Summary
本协议描述了从成年，幼年，幼虫和胚胎斑马鱼（Danio rerio）中急性分离活的心脏和血管平滑肌细胞，适用于电生理研究。
Abstract
斑马鱼长期以来一直被用作心血管研究中的模式脊椎动物生物。从斑马鱼心血管组织中分离单个细胞的技术困难一直限制着研究它们的电生理特性。以前的方法已被描述用于解剖斑马鱼心脏和分离心室心肌细胞。然而，斑马鱼心房和血管肌细胞的分离用于电生理表征并不详细。这项工作描述了新的和改良的酶方案，这些方案常规提供分离的幼年和成年斑马鱼心室和心房心肌细胞，以及来自球状动脉的血管平滑肌（VSM）细胞，适用于膜片钳实验。没有文献证据表明斑马鱼心血管组织在胚胎和幼虫发育阶段分离的心血管组织进行电生理学研究。展示了允许对幼虫和胚胎心脏的单个细胞进行膜片钳实验的部分解离技术。
Introduction
斑马鱼是小型硬骨鱼，长期以来一直被用作模型脊椎动物生物1，最近作为用于基因和药物高通量筛选的可行脊椎动物系统而崭露头角2，3。然而，斑马鱼组织的生理分析尚未得到很好的发展。在心血管系统中，已经描述了解剖斑马鱼心脏4和分离心室心肌细胞5，6，7的方法。关于有效分离心房肌细胞的详细描述很少，也没有关于血管平滑肌（VSM）制剂用于膜片钳研究的报告。
目前的工作描述了分离斑马鱼心脏和血管肌细胞的方法，可用于电生理和功能研究。该方法包括修改先前报道的斑马鱼心室心室肌细胞分离方案5，6，并适应哺乳动物VSM细胞分离8的方法，允许从球状动脉（BA）中分离斑马鱼血管平滑肌细胞。该方案可有效产生来自斑马鱼的分离心房、心室和 VSM 细胞，这些细胞可以可靠地用于膜片钳研究长达 8 小时9。
尽管它们的幼虫几乎透明，完全在亲本生物体之外发育，但在研究心血管发育方面探索它们所承诺的个体发育潜力受到年轻时提取和分析组织的挑战的限制。本文通过使用经过调整的、已发表的提取方法，在受精后 3 天 （dpf） 分离的斑马鱼心脏上演示膜片钳实验来解决这一限制10.
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Protocol
所有斑马鱼（野生型品系AB，雄性和雌性）都按照华盛顿大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导方针饲养，维护和处理实验。
1. 从成年、幼年和幼虫斑马鱼中分离心房、心室和球状动脉
- 使用冷休克对鱼实施安乐死，即浸入4°C水中~10秒。
- 使用弯曲的镊子，将鱼转移到部分填充有灌注缓冲液（PB）的大培养皿中（表1），并置于解剖显微镜下。
- 用一把剪刀将鱼斩首到眼睛的后方。
- 使用弯曲的镊子（幼鱼的细镊子），用非惯用手握住鱼，腹侧朝向解剖镜。用惯用手握第二对细镊子（或幼鱼的超细镊子），轻轻撕开胸肌和鳍，露出心血管（CV）组织（心房、心室和球状动脉，BA）（图 1）。
- 将细镊子放在惯用手上，轻轻拉动BA与腹侧主动脉的交叉尖端。
注意：BA和心脏将从体腔中出来。- 通过捏住镊子并定位多个静脉分支汇聚的心房尖端（静脉窦），小心地将 BA 与主动脉分开。使用细镊子，将心房的尖端从静脉窦上“拔出”。这将CV组织与身体的其他部分隔离开来（图1）。
2. 从成年、幼年和幼虫斑马鱼中解离心肌细胞以进行电生理研究
- 使用细镊子，将心房和心室从前面一步中分离的CV组织中“拔出”。
注意：该过程允许以最小的交叉污染清洁解剖每个组织，感觉类似于从树上摘果实。- 使用细镊子轻轻撕裂心室以排出多余的血液，当心脏组织从鲜红色变成淡鲑鱼色时，可以确保这一点。
- 将分离的心房和心室汇集到含有灌注缓冲液 （PB; 1.5 mL） 的单独 1.5 mL 离心管中。
注意：为了保证成年斑马鱼心房心肌细胞（ACM）和室性心肌细胞（VCM）的成功解离，通常需要四个心房和三个心室。对于幼年斑马鱼（28-90天），这个数字翻了一番。- 在斑马鱼幼虫（14-28天）的情况下，从~30只幼虫中收集尽可能多的组织。
