatoriska postsynaptiska potentialer (EPSP) i minst 10 minuter. Därefter leverera 900 2-ms pulser av 473-nm ljus med en frekvens av 1 Hz (total tid = 15 min). Registrera sedan kontinuerligt EPSP vid 0,1 Hz i ≥60 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En tidslinje som beskriver experimentordningen visas i figur 1. Under beteendeexperiment tjänar antalet kokaininfusioner såväl som antalet svar som görs på den aktiva spaken som ett mått på intensiteten av kokainsökande beteende. Under de första dagarna av självadministrering av kokain bör antalet aktiva svar gradvis öka under varje förvärvsdag innan det stabiliseras under den andra veckan. Omvänt bör inaktiva hävstångsreaktioner förbli låga under hela experimentet (figur 2A). På den första dagen av instrumentell utrotning finns det vanligtvis en ökning av antalet aktiva hävstångssvar, eftersom den oväntade frånvaron av kokain resulterar i eskalering av kokainsökande beteende. Detta svar kommer dock gradvis att minska med efterföljande sessioner när råttor lär sig den nya beredskapen, vilket resulterar i ett lågt och stabilt antal aktiva spaksvar inom 6-10 d (figur 2B). Råttor som inte når de angivna förvärvskriterierna i antingen självadministrerings- eller instrumentella utrotningsfaserna av experimentet tas bort från studien och data ingår inte i den slutliga analysen.
Efter instrumentell utrotning återinför återexponering för kokainassocierade signaler kokainsökande beteende, vilket resulterar i en ökning av antalet aktiva hävstångssvar. Denna ökning observeras i båda grupperna av kontrollexperiment: råttor som injicerades med virus som saknade oChIEF (AAV-kontroll) och råttor som inte fick laserstimulering (HAM-kontroll; Figur 3A) Men in vivo optogenetisk LTD av MGN-LA-terminaler orsakade en minskning av efterföljande cue-inducerad kokainsökning. 24 timmar efter optogenetisk LTD-induktion reducerades antalet aktiva spakpressar signifikant i förhållande till både AAV-kontroller och HAM-kontroller (figur 3A). Denna låga svarsnivå bibehölls under ett efterföljande återinsättningstest 7 dagar senare (utfört på en undergrupp av råttor) (figur 3B), vilket indikerar en ihållande minskning av kömotiverat kokainsökande i flera återanställningstester.
Ex vivo elektrofysiologiska registreringar från djur som exponerats för optisk stimulering bekräftade att dämpningen vid återinsättning faktiskt berodde åtminstone delvis på en modulering av MGN-LA synaptisk plasticitet. Detta bevisades av en minskning av optiskt framkallad EPSC-amplitud i LA-neuroner efter exponering för optisk LTD (figur 4A). Denna dämpning i EPSC-amplituden var specifik för neuroner som fick optisk stimulering, eftersom EPSC-amplituden förblev oförändrad i SHAM-kontroller. Dessutom kunde LTD inte genereras i skivor från råttor som redan hade fått optisk stimulering in vivo , men framkallades på ett tillförlitligt sätt i neuroner från råttor som genomgick HAM-stimulering, vilket framgår av en ihållande minskning av EPSP-stigningslutningen (figur 4B). Således verkar optisk stimulering in vivo blockera ytterligare LTD-induktion i skiva. Under inspelningen är det viktigt att mäta seriens motstånd under inspelningens varaktighet för att säkerställa att plåstret bibehålls hälsa. Celler med en förändring i serieresistens över 20% accepteras inte för dataanalys. Detta är särskilt viktigt för LTD-experiment som varar >60 minuter, eftersom förändringar i serieresistens kan påverka receptor- och kanaldynamiken. För att säkerställa att afferenterna som stimuleras under elektrofysiologiska registreringar har sitt ursprung i MGN är det viktigt att samla skivor genom thalamus utsträckning. Detta tjänar som validering att cellkropparna i MGN verkligen fluorescerande uttrycker AAV. Förutom visuell bekräftelse är funktionell validering också nödvändig. Under strömklämningsförhållanden avfyrar AAV-oChIEF-infekterade MGN-neuroner åtgärdspotentialer som svar på både höga och låga frekvenser av 473-nm-ljusstimulering (figur 4C).
Alla beteendemässiga resultat ansågs preliminära tills viralt uttryck och optiska fiberimplantat histologiskt verifierades och korrekt placering bekräftades (figur 5). Brist på AAV-uttryck i antingen MGN eller LA och / eller de där de optiska fibrerna inte var korrekt placerade i dorsala LA uteslöts från experimentell analys, men kan i vissa fall inkluderas som en negativ anatomisk kontroll.
Figur 1: Tidslinje för försöksförfarandet. En översikt över de kritiska stegen i protokollet, inklusive sekventiell tidsförlopp och varaktighet för varje experimentell fas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Förvärv och utrotning av självadministrering av kokain. (A) Djur uppvisar ett ökande antal kokaininfusioner och aktiva hävstångsreaktioner vid förvärvet, och en låg nivå av inaktiva hävstångsreaktioner. (B) Efter en inledande ökning av hävstångspressning på dag 1 av utrotningen minskar djuren med att reagera på både aktiva och inaktiva spakar till en låg, stabil nivå. Felstaplar, medelvärde ±SEM. Denna siffra har modifierats från Rich et al. 20194. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: In vivo optogenetic LTD dämpar cue-inducerad återanställning. (A) Optical LTD orsakar en signifikant minskning av aktiva spakpressar under återinsättning jämfört med djur som fick kontrollvirus eller SHAM-kontrollstimulering. Tvåvägs ANOVA, huvudeffekt av grupp (F (2,27) = 7,04, P = .004) och en dag x gruppinteraktion (F (2,27) = 8,08, P = .002); Bonferronis post hoc-analys: ***p < .001. (B) 7 dagar senare genomgick råttor ett andra återinsättningstest, vilket avslöjade en signifikant minskning av aktiv hävstångspressning hos djur som tidigare genomgick MGN-LA LTD i förhållande till SHAM-kontroller. Tvåvägs ANOVA, huvudeffekt av gruppen (F (1,32) = 5,04, P = .032), signifikant interaktion (F (1,32) = 7,69, P = .009); Bonferronis post hoc-analys, **p < .01. Felstaplar, medelvärde ±SEM, n i staplar, antal råttor. Denna siffra har modifierats från Rich et al. 20194. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Funktionell validering av in vivo lågfrekvent optogenetisk stimulering (A) In vivo dual hemisphere LTD av MGN-LA-synapser dämpar EPSC-amplituden i förhållande till SHAM-kontroller (Unpaired t-test, t(10) = 2,73, *P = .021). Infälld: Genomsnittliga EPSC-provspår framkallade vid Erev-70 mV. Skalstänger: 50 ms, 200 pA, n i staplar, antal råttor (neuroner). (B) In vivo optisk LTD-induktion ockluderar ex vivo LTD. 24 timmar efter in vivo LTD-induktion bereddes amygdalaskivor och samma stimuleringsprotokoll applicerades. EPSP-stigningslutningen vid MGN-LA-terminaler reducerades genom ex vivo optisk stimulering i neuroner från djur som hade fått in vivo FAM-stimulering, men inte i neuroner från djur som hade fått in vivo optisk LTD. n i kursiv stil, antal neuroner. (C) Exempel på strömkläminspelningar från AAV-oChIEF-infekterade MGN-neuroner. Åtgärdspotentialer framkallades genom stimulering av blått ljus (5-100 Hz). Skalstänger: 100 ms, 40 mV. Felstaplar, medelvärde ±SEM. Denna siffra har modifierats från Rich et al. 20194. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Histologisk verifiering av viralt uttryck och optiska fiberplaceringar. (A) Representativa mikroskopiska bilder som visar DAPI- och AAV-oChIEF-tdToto-uttryck i LA (vänster) och MGN (höger). Skalstång: 2 mm. (B) Schematiskt schema som visar injektion av AAV-oChIEF-tdTomato och hela den främre-bakre utsträckningen av LA (vänster) och MGN (höger) och optiska fiberplaceringar i LA. Mörkröd skuggning visar representation av minsta acceptabla virusspridning och ljusrosa skuggning visar representation av största acceptabla spridning. Blå cirklar motsvarar framgångsrik optisk fiberplacering i båda halvklotet. Svarta cirklar motsvarar framgångsrik optisk fiberplacering på endast en halvklot. Svart "X" motsvarar misslyckad fiberplacering. För att inkluderas i den slutliga analysen krävde råttor viralt uttryck av dubbla halvklotet i LA samt framgångsrik placering av fibrer. Koordinaterna är i mm, bakom bregma. Denna siffra har modifierats från Rich et al. 20194. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Kemisk | mm | MW | g/1000 ml |
