Summary
O ensaio ACT1-CUP1, um ensaio de crescimento de cobre, fornece uma leitura rápida do splicing de RNA mensageiro precursor (pré-mRNA) e do impacto que os fatores de splicing mutantes têm na função spliceossomal. Este estudo fornece um protocolo e destaca a personalização possível para abordar a questão do splicing de interesse.
Abstract
Mutações introduzidas no spliceossomo ou em seu substrato contribuíram significativamente para a nossa compreensão dos meandros da função spliceossomal. Sejam relacionadas à doença ou funcionalmente selecionadas, muitas dessas mutações foram estudadas usando ensaios de crescimento no organismo modelo Saccharomyces cerevisiae (levedura). O ensaio de crescimento de cobre específico de splicing, ou ensaio ACT1-CUP1, fornece uma análise abrangente da mutação no nível fenotípico. O ensaio ACT1-CUP1 utiliza repórteres que conferem tolerância ao cobre quando emendados corretamente. Assim, na presença de cobre, as mudanças na viabilidade da levedura se correlacionam com mudanças na produção de mRNA através do splicing. Em um experimento típico, o spliceossomo de levedura é desafiado com diferentes repórteres de emenda não consensuais e a mutação do fator de emenda de interesse para detectar qualquer impacto sinérgico ou antitético no splicing. Aqui uma descrição completa da preparação da placa de cobre, chapeamento de células de levedura e avaliação de dados são dadas. Uma seleção de experimentos complementares é descrita, destacando a versatilidade dos repórteres ACT1-CUP1. O ensaio ACT1-CUP1 é uma ferramenta útil na caixa de ferramentas de splicing graças à leitura direta do(s) efeito(s) mutacional(is) e às possibilidades comparativas do uso contínuo no campo.
Introduction
O spliceossomo é uma grande máquina biológica que catalisa a remoção de íntrons, regiões não codificantes, no RNA mensageiro precursor (pré-mRNA)1,2. Caracterizar o efeito de um único mutante pontual em 1 das quase 100 proteínas e 5 RNAs não codificantes é muitas vezes ambíguo ao estudar a proteína ou RNA isoladamente. A mudança na função do componente mutado pode ser melhor avaliada in vivo no contexto do spliceossomo completo e funcional.
O ensaio de crescimento de cobre descrito aqui é um indicador rápido da eficiência de splicing em Saccharomyces cerevisiae ou levedura em brotamento. Desenvolvido por C.F. Lesser e C. Guthrie e publicado em 1993, este ensaio combina a facilidade de trabalhar com um organismo modelo simples e a leitura direta da viabilidade celular3. A viabilidade se correlaciona com o quão bem os spliceossomos nessas células podem reconhecer e emendar o transcrito do repórter.
Este ensaio de crescimento de cobre é mais comumente chamado de ensaio ACT1-CUP1. O nome ACT1-CUP1 origina-se dos dois genes fundidos para criar um repórter de eficiência de splicing. ACT1 é o gene da actina da levedura, que é altamente expresso e tem um íntron eficientemente emendado 4,5. Cup1p é um quelante de cobre que sequestra o cobre na célula para evitar interferências com as funções celulares regulares 6,7,8. O relator ACT1-CUP1 contém esses genes em sequência tal que CUP1 está no quadro de leitura adequado somente se ocorrer splicing pré-mRNA do íntron de ACT1 (Figura 1). A proteína de fusão resultante contém os primeiros 21 aminoácidos da actina e a proteína Cup1p de comprimento total, o que aumenta a viabilidade da levedura em um ambiente rico em cobre3. Assim, um aumento na quantidade de splicing do repórter resulta em uma maior concentração de Cup1p e uma maior resistência ao cobre (Figura 1). Em comparação com outros genes repórteres, o CUP1 afeta a viabilidade celular mesmo em níveis baixos, tem uma ampla faixa de sensibilidade e pode ser usado para selecionar diretamente mutaçõesde splicing 3,6,7. Além disso, a CUP1 não é essencial para o crescimento padrão de leveduras e, portanto, a homeostase celular não é afetada durante a configuração deste ensaio. Complementar aos ensaios de exclusão ou crescimento de temperatura, o ACT1-CUP1 fornece informações sobre os efeitos no splicing sob condições ideais de crescimento de leveduras.
O spliceossomo reconhece seu substrato através de três sequências intrônicas, a saber, o local de emenda de 5' (5' SS), o local de ramificação (BS) e o local de emenda de 3' (3' SS). Numerosos repórteres ACT1-CUP1 foram gerados contendo sequências não consensuais nesses locais. Uma seleção dos repórteres ACT1-CUP1 mais comuns é mostrada na Figura 1 e na Tabela 1. Como o spliceossomo interage com cada local de emenda exclusivamente em diferentes pontos do ciclo de emenda, a robustez do spliceossomo pode ser testada em diferentes etapas com base nas quais o repórter não consensual é usado. Repórteres não consensuais são nomeados para a posição mutada dentro do íntron e a base para a qual ele foi mutado. Por exemplo, A3c é um repórter com uma mutação no SS 5', especificamente a posição 3 da adenosina de consenso para uma citosina. Este repórter irá interagir fortemente com mutações de spliceossomas que afetam a seleção e o uso de SS de 5'. Em seu estudo inicial, Lesser e Guthrie determinaram quais mutações de 5' SS inibiram o splicing3. Mais tarde, no mesmo ano, repórteres não consensuais em todos os três locais de emenda foram publicados por Burgess e Guthrie em uma tela supressora de mutações na ATPase Prp16p9. Comparando o consenso com os repórteres não consensuais, o ensaio ACT1-CUP1 tem sido uma chave importante para a compreensão da robustez e seletividade do spliceossomo de levedura e para inferir a função dos spliceossomos de outros eucariotos.
