Summary
Her beskriver vi en enkel og reproduserbar metode som kan indusere hjerteinