Summary
ここでは、アリザリンレッド染色を使用して、酢酸鉛曝露がゼブラフィッシュ幼虫の骨量変化を引き起こすことを示しました。この染色法は、他の有害毒物によって誘発されるゼブラフィッシュ幼虫の喪失における骨量減少の調査に適合させることができる。
Abstract
鉛(Pb)曝露による化学的に誘発された骨量減少は、人間と動物の両方の骨格系に一連の悪影響を引き起こす可能性があります。しかし、ゼブラフィッシュの具体的な効果とメカニズムは不明のままです。アリザリンレッドはカルシウムイオンとの親和性が高く、骨を視覚化し、骨格ミネラル量を説明するのに役立ちます。本研究では、アリザリンレッド染色を用いてゼブラフィッシュ幼生の酢酸鉛(PbAc)による骨量減少の検出を目指した。ゼブラフィッシュの胚は、受精後2〜120時間の間に一連のPbAc濃度(0、5、10、20 mg / L)で処理されました。受精後9日目の幼虫に対してホールマウント骨格染色を行い、ImageJソフトウェアを用いて総染色面積を定量した。その結果、石灰化組織は赤色に染色され、PbAc曝露群では染色面積が有意に減少し、骨の石灰化が用量依存的に変化することが示されました。この論文は、PbAc誘発骨欠損の骨格変化を調査するための染色プロトコルを提示します。この方法は、他の化学物質によって誘発される骨量減少の検出のためにゼブラフィッシュ幼虫においても使用することができる。
Introduction
最近の研究では、グルココルチコイド、アロマターゼ阻害剤、および過度のアルコール摂取による骨粗鬆症が一般的であることが確認されています1,2。鉛(Pb)は、植物、土壌、水生環境に見られる有毒金属です3。Pbの人体への悪影響が注目されていますが、骨への不可逆的な影響についてはさらに調査する必要があります。鉛中毒は、発達中の骨格と成人の骨格の両方に多様な病理学的変化を引き起こし、通常の生活活動に影響を及ぼします。研究によると、慢性的なPb曝露と骨損傷4との関連が見出されており、骨構造の障害5,6、骨塩密度の低下、さらには骨粗鬆症のリスクの増加などが含まれます7。
石灰化組織は骨強度8にとって非常に重要であり、骨石灰化マトリックス沈着は骨形成の重要な指標です9。アリザリンレッドはカルシウムイオンとの親和性が高く、アリザリンレッド染色は骨形成を評価するための標準的な手順です10。この方法によれば、石灰化組織は赤く染色されますが、他のすべての組織は透明なままです。次いで、染色された領域は、デジタル画像解析11によって定量化される。
ゼブラフィッシュは、創薬モデルや疾患モデルで広く用いられている重要なモデル生物です。ゼブラフィッシュとヒトの遺伝学的研究は、分子レベルで骨格形態形成の根底にあるメカニズムの類似性を示しています12。さらに、ハイスループットの薬物または生体分子スクリーニングは、マウスモデルよりもゼブラフィッシュの大きなクラッチでより実行可能であり、骨形成促進分子または骨毒性分子の機構的研究を容易にします13。 toto10 の骨格の鑑別染色は、小型脊椎動物および哺乳類胎児の骨格異形成の研究に頻繁に使用されます。アリザリン赤色染色は、ゼブラフィッシュ幼虫における化学物質の骨発生毒性を調べるために実施されました。本明細書では、ゼブラフィッシュ幼虫における酢酸鉛誘発骨欠損を検出するためのプロトコルを記載するために、例として鉛を用いた。
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Protocol
ここで概説されているすべての動物の手順は、東呉大学の倫理委員会の動物管理研究所によってレビューおよび承認されています。
1.魚の飼育と胚の収集14
- 毎日3回魚に餌をやる。ゼブラフィッシュが28.5 ± 0.5°Cに維持され、14:10時間の明暗サイクルがあることを確認します。
- 夕方には、産卵タンクの隔離ボードでオスとメスの成魚を2:1のオスとメスの比率で分離します。
- 翌朝、午前9:00に隔離ボードを取り外し、2時間後に胚を採取します。
- 実験前に28.5°Cに維持した生化学的インキュベーターに胚を置きます。
2.化学物質への暴露
- マザーストックを調製します:酢酸鉛三水和物(5 g)を量り、攪拌しながら超純水(50 mL)に溶解します。
注意: PbAcは有毒です。適切な防塵マスク、防護服、手袋を着用してください。ドラフトの下で実験を行います。 - ゼブラフィッシュの胚を選択し、きれいな6ウェルプレートにランダムに分配します(3 mLのゼブラフィッシュ繁殖水中のウェルあたり30個の胚;その組成については 表1 を参照してください)。受精後2〜120時間(hpf)で胚をPbAc(0、5、10、20 mg / L)で処理します。