À medida que os repórteres ACT1-CUP1 não consensuais sensibilizam o spliceossomo para uma perturbação adicional, o impacto de uma única mutação do fator de splicing pode ser caracterizado através dos repórteres que impacta positiva ou negativamente. Isso tem sido aplicado ao splicing de perguntas de pesquisa de várias maneiras. Primeiro, o ensaio ACT1-CUP1 pode e tem sido usado como uma triagem genética para mutações em fatores de splicing. Por exemplo, Prp8p, a maior proteína de splicing, serve como uma plataforma sobre a qual o núcleo de RNA do spliceossomo catalisa a reação de splicing. Isso foi deduzido, em parte, através de como os mutantes Prp8p melhoraram ou reduziram o splicing de diferentes repórteres ACT1-CUP1 10,11,12,13,14,15,16,17. Outros componentes proteicos do spliceossomo também foram investigados usando ACT1-CUP1, incluindo Hsh155p, Cwc2p, Cef1p e Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Os limiares energéticos para Prp16p e outras quatro ATPases envolvidas na transição spliceossômica também foram estudados com este ensaio 9,26,27,28,29,30. Os pequenos RNAs nucleares (snRNAs) também têm sido extensivamente estudados utilizando ACT1-CUP1 para identificar as sequências de pré-mRNA que coordenam e as mudanças na estrutura secundária que os snRNAs sofrem durante o splicing 3,31,32,33,34,35,36,37.
O ensaio ACT1-CUP1 requer uma cepa de levedura onde todas as cópias do gene CUP1 foram eliminadas. Como o CUP1 pode ter um número de cópia alto 6,38, a preparação de uma cepa completa de nocaute pode exigir várias rodadas ou triagem extensiva. Como resultado, as cepas de levedura cup1Δ têm sido frequentemente compartilhadas entre laboratórios, assim como os repórteres.
Se a(s) mutação(ões) em um fator de splicing estiver sendo avaliada a partir de uma cópia plasmídica, o gene do tipo selvagem para esse fator deve ser eliminado. Além disso, o fundo de levedura deve permitir a seleção de pelo menos dois plasmídeos, um contendo um repórter ACT1-CUP1, historicamente em um plasmídeo de seleção de nutrientes de leucina, e outro contendo uma mutação ou perturbação na maquinaria de splicing que será estudada (Figura 2). Normalmente, em um único ensaio, várias cepas de levedura, cada uma carregando a perturbação de emenda de consulta (QSP) e um repórter diferente, testarão o impacto da consulta no splicing.
As variáveis independentes no ensaio ACT1-CUP1 permitem ao pesquisador avaliar a gravidade de um QSP. Essas variáveis independentes são a concentração de cobre e a seleção de múltiplos repórteres de splicing não consensuais. Em primeiro lugar, uma vez que as estirpes de levedura são cultivadas em placas contendo uma gama de concentrações de cobre (Figura 2), a configuração do ensaio inclui a selecção do gradiente de concentrações utilizadas. Os estudos podem utilizar um gradiente de concentração de cobre de curso para obter uma leitura inicial da viabilidade e, em seguida, repetir o ensaio com um gradiente mais fino para identificar diferenças sutis de viabilidade. A segunda variável é a ampla gama de repórteres ACT1-CUP1 possíveis de testar (Figura 1 e Tabela 1). Se o QSP impacta a viabilidade da levedura de forma diferente na presença de um repórter não consensual versus do tipo selvagem, pode-se concluir que o QSP afeta uma etapa no splicing ou uma região do spliceossomo importante durante o reconhecimento ou processamento dessa região do intron.
A caixa de ferramentas de levedura é extensa e o ensaio ACT1-CUP1 é parte integrante da pesquisa de emenda. O ensaio ACT1-CUP1 é frequentemente realizado juntamente com uma análise genética, estrutural e/ou bioquímica mais aprofundada sobre o impacto de um QSP. Como esses estudos mais detalhados geralmente têm um procedimento mais demorado e / ou preço mais alto, uma abordagem frequente é a triagem de mutantes interessantes com ACT1-CUP1 primeiro.
Fornecido aqui é um protocolo de ensaio ACT1-CUP1, incluindo a preparação da placa de cobre. Este ensaio fornece aos pesquisadores uma resposta inicial para o efeito de um QSP no splicing e quais regiões intrônicas são mais afetadas pela perturbação.
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Protocol
1. Construção da cepa de levedura
- Gerar ou obter uma cepa de S. cerevisiae cujo fundo inclua leu2 e cup1Δ. Para gerar esse pano de fundo, use o método de levedura bem estabelecido que emprega acetato de lítio e DNA de fita simples39.
NOTA: As estirpes de levedura haploide podem conter uma, duas ou mais cópias de CUP1 6,38. Consulte as informações genômicas para a cepa de levedura selecionada ao projetar primers knock-out para flanquear a(s) localização(ões) do gene CUP1. - Realizar uma transformação de levedura para incorporar o QSP através da incorporação genômica ou em um plasmídeo. Utilizar um protocolo bem estabelecido, como os descritos em pesquisas anteriores40,41,42.
- Efectuar uma transformação de levedura com a(s) estirpe(ns) resultante(s) do passo 1.2. para adicionar o plasmídeo do relator ACT1-CUP1 desejado.
