Summary
구리 성장 분석인 ACT1-CUP1 분석은 전구체 메신저 RNA(pre-mRNA) 스플라이싱과 돌연변이 스플라이싱 인자가 스플라이세오솜 기능에 미치는 영향에 대한 빠른 판독을 제공합니다. 이 연구는 프로토콜을 제공하고 관심 있는 접합 문제를 해결하기 위해 가능한 사용자 정의를 강조합니다.
Abstract
스플라이세오솜 또는 그 기질에 도입된 돌연변이는 스플라이세오솜 기능의 복잡성에 대한 우리의 이해에 크게 기여했습니다. 질병과 관련이 있든 기능적으로 선택되었든, 이러한 돌연변이의 대부분은 모델 유기체 사카로마이세스 세레비시아에 (효모)에서 성장 분석을 사용하여 연구되었습니다. 접합 특이적 구리 성장 분석법 또는 ACT1-CUP1 분석은 표현형 수준에서 돌연변이에 대한 포괄적인 분석을 제공합니다. ACT1-CUP1 분석은 올바르게 접합될 때 구리 내성을 부여하는 리포터를 활용합니다. 따라서, 구리의 존재하에서, 효모 생존율의 변화는 스 플라이 싱을 통한 mRNA 생산의 변화와 관련이있다. 전형적인 실험에서, 효모 스플라이세오솜은 스플라이싱에 대한 상승적 또는 반대적 영향을 검출하기 위해 상이한 비합의 스플라이싱 리포터 및 관심 있는 스플라이싱 인자 돌연변이에 도전한다. 여기에서는 동판 준비, 효모 세포 도금 및 데이터 평가에 대한 전체 설명이 제공됩니다. ACT1-CUP1 리포터의 다양성을 강조하는 다양한 무료 실험이 설명됩니다. ACT1-CUP1 분석은 돌연변이 효과의 직접적인 판독과 현장에서의 지속적인 사용으로 인한 비교 가능성 덕분에 접합 도구 상자에서 편리한 도구입니다.
Introduction
스플라이세오솜은 전구체 메신저 RNA(pre-mRNA)1,2에서 비코딩 영역인 인트론의 제거를 촉매하는 대형 생물학적 기계입니다. 거의 100 개의 단백질 중 1 개와 5 개의 비 코딩 RNA에서 단일 점 돌연변이의 효과를 특성화하는 것은 단백질 또는 RNA를 분리 할 때 종종 모호합니다. 돌연변이된 구성 요소의 기능 변화는 완전히 기능하는 스플라이세오솜의 맥락에서 생체 내에서 가장 잘 평가될 수 있습니다.
여기에 설명된 구리 성장 분석은 사카로마이세스 세레비시아에 또는 신진 효모의 접합 효율에 대한 빠른 척도입니다. C.F. Lesser와 C. Guthrie가 개발하고 1993년에 발표한 이 분석은 간단한 모델 유기체로 작업하는 용이성과 세포생존율의 간단한 판독을 결합합니다3. 생존력은 이들 세포의 스플라이세오좀이 리포터 전사체를 얼마나 잘 인식하고 접합할 수 있는지와 상관관계가 있다.
이 구리 성장 분석은 더 일반적으로 ACT1-CUP1 분석이라고 합니다. ACT1-CUP1이라는 이름은 접합 효율의 리포터를 만들기 위해 융합된 두 유전자에서 유래했습니다. ACT1은 효모의 액틴 유전자로 발현이 높고 효율적으로 접합된 인트론 4,5를 가지고 있습니다. Cup1p는 규칙적인 세포 기능 6,7,8에 대한 간섭을 방지하기 위해 세포에서 구리를 격리하는 구리 킬레이터입니다. ACT1-CUP1 리포터는 ACT1 인트론의 pre-mRNA 스플라이싱이 발생하는 경우에만 CUP1이 적절한 판독 프레임에 있도록 이러한 유전자를 순서대로 포함합니다(그림 1). 생성 된 융합 단백질은 액틴의 처음 21 개 아미노산과 구리가 풍부한 환경에서 효모 생존력을 증가시키는 전장 Cup1p 단백질을 함유한다3. 따라서 리포터의 접합량이 증가하면 Cup1p 농도가 높아지고 구리 저항이 높아집니다(그림 1). 다른 리포터 유전자와 비교하여 CUP1은 낮은 수준에서도 세포 생존율에 영향을 미치고 민감도 범위가 넓으며 스플라이싱 돌연변이 3,6,7을 직접 선택하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 CUP1은 표준 효모 성장에 필수적이지 않으므로 이 분석을 설정하는 동안 세포 항상성이 영향을 받지 않습니다. 결실 또는 온도 성장 분석을 보완하는 ACT1-CUP1은 최적의 효모 성장 조건에서 접합에 미치는 영향에 대한 정보를 제공합니다.
스플라이세오솜은 3개의 인트론 서열, 즉 5' 스플라이스 부위(5' SS), 분기 부위(BS) 및 3' 스플라이스 부위(3' SS)를 통해 기판을 인식합니다. 이러한 사이트에서 합의되지 않은 시퀀스를 포함하는 수많은 ACT1-CUP1 리포터가 생성되었습니다. 가장 일반적인 ACT1-CUP1 리포터의 선택은 그림 1 및 표 1에 나와 있습니다. 스플라이세오솜이 스플라이싱 주기의 다른 지점에서 각 스플라이스 부위와 고유하게 상호 작용하기 때문에 스플라이세오솜의 견고성은 비합의 리포터가 사용되는 단계에 따라 다른 단계에서 테스트할 수 있습니다. 합의되지 않은 기자는 인트론 내의 돌연변이된 위치와 그것이 돌연변이된 베이스에 따라 명명됩니다. 예를 들어, A3c는 5' SS, 구체적으로 컨센서스 아데노신에서 시토신으로의 위치 3에 돌연변이를 갖는 리포터이다. 이 리포터는 5' SS 선택 및 사용에 영향을 미치는 스플라이세오솜 돌연변이와 강하게 상호작용할 것이다. 초기 연구에서 Lesser와 Guthrie는 어떤 5' SS 돌연변이가 접합3을 억제하는지 결정했습니다. 같은 해 말, 세 개의 스플 라이스 사이트 모두에서 합의되지 않은 기자들이 ATPase Prp16p9의 돌연변이 억제 스크린에서 Burgess와 Guthrie에 의해 출판되었습니다. 합의를 비합의 보고자와 비교하는 ACT1-CUP1 분석은 효모 스플라이세오솜의 견고성과 선택성을 이해하고 다른 진핵생물의 스플라이세오솜의 기능을 추론하는 데 중요한 열쇠였습니다.