- 用 750 μL 消化缓冲液 （DB）（表 1） 替换试管中的 PB，并将试管置于 37 °C 和 800 rpm 的恒温摇床上。允许消化组织，直到它们变成半透明（心房~30分钟，心室~40分钟）。
- 通过在台式微型离心机（环境温度下为2，000 x g ）中轻轻旋转组织3-5秒来结束消化，并用750μL停止缓冲液（SB）替换上清液DB（表1）。
注意：此离心步骤对于VCM隔离是可选的。 - 将沉淀的组织在SB中在环境温度下孵育15分钟。
- 用每个 500-750 μL PB（取决于最终细胞的所需密度）轻轻替换 SB，并使用火焰抛光的巴斯德移液管研磨组织（~30 次）以分散细胞。
注意：心肌细胞（CM）现在已准备好进行电生理研究，并在室温下储存长达8小时。 - 为了均匀采样，轻轻地上下移液细胞几次以重悬，然后再加入一滴细胞进行相应的研究。
3. 从成年和幼年斑马鱼中解离血管平滑肌 （VSM） 细胞以进行电生理研究
- 使用与步骤2.1相同的方法从CV组织中拔出球状动脉（BA），并将五个成人BA汇集到含有S1缓冲液（1.5mL）的1.5 mL离心管中（表2）。对于幼年斑马鱼，池10个BA，对于超过2周的幼虫，池30-40个BA。
注意：从小于2周的斑马鱼幼虫中分离VSM细胞是不切实际的。 - 用400μLS2缓冲液（表2）替换S1，并让木瓜蛋白酶（参见 材料表）在37°C和800rpm的恒温摇床上消化BAs~20分钟。
- 让部分消化的BA沉淀1分钟，并用500μL含有胶原酶的S3缓冲液（表2）替换上清液S2。在37°C和800rpm的恒温摇床上消化组织3-5分钟。
- 通过在台式小型离心机（环境温度下为 2，000 x g ）中轻轻旋转组织 3-5 秒并用 500 μL S1 替换上清液 S3 来结束消化。
- 轻轻研磨沉淀组织（~15次）以分散VSM细胞并板到适当尺寸的玻璃盖玻片上。
注意：盖玻片尺寸由膜片钳记录室的尺寸决定，在本例中，使用5 x 5 mm）。- 将盖玻片在室温下保持30分钟，使细胞附着并在接下来的6小时内使用它们。
4. 从胚胎斑马鱼中分离心脏以进行电生理研究
- 将三卡因（150mg / L;每100mm x 20mm培养皿1ml）添加到~300个胚胎（2-5dpf）中，从其孵育条件收集（图2A）。
- 通过使用移液管将麻醉胚胎转移到5 mL离心管中来浓缩麻醉胚胎，从离心管中去除多余的培养基（E3）（图2B）。
- 用 3 mL 冷灌注缓冲液 （PB） 洗涤胚胎两次，然后重悬于 2 mL PB 中（图 2B）。
- 使用胚胎心脏分离装置（图2C），将~1mL的胚胎吸入注射器针中，并立即将它们排出回管中。重复此过程30次，每次注射器运动1秒（图2C）。
- 将破碎的胚胎通过放置在漏斗中的100μm细胞过滤器筛，并将过滤后的心脏收集在另一个5 mL离心管中。用1mL PB冲洗注射器，并通过筛子将该冲洗液收集到管中（图2C）。
- 充分混合并分离到 1.5 mL 离心管中，每个管包含 1 mL 内容物。将所有管在台式小型离心机上离心5秒（环境温度下为2，000 x g ）并丢弃上清液。
- 使用 1 mL PB 对试管中的沉淀进行连续重悬，即使用 1 mL PB 将沉淀重悬于一个管中，并使用该重悬的 PB 将沉淀重悬到下一个试管中。
- 轻轻上下移液心脏两次，然后加入一滴用于相应的研究。
5. 分离心血管细胞的膜片钳研究
注意：从分离的细胞获得由内而外和全细胞膜片钳记录，如之前报道的斑马鱼心脏血管系统中的KATP通道电流9。
- 对于成人和青少年心肌细胞，将解离的细胞（来自步骤2）从悬浮液直接添加到记录室中。对于VSM细胞，将包含电镀VSM细胞（来自步骤3）的盖玻片放入记录室中。
- 将分离的完整胚胎心脏（来自步骤4）从悬浮液添加到腔室中，并从心外膜肌细胞中进行膜片钳记录（图2D）。
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Representative Results