NOTA: As células devem ser mantidas em placas e meios de gota de leucina (-Leu) para garantir a retenção dos plasmídeos repórteres ACT1-CUP1 após essa transformação. - Execute as etapas 1.2. e 1.3. para cada QSP e cada plasmídeo reportador ACT1-CUP1 a ensaiar, incluindo estirpes de controlo.
2. Preparação da placa de cobre
- Selecione uma faixa de concentração de cobre que se adapte aos repórteres a serem testados (consulte a Tabela 1 para a letalidade dos repórteres usados com frequência).
NOTA: Um exemplo de uma faixa abrangente de concentração de cobre são 30 concentrações diferentes de cobre de 0 mM, 0,025 mM, 0,05 mM, 0,075 mM, 0,1 mM, 0,15 mM, 0,2 mM, 0,25 mM, 0,3 mM, 0,35 mM, 0,4 mM, 0,45 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM e 2,5 mM2+. - Faça uma solução-mãe de 1 M CuSO4 e filtro estéril através de um filtro estéril PES (polietersulfona) de 0,22 μm.
- Por placa de cobre desejada, prepare uma diluição de 2 mL do estoque de CuSO4 em água estéril.
NOTA: Como a placa com 0 mM 2+ será sempre analisada e fotografada como referência, recomenda-se fazer duas placas 0 mM2+, uma no início e outra no final da etapa de chapeamento (etapa 3.4.).- Calcular a quantidade de estoque para a concentração final desejada de cobre em 40 mL do volume da placa (Tabela Suplementar 1).
- Adicione a quantidade calculada de água estéril e 1 M CuSO4 a um tubo estéril de 2 mL.
- Despeje placas para o ensaio ACT1-CUP1.
NOTA: Uma alternativa ao protocolo abaixo é combinar inicialmente o meio e o ágar em um recipiente grande e alíquota após a autoclave em recipientes menores para atingir diferentes concentrações de cobre para cada placa. Qualquer que seja o método adotado, é importante garantir que a concentração do meio seja consistente entre todas as placas, apesar de cada uma ter uma concentração de cobre diferente.- Rotule cada placa vazia a ser derramada com a concentração final de cobre que ela conterá. Preparar pelo menos uma placa quadrada por concentração de cobre a ensaiar.
- Rotule um frasco de 100 mL por concentração de cobre a ser testado.
- A cada frasco, adicione 790 mg de ágar (2% p/v de ágar) e uma barra de agitação.
- Em um copo grande, combine o meio de crescimento -Leu para que todas as placas de cobre sejam derramadas. Por placa a ser feita, dissolver 265 mg de levedura à base de nitrogênio (YNB) e 64 mg de mistura drop-out menos leucina (e quaisquer outros nutrientes que possam ser necessários para manter o plasmídeo QSP nas células) em 34 mL de água deionizada.
- Adicione 34 mL da solução de meio de crescimento -Leu a cada frasco preparado de 100 mL e cubra com papel alumínio. Rotule a folha com a concentração de cobre pretendida.
- Autoclave para esterilizar e dissolver o ágar usando o ciclo líquido recomendado para a autoclave.
- O mais rapidamente possível, adicione 4 mL de glicose a 20% p/v (filtrada estéril) a cada frasco.
- Combine os rótulos e adicione as diluições de 2 ml de CuSO4 ao frasco pretendido.
NOTA: Como dezenas de placas de cobre podem ser feitas ao mesmo tempo, cada uma com uma concentração diferente, rotular todas as garrafas, tubos e placas claramente com a concentração de cobre pretendida evitará confusão durante o derramamento da placa. - Use uma placa de agitação para misturar por ~ 30 s e despeje ou pipete 35 mL na placa rotulada, evitando bolhas. Deixe esfriar antes de armazenar ou usar.
NOTA: Frequentemente, as placas são feitas com 1 dia ou 2 dias de antecedência do ensaio e armazenadas a 4 °C até algumas horas antes da utilização. As placas devem estar à temperatura ambiente (RT) antes do início do chapeamento (etapa 3.4.).
3. Ensaio ACT1-CUP1
- Retire as cepas desejadas nas placas -Leu.
NOTA: Se trabalhar a partir de existências criogênicas, deve-se tomar cuidado para garantir que as células sejam suficientemente revividas do armazenamento antes do revestimento. Um procedimento recomendado para isso é riscar do estoque criogênico e permitir que ele cresça por 3-5 dias a 30 °C. Em seguida, restreak uma pequena amostra e deixá-lo crescer por mais 2-3 dias a 30 ° C. - Cultivar culturas noturnas em 10 mL de meio.
- Preparar o meio de crescimento -Leu utilizando os mesmos rácios descritos no passo 2.4.2. Por 10 mL de meio, adicione 66 mg de levedura à base de nitrogênio (YNB) e 16 mg de mistura drop-out menos leucina a 9 mL de água deionizada. Passe por um filtro estéril PES de 0,22 μm.
- Por cepa de levedura, adicione 9 mL de meio de crescimento -Leu e 1 mL de glicose a 20% p/v (filtrada estéril) a um tubo cônico estéril de 50 mL.
- Usando uma vara estéril ou ponta de pipeta, reúna uma pequena amostra (~ 1 mm redonda) de levedura e inocular o meio.
- Agitar todas as culturas durante a noite a 180 rpm e 30 °C.
NOTA: Se disponível, os rotadores podem ser usados em vez de um agitador.
- Diluir as cepas para um OD600 0,5 ± 0,05 em glicerol a 10%.