합의되지 않은 ACT1-CUP1 리포터가 스플라이세오솜을 추가 섭동에 민감하게 반응함에 따라 단일 스플라이싱 인자 돌연변이의 영향은 리포터를 통해 긍정적이거나 부정적인 영향을 미치는 것으로 특성화할 수 있습니다. 이것은 다양한 방식으로 연구 질문을 접합하는 데 적용되었습니다. 첫째, ACT1-CUP1 분석은 스플라이싱 인자의 돌연변이에 대한 유전자 스크리닝으로 사용될 수 있고 사용되어 왔다. 예를 들어, 가장 큰 스플라이싱 단백질인 Prp8p는 스플라이세오솜의 RNA 코어가 스플라이싱 반응을 촉매하는 플랫폼 역할을 합니다. 이는 부분적으로 Prp8p 돌연변이체가 상이한 ACT1-CUP1 리포터 10,11,12,13,14,15,16,17의 스플라이싱을 개선하거나 감소시키는 방법을 통해 추론되었다. 스플라이세오솜의 다른 단백질 성분은 또한 Hsh155p, Cwc2p, Cef1p 및 Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25를 포함하는 ACT1-CUP1을 사용하여 조사되었다. Prp16p 및 스플라이세오솜 전이와 관련된 4개의 다른 ATPase에 대한 에너지 역치도 이 분석 9,26,27,28,29,30으로 연구되었습니다. 소형 핵 RNA (snRNA)는 또한 ACT1-CUP1을 사용하여 광범위하게 연구되어 이들이 조정하는 pre-mRNA 서열과 snRNA가 3,31,32,33,34,35,36,37을 접합하는 동안 겪는 2 차 구조의 변화를 식별합니다.
ACT1-CUP1 분석에는 CUP1 유전자의 모든 사본이 녹아웃된 효모 균주가 필요합니다. CUP1은 높은 카피 번호 6,38을 가질 수 있으므로 전체 녹아웃 변형을 준비하려면 여러 라운드 또는 광범위한 스크리닝이 필요할 수 있습니다. 결과적으로 cup1Δ 효모 균주는 종종 기자와 마찬가지로 실험실 간에 공유되었습니다.
스플라이싱 인자의 돌연변이가 플라스미드 사본에서 평가되는 경우 이 인자에 대한 야생형 유전자를 녹아웃해야 합니다. 또한, 효모 배경은 적어도 두 개의 플라스미드를 선택할 수 있어야 하는데, 하나는 역사적으로 류신 영양소 선택 플라스미드에 ACT1-CUP1 리포터를 포함하고, 다른 하나는 연구될 스플라이싱 기계에서 돌연변이 또는 섭동을 포함합니다(그림 2). 일반적으로 단일 분석에서 각각 쿼리 접합 섭동(QSP)과 다른 리포터를 운반하는 여러 효모 균주가 질의가 접합에 미치는 영향을 테스트합니다.
ACT1-CUP1 분석의 독립 변수를 통해 연구자는 QSP의 심각도를 평가할 수 있습니다. 이러한 독립 변수는 구리의 농도와 여러 비합의 접합 보고자의 선택입니다. 첫째, 효모 균주가 다양한 구리 농도를 포함하는 플레이트에서 성장함에 따라(그림 2), 분석 설정에는 사용된 농도의 구배를 선택하는 것이 포함됩니다. 연구는 코스 구리 농도 구배를 활용하여 생존력의 초기 판독값을 얻은 다음 미세한 구배로 분석을 반복하여 미묘한 생존력 차이를 식별할 수 있습니다. 두 번째 변수는 테스트할 수 있는 광범위한 ACT1-CUP1 리포터입니다(그림 1 및 표 1). QSP가 비합의 리포터 대 야생형의 존재 하에 효모 생존율에 다르게 영향을 미치는 경우, QSP가 인트론의 해당 영역을 인식하거나 처리하는 동안 중요한 스플라이세오솜의 단계 또는 스플라이세오솜의 영역에 영향을 미친다는 결론을 내릴 수 있습니다.
효모 도구 상자는 광범위하며 ACT1-CUP1 분석은 접합 연구의 필수적인 부분입니다. ACT1-CUP1 분석은 종종 QSP의 영향에 대한 보다 심층적인 유전적, 구조적 및/또는 생화학적 분석과 함께 수행됩니다. 이러한 보다 상세한 연구는 일반적으로 더 긴 절차 및/또는 더 높은 가격표를 가지고 있기 때문에 빈번한 접근 방식은 먼저 ACT1-CUP1을 가진 흥미로운 돌연변이를 스크리닝하는 것입니다.
여기에는 동판 준비를 포함한 ACT1-CUP1 분석 프로토콜이 제공됩니다. 이 분석은 연구자에게 접합에 대한 QSP의 영향과 섭동의 영향을 가장 많이 받는 인트로닉 영역에 대한 초기 답변을 제공합니다.
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Protocol
1. 효모 균주 건설
- 배경에 leu2 및 cup1Δ가 포함된 S. 세레비시아에 균주를 생성하거나 얻습니다. 이러한 배경을 생성하려면 리튬 아세테이트와 단일 가닥 DNA39를 사용하는 잘 확립된 효모 방법을 사용하십시오.
참고: 반수체 효모 균주는 CUP1 6,38의 사본 1개, 2개 또는 그 이상을 포함할 수 있습니다. CUP1 유전자 위치의 측면에 녹아웃 프라이머를 설계할 때 선택한 효모 균주에 대한 게놈 정보를 참조하십시오. - 효모 형질전환을 수행하여 게놈 혼입 또는 플라스미드를 통해 QSP를 통합합니다. 이전 연구40,41,42에 설명된 것과 같은 잘 확립된 프로토콜을 사용하십시오.
- 단계 1.2에서 생성된 균주로 효모 형질전환을 수행합니다. 원하는 ACT1-CUP1 리포터 플라스미드를 추가한다.
참고: 세포는 이 형질전환 후 ACT1-CUP1 리포터 플라스미드의 머무름을 보장하기 위해 류신 드롭아웃(-Leu) 플레이트 및 배지에서 유지되어야 합니다. - 1.2단계를 수행합니다. 및 1.3. 각 QSP 및 각각의 ACT1-CUP1 리포터에 대해 시험될 플라스미드를 포함하여, 대조군 균주를 포함한다.
2. 동판 준비
- 검사할 리포터에 적합한 구리 농도 범위를 선택합니다(자주 사용하는 리포터의 치사율은 표 1 참조).
참고: 포괄적인 구리 농도 범위의 예는 0 mM, 0.025 mM, 0.05 mM, 0.075 mM, 0.1 mM, 0.15 mM, 0.2 mM, 0.25 mM, 0.3 mM, 0.35 mM, 0.4 mM, 0.4 mM, 0.45 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1.0 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 1.7 mM, 1.8 mM, 1.9 mM, 2.0 mM, 2.25 mM 및 2.5 mMCu2+. - 0.22 μm PES (폴리 에테르 술폰) 멸균 필터를 통해 1 M CuSO4 및 멸균 필터의 저장 용액을 만든다.
- 원하는 구리 플레이트 당, 멸균수에서CuSO4 스톡의 2 mL 희석액을 준비한다.
알림: 0 mM Cu 2 +를 갖는 플레이트는 항상 기준으로 분석되고 이미징 될 것이므로 도금 단계의 시작과 끝에 하나씩 두 개의 0 mM Cu2 + 플레이트를 만드는 것이 좋습니다 (단계 3.4).- 플레이트 부피의 40mL에서 원하는 최종 구리 농도에 대한 재고량을 계산합니다(보충 표 1).
- 계산된 양의 멸균수 및 1 MCuSO4 스톡을 멸균된 2 mL 튜브에 첨가한다.
- ACT1-CUP1 분석을 위한 붓는 플레이트.
참고: 아래 프로토콜의 대안은 처음에 배지와 한천을 큰 용기에 결합하고 오토클레이빙 후 분취량을 더 작은 용기에 결합하여 각 플레이트에 대해 다른 구리 농도를 달성하는 것입니다. 어떤 방법을 사용하든 각각 다른 구리 농도를 가지고 있음에도 불구하고 모든 플레이트 간에 매체 농도가 일관되도록 하는 것이 중요합니다.- 부을 각 빈 접시에 포함될 최종 구리 농도를 표시합니다. 테스트 할 구리 농도 당 적어도 하나의 정사각형 플레이트를 준비하십시오.