上述方案可靠且常规地提供了足够的心脏和血管肌细胞，质量一致，适合膜片钳研究，正如最近在野生型和突变斑马鱼心脏脉管系统中 ATP 敏感钾 （KATP） 通道的广泛研究中报道的那样9。来自分离的心肌细胞的这种K ATP通道活性的记录的代表性迹线如图3A-C所示。在从球状动脉分离的细胞的情况下，血管平滑肌细胞通过Tg（tagln：egfp）表达11，12确认（图1）。在从胚胎心脏切除的贴片中获得成功的单通道记录（n = 8个记录，来自N = 5个制剂）（图3D）。使用膜片钳放大器和兼容的数字化仪，在全细胞电流钳模式下记录分离的成年斑马鱼心室和心房肌细胞的动作电位（见材料表）。用于动作电位 （AP） 测量的细胞外记录溶液包含 NaCl （140 mM）、KCl （4 mM）、CaCl 2 （1.8 mM）、MgCl2 （1 mM）、葡萄糖 （10 mM）、HEPES （10 mM） 和布比他汀 （0.01 mM， pH 7.4）;细胞内记录溶液含有KCl（120mM），EGTA（5mM），K 2 ATP（5mM），MgCl 2（5mM）和HEPES（10mM，pH7.2）。贴片移液器从钠钙玻璃中取出，当填充细胞内溶液时，电阻为3 - 5 MΩ。心室肌细胞表现出稳定的超极化膜电位，并通过贴片移液管的电流注入刺激动作电位（图3E），而心房肌细胞表现出自发动作电位放电（图3F）。动作电位特性总结于表3中。
图 1：心房、心室和球状动脉细胞的分离。 说明心房 （A）、心室 （B） 和球状动脉 （C） 细胞分离的示意图。描述每种分离细胞类型（底部）的图像在每种情况下都有比例尺= 50μm。从平滑肌细胞转基因斑马鱼系（Tg（tagln：egfp）11，12）中分离的BA细胞呈绿色荧光阳性。请点击此处查看此图的大图。
图2：说明胚胎心脏分离的示意图。 （A）将受精胚胎从繁殖池中取出并置于含有E3水的培养皿中，并在28°C下保持长达5天。（B）在所需年龄，使用三卡因原 位 麻醉胚胎，并将其转移到5mL离心管中的PB中进行解离。（C）胚胎心脏分离装置由一个10毫升注射器组成，该注射器连接到安装在台架上的解离管上方的19 G针头上，允许手进行研磨。（D）连接到膜片钳移液器的孤立心脏（第4天）的图像。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：来自分离的斑马鱼心血管组织的代表性膜片钳记录。 （A，B）ATP敏感的KATP通道来自从成年斑马鱼分离的心房（A）和心室（B）心肌细胞的由内而外切除的膜片钳记录。（C）从成年斑马鱼中分离的VSM细胞的全细胞膜片钳中记录KATP通道电导。（D）从斑马鱼胚胎心脏切除的膜贴片中的单个K +通道活性（4 dpf）。所有切除的贴片记录均在膜的两侧用140 mM KCl进行，膜电位为-50 mV。记录全电池电流，膜电位钳位为-70 mV。（E）来自孤立心室肌细胞的电流钳记录示例。电流注入刺激动作电位，如下所示。（F）来自分离的心房肌细胞的电流钳记录示例，显示自发动作电位放电。请点击此处查看此图的大图。
| 灌注缓冲液 （PB） | 10 毫米HEPES，30 毫米牛磺酸，5.5 毫米葡萄糖，10 毫米BDM。将溶液放入磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，将pH调节至7.4 | ||
| 消解缓冲液（分贝） | PB + 12.5 μM 氯化钙2 + 5 毫克/毫升 Col II + 5 毫克/毫升 Col IV + 5 ng/mL 胰岛素 | ||
| 停止缓冲液 （SB） | PB + 10% FBS + 12.5 μM 氯化钙2 + 10 毫克/毫升 BSA + 5 纳克/毫升胰岛素 | ||
表1：用于分离斑马鱼心肌细胞的溶液。