- Por estirpe, adicionar 100 μL de cultura a uma cubeta contendo 900 μL de água.
- Meça o OD600 com um espectrofotômetro.
- Calcular a diluição necessária a uma DO600 de 0,5 num volume final de 2 ml.
- Diluir cada cepa para OD600 0,5 em 10% de glicerol (estéril).
- Remeça o OD600 para confirmar que a densidade da célula está dentro da faixa desejada de 0,5 ± 0,05.
- Chapear as tensões nas placas de cobre.
NOTA: Uma variedade de métodos pode ser usada para chapear as cepas, incluindo pipetagem manual de volumes de 5-10 μL, usando um pipetador repetido ou multicanal ou carimbando com um replicador de pinos. Este último método é descrito abaixo, embora a maioria das etapas seja semelhante, independentemente do método.- Configure um local de trabalho estéril e um queimador Bunsen iluminado.
- Para um replicador de 48 pinos, pipete 200 μL de cada cepa diluída em um poço separado de uma placa de 96 poços. Preencha os espaços vazios na grade 6 x 8 com 200 μL de glicerol a 10% (estéril).
NOTA: Um exemplo de um esquema de chapeamento para nove cepas de levedura está na Tabela Suplementar 2. - Mergulhe o replicador em um prato raso de 95% (v/v) de etanol e chamas para esterilizar. Deixe esfriar por pelo menos 2 minutos após a chama se extinguir para evitar o choque térmico das células.
- Coloque quatro placas perto do queimador e retire as tampas.
- Mergulhe o replicador na placa de 96 poços e levante-o em um movimento rápido.
- Coloque suavemente sobre o prato e agite levemente para frente e para trás para facilitar uma boa transferência.
- Levante em um movimento rápido e coloque exatamente na mesma orientação na placa de 96 poços.
- Repita para até três outras placas. Repita o processo de mergulhar o replicador em etanol, inflamando para esterilizar e esperando para resfriar a cada quatro placas.
- Depois que uma placa tiver sido chapeada, mova-se com um movimento suave para o lado, mas ainda dentro do guarda-chuva de esterilização da chama.
NOTA: Recomenda-se fazer as diluições de levedura e chapeamento perto de uma chama. As placas podem facilmente ficar contaminadas durante a secagem. - Deixe as placas secarem completamente antes de colocar as tampas, geralmente 3-5 min.
- Incubar as placas durante 3 dias a 30 °C.
4. Coleta e análise dos dados
- Remova as placas da incubadora e inspecione-as visualmente.
- Grave as imagens das placas com uma câmera disponível ou outro sistema de imagem digital.
- Registre (ou pontuação) para cada cepa a última concentração de cobre visível é observada.
NOTA: As células são capazes de emendar e permanecer viáveis até essa concentração. Para maior consistência, use sempre o mesmo método, seja a olho ou a partir das imagens da placa, para pontuar a última concentração viável de cobre. Colônias muito pequenas às vezes são visíveis pelo olho, mas não na imagem. A diferença entre inspeção visual direta ou gravação de imagens é pequena, geralmente um passo no gradiente. Como as imagens das colônias são frequentemente usadas em publicações, recomenda-se a pontuação pelas imagens. - Combine dados de vários ensaios ACT1-CUP1 para a mesma cepa para tirar conclusões sobre como o QSP afeta o splicing.
NOTA: Os números de publicação costumam mostrar imagens das colônias de leveduras na concentração de 0 mM2+ , a última concentração viável de cobre e a concentração subsequente onde a colônia morreu. Os dados também podem ser exibidos como um gráfico de barras com barras de erro para o desvio padrão entre as replicações. Os dados não precisam ser normalizados, mas podem ser definidos pela viabilidade do controle do fator de splicing WT como 1 e comparando o efeito da(s) mutação(ões) introduzida(s).
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Representative Results
Ensaios de crescimento, como ACT1-CUP1, requerem a avaliação visual e comparativa de múltiplas colônias. Aqui, cada cepa foi cultivada até a saturação durante a noite, diluída para uma OD600 de 0,5 e banhada em 20 placas contendo uma faixa de concentrações de cobre de 0 mM a 1,1 mM CuSO4 (Figura 3). Esse intervalo é menor do que o listado no protocolo, pois permitiu a avaliação completa do impacto dos QSPs e dos repórteres ACT1-CUP1 usados e descritos abaixo. As placas foram visualizadas e pontuadas (Figura 3 e Tabela Suplementar 3).
Para este experimento representativo, o fundo da levedura inclui um gene ADE2 interrompido, resultando em colônias variando tons de vermelho (Figura 3A,B). Esta ruptura comum de levedura na via de produção de adenosina causa um acúmulo de um precursor pigmentado vermelho para a adenosina. Assim, a cor vermelha é um indicador da maturidade da colônia de levedura (ou seja, a quantidade e a idade das células presentes). Para os fins de um ensaio ACT1-CUP1, a cor vermelha pode servir como um indicador de contaminação de espécies fúngicas se de cor branca ou amarela. A cor pode ser uma confirmação secundária da tolerância ao cobre, pois as colônias mais viáveis serão um tom vermelho mais profundo.