- 테스트할 구리 농도당 100mL 병에 라벨을 붙입니다.
- 각 병에 790mg의 한천 (2 % w / v 한천)과 교반 막대를 첨가하십시오.
- 큰 비커에서 부을 모든 동판에 대해 -Leu 성장 배지를 결합합니다. 만들 플레이트당 효모 질소 염기(YNB) 265mg과 탈락 믹스 64mg에서 류신(및 세포에서 QSP 플라스미드를 유지하는 데 필요할 수 있는 기타 영양소)을 뺀 34mL의 탈이온수에 녹입니다.
- 34mL의 -Leu 성장 배지 용액을 각각 준비된 100mL 병에 넣고 알루미늄 호일로 캡을 씌운다. 의도한 구리 농도로 호일에 라벨을 붙입니다.
- 오토클레이브는 오토클레이브에 권장되는 액체 사이클을 사용하여 한천을 살균하고 용해합니다.
- 가능한 한 빨리 각 병에 4mL의 20% w/v 포도당(멸균 여과)을 추가합니다.
- 라벨을 일치시키고 CuSO4 의 2mL 희석액을 의도 한 병에 첨가하십시오.
알림: 각각 농도가 다른 수십 개의 동판을 동시에 만들 수 있으므로 모든 병, 튜브 및 플레이트에 의도한 구리 농도로 명확하게 라벨을 붙이면 접시를 붓는 동안 혼동을 방지할 수 있습니다. - 교반 플레이트를 사용하여 ~30초 동안 혼합하고 거품을 피하면서 라벨이 부착된 플레이트에 35mL를 붓거나 피펫합니다. 보관하거나 사용하기 전에 식히십시오.
참고: 종종, 플레이트는 분석 1일 또는 2일 전에 만들어지고 사용 몇 시간 전까지 4°C에서 보관됩니다. 플레이트는 도금이 시작되기 전에 실온 (RT)에 있어야합니다 (단계 3.4).
3. ACT1-CUP1 분석
- -Leu 플레이트에 원하는 균주를 제거합니다.
알림: 냉동 재고로 작업하는 경우 도금 전에 셀이 보관에서 충분히 되살아나도록 주의해야 합니다. 이에 대한 권장 절차는 극저온 주식에서 줄무늬를 만들어 30 ° C에서 3-5 일 동안 자라게하는 것입니다. 그런 다음 작은 견본을 고정하고 30 ° C에서 2-3 일 더 자라게합니다. - 10mL의 배지에서 하룻밤 배양액을 성장시킵니다.
- 단계 2.4.2에 기재된 것과 동일한 비율을 사용하여 -Leu 성장 배지를 준비한다. 배지 10mL당 효모 질소 염기(YNB) 66mg과 류신을 뺀 드롭아웃 혼합물 16mg을 탈이온수 9mL에 추가합니다. 0.22μm PES 멸균 필터를 통과합니다.
- 효모 균주당 9mL의 -Leu 성장 배지와 1mL의 20% w/v 포도당(멸균 여과)을 멸균 50mL 원뿔형 튜브에 추가합니다.
- 멸균 스틱 또는 피펫 팁을 사용하여 효모의 작은(~1mm 원형) 견본을 수집하고 배지를 접종합니다.
- 모든 밤새 배양물을 180 rpm 및 30°C에서 흔들어준다.
알림: 가능한 경우 셰이커 대신 회전 장치를 사용할 수 있습니다.
- 균주를OD600 0.5 ± 0.05 in 10% 글리세롤로 희석한다.
- 균주당 900μL의 물이 포함된 큐벳에 100μL의 배양액을 추가합니다.
- 분광 광도계로 OD600 을 측정합니다.
- 2mL의 최종 부피에서 0.5의 OD600 에 필요한 희석을 계산합니다.
- 각 균주를OD600 0.5 in 10% 글리세롤(멸균)로 희석한다.
- OD600을 재측정하여 셀 밀도가 원하는 범위인 0.5 ± 0.05 내에 있는지 확인합니다.
- 구리판에 변형을 도금하십시오.
참고: 5-10 μL 부피의 수동 피펫팅, 반복 또는 다중 채널 피펫터 사용 또는 핀 리플리케이터를 사용한 스탬핑 등 다양한 방법을 사용하여 균주를 도금할 수 있습니다. 이 마지막 방법은 아래에 설명되어 있지만 방법에 관계없이 대부분의 단계는 유사합니다.- 멸균 작업 장소와 불이 켜진 분젠 버너를 설치하십시오.
- 48핀 리플리케이터의 경우, 희석된 각 균주 200μL를 96웰 플레이트의 개별 웰에 피펫팅합니다. 6 x 8 그리드의 빈 공간을 200 μL의 10 % 글리세롤 (멸균)로 채 웁니다.
참고: 9개의 효모 균주에 대한 도금 방식의 예는 보충 표 2에 있습니다. - 복제기를 95%(v/v) 에탄올과 화염이 담긴 얕은 접시에 담가 살균합니다. 열에 셀에 충격을 주지 않도록 화염이 꺼진 후 최소 2분 동안 식히십시오.
- 버너 근처에 4 개의 판을 놓고 뚜껑을 제거하십시오.
- 복제기를 96웰 플레이트에 담그고 한 번의 빠른 동작으로 들어 올립니다.
- 접시에 부드럽게 놓고 좋은 이동을 용이하게 하기 위해 앞뒤로 가볍게 흔듭니다.
- 한 번의 빠른 동작으로 들어 올려 96웰 플레이트에 정확히 같은 방향으로 놓습니다.
- 최대 3개의 다른 플레이트에 대해 반복합니다. 복제기를 에탄올에 담그고 불타서 살균하고 4 개의 플레이트마다 냉각을 기다리는 과정을 반복하십시오.
- 플레이트를 도금한 후 측면으로 부드럽게 움직이되 여전히 화염의 살균 우산 내에서 움직입니다.
알림: 효모 희석과 화염 근처에서 도금하는 것이 좋습니다. 플레이트는 건조 중에 쉽게 오염될 수 있습니다. - 뚜껑을 덮기 전에 접시를 완전히 말리십시오(보통 3-5분).
- 플레이트를 30°C에서 3일 동안 인큐베이션한다.
4. 자료 수집 및 분석
- 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 육안으로 검사하십시오.
- 사용 가능한 카메라 또는 기타 디지털 이미징 시스템으로 플레이트의 이미지를 기록합니다.
- 각 균주에 대한 기록(또는 점수)이 관찰되는 마지막 구리 농도 가시적 성장이 관찰된다.
알림: 세포는 접합할 수 있고 해당 농도까지 생존 상태를 유지할 수 있습니다. 일관성을 위해 항상 눈으로 또는 플레이트 이미지에서 동일한 방법을 사용하여 마지막 실행 가능한 구리 농도를 채점하십시오. 매우 작은 식민지는 때때로 눈으로 볼 수 있지만 이미지에는 보이지 않습니다. 직접 육안 검사 또는 이미지 기록 간의 차이는 작으며 일반적으로 그라디언트의 한 단계입니다. 식민지의 이미지는 출판물에 자주 사용되므로 이미지로 점수를 매기는 것이 좋습니다. - 동일한 균주에 대한 여러 ACT1-CUP1 분석의 데이터를 결합하여 QSP가 접합에 미치는 영향에 대한 결론을 도출합니다.