注:PbAcの濃度は、用量範囲測定実験に従って選択されました。結果は、ゼブラフィッシュ胚の酢酸鉛のLC50が120 hpfで41.044 mg / Lであることを示しました。したがって、最高濃度はLC50 の半分に設定し、一連の溶液を2倍希釈して調製した。 - 受精後5日から1日2回幼虫に餌をやる(dpf)。ゼブラフィッシュの胚を28.5 ± 0.5°Cに維持し、14:10時間の明暗サイクルで維持します。
- 鉛フリー培地(ゼブラフィッシュ飼育水)を24時間ごとに9dpfまでリフレッシュします。
注:実験が完了すると、すべての鉛含有溶液が指定された液体タンクに注がれ、実験管理センターによって処理されました。
3.アリザリン赤染色
注意: 染色プロセス全体を通して、適切な防塵マスク、保護服、および手袋を着用してください。全ての溶液の組成を 表1に示す。
- 特定の染色ステップ
注:染色プロセスは、室温で24ウェルプレートで実施しました。各溶液を添加した後、低速に設定した振とう台の上に24ウェルプレートを置きます。- 各グループから10匹のゼブラフィッシュの幼虫を9 dpfでランダムに取り除き、魚を1 mLの2%パラホルムアルデヒド/ 1xリン酸緩衝生理食塩水に2時間固定します。
- 溶液をデカントし、ゼブラフィッシュの幼虫を100 mM Tris-HCl(pH 7.5)/10 mM MgCl2 で10分間洗浄します。
- 溶液をデカントし、脱色のために次の溶液で幼虫をそれぞれ5分間インキュベートします:無水エタノール(EtOH)溶液(80%EtOH / 100 mMトリス塩酸塩(pH 7.5)/ 10 mM MgCl2、50%EtOH / 100 mMトリス塩酸l(pH = 7.5)、および25%EtOH / 100mMトリス塩酸l(pH = 7.5)。
- 溶液をデカントし、3%H2O2と0.5%KOHからなる溶液で漂白して顔料を除去し、顔料が完全に除去されるまで10分に1回観察する。
- ゼブラフィッシュの幼虫を25%グリセリン/ 0.1%KOHで泡がなくなるまでそれぞれ10分間数回すすぎます。
注意: 気泡を避けることが重要です。さもなければ、ゼブラフィッシュの体の泡は顕微鏡の下で黒い視野として現れるでしょう、そしてそれは観察と定量分析に影響を与えるでしょう。 - 1mLの0.01%アリザリンに50分間浸して幼虫を染色する。
- 溶液をデカントし、1mLの50%グリセリン/ 0.1%KOHを10分間加えてバックグラウンドをクリアします。その後の観察のために、魚を新鮮な50%グリセリン/ 0.1%KOHに保管します。
4. 画像取得
- 毎回1匹の幼虫をスライドガラスに移し、幼虫を液滴の中央に保ちます。
- 実体顕微鏡で幼虫を観察する。
- カメラの電源を入れ、ソフトウェアを開き( 材料表を参照)、デフォルト設定のままにします。
- AEをクリックし、最適な画像を得るために適切な露光時間(この実験では60ミリ秒)を選択します。
- 同じ設定ですべての画像をキャプチャします。後で分析できるように.tif形式で画像を保存します。
5. 画像解析
注:画像分析用のサンプルグラフのセットの例については、 補足ファイル を参照してください。
- ImageJアイコンをダブルクリックし、手順4.5で保存した画像を解析します。
- ファイルをクリック |[開く ] をクリックして、手順 4.5 で保存した画像を開きます。
- 画像をクリック |タイプで [8 ビット] を選択します。
- [編集]をクリックします |反転。
- [ 分析]をクリックします|キャリブレーションし、ポップアップインターフェイスで[ 未キャリブレーションOD ]を選択し、下部インターフェイスの左下にある [グローバルキャリブレーション ]をチェックして、[ OK]をクリックします。
- [ 分析]をクリックします|縮尺を設定する |ポップアップインターフェイスでスケールを削除してクリック し、下の [グローバル ]をチェックして、[ OK]をクリックします。
- [分析]をクリックします|[測定値]を設定し、ポップアップインターフェイスでアイテム領域を選択し、[制限しきい値]を以下のチェックボックスをオンにして(選択した範囲のみを測定します)、[OK]をクリックします。