Ao revestir com um replicador de pinos, existem várias aberrações comuns. Primeiro, é possível criar colônias de forma oval se o replicador for levantado enquanto se move para a esquerda ou para a direita (Figura 3B, seta laranja). Além disso, as microcolônias também podem se formar a partir de pequenas gotículas de solução celular se o replicador de pinos for trazido em um ângulo ou se agitado acima da placa (Figura 3B, seta vermelha). Muitas vezes inócuas, ocasionalmente, as microcolônias podem se misturar com uma colônia carimbada, e isso impede a interpretação dessa colônia. Problemas adicionais de revestimento incluem tempo de espera insuficiente após a esterilização para que os pinos do replicador esfriem e contato insuficiente entre a placa e os pinos, de modo que ocorra uma transferência deficiente do meio de cultura. Em ambos os casos, poucas, se houver, células crescerão na placa, inclusive para as cepas de controle contendo o repórter do tipo selvagem. Como em qualquer ensaio de crescimento, independentemente do método de chapeamento, é importante realizar o ACT1-CUP1 em triplicado para confirmar que os resultados são consistentes e repetíveis. Idealmente, essas diferentes replicações devem ser realizadas em placas de cobre preparadas em momentos diferentes para garantir a reprodutibilidade.
Para esses experimentos representativos, o repórter A3c foi selecionado para destacar o impacto de uma sequência não consensual na tolerância ao cobre na ausência de perturbações adicionais do spliceossomo. A A3c reduz significativamente a quantidade de mRNA CUP1 produzido, pois perturba a capacidade do spliceossomo de reconhecer e utilizar o 5' SS15. A levedura com o repórter A3c sobreviveu a 0,15 mM2+, enquanto as células repórteres do tipo selvagem mantiveram a viabilidade até o final da faixa de concentrações de cobre testadas (Figura 3C). O repórter do tipo selvagem contendo células cresce para 2,5 mM2+ sem impacto na viabilidade (dados não mostrados).
O snRNA U6 é um componente catalítico essencial do spliceossomo. Vários estudos têm utilizado o ACT1-CUP1 para estudar o efeito que as mutações podem ter sobre esse RNA 16,32,34. Duplicadas para este estudo, foram estudadas três sequências de snRNA U6, a saber, a sequência do tipo selvagem (WT), a posição 57 substituída de uma uridina por uma citosina (U57c) e a posição 57 substituída de uma uridina por uma adenosina (U57a) (Figura 3 e Figura 4). Combinado com os repórteres ACT1-CUP1 que impactam as etapas catalíticas no splicing, determinou-se que o U57c favorece o primeiro passo catalítico e o U57a favorece a progressão para o segundo passo 16,32.
Para configurar o ensaio ACT1-CUP1, uma cepa foi criada com a cópia genômica do snRNA U6 excluída e as sequências selvagens ou mutadas do tipo snRNA U6 incluídas nos plasmídeos. Como o snRNA U6 é um componente essencial da célula, três transformações separadas foram usadas para primeiro nocautear o snRNA genômico U6, mantendo a viabilidade celular, posteriormente introduzir snRNAs U6 mutantes em plasmídeos e, finalmente, adicionar os repórteres ACT1-CUP1. Para a primeira transformação, uma cepa de levedura cup1Δ foi usada no knock-out da cópia genômica do snRNA U6 enquanto simultaneamente adicionava WT U6 snRNA em um plasmídeo marcador de seleção URA para manter a viabilidade. Uma transformação subsequente adicionou snRNA U6 do tipo selvagem ou mutado em um plasmídeo marcador de seleção TRP, selecionando contra o marcador URA via seleção 5-FOA. Assim, três cepas de levedura cup1Δ foram geradas, cada uma com uma das sequências de snRNA U6, a saber, WT, U57a e U57c. Uma transformação final de levedura para cada cepa adicionou um dos três plasmídeos repórteres ACT1-CUP1 diferentes a serem usados neste experimento. Os repórteres selecionados foram o repórter do tipo selvagem, A3c, e uma mutação da adenosina em guanina (BS-G). Um total de nove cepas foram geradas para este experimento, cada uma contendo uma sequência de snRNA U6 e um repórter ACT1-CUP1 (Tabela Suplementar 4 e Tabela Suplementar 5).
Os resultados mostraram que as diferentes bases na posição U6 snRNA 57 têm impactos únicos sobre o spliceossomo em combinação com uma mutação SS ou BS de 5' (Figura 4). Tanto os repórteres A3c quanto o BS-G inibem principalmente o splicing estabilizando a conformação do primeiro passo catalítico14,15. Assim, U57c é uma mutação aditiva que diminui a tolerância ao cobre em combinação com qualquer um desses repórteres (Figura 4B). Em contraste, o U57a aumenta a tolerância ao cobre, pois promove a progressão para a segunda etapa (Figura 4B)16,32. A diminuição da tolerância ao cobre da cepa BS-G com U57a em comparação com U6 snRNA WT destaca um provável impacto secundário do BS-G na segunda etapa do splicing16.
Esses resultados também destacam a natureza qualitativa deste ensaio e por que as sequências de consulta e de repórter do tipo selvagem devem ser testadas. Embora o padrão geral de aumento ou diminuição da tolerância ao cobre seja verdadeiro para essas mutações do snRNA U6 em comparação com o snRNA U6 do tipo selvagem, a concentração exata de cobre à qual as células sobrevivem pode diferir entre os estudos (Tabela 1) e diferiu entre esses dados representativos e outros resultados publicados. Isso provavelmente se deve ao fundo da cepa que contém a deleção CUP1 , mas também pode ser devido à saúde geral das cepas antes do revestimento (ou seja, quanto tempo após a geração da cepa ou restreak do crio o ensaio foi realizado), diferenças na forma como as placas são preparadas e variabilidade entre diferentes incubadoras. Variância semelhante foi observada em Mayerle et al. para mutações de consulta Prp8 na literatura43. Assim, a comparação de tendências de tolerância ao cobre pode ser realizada para diferentes ensaios de ACT1-CUP1, mas a comparação numérica das concentrações de cobre deve ser feita apenas dentro do mesmo laboratório e, às vezes, com o mesmo conjunto de placas de cobre.