참고: 간행물 수치는 일반적으로 0mM Cu2+ 농도, 마지막 실행 가능한 구리 농도 및 콜로니가 죽은 후속 농도에서 효모 콜로니의 이미지를 보여줍니다. 데이터는 반복실험 간 표준 편차에 대한 오차 막대가 있는 막대 그래프로 표시될 수도 있습니다. 데이터는 정규화 할 필요는 없지만 WT 스 플라이 싱 인자 대조군의 생존력을 1로 설정하고 도입 된 돌연변이의 효과를 비교함으로써 정규화 할 수 있습니다.
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Representative Results
ACT1-CUP1과 같은 성장 분석에는 여러 콜로니에 대한 시각적 비교 평가가 필요합니다. 여기서, 각각의 균주를 밤새 포화 상태로 성장시키고, 0.5의OD600 으로 희석하고, 0 mM 내지 1.1 mMCuSO4 의 구리 농도 범위를 함유하는 20개의 플레이트에 도말하였다(도 3). 이 범위는 아래에 사용 및 설명된 QSP 및 ACT1-CUP1 보고자의 영향을 완전히 평가할 수 있으므로 프로토콜에 나열된 범위보다 작습니다. 플레이트를 이미지화하고 점수를 매겼습니다(그림 3 및 보충 표 3).
이 대표적인 실험의 경우, 효모 배경에는 파괴 된 ADE2 유전자가 포함되어있어 콜로니가 다양한 빨간색 음영이됩니다 (그림 3A, B). 아데노신 생산 경로에서 이러한 일반적인 효모 파괴는 아데노신에 대한 적색 색소 전구체의 축적을 유발합니다. 따라서, 붉은 색은 효모 콜로니 성숙도 (즉, 존재하는 세포의 양 및 나이)의 지표이다. ACT1-CUP1 분석의 목적을 위해, 붉은 색은 흰색 또는 노란색의 경우 곰팡이 종을 오염시키는 지표로 작용할 수 있습니다. 색상은 더 생존 가능한 식민지가 더 깊은 붉은 그늘이 될 것이기 때문에 구리 내성의 2차 확인이 될 수 있습니다.
핀 리플리케이터로 도금할 때 몇 가지 일반적인 수차가 있습니다. 첫째, 복제기를 왼쪽 또는 오른쪽으로 이동하면서 들어 올리면 타원형의 콜로니를 만들 수 있습니다 (그림 3B, 주황색 화살표). 또한 핀 복제기를 비스듬히 가져오거나 플레이트 위에서 흔들면 세포 용액의 작은 방울에서 마이크로콜로니가 형성될 수도 있습니다(그림 3B, 빨간색 화살표). 종종 무해하고 때로는 마이크로 콜로니가 스탬프 된 식민지와 섞일 수 있으며, 이는 해당 식민지의 해석을 방지합니다. 추가적인 도금 문제로는 멸균 후 복제기 핀이 냉각될 때까지 불충분한 대기 시간이 발생하고 플레이트와 핀 사이의 접촉이 불충분하여 배양 배지의 전달 불량이 발생합니다. 두 경우 모두에서, 야생형 리포터를 함유하는 대조군 균주를 포함하여, 플레이트에서 성장할 세포는 거의 없을 것이다. 모든 성장 분석과 마찬가지로 도금 방법에 관계없이 ACT1-CUP1을 삼중으로 수행하여 결과가 일관되고 반복 가능한지 확인하는 것이 중요합니다. 이상적으로는 재현성을 보장하기 위해 서로 다른 시간에 준비된 동판에서 이러한 다양한 반복을 수행해야 합니다.
이러한 대표적인 실험을 위해 A3c 리포터는 추가 스플라이세오솜 섭동이 없는 경우 구리 내성에 대한 비합의 서열의 영향을 강조하기 위해 선택되었습니다. A3c는 5'SS15를 인식하고 활용하는 스플라이세오솜의 능력을 교란시키기 때문에 생성된 CUP1 mRNA의 양을 상당히 감소시킵니다. A3c 리포터를 사용한 효모는 0.15 mMCu2+까지 생존한 반면, 야생형 리포터 세포는 시험된 구리 농도 범위의 말기까지 생존능을 유지하였다(도 3C). 야생형 리포터 함유 세포는 생존력에 영향을 미치지 않고 2.5 mMCu2+까지 성장한다 (데이터는 나타내지 않음).
U6 snRNA는 스플라이세오솜의 필수 촉매 성분입니다. 여러 연구에서 ACT1-CUP1을 사용하여 돌연변이가 이 RNA 16,32,34에 미칠 수 있는 영향을 연구했습니다. 이 연구를 위해 중복된 3개의 U6 snRNA 서열, 즉 야생형 서열(WT), 우리딘에서 시토신으로 치환된 위치 57(U57c) 및 우리딘에서 아데노신으로 치환된 위치 57(U57a)을 연구했습니다(그림 3 및 그림 4). 스플라이싱에서 촉매 단계에 영향을 미치는 ACT1-CUP1 리포터와 조합하여, U57c는 제1 촉매 단계를 선호하고, U57a는 제2 단계(16,32)로의 진행을 선호한다고 결정되었다.
ACT1-CUP1 분석을 설정하기 위해, U6 snRNA의 게놈 사본이 삭제되고 U6 snRNA 야생형 또는 돌연변이 서열이 플라스미드에 포함된 균주가 생성되었다. U6 snRNA는 세포의 필수 구성 요소이기 때문에 세 가지 개별 형질전환을 사용하여 먼저 세포 생존력을 유지하면서 게놈 U6 snRNA를 녹아웃한 다음 플라스미드에 돌연변이된 U6 snRNA를 도입하고 마지막으로 ACT1-CUP1 리포터를 추가했습니다. 첫 번째 형질전환의 경우, 생존력을 유지하기 위해 URA 선택 마커 플라스미드에 WT U6 snRNA를 동시에 추가하는 동시에 U6 snRNA의 게놈 카피의 녹아웃에 cup1Δ 효모 균주를 사용했습니다. 후속 형질전환은 TRP 선택 마커 플라스미드 상에 야생형 또는 돌연변이된 U6 snRNA를 추가하고, 5-FOA 선택을 통해 URA 마커에 대해 선택하였다. 따라서, 3개의 cup1Δ 효모 균주가 생성되었고, 각각은 U6 snRNA 서열 중 하나, 즉 WT, U57a, 및 U57c를 가졌다. 각 균주에 대한 최종 효모 형질전환은 본 실험에 사용될 3개의 상이한 ACT1-CUP1 리포터 플라스미드 중 하나를 첨가하였다. 선정된 리포터는 야생형 리포터 A3c와 가지부위 아데노신의 구아닌으로의 돌연변이(BS-G)였다. 이 실험을 위해 총 9개의 균주가 생성되었으며, 각각은 하나의 U6 snRNA 서열과 하나의 ACT1-CUP1 리포터를 함유했습니다(보충 표 4 및 보충 표 5).
결과는 U6 snRNA 위치 57의 서로 다른 염기가 5' SS 또는 BS 돌연변이와 결합하여 스플라이세오솜에 고유한 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다(그림 4). A3c 및 BS-G 리포터 모두는 주로 제 1 촉매 단계 형태(14,15)를 안정화시킴으로써 접합을 억제한다. 따라서 U57c는 이러한 리포터 중 하나와 결합하여 구리 내성을 감소시키는 부가 돌연변이입니다(그림 4B). 대조적으로, U57a는 두 번째 단계로의 진행을 촉진하기 때문에 구리 내성을 증가시킵니다(그림 4B)16,32. U6 snRNA WT에 비해 U57a에 대한 BS-G 리포터 균주의 감소된 구리 내성은 스플라이싱16의 두 번째 단계에서 BS-G의 가능한 2차 영향을 강조합니다.
이러한 결과는 또한 이 분석의 정성적 특성과 야생형 질의 및 리포터 서열을 테스트해야 하는 이유를 강조합니다. 야생형 U6 snRNA와 비교하여 이러한 U6 snRNA 돌연변이에 대해 구리 내성이 증가하거나 감소하는 일반적인 패턴이 사실이지만, 세포가 생존하는 구리의 정확한 농도는 연구마다 다를 수 있으며(표 1) 이러한 대표 데이터와 다른 발표된 결과 간에 차이가 있었습니다. 이는 CUP1 결실을 포함하는 균주의 배경 때문일 수 있지만 도금 전 균주의 일반적인 건강 상태(즉, 극저온에서 균주 또는 레스트리크가 생성된 후 분석이 수행된 시기), 플레이트 준비 방법의 차이 및 서로 다른 인큐베이터 간의 가변성 때문일 수도 있습니다. 유사한 분산이 문헌43에서 Prp8 쿼리 돌연변이에 대해 Mayerle et al.에서 언급되었다. 따라서 구리 허용 오차 추세 비교는 다른 ACT1-CUP1 분석에 대해 수행할 수 있지만 구리 농도의 수치 비교는 동일한 실험실 내에서만 수행되어야 하며 때로는 동일한 구리 플레이트 세트로 수행해야 합니다.
그림 1: ACT1-CUP1 리포터 설계 접합 리포터의 농도는 효모 구리 내성과 직접적인 상관 관계가 있습니다. 리포터의 다이어그램은 5' 스플라이스 사이트(5' SS), 분기 사이트(BS) 및 3' 스플라이스 사이트(3' SS)의 3개의 스플라이스 사이트를 포함한다. 이러한 부위에 대한 효모 컨센서스 서열이 표시되며, 절단 대상은 인트론에서의 위치에 따라 굵게 표시되고 번호가 매겨집니다. 일반적으로 사용되는 비-합의 ACT1-CUP1 리포터 서열은 대응하는 합의 서열 위치 아래의 소문자에 도시되어 있고, 표 1에 열거되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: ACT1-CUP1 분석 워크플로우. 이 분석을 위해, 효모 균주는 cup1Δ leu2이어야 하고, 원하는 ACT1-CUP1 리포터 플라스미드 및 QSP 유전자를 함유해야 하며, 도면에서 유전자로 표지된다. QSP 유전자는 게놈으로 삽입되거나 플라스미드에 삽입되어야 합니다. 핀 복제기를 사용하는 프로토콜은 효모 세포를 준비하는 4단계를 포함합니다. 1단계는 세포를 포화 상태로 성장시키는 것이다. 단계 2는 배양물의 OD600을 측정하고 0.5의OD600으로 희석하는 것이다. 단계 3은 96-웰 플레이트에 걸쳐 분배하는 것이다. 4단계는 증가하는 농도의 구리(증가하는 파란색으로 표시됨)를 포함하는 플레이트에 도금하는 것입니다. 1단계, 2단계 및 4단계는 핸드 피펫팅에 대해 동일합니다. 일단 도금되면, 플레이트를 30°C에서 3일 동안 인큐베이션한 다음, 생존율을 위해 스코어링한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: ACT1-CUP1 데이터의 대표 보기. 이 실험을 위해 효모 스플라이세오솜은 두 개의 서로 다른 U6 snRNA 돌연변이에 도전하고 세 명의 비합의 보고자가 있는 상태에서 테스트합니다. 이 분석의 세 가지 반복은 시연 목적으로 동일한 플레이트에 제시됩니다. 이 분석은 별도의 플레이트와 별도의 날에 반복을 수행하는 것이 좋습니다. (a) 20개의 플레이트에 걸쳐 0 mM 내지 1.1 mM의 구리 구배를 갖는 완료된 분석이 도시된다. 구리 농도가 증가함에 따라 접합이 낮은 변형은 구리 농도가 치명적일 정도로 컨플루언스가 감소하는 것으로 나타났습니다. 효모 배경은 ade2 였고, 따라서 성숙한 식민지는 붉은 색입니다. (B) 핸드헬드 카메라와 디지털 이미징 시스템으로 이미징된 0mM 및 0.1mM CuSO4에서 동일한 플레이트의 비교. 이것은 다수의 합의되지 않은 기자를 야생형 기자와 나란히 비교할 수 있는 방법의 예입니다. 플레이트에 대한 일반적인 관찰에는 핀 복제기에서 떨어진 배양 배지의 가짜 방울(빨간색 화살표)과 플레이트 표면을 따라 핀이 미끄러지거나 배양 방울이 충분히 건조되기 전에 플레이트의 움직임으로 인한 콜로니의 약간의 타원형(주황색 화살표)이 포함됩니다. (c) 야생형 리포터와 비교하여 세포 생존율에 대한 A3c 리포터의 효과의 예. (B)에 표시된 것과 같은 이미지는 다양한 구리 농도에서 성장 차이를 강조하기 위해 잘리고 정렬됩니다. A3c 리포터 균주의 구리 내성은 시험된 범위의 끝까지 야생형 리포터 균주의 생존력에 비해 0.15 mMCu2+ 로 감소한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 스플라이싱 성분 돌연변이가 있는 효모의 스플라이싱을 모니터링하는 대표적인 ACT1-CUP1 결과. (A) 제1 촉매 단계 직후의 활성 부위의 RNA 성분의 개략도. U2 및 U6 snRNA는 이중되어 인트론의 5' SS 및 BS를 근접하게 만듭니다. A259 (BS)와 G1 (5'SS) 사이의 인트론 결합은 주황색 점으로 표시됩니다. 본 실험에서 시험된 ACT1-CUP1 리포터에서 비합의 서열 치환의 위치는 굵은 검은색으로 표시하였다. U6 snRNA (U57)의 돌연변이 된 위치는 굵은 녹색이고 치환 된 염기는 파란색 또는 분홍색입니다. (B) 간행물에서 ACT1-CUP1 데이터를 제시하는 한 가지 가능성은 관련 Cu2+ 농도로부터의 콜로니의 여러 이미지를 포함한다. WT 리포터는 질의된 3개의 U6 snRNA 균주 모두에 대해 시험된 구리 농도를 지나서 생존하였다. (c) 리포터 당 및 U6 snRNA 돌연변이체 당 효과를 비교하는 막대 그래프. 정규화는 U6 snRNA WT의 구리 허용오차를 1로 설정하고 U57c 및 U57a 돌연변이에 대한 비율을 계산함으로써 각 ACT1-CUP1 리포터에 대해 수행된다. 오차 막대는 세 번의 반복실험에서 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: ACT1-CUP1 결과를 보완하는 추가 방법. (A) 프라이머 확장은 3' ACT1 엑손에서 프라이머 어닐링을 통해 수행된 다음 인트론으로 신장됩니다. 이 예에서, 프라이머는 IR700 염료로 말단 표지되고, 프라이머 연장은 20,21에 기재된 바와 같이 수행되었다. U6 snRNA의 프라이머 연장은 로딩 조절로서 작용하기 위해 동일한 반응으로 수행된다. 7% 19:1 비스/아크릴아미드 변성 젤은 van der Feltz et al.22에 설명된 대로 근적외선 겔 이미징 장치를 사용하여 프라이머 확장 후 pre-mRNA, mRNA 및 lariat 제품을 분해합니다. 