- 画像をクリック |調整|しきい値、ポップアップインターフェイスの中央にあるスライダーをスライドさせて適切なしきい値を選択し(各画像のしきい値を変更)、1つの画像でテストするすべてのターゲットが選択されるようにし、[ 設定]をクリックします。
- [ 分析]をクリックします|測定します。各グループの日付を記録します。
- 一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較検定を使用して差を分析し、有意水準を p <0.001(***)に設定します。
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Representative Results
アリザリン赤色染色は、ゼブラフィッシュ幼虫の骨石灰化の変化を測定するための高感度で特異的な方法です。本研究では、PbAcがゼブラフィッシュ幼生に、死亡、奇形、心拍数の低下、体長短縮などの悪影響があることを観察しました。さらに、ゼブラフィッシュ幼生のミネラル骨格領域を評価し、PbAc誘発性骨量減少を調べた。9 dpf(図1A)では、副蝶形骨(PS)、オペクル(OP)、角鰓(CB)、脊索(NC)など、頭骨格の多くの骨が石灰化しているため、赤色に染色されます。対照的に、耳石(OT)(非骨構造)は赤ではなく茶色がかった黒に見えます。デジタル分析は、各画像における総染色面積を定量化するために実施された。対照群と比較して、10および20 mg/L PbAcで処理された酢酸鉛群は、染色領域で有意な減少(p < 0.001)を示しました(図1B)。骨石灰化の変化は用量依存性を示した。
図1:ゼブラフィッシュ幼虫の頭蓋骨に対する異なる濃度のPbAcの影響 。 (A)9dpfの幼虫のアリザリンレッドで染色された頭骨の背側の画像。石灰化した組織は赤く染まっています。スケールバー= 0.5 mm。 (B)9 dpfでの相対的な鉱化面積の変化。グループあたり10匹の幼虫。データはSEM±平均値として表されます。3回の反復を行った。 p < 0.001 ***.略語:PS =パラスフェノイド;OP = オペラ;OT =耳石;CB =角鰓状;NC = 脊索;dpf =受精後の日数。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 解決 | 組成 | |
| ゼブラフィッシュ飼育水 | pH 7-7.3, 27-29 °C, 導電率 450-550 μs, 塩分 0.25-0.75 %0, 溶存酸素 >6 mg/L, 日長 14/10 h, 硬度 100-200 mg/L, 塩素 0 mg/L, アンモニア態窒素濃度 <0.02 mg/L, 亜硝酸塩 <1 mg/L, 硝酸塩 <50 mg/L, 二酸化炭素 <50 mg/L | |
| 2%パラホルムアルデヒドと1x PBSの混合溶液(50 mL) | 25 mLの4%パラホルムアルデヒド、5 mLの10x PBSバッファー、および二重蒸留水(ddH2O)q.s.から50 mL | |
| 100 mM トリス塩酸塩(pH 7.5)と10 mM MgCl2の混合溶液(50 mL) | 5 mL の 1 M トリス塩酸塩 (pH=7.5)、0.5 mL の 1 M MgCl 2、および ddH2 O q.s. から 50mL | |
| 80%無水エタノール、10 mM MgCl2、および100 mM トリス塩酸塩(pH=7.5)の混合溶液(50 mL) | 42.1 mL の 95% 無水エタノール、5 mL の 1 M トリス塩酸塩 (pH=7.5)、0.5 mL の 1 M MgCl 2、および ddH2 O q.s. から 50 mL | |
| 50%無水エタノールと100 mMトリス塩酸塩の混合溶液(50 mL)(pH=7.5) | 26.3 mL の 95% 無水エタノール、5 mL の 1 M トリス塩酸塩 (pH=7.5)、および ddH2O q.s. から 50 mL | |
| 25%無水エタノールと100 mMトリス塩酸塩の混合溶液(50 mL)(pH=7.5) | 13.2 mL の 95% 無水エタノール、5 mL の 1 M トリス塩酸塩 (pH=7.5)、および ddH2O q.s. から 50 mL | |
| 3%H2O2溶液と0.5%KOH溶液の混合溶液 | 使用前に等量の6%H2 O2と1%KOHを混合 | |
| 25%グリセリンと0.1%KOHの混合溶液(50 mL) | 12.5 mLの100%グリセリン、0.25 mLの20%KOH、およびddH2Oq.s.から50mL | |