| S1 缓冲区 | 0.1% BSA （w/v）， 145 mM 氯化钠， 4 mM 氯化钾， 10 mM HEPES， 10 mM 葡萄糖， 0.05 mM 氯化钙 2， 1 mM 氯化镁2， 使用 NaOH 调节至 pH 7.4 | ||
| S2 缓冲区 | 2 mL S1、4 mg 木瓜蛋白酶、2 mg DTT | ||
| S3 缓冲区 | 2 mL S1、3 mg H 型胶原酶、2 mg 胰蛋白酶抑制剂、1 mg 弹性蛋白酶 | ||
表2：用于分离斑马鱼VSM细胞的溶液。
| 心室肌细胞（n = 3 个记录） | |||
| 维姆 （毫伏） | APA （毫伏） | APD50 （毫秒） | |
| -75.7 ± 3.9 | -119.6 ± 3.8 | 329±163 | |
| 心房肌细胞（n = 3 个记录） | |||
| AP 速率（最小值-1） | MDP （毫伏） | APA （毫伏） | APD50 （毫秒） |
| 107.3 ± 32.6 | -71.2 ± 5.1 | 98.4 ± 4.7 | 141±12 |
表3：分离的斑马鱼心肌细胞的作用电位特性。以电流箝位模式记录。数据显示为平均值± S.D. Vm = 膜电位;APA = 动作电位幅度;APD50 = 作用电位持续时间至 50% 复极化;MDP = 最大舒张电位。
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Discussion
以前分离斑马鱼心室肌细胞的方法5，6旨在产生用于培养或电生理研究的肌细胞，提供的细胞产量较低，并且涉及多次离心的冗长步骤，对细胞质量和活力产生不利影响。这里描述的方案是可靠的，涵盖了每个重要的心血管组织（心室，心房和VSM），重要的是对于活细胞的急性分离非常实用。涉及通过 BA13 插管心室的隔离方法可能是室性心肌细胞的复杂替代方案，但需要更高的灵活性，并且可能对心房隔离产生负面影响。当前协议中详述的方法提供了一种简单有效的替代方案。
幼虫心脏组织分离的其他注意事项是：（1）在步骤1.4中，根据鱼的年龄和可用的放大倍数，甚至在切除胸肌之前就可以看到组织，在这种情况下，组织可以直接“拔出”鱼，而无需事先手术，然后可以使用超细镊子去除非CV组织;（2）在步骤2.2中，对于小于14天的幼虫，心脏可以直接用于电生理研究，而无需酶解离。
如上所述，通常适用于酶解离方法，并且每次都证明使用新鲜缓冲液和酶很重要。但是，灌注缓冲液（PB）和S1缓冲液可以提前制备并在4-8°C下储存1个月。
每条鱼成功的组织分离时间不应超过~90秒，并且组织不应暴露在空气中。当解离需要更长的时间时，细胞质量（即存活）会降低。研磨组织时，应注意避免产生气泡，这也降低了细胞质量。VSM细胞分离对S3缓冲液中胶原酶的消化很敏感。消化的前3分钟后，应每分钟将管子从恒温摇床中取出，并检查漂浮的扩张和半透明组织。一旦组织破碎明显，应停止消化步骤。
重要的是要注意，这些方案没有像收缩力研究那样广泛优化以分离耐钙心肌细胞。然而，如图所示，在存在生理细胞外钙浓度7，14的情况下，可以实现心肌细胞动作电位的可靠记录。在这些实验中，包括用于解耦激发和收缩以及提高千兆欧姆密封形成和记录效率的布比他汀，先前已被证明不会显着影响完整斑马鱼心脏中的AP参数14。对于电生理学，细胞的绝对产量也不是常规的限速。该协议尚未针对产量进行优化，这对于分离细胞的生化研究可能是必要的。尽管如此，使用这些方法获得的产量非常适合电生理研究以及可能的其他多种方法。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH向CGN授予HL140024和向CMC授予HL150277的支持。图 1 和图 2 是使用 BioRender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
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