| N-metyl-D-glukamin | 92 | 195.215 | 17.96 |
| Kaliumklorid | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Natriumfosfat monobasiskt | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Bikarbonat | 30 | 84.01 | 2.52 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glukos | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Natriumaskorbat | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Tiourea | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Natriumpyruvat | 3 | 110 | 0.33 |
| Magnesiumsulfat | 10 | Använd 5,0 ml 2,0 M lager | |
| Kalciumklorid | 0.5 | Använd 250 μl 2,0 M lager | |
| 1. För 1 liter lösning, tillsätt salter i den ordning som anges till 850 mlddH2O | |||
| 2. pH med koncentrerad HCl till 7,3-7,4 (NMDG gör en baslösning) | |||
| 3. Syresätt i 5-10 minuter och tillsätt sedanMgSO4 ochCaCl2 | |||
| 4. Ta den slutliga volutmen till 1 L med ddH2O och dubbelkolla det slutliga pH-värdet | |||
| 5. Kontrollera osmolariteten med osmometern och justera till 300-310 mOsm/kgH2O | |||
Tabell 1: Förteckning över ingredienser för extracellulär skärlösning. Ingredienser och instruktioner som används för beredning av den NMDG-baserade extracellulära skärlösningen.
| Kemisk | mm | MW | g/1000 ml |
| N-metyl-D-glukamin | 86 | 195.215 | 5.03 |
| Kaliumklorid | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Natriumfosfat monobasiskt | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Bikarbonat | 35 | 84.01 | 2.94 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 4.77 |
| D-glukos | 25 | 180.16 | 4.5 |
| Natriumaskorbat | 5 | 198.11 | 0.99 |
| Tiourea | 2 | 76.12 | 0.15 |
| Natriumpyruvat | 3 | 110 | 0.33 |
| Magnesiumsulfat | 1 | Använd 500 μl 2,0 M lager | |
| Kalciumklorid | 2 | Använd 1000 μL 2,0 M lager | |
| 1. För 1 liter lösning, tillsätt salter i den ordning som anges till 850 mlddH2O | |||
| 2. pH med 1 N HCl eller KOH till 7,3-7,4 | |||
| 3. Syresätt i 5-10 minuter och tillsätt sedanMgSO4 ochCaCl2 | |||
| 4. Ta den slutliga volutmen till 1 L med ddH2O och dubbelkolla det slutliga pH-värdet | |||
| 5. Kontrollera osmolariteten med osmometern och justera till 300-310 mOsm/kgH2O | |||
Tabell 2: Förteckning över ingredienser för extracellulär hållningslösning. Ingredienser och instruktioner som används för beredning av den extracellulära hålllösningen.
| Kemisk | mm | MW | g/1000 ml |
| N-metyl-D-glukamin | 119 | 195.215 | 6.95 |
| Kaliumklorid | 2.5 | 74.551 | 0.19 |
| Natriumfosfat monobasiskt | 1.25 | 119.98 | 0.15 |
| Bikarbonat | 26 | 84.01 | 2.18 |
| HEPES | 5 | 238.301 | 1.19 |
| D-glukos | 12.5 | 180.16 | 2.25 |
| Magnesiumsulfat | 1 | Använd 500 μl 2,0 M lager | |
| Kalciumklorid | 2 | Använd 1000 μL 2,0 M lager | |
| 1. För 1 liter lösning, tillsätt salter i den ordning som anges till 850 mlddH2O | |||
| 2. pH med 1 N HCl eller KOH till 7,3-7,4 | |||
| 3. Syresätt i 5-10 minuter och tillsätt sedanMgSO4 ochCaCl2 | |||
| 4. Ta den slutliga volutmen till 1 L med ddH2O och dubbelkolla det slutliga pH-värdet | |||
| 5. Kontrollera osmolariteten med osmometern och justera till 300-310 mOsm/kgH2O | |||
Tabell 3: Förteckning över ingredienser för extracellulär inspelningslösning. Ingredienser och instruktioner som används för framställning av den extracellulära inspelningslösningen.