Figura 1: O design do relator ACT1-CUP1. A concentração de repórter emendado correlaciona-se diretamente com a tolerância de cobre de levedura. O diagrama do repórter inclui os três sites de emenda do site de emenda de 5' (5' SS), do site de filial (BS) e do site de emenda de 3' (3' SS). As sequências de consenso de levedura para esses locais são mostradas, com aquelas direcionadas para clivagem indicadas em negrito e numeradas com base em sua localização no intron. As sequências de repórteres ACT1-CUP1 não consensuais comumente usadas são mostradas em minúsculas abaixo de seus locais de sequência de consenso correspondentes e estão listadas na Tabela 1. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxo de trabalho do ensaio ACT1-CUP1. Para este ensaio, uma cepa de levedura deve ser cup1Δ leu2 e conter o plasmídeo repórter ACT1-CUP1 desejado e o gene QSP, marcado Gene na figura. O gene QSP deve ser genomicamente inserido ou em um plasmídeo. O protocolo usando um replicador de pinos envolve quatro etapas para preparar as células de levedura. O passo 1 é fazer com que as células cheguem à saturação. O passo 2 é medir o OD 600 da cultura e diluir para um OD600 de 0,5. O passo 3 é distribuir sobre uma placa de 96 poços. O passo 4 é chapar em placas contendo concentrações crescentes de cobre (indicado com aumento da cor azul). A etapa 1, a etapa 2 e a etapa 4 seriam idênticas para a pipetagem manual. Uma vez chapeadas, as placas são incubadas por 3 dias a 30 °C e, em seguida, pontuadas quanto à viabilidade. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exibições representativas dos dados ACT1-CUP1. Para este experimento, os spliceossomos de levedura são desafiados com duas mutações diferentes de snRNA U6 e testados na presença de três repórteres não consensuais. Três réplicas deste ensaio são apresentadas nas mesmas placas para fins de demonstração. Recomenda-se que este ensaio faça repetições em placas separadas e em dias separados. (A) Um ensaio completo com um gradiente de cobre de 0 mM a 1,1 mM em 20 placas é mostrado. À medida que a concentração de cobre aumenta, as cepas com menor splicing mostram menor confluência até o ponto em que a concentração de cobre se torna letal. O fundo da levedura era ade2 e, portanto, as colônias maduras são de cor vermelha. (B) Comparação das mesmas placas a 0 mM e 0,1 mM CuSO4 fotografadas com uma câmera portátil versus um sistema de imagem digital. Este é um exemplo de como vários repórteres não consensuais podem ser comparados lado a lado e com o repórter do tipo selvagem. Observações comuns em placas incluem uma gota espúria de meios de cultura que caíram do replicador de pinos (seta vermelha) e um ligeiro obusto das colônias devido ao deslizamento do pino ao longo da superfície da placa ou movimento da placa antes que a gota de cultura tenha secado suficientemente (seta laranja). (C) Exemplo do efeito do repórter A3c na viabilidade celular em comparação com o repórter do tipo selvagem. Imagens como as mostradas em (B) são cortadas e alinhadas para destacar as diferenças de crescimento em diferentes concentrações de cobre. A tolerância ao cobre da cepa do repórter A3c diminui para 0,15 mM2+ em comparação com a viabilidade da cepa repórter do tipo selvagem até o final da faixa testada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados representativos do ACT1-CUP1 monitorando o splicing em leveduras com mutações nos componentes do splicing . (A) Esquema dos componentes de RNA do sítio ativo imediatamente após a primeira etapa catalítica. Os snRNAs U2 e U6 são duplexados, trazendo os 5' SS e BS do íntron em estreita proximidade. A ligação intrônica entre A259 (BS) e G1 (5' SS) é indicada pelo ponto laranja. Os locais das substituições de sequência não consensual no relator ACT1-CUP1 testado neste experimento são indicados em negrito preto. A posição mutada em U6 snRNA (U57) está em verde negrito, e as bases substituídas estão em azul ou rosa. (B) Uma possibilidade para a apresentação de dados de ACT1-CUP1 em uma publicação inclui várias imagens de colônias de concentrações relevantes de2 +. O repórter do WT sobreviveu além da concentração de cobre testada para todas as três cepas de snRNA U6 consultadas. (C) Um gráfico de barras comparando os efeitos por repórter e por mutante U6 snRNA. A normalização é realizada para cada repórter ACT1-CUP1 definindo a tolerância ao cobre do WT de snRNA U6 para 1 e calculando a razão para as mutações U57c e U57a. As barras de erro representam o desvio padrão de três replicações. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Métodos adicionais para complementar os resultados do ACT1-CUP1. (A) A extensão do primer é realizada através de um recozimento do primer no éxon ACT1 de 3' e, em seguida, alongando-se no intron. Neste exemplo, o primer é marcado com corante IR700, e a extensão do primer foi realizada conforme descrito em 20,21. A extensão do primer do snRNA U6 é realizada na mesma reação para servir como controle de carga. O gel desnaturante de bis/acrilamida 19:1 a 7% resolve os produtos pré-RNAm, mRNA e lariat após a extensão do primer usando um dispositivo de imagem de gel quase infravermelho, conforme descrito em van der Feltz et al.22. A intensidade das diferentes bandas pode ser usada para medir a eficiência geral do splicing, bem como distinguir as diferenças de splicing que ocorrem na primeira ou segunda etapa, conforme quantificado com o ImageJ44 ou outro software de quantificação de banda de gel. Tanto a eficiência de splicing quanto a eficiência da etapa de splicing são calculadas conforme descrito em Query e Konarska14. (B) Telas mutacionais com repórteres ACT1-CUP1 podem utilizar a seleção de cobre para identificar mutantes que afetam o splicing. O(s) gene(s) de interesse pode(m) então ser sequenciado(s) nas cepas resultantes para determinar se a mutação ocorreu nesse gene. (C) Alterações podem ser feitas no repórter fora dos locais de emenda para monitorar as mudanças de emenda em relação à estrutura do íntron, sequências exônicas, número de éxons ou exportação nuclear de RNA não emendado. As regiões em cinza são regiões de expansão opcionais a serem incluídas em um repórter, e as áreas em vermelho são regiões nas quais a sequência e as mudanças estruturais podem ser testadas quanto ao seu impacto potencial no splicing usando o ensaio ACT1-CUP1. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome do repórter | Região intronic | Seqüenciar | Última concentração viável de2+ (mM) | |
| WT | 5' | GUAUGU | > 2.5 | |
| G1a | 5ʹ | um UAUGU | 0,0133 ou 0,0532 | |
| A3c | 5ʹ | GUcUGU | 0,15^,18 ou 0,216 | |
| G5a | 5ʹ | GUAUaU | 0,303 ou 0,259 | |
| WT | Site de filial | UACUAAC | > 2.5 | |
| C256a | Site de filial | UAaUAAC | 0,1526 ou 0,1832 | |
| U257c/a | Site de filial | UACc/aAAC | 0,226 ou 0,332 ou 0,545 | 0,059,32 |
| A258c/u | Site de filial | UACUc/uAC | 0,826 | 1,045 ou 1,646 |
| BS-C | Site de filial | UACUAcC | 0,153 ou 0,1832,56 ou 0,2 26 | |
| BS-G | Site de filial | UACUAgC | 0,0516,32 ou 0,625 ou 0,846 | |
| C260g | Site de filial | UACUAAg | 0,826 | |
| WT | 3' | UAG | > 2.5 | |
| U301g | 3ʹ | g AG | 0,1518 | |
| A302g/u | 3' | Ug/uG | 0,0139 | 0,07516 ou 0,1824 |
| G303c | 3ʹ | UAc | 0,0532 | |
Tabela 1: Lista de repórteres comuns e a letalidade de concentração de2+ relatada. Existem mais de 100 citações de Lesser e Guthrie3. Embora uma pequena seleção dessas citações tenha sido usada para criar esta tabela, elas destacam a tendência geral de diferenças leves a moderadas entre os estudos nas concentrações de viabilidade de cobre relatadas. No ACT1-CUP1, é importante comparar a proteína do tipo selvagem ou RNA com os mutantes, todos com o mesmo fundo de cepa de levedura, usando as concentrações publicadas como guia, mas antecipando que as concentrações observadas podem diferir. Dados coletados da Figura 3 (^) e de múltiplas publicações anotadas pelas seguintes citações 3,9,16,18,24,25,26,32,45,46.
Tabela suplementar 1: Conteúdo de uma única placa de cobre e um exemplo de cálculos feitos para alcançar diluições de cobre de 0 mM a 2,5 mM de um estoque de CuSO4 de 1 M. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela Suplementar 2: Exemplo de um esquema de chapeamento para o replicador de 48 pinos. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela Suplementar 3: Exemplo de viabilidade pontuada a partir de placas de cobre incubadas por 3 dias a 30°C. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela Suplementar 4: Lista de cepas de leveduras usadas para gerar os dados representativos. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela Suplementar 5: Lista de plasmídeos utilizados para gerar os dados representativos. Plasmídeos de snRNA U6 gerados e publicados em pesquisas anteriores22,47. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
ACT1-CUP1 é um ensaio de crescimento, e deve-se tomar cuidado para garantir que as diferenças de crescimento observadas só possam ser atribuídas a defeitos de splicing. Todas as cepas devem ser manuseadas de forma semelhante antes do revestimento, incluindo um comprimento e tipo semelhantes de condições de crescimento e armazenamento. Se utilizarem estirpes sensíveis à temperatura, os ensaios ACT1-CUP1 só devem ser realizados em condições em que essas estirpes cresçam de forma comparável à do tipo selvagem. Da mesma forma, para o componente QSP, recomenda-se ter fundos de levedura idênticos e níveis de expressão do(s) gene(s) QSP, de modo a não obscurecer a interpretação dos resultados. Ao considerar o número de QSPs e repórteres a serem usados, não é aconselhável testar mais de 30 cepas de cada vez com o método do replicador de pinos. Com o tempo adicional para executar cada etapa, as células se acomodarão e os resultados do ensaio serão inconsistentes devido à diminuição da viabilidade celular.
Além das limitações que o ACT1-CUP1 inerentemente tem como ensaio de crescimento, um QSP pode ter um impacto mais complexo no splicing do que pode ser resolvido com esse método. Como o splicing é um processo de várias etapas e os fatores são reciclados, o fenótipo observado pode resultar na perturbação que afeta mais de uma etapa do splicing. Isso vale mesmo para as análises subsequentes que podem acompanhar o ACT1-CUP1, algumas das quais são descritas abaixo. Os dados destacarão a etapa mais perturbada do processo, mesmo que outras etapas possam ser afetadas pela função alterada do fator de splicing.