서로 다른 밴드의 강도는 ImageJ44 또는 기타 겔 밴드 정량화 소프트웨어로 정량화 된 바와 같이 첫 번째 또는 두 번째 단계에서 발생하는 스 플라이 싱 차이를 구별 할뿐만 아니라 전체 스 플라이 싱 효율을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 스플라이싱 효율과 스플라이싱 단계 효율은 모두 Query 및 Konarska14에 설명된 대로 계산됩니다. (B) ACT1-CUP1 리포터를 사용한 돌연변이 스크리닝은 구리 선택을 활용하여 접합에 영향을 미치는 돌연변이를 식별할 수 있습니다. 그런 다음 관심 유전자를 결과 균주에서 시퀀싱하여 해당 유전자에서 돌연변이가 발생했는지 확인할 수 있습니다. (C) 인트론 구조, 엑소닉 서열, 엑손 수 또는 스플라이싱되지 않은 RNA의 핵 수출과 관련된 스플라이싱 변화를 모니터링하기 위해 스플라이스 부위 외부의 리포터에게 변경을 가할 수 있습니다. 회색 영역은 리포터에 포함할 선택적 확장 영역이고, 빨간색 영역은 ACT1-CUP1 분석을 사용하여 접합에 대한 잠재적 영향에 대해 시퀀스 및 구조적 변화를 테스트할 수 있는 영역입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 보고자 이름 | 인트로닉 영역 | 순서 | 마지막 생존 가능한 Cu2+ 농도 (mM) | |
| 증권 시세 표시기 | 5' | 구아우구 | > 2.5 | |
| G1a | 5ʹ | ᅡ 아우구 | 0.0133 또는 0.0532 | |
| A3c | 5ʹ | GUcUGU | 0.15^,18 또는 0.216 | |
| G5a | 5ʹ | 구아아우아우 | 0.303 또는 0.259 | |
| 증권 시세 표시기 | 분기 사이트 | 무아쿠악 | > 2.5 | |
| C256a | 분기 사이트 | UAaUAAC | 0.1526 또는 0.1832 | |
| U257c/a | 분기 사이트 | UACc / aAAC | 0.226 또는 0.332 또는 0.545 | 0.059,32 |
| A258c/u | 분기 사이트 | UACUc/uAC | 0.826 | 1.045 또는 1.646 |
| 학사-씨 | 분기 사이트 | UACUAcC | 0.153 또는 0.1832,56 또는 0.226 | |
| BS-G | 분기 사이트 | UACUAgC | 0.0516,32 또는 0.625 또는 0.846 | |
| 씨260지 | 분기 사이트 | UACUAAg | 0.826 | |
| 증권 시세 표시기 | 3' | 증권 시세 표시기 | > 2.5 | |
| U301g | 3ʹ | 지 증권 시세 표시기 | 0.1518 | |
| A302g/u | 3' | Ug/uG | 0.0139 | 0.07516 또는 0.1824 |
| G303c | 3ʹ | UAc | 0.0532 | |
표 1: 보고된 일반적인 보고자 목록 및Cu2+ 농도 치사율. Lesser와 Guthrie3의 100개 이상의 인용이 있습니다. 이 표를 작성하기 위해 이러한 인용의 작은 선택이 사용되었지만,보고 된 구리 생존 농도에서 연구 간의 약간에서 중간 정도의 차이의 일반적인 경향을 강조합니다. ACT1-CUP1에서는 공개된 농도를 가이드로 사용하지만 관찰된 농도가 다를 수 있음을 예상하여 야생형 단백질 또는 RNA를 모두 동일한 효모 균주 배경을 가진 돌연변이체와 비교하는 것이 중요합니다. 그림 3(^) 및 다음 인용 3,9,16,18,24,25,26,32,45,46으로 주석이 달린 여러 출판물에서 수집된 데이터입니다.
보충 표 1: 단일 구리 플레이트의 내용물 및 1MCuSO4 스톡으로부터 0mM 내지 2.5mM의 구리 희석을 달성하기 위해 수행된 계산의 예. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: 48핀 리플리케이터에 대한 도금 방식의 예. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 3: 30°C에서 3일 동안 배양한 동판에서 득점한 생존력의 예. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 4: 대표 데이터를 생성하기 위해 사용된 효모 균주의 목록. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 5: 대표 데이터를 생성하기 위해 사용된 플라스미드의 목록. U6 snRNA 플라스미드 생성 및 이전 연구22,47에서 발표되었습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
ACT1-CUP1은 성장 분석법이며, 관찰된 성장 차이가 접합 결함에만 기인할 수 있도록 주의해야 합니다. 모든 균주는 유사한 길이와 유형의 성장 및 저장 조건을 갖는 것을 포함하여 도금 전에 유사한 방식으로 취급되어야 합니다. 온도에 민감한 균주를 사용하는 경우 ACT1-CUP1 분석은 해당 균주가 야생형과 비슷하게 자라는 조건에서만 수행해야 합니다. 이와 관련하여, QSP 성분의 경우, 결과의 해석을 흐리게 하지 않도록 QSP 유전자(들)의 동일한 효모 배경 및 발현 수준을 갖는 것이 권고된다. 사용할 QSP 및 리포터의 수를 고려할 때 핀 복제기 방법으로 한 번에 30개 이상의 균주를 분석하는 것은 권장되지 않습니다. 각 단계를 수행하는 데 추가 시간이 걸리면 세포가 안정되고 세포 생존율 감소로 인해 분석 결과가 일치하지 않습니다.
ACT1-CUP1이 성장 분석으로서 본질적으로 갖는 한계 외에도 QSP는 이 방법으로 해결할 수 있는 것보다 스플라이싱에 더 복잡한 영향을 미칠 수 있습니다. 접합은 다단계 프로세스이고 요인이 재활용되기 때문에 관찰된 표현형으로 인해 섭동이 둘 이상의 접합 단계에 영향을 미칠 수 있습니다. 이는 ACT1-CUP1을 추적할 수 있는 후속 분석에도 적용되며, 그 중 일부는 아래에 설명되어 있습니다. 데이터는 다른 단계가 접합 계수의 변경된 기능에 의해 영향을 받을 수 있더라도 프로세스의 가장 교란된 단계를 강조 표시합니다.
ACT1-CUP1 리포터의 프라이머 확장은 Lesser and Guthrie의 원래 논문에서 처음 사용되었으며 ACT1-CUP1 결과가 성장 결함3을 나타내는 경우 종종수행됩니다. 이 분석은 리포터를 표적으로 하고 PCR 산물의 길이를 사용하여 존재하는 비접합, 부분 접합 및 완전 접합된 리포터의 상대적인 양을 결정합니다(그림 5A). 전체 스플라이싱 효율 및 결함이 제1 또는 제2 촉매 단계에 더 강하게 영향을 미치는지 여부는 PCR 산물 양의 비율(14)을 취함으로써 계산된다. 예를 들어, 5' SS 리포터 G5a는 야생형 리포터에 비해 스플라이싱이 감소했지만, 그의 제1 및 제2 스텝 효율은 야생형과 유사한 패턴을 따른다(도 5A). 이것은 첫 번째 촉매 단계 이전의 결함을 가리키며, 아마도 스플라이세오솜 조립에서 두 단계 모두 유사하게 영향을 받기 때문입니다(31).
새로운 분석은 다른 스플라이싱 인자 돌연변이체 및/또는 비합의 스플라이싱 서열의 존재 하에 스플라이싱을 개선하는 돌연변이체에 대한 스크리닝과 같은 표준 ACT1-CUP1 분석으로부터 개발되었습니다(그림 5B). 예를 들어, ACT1-CUP1 리포터를 함유하는 효모를 UV에 노출시킨 다음, 구리의 존재 하에 선택하면, 비-컨센서스 서열14,19의 스플라이싱을 개선하는 Prp8 및 Hsh155 돌연변이체가 생성되었다.
스플라이스 부위 및 구성적 스플라이싱 인자의 효과에 대한 연구를 넘어 확장하여, CUP1 성장 의존성은 다중 인트론 스플라이싱, 핵 수출 제어, UTR 및 기타 말초 서열이 스플라이싱에 미치는 영향을 연구하는 데 사용되었습니다(그림 5C). 이러한 연구 중 일부는 인트론 2차 구조 및 다중 인트론 전사체 스플라이싱 48,49,50,51,52에 대한 효과를 연구하기 위해 더 복잡한 스플라이싱 패턴을 가질 수 있는 CUP1 및 기타 인트론 함유 효모 유전자를 가진 리포터를 만들었습니다. 접합과 핵 수출 사이의 연결은 프레임 1에서 CUP53,54를 인코딩하는 접합 또는 접합되지 않은 전사체를 사용하여 연구되었습니다. 특정 요인으로 인한 피리 미딘 트랙의 길이와 스플 라이스 부위 선택의 거리 의존성도 20,55,56,57로 테스트되었습니다. 이러한 예와 다른 많은 예는 ACT1-CUP1 및 기타 CUP1 성장 분석의 다양성을 강조합니다.
ACT1-CUP1 분석은 넓은 감도 범위의 간단한 성장 표현형을 사용하여 섭동을 복잡한 반응 주기에 연결합니다. 이 레거시 분석은 접합 주기에 대한 이해의 토대를 마련하기 위해 여러 실험실에서 사용되었습니다. 보다 최근에, ACT1-CUP1은 현재 이용 가능한 풍부한 구조 데이터로부터 발생하는 질문에 답하기 위해 사용되었다 21,22,25. 비합의 서열에 결합된 스플라이세오좀의 구조 연구는 변경된 구조와 변경된 기능의 상관 관계를 해석하기 위해 ACT1-CUP1 결과와 쌍을 이룰 수 있습니다. ACT1-CUP1은 보다 복잡한 분석을 보완할 수 있는 스플라이싱 돌연변이를 위한 이상적인 첫 번째 스크린입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
그림 3-5 생성에 효모 균주와 장비를 사용한 위스콘신-매디슨 대학의 Aaron Hoskins와 Hoskins 실험실 구성원에게 감사드립니다. 원고에 대한 통찰력 있는 의견을 주신 Harpreet Kaur와 Xingyang Fu에게 감사드립니다. 이 논문을 작성, 편집 및 촬영하는 동안 Northwest University의 지원적인 학생, 교직원 및 교수진에게 감사드립니다. 이 방법을 촬영하는 데 도움을 준 Isabelle Marasigan에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL sterile microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 2 mL sterile microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-138 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 07-201-332 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 96-well round bottom microplate | Fisher Scientific | 07-200-760 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 190 proof ethanol | Fisher Scientific | 22-032-600 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| 500 mL Filter System (0.22 µm) | CellTreat Scientific Products | 229707 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | Any molecular grade agar will work. |
| Autoclave | Tuttnauer | 3870EA | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Bunsen burner | Humboldt | PN6200.1 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Cell Density Meter | VWR | 490005-906 | Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm. |
| Copper sulfate Pentahydrate | Fisher Scientific | LC134051 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Digital imaging system | Cytiva | 29399481 | ImageQuant 4000 (used for Figure 3), Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer. |
| Dropout mix (-Leu) | USBiological Life Sciences | D9525 | Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu |
| D-Glucose | Fisher Scientific | AAA1682836 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Gel band quantifying software | Cytiva | 29-0006-05 | ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer. |
| Hand held camera | Nikon | D3500 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Near infra-red gel imaging device | Cytiva | 29238583 | Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer. |
| Laboratory grade clamp | Fisher Scientific | 05-769-7Q | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Laboratory grade stand and clamp | Fisher Scientific | 12-000-101 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-51 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Pin replicator | VP Scientific | VP 407AH | |
| Semi-micro disposable cuvettes | VWR | 97000-590 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Shaker | JEIO Tech | IST-3075 | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Spectrophotometer | Biowave | 80-3000-45 | Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm. |
| Square plates | VWR | 102091-156 | Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator. |
| Stir plate | Fisher Scientific | 11-520-16S | Or comparable item from a different manufacturer. |
| Yeast nitrogen base | USBiological Life Sciences | Y2025 | Or comparable item from a different manufacturer. |
References
- Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
- Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K.
- Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
- Ng, R., Abelson, J. Isolation and sequence of the gene for actin in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (7), 3912-3916 (1980).
- Gallwitz, D., Sures, I. Structure of a split yeast gene: Complete nucleotide sequence of the actin gene in I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2546-2550 (1980).
- Fogel, S., Welch, J. W., Cathala, G., Karin, M. Gene amplification in yeast: CUP1 copy number regulates copper resistance. Current Genetics. 7 (5), 347-355 (1983).
- Hamer, D. H., Thiele, D. J., Lemontt, J. E. Function and autoregulation of yeast copperthionein. Science. 228 (4700), 685-690 (1985).
- Winge, D. R., Nielson, K. B., Gray, W. R., Hamer, D. H. Yeast metallothionein. Sequence and metal-binding properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14464-14470 (1985).
- Burgess, S. M., Guthrie, C. A mechanism to enhance mRNA splicing fidelity: The RNA-dependent ATPase Prp16 governs usage of a discard pathway for aberrant lariat intermediates. Cell. 73 (7), 1377-1391 (1993).
- Collins, C. A., Guthrie, C. Allele-specific genetic interactions between Prp8 and RNA active site residues suggest a function for Prp8 at the catalytic core of the spliceosome. Genes & Development. 13 (15), 1970-1982 (1999).
- Siatecka, M., Reyes, J. L., Konarska, M. M. Functional interactions of Prp8 with both splice sites at the spliceosomal catalytic center. Genes & Development. 13 (15), 1983-1993 (1999).
- Umen, J. G., Guthrie, C. Mutagenesis of the yeast gene PRP8 reveals domains governing the specificity and fidelity of 3' splice site selection. Genetics. 143 (2), 723-739 (1996).
- Grainger, R. J., Beggs, J. D. Prp8 protein: At the heart of the spliceosome. RNA. 11 (5), 533-557 (2005).
- Query, C. C., Konarska, M. M. Suppression of multiple substrate mutations by spliceosomal prp8 alleles suggests functional correlations with ribosomal ambiguity mutants. Molecular Cell. 14 (3), 343-354 (2004).