| Kemisk | mm | MW | mg/50 ml |
| Cesiummetansulfonat | 108 | 227.997 | 1231.3 |
| Cesiumklorid | 15 | 168.36 | 126.3 |
| Cesium-EGTA | 0.4 | Tillsätt 80 μL 250 mM Cs-EGTA | |
| TE-klorid | 5 | 165.705 | 41.4 |
| HEPES | 20 | 238.301 | 238.3 |
| QX-314-Br | 1 | 343.31 | 17.2 |
| L-glutation | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Natriumfosfokreatin | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2.5 | 507.18 | 63.4 |
| Na-GTP | 0.25 | 523.18 | 6.5 |
| 1. Börja med 40-45 ml HPLC-klass H2O | |||
| 2. Håll fosfokreatin, ATP och GTP på is hela tiden. | |||
| 3. Lägg till ingredienser i den ordning som anges i tabellen | |||
| 4. pH till 7,3 med CsOH (ca 200 μl 2 M CsOH) | |||
| 5. Använd osmometer för att kontrollera osmolaritet. | |||
| 6. Tillsätt H2O av HPLC-kvalitet till en slutlig osmolaritet på ca 285-290 mOsm/kgH2O | |||
| 7. Bered 500–1000 μl alikvoter och förvara vid -80 °C eller -20 °C | |||
Tabell 4: Förteckning över beståndsdelar i cesiummetansulfonat intracellulär elektrofysiologilösning. Ingredienser och instruktioner som används för framställning av cesiummetansulfonat intracellulär lösning.
| Kemisk | mm | MW | mg/50 ml |
| Kaliumglukonat | 145 | 234.246 | 1698.2 |
| Kaliumklorid | 2.5 | 74.56 | 9.3 |
| Koksalt | 2.5 | 58.44 | 7.3 |
| K-BAPTA | 0.1 | Tillsätt 80 μL K-BAPTA | |
| HEPES | 10 | 238.301 | 119.2 |
| L-glutation | 1 | 307.323 | 15.4 |
| Natriumfosfokreatin | 7.5 | 255.1 | 95.7 |
| Mg-ATP | 2 | 507.18 | 63.4 |
| Tris-GTP | 0.25 | 886.59 | 11.1 |
| 1. Börja med 40-45 ml HPLC-klass H2O | |||
| 2. Håll fosfokreatin, ATP och GTP på is hela tiden. | |||
| 3. Lägg till ingredienser i den ordning som anges i tabellen | |||
| 4. pH till 7,3 med KOH (ca 200 μl 2 M KOH) | |||
| 5. Använd osmometer för att kontrollera osmolaritet. | |||
| 6. Tillsätt H2O av HPLC-kvalitet till en slutlig osmolaritet på ca 285-290 mOsm/kgH2O | |||
| 7. Bered 500–1000 μl alikvoter och förvara vid -80 °C eller -20 °C | |||
Tabell 5: Förteckning över ingredienser för kaliumglukonat intracellulär elektrofysiologilösning. Ingredienser och instruktioner som används för framställning av kaliumglukonat intracellulär lösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som beskrivits ovan finns det flera kritiska steg som är viktiga för att uppnå rätt experimentella resultat. Protokollet kommer sannolikt endast att vara effektivt hos djur som korrekt förvärvar kokain självadministrering, och hittills har det bara testats med de parametrar som beskrivs ovan. Det är möjligt att kokaindos, förstärkningsschema och cue-parametrar kan modifieras med sannolikt liten effekt på beteendemässiga resultat, med undantag för att ett andra ordningens förstärkningsschema kan leda till amygdala-oberoende kokainsökning som kan minska effekten av proceduren, även om detta inte har testats direkt14 . Det finns flera punkter i hela protokollet där validering av korrekt konstruktion och funktion av optiska fibrer kommer att bidra till att säkerställa framgångsrik optisk stimulering. Det är nödvändigt att korrekt poängsätta hylsor för att förhindra förlust från huvudkåpan och polera optiska fibrer och för att testa att förlusten av ljusflöde genom implantaten inte överstiger 30%9. Dessutom är laserstimuleringsparametrarna viktiga överväganden. Lasern ska användas med relativt låg effekt (5-7 mW). Ihållande lågfrekvent stimulering används för att inducera LTD, och detta kan valideras funktionellt genom att mäta MGN-LA synaptisk styrka med elektrofysiologiska inspelningar. Slutligen indikerade resultaten en signifikant minskning av cue-inducerad återinsättning med ett slutligt n på 10 djur per grupp, men experimenter bör förvänta sig att börja med ett större n, eftersom det är troligt att vissa djur kommer att behöva uteslutas från slutlig analys. Det är viktigt att verifiera korrekt anatomisk placering och uttryck av virus och optiska fibrer, och att endast använda data från djur där histologi har verifierats.