A extensão da cartilha dos repórteres ACT1-CUP1 foi utilizada pela primeira vez no artigo original de Lesser e Guthrie e é frequentemente realizada se os resultados do ACT1-CUP1 mostrarem um defeito de crescimento3. Este ensaio tem como alvo o relator e usa o comprimento dos produtos de PCR para determinar as quantidades relativas de repórter não emendado, parcialmente emendado e totalmente emendado presente (Figura 5A). A eficiência geral do splicing e se o defeito afeta mais fortemente a primeira ou a segunda etapa catalítica são calculadas tomando proporções das quantidades do produto de PCR14. Por exemplo, o repórter SS de 5' G5a reduziu o splicing em comparação com o repórter do tipo selvagem, mas suas eficiências de primeira e segunda etapa seguem um padrão semelhante ao do tipo selvagem (Figura 5A). Isso aponta para um defeito anterior à primeira etapa catalítica, possivelmente na montagem do spliceossomo, pois ambas as etapas são afetadas de forma semelhante31.
Novos ensaios foram desenvolvidos a partir do ensaio canônico ACT1-CUP1, como a triagem de mutantes que melhoram o splicing na presença de outros mutantes do fator de splicing e/ou sequências de splicing não consensuais (Figura 5B). Por exemplo, a exposição de leveduras contendo o repórter ACT1-CUP1 a UV e, em seguida, a seleção na presença de cobre produziram mutantes Prp8 e Hsh155 que melhoraram o splicing de sequências não consensuais14,19.
Expandindo além do estudo do efeito dos locais de emenda e dos fatores constitutivos de splicing, a dependência de crescimento da CUP1 tem sido usada para estudar o splicing de múltiplos íntrons, o controle da exportação nuclear e o impacto da UTR e de outras sequências periféricas no splicing (Figura 5C). Alguns desses estudos criaram repórteres com CUP1 e outros genes de levedura contendo ítron que podem ter padrões de splicing mais complexos para estudar o efeito na estrutura secundária intrônica e no splicing de transcrição multi-íntron 48,49,50,51,52. A ligação entre splicing e exportação nuclear foi estudada por meio de transcritos emendados ou não emendados codificando CUP1 no quadro53,54. O comprimento da pista de pirimidina e a dependência da distância da seleção do local de emenda devido a fatores específicos também foram testados 20,55,56,57. Esses exemplos e muitos outros destacam a versatilidade do ACT1-CUP1 e de outros ensaios de crescimento CUP1.
O ensaio ACT1-CUP1 vincula as perturbações a um ciclo de reação complexo com um fenótipo de crescimento simples com uma ampla faixa de sensibilidade. Este ensaio legado tem sido usado por vários laboratórios para estabelecer as bases da compreensão do ciclo de emenda. Mais recentemente, o ACT1-CUP1 tem sido utilizado para responder a questões que surgem da riqueza de dados estruturais agora disponíveis21,22,25. Estudos estruturais de spliceossomos ligados a sequências não consensuais poderiam ser pareados com os resultados do ACT1-CUP1 para interpretar como a estrutura alterada e a função alterada se correlacionam. ACT1-CUP1 é uma primeira tela ideal para mutações de splicing que podem complementar análises mais complexas.
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Disclosures
O autor não tem nada a revelar.
Acknowledgments
Obrigado a Aaron Hoskins e aos membros do laboratório Hoskins da Universidade de Wisconsin-Madison pelo uso de cepas de levedura e equipamentos na geração das figuras 3-5. Obrigado a Harpreet Kaur e Xingyang Fu por seus comentários perspicazes sobre o manuscrito. Obrigado aos alunos, funcionários e professores de apoio da Northwest University durante a escrita, edição e filmagem deste artigo. Obrigado a Isabelle Marasigan pela ajuda nas filmagens deste método.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 2 mL sterile microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-138 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 07-201-332 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 96-well round bottom microplate | Fisher Scientific | 07-200-760 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 190 proof ethanol | Fisher Scientific | 22-032-600 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 500 mL Filter System (0.22 µm) | CellTreat Scientific Products | 229707 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | Any molecular grade agar will work. |
| Autoclave | Tuttnauer | 3870EA | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Bunsen burner | Humboldt | PN6200.1 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Cell Density Meter | VWR | 490005-906 | Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm. |
| Copper sulfate Pentahydrate | Fisher Scientific | LC134051 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Digital imaging system | Cytiva | 29399481 | ImageQuant 4000 (used for Figure 3), Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer. |
| Dropout mix (-Leu) | USBiological Life Sciences | D9525 | Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu |
| D-Glucose | Fisher Scientific | AAA1682836 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Gel band quantifying software | Cytiva | 29-0006-05 | ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer. |
| Hand held camera | Nikon | D3500 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Near infra-red gel imaging device | Cytiva | 29238583 | Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer. |
| Laboratory grade clamp | Fisher Scientific | 05-769-7Q | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Laboratory grade stand and clamp | Fisher Scientific | 12-000-101 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-51 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Pin replicator | VP Scientific | VP 407AH | |
| Semi-micro disposable cuvettes | VWR | 97000-590 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Shaker | JEIO Tech | IST-3075 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Spectrophotometer | Biowave | 80-3000-45 | Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm. |
| Square plates | VWR | 102091-156 | Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator. |
| Stir plate | Fisher Scientific | 11-520-16S | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Yeast nitrogen base | USBiological Life Sciences | Y2025 | Or comparable item from a different manufacturer. |
References
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