- Konarska, M. M., Vilardell, J., Query, C. C. Repositioning of the reaction intermediate within the catalytic center of the spliceosome. Molecular Cell. 21 (4), 543-553 (2006).
- Liu, L., Query, C. C., Konarska, M. M. Opposing classes of prp8 alleles modulate the transition between the catalytic steps of pre-mRNA splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (6), 519-526 (2007).
- MacRae, A. J., et al. Prp8 positioning of U5 snRNA is linked to 5' splice site recognition. RNA. 24 (6), 769-777 (2018).
- Query, C. C., Konarska, M. M. CEF1/CDC5 alleles modulate transitions between catalytic conformations of the spliceosome. RNA. 18 (5), 1001-1013 (2012).
- Tang, Q., et al. SF3B1/Hsh155 HEAT motif mutations affect interaction with the spliceosomal ATPase Prp5, resulting in altered branch site selectivity in pre-mRNA splicing. Genes & Development. 30 (24), 2710-2723 (2016).
- Carrocci, T. J., Zoerner, D. M., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. SF3b1 mutations associated with myelodysplastic syndromes alter the fidelity of branchsite selection in yeast. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4837-4852 (2017).
- Kaur, H., Groubert, B., Paulson, J. C., McMillan, S., Hoskins, A. A. Impact of cancer-associated mutations in Hsh155/SF3b1 HEAT repeats 9-12 on pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 15 (4), 0229315 (2020).
- vander Feltz, C., et al. Saccharomyces cerevisiae Ecm2 modulates the catalytic steps of pre-mRNA splicing. RNA. 27 (5), 591-603 (2021).
- Carrocci, T. J., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. Functional analysis of Hsh155/SF3b1 interactions with the U2 snRNA/branch site duplex. RNA. 24 (8), 1028-1040 (2018).
- Hogg, R., de Almeida, R. A., Ruckshanthi, J. P., O'Keefe, R. T. Remodeling of U2-U6 snRNA helix I during pre-mRNA splicing by Prp16 and the NineTeen Complex protein Cwc2. Nucleic Acids Research. 42 (12), 8008-8023 (2014).
- Hansen, S. R., Nikolai, B. J., Spreacker, P. J., Carrocci, T. J., Hoskins, A. A. Chemical inhibition of pre-mRNA splicing in living Saccharomyces cerevisiae. Cell Chemical Biology. 26 (3), 443-448 (2019).
- Xu, Y. Z., Query, C. C. Competition between the ATPase Prp5 and branch region-U2 snRNA pairing modulates the fidelity of spliceosome assembly. Molecular Cell. 28 (5), 838-849 (2007).
- Staley, J. P., Guthrie, C. An RNA switch at the 5' splice site requires ATP and the DEAD box protein Prp28p. Molecular Cell. 3 (1), 55-64 (1999).
- Bousquet-Antonelli, C., Presutti, C., Tollervey, D. Identification of a regulated pathway for nuclear pre-mRNA turnover. Cell. 102 (6), 765-775 (2000).
- Villa, T., Guthrie, C. The Isy1p component of the NineTeen complex interacts with the ATPase Prp16p to regulate the fidelity of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 19 (16), 1894-1904 (2005).
- Mayas, R. M., Maita, H., Staley, J. P. Exon ligation is proofread by the DExD/H-box ATPase Prp22p. Nature Structure and Molecular Biology. 13 (6), 482-490 (2006).
- Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutations in U6 snRNA that alter splice site specificity: Implications for the active site. Science. 262 (5142), 1982-1988 (1993).
- McPheeters, D. S. Interactions of the yeast U6 RNA with the pre-mRNA branch site. RNA. 2 (11), 1110-1123 (1996).
- Perriman, R. J., Ares, M. Rearrangement of competing U2 RNA helices within the spliceosome promotes multiple steps in splicing. Genes & Development. 21 (7), 811-820 (2007).
- Mefford, M. A., Staley, J. P. Evidence that U2/U6 helix I promotes both catalytic steps of pre-mRNA splicing and rearranges in between these steps. RNA. 15 (7), 1386-1397 (2009).
- Hilliker, A. K., Mefford, M. A., Staley, J. P. U2 toggles iteratively between the stem IIa and stem IIc conformations to promote pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (7), 821-834 (2007).
- Wu, G., et al. Pseudouridines in U2 snRNA stimulate the ATPase activity of Prp5 during spliceosome assembly. EMBO Journal. 35 (6), 654-667 (2016).
- Crotti, L. B., Bacikova, D., Horowitz, D. S. The Prp18 protein stabilizes the interaction of both exons with the U5 snRNA during the second step of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (10), 1204-1216 (2007).
- Fogel, S., Welch, J. W. Tandem gene amplification mediates copper resistance in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5342-5346 (1982).
- Gardner, J. M., Jaspersen, S. L. Manipulating the yeast genome: Deletion, mutation, and tagging by PCR. Methods Molecular Biology. 1205, 45-78 (2014).
- JoVE. Yeast Transformation and Cloning. In Biology I: yeast, Drosophila and C. Elegant. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Molecular Biology. 313, 107-120 (2006).
- Gietz, R. D., Woods, R. A.
- Mayerle, M., et al. Structural toggle in the RNaseH domain of Prp8 helps balance splicing fidelity and catalytic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4739-4744 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Beier, D. H., et al. Dynamics of the DEAD-box ATPase Prp5 RecA-like domains provide a conformational switch during spliceosome assembly. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10842-10851 (2019).
- vander Feltz, C., DeHaven, A. C., Hoskins, A. A. Stress-induced pseudouridylation alters the structural equilibrium of yeast U2 snRNA Stem II. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 524-536 (2018).
- Rodgers, M. L., Didychuk, A. L., Butcher, S. E., Brow, D. A., Hoskins, A. A. A multi-step model for facilitated unwinding of the yeast U4/U6 RNA duplex. Nucleic Acids Research. 44 (22), 10912-10928 (2016).
- Stutz, F., Rosbash, M. A functional interaction between Rev and yeast pre-mRNA is related to splicing complex formation. EMBO Journal. 13 (17), 4096-4104 (1994).
- Libri, D., Lescure, A., Rosbash, M. Splicing enhancement in the yeast rp51b intron. RNA. 6 (3), 352-368 (2000).
- Libri, D., Stutz, F., McCarthy, T., Rosbash, M. RNA structural patterns and splicing: Molecular basis for an RNA-based enhancer. RNA. 1 (4), 425-436 (1995).
- Howe, K. J., Kane, C. M., Ares, M. Perturbation of transcription elongation influences the fidelity of internal exon inclusion in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 9 (8), 993-1006 (2003).
- Cuenca-Bono, B., et al. SUS1 introns are required for efficient mRNA nuclear export in yeast. Nucleic Acids Research. 39 (19), 8599-8611 (2011).
- Scherrer, F. W., Spingola, M. A subset of Mer1p-dependent introns requires Bud13p for splicing activation and nuclear retention. RNA. 12 (7), 1361-1372 (2006).
- Hálová, M., et al. Nineteen complex-related factor Prp45 is required for the early stages of cotranscriptional spliceosome assembly. RNA. 23 (10), 1512-1524 (2017).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
- Crotti, L. B., Horowitz, D. S. Exon sequences at the splice junctions affect splicing fidelity and alternative splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 18954-18959 (2009).
- Perriman, R., Ares, M. Invariant U2 snRNA nucleotides form a stem loop to recognize the intron early in splicing. Molecular Cell. 38 (3), 416-427 (2010).