Trots den robusta beteendemässiga effekten på kokainsökande som observerats med detta protokoll finns det flera begränsningar som måste beaktas. För det första har metoden endast testats på råttor som tränades med en enda audiovisuell signal i kombination med kokain. Det är inte klart vad som skulle hända i ett scenario där flera olika signaler konditionerades, vilket skulle vara en mer exakt representation av mänskligt beroende, varigenom flera miljöstimuli blir starkt associerade med narkotikamissbruk15,16,17. Bevis från vårt laboratorium indikerar att optogenetisk LTD: s förmåga att minska läkemedelssökande beror på en minskning av synaptisk styrka som försvagar läkemedels-cue-associerade minnen. Det är dock inte klart i vilken utsträckning neutrala eller minnen som inte är förknippade med självadministrering av kokain kan påverkas av detta protokoll. Dessutom, medan metoden endast påverkar synaptisk styrka vid en krets, kan andra kretsar också vara viktiga för kodning av minne och / eller körning kokainsökande beteende18,19,20. Slutligen bör det noteras att LTD endast kan induceras vid synapser där virus uttrycks tillräckligt, vilket sannolikt lämnar vissa synaptiska anslutningar opåverkade av stimuleringsprotokollet, vilket potentiellt begränsar beteendepåverkan. Dessutom tyder bevis på att endast små ensembler av neuroner och synapser är involverade i kodningen av ett visst minne, vilket ger trovärdighet till tanken att LTD-induktion inom en hel hjärnregion inte är den bästa strategin för att åstadkomma beteendeförändring, medan andra tillvägagångssätt finns för att specifikt rikta in sig på cue- eller kontextuellt aktiva populationer av neuroner21, 22. Trots detta är protokollet effektivt för att dämpa cue-motiverad läkemedelssökning, troligen för att den lågfrekventa optiska stimuleringen begränsar LTD-induktion till synapser som tidigare har förstärkts av upprepade kokain-cue-parningar4.
Detta protokoll ger ett betydande framsteg till mer vanliga optogenetiska beteendestudier där neurons aktivitet aktiveras eller hämmas medan djuret utför beteendet i realtid19,23. Istället används optogenetik här som ett neuromodulerande verktyg för att vända kokaininducerad plasticitet. En fördel med denna metod är att den optogenetiska manipulationen är oberoende av beteendetestet, så att potentiella förvirrande effekter av optogenetik (t.ex. lokala kretseffekter, eldfast period efter ljusstimulering, antidromiska stimuleringseffekter etc. 24 bör inte påverka resultaten, vilket ökar förtroendet för att den hypotetiska neurala mekanismen förmedlar förändringar i beteende. Denna metod kan därför användas i ett antal applikationer som undersöker hur synaptisk plasticitet, särskilt en ökning av synaptisk styrka som sker med LTP, relaterar till förändringar i beteende. Liknande tillvägagångssätt kan också vara relevanta för klinisk tillämpning av neurala stimuleringstekniker där onormala anslutningar i hjärnan som driver dysfunktionellt beteende kan avregleras. På samma sätt, eftersom oChIEF-viruskonstruktionen svarar på både låg- och högfrekventa stimuleringar, finns det potentiella tillämpningar på dessa metoder utanför ramen för de beskrivna experimenten. Till exempel kan optogenetiskt inducerad LTP vara fördelaktig för att vända underskott i plasticitet som finns i ett brett spektrum av neurodegenerativa och neurodevelopmental störningar25. Vidare har dubbelriktad plasticitet vid MGN-LA-synapser också varit direkt kopplad till reglering av beteenden som är relevanta för rädsloassocierade störningar8.