| 0.01%アリザリン(50 mL) | 1 mLの0.5%アリザリン、12.5 mLの100%グリセリン、5 mLの1 M Tris-HCl(pH=7.5)、およびddH2Oq.s.から50 mL | |
| 50%グリセリンと0.1%KOHの混合溶液(50mL) | 25 mLの100%グリセリン、0.25 mLの20%KOH、およびddH2Oq.s.から50 mL | |
表1:アリザリン赤色染色プロトコルで使用される溶液の組成。 略語:q.s. =十分な量子(必要に応じて)。
補足ファイル: 画像解析用のサンプル グラフのセット。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ゼブラフィッシュは骨代謝疾患の研究に適したモデルです。げっ歯類モデルと比較して、ゼブラフィッシュモデルは比較的迅速に確立でき、病気の重症度の測定が容易です。野生型ゼブラフィッシュ幼生では、頭部骨格の石灰化作用は5 dpfで、軸骨格の石灰化は7 dpf15で起こる。したがって、PS、OP、CB、NCなどの頭蓋骨は9dpfでよく発達しています。幼虫を完全に脱染色して漂白した後、軟部組織が除去され、魚体の外観が透明になりました。アリザリンレッド染色試薬を添加して、ゼブラフィッシュのミネラルボーンを赤色で染色および視覚化しました。
この実験で信頼できる実験的結論を得るためには、画像解析が重要です。姿勢が良く、背景がきれいなゼブラフィッシュの写真を選択して定量分析しました。1枚の画像の染色面積を数値化すると、1匹の魚の赤く染まった石灰化した骨がすべて計算されます。したがって、鉛曝露群と対照群の間の骨量の変化を比較することができます。本研究では、PbAc曝露はゼブラフィッシュの発生毒性を引き起こし、ミネラル骨の染色面積の有意な減少が9dpfで10および20 mg/LのPbAc曝露群で観察されました。したがって、PbAcへの初期の胚曝露は、ゼブラフィッシュ幼虫の骨量を減らしました。 図1 は、ゼブラフィッシュ幼生におけるアリザリンレッド染色によって可視化されたPbAc誘発性骨量減少を示す。
石灰化マトリックスに結合する色素は、骨格全体を標識するために使用されます。カルセインは、生体組織中のカルシウムにも特異的に結合できる蛍光発色団であり、骨構造の標識や骨成長の研究に使用されています10。カルセインとは異なり、固定組織のアリザリン赤色染色は、いくつかの標本の比較を容易にすることができる骨格変化の永久記録を生成する。マイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)は、一連の2D X線を取得することにより、石灰化組織の正確な定量分析を提供できます。しかし、ゼブラフィッシュのサイズが小さく、発達中のゼブラフィッシュ骨格の骨の多くが薄いため、マイクロCT分析ツールはこれらの骨を正確に特徴付けることができません16。
蛍光トランスジェニックレポーターラインは、生きた幼虫やさらに成熟した魚の骨格発達をリアルタイムで視覚化するのにも役立ちます17。同様に、アリザリンレッドS インビボ 染色は、生きた魚の評価および奇形の連続追跡を可能にする18。したがって、アリザリン赤色染色は、ゼブラフィッシュ幼虫の骨量減少を分析するための有用で費用効果の高い方法です。ただし、実験ステップの複雑さと使用される溶液の数のために、アリザリン赤染色画像の分析の最終結果は実験操作によって影響を受ける可能性があります。さらに、成体のゼブラフィッシュには、体容積と軟部組織の増加のためにこの染色法を使用することは困難である。マイクロCT分析またはトランスジェニック株は、成体ゼブラフィッシュの骨格イメージングに適しています。要約すると、ここに提示されたプロトコルは、化学毒物曝露後のゼブラフィッシュ幼虫の骨石灰化の変化を研究するために使用できます。この手順は、骨疾患を研究し、新しい治療薬を開発するためのゼブラフィッシュモデルを確立するのに役立つ可能性があります。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(81872646; 81811540034; 81573173)および江蘇省高等教育機関の優先学術プログラム開発(PAPD)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
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