Modulering av de specifika neurala kretsarna som stöder drogmotiverade beteenden är avgörande för att etablera långvarig avhållsamhet från droganvändning. Detta protokoll använder nya framsteg inom in vivo-optogenetik för att vända plasticiteten hos en exakt neural krets som förstärks av upprepad självadministrering av kokain i närvaro av miljösignaler. Resultatet av denna specifika neuromodulering är en minskad sannolikhet för efterföljande återexponeringar för att utlösa ett kokainsökande svar, vilket kan få viktiga konsekvenser för utvecklingen av framtida terapier för substansanvändningsstörningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna stöd från USPHS-bidrag K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) och Pennsylvania Department of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
- Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
- Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T. Role of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in treatment of addiction and related disorders: A systematic review. Current Drug Abuse Reviews. 10 (1), 31-43 (2017).
- Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. The reinstatement model of drug relapse: History, methodology and major findings. Psychopharmacology. 168 (1-2), 3-20 (2003).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Plasticity at Thalamo-amygdala Synapses Regulates Cocaine-Cue Memory Formation and Extinction. Cell Reports. 26 (4), 1010-1020 (2019).
- Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Calcineurin promotes neuroplastic changes in the amygdala associated with weakened cocaine-cue memories. Journal of Neuroscience. 40 (6), 1344-1354 (2020).
- Deisseroth, K. Optogenetics 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
- Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
- Nabavi, S., Fox, R., Proulx, C. D., Lin, J. Y., Tsien, R. Y., Malinow, R. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Sparta, D. R., Stamatakis, A. M., Phillips, J. L., Hovelsø, N., Van Zessen, R., Stuber, G. D. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2012).
- Stripling, J. S. A simple intravenous catheter for use with a cranial pedestal in the rat. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 15 (5), 823-825 (1981).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Hard Cover Edition. , 466 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Bender, B. N., Torregrossa, M. M. Dorsolateral striatum dopamine-dependent cocaine seeking is resistant to pavlovian cue extinction in male and female rats. Neuropharmacology. 182, (2021).
- Milton, A. L., Everitt, B. J. The persistence of maladaptive memory: Addiction, drug memories and anti-relapse treatments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (4), 1119-1139 (2012).
- Torregrossa, M. M., Taylor, J. R. Learning to forget: Manipulating extinction and reconsolidation processes to treat addiction. Psychopharmacology. 226 (4), 659-672 (2013).
- Kalivas, P. W., Volkow, N. D. The Neural Basis of Addiciton: A Pathology of Motivation and Choice. American Journal of Psychiatry. 162 (8), 1403-1413 (2005).
- Stefanik, M. T., et al. Optogenetic inhibition of cocaine seeking in rats. Addiction Biology. 18 (1), 50-53 (2013).
- Arguello, A. A., et al. Role of a Lateral Orbital Frontal Cortex-Basolateral Amygdala Circuit in Cue-Induced Cocaine-Seeking Behavior. Neuropsychopharmacology. 42 (3), 727-735 (2017).
- Cruz, A. M., Spencer, H. F., Kim, T. H., Jhou, T. C., Smith, R. J. Prelimbic cortical projections to rostromedial tegmental nucleus play a suppressive role in cue-induced reinstatement of cocaine seeking. Neuropsychopharmacology. 46 (8), 1399-1406 (2021).
- Cruz, F. C., Javier Rubio, F., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
- Rubio, F. J., et al. Context-Induced Reinstatement of Methamphetamine Seeking Is Associated with Unique Molecular Alterations in Fos-Expressing Dorsolateral Striatum Neurons. Journal of Neuroscience. 35 (14), 5625-5639 (2015).
- Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. 86 (4), 923-935 (2015).
- McCracken, C. B., Grace, A. A. High-frequency deep brain stimulation of the nucleus accumbens region suppresses neuronal activity and selectively modulates afferent drive in rat orbitofrontal cortex in vivo. Journal of Neuroscience. 27 (46), 12601-12610 (2007).
- Zhang, H., Bramham, C. R. Bidirectional Dysregulation of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission and Plasticity in Brain Disorders. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12 (26), (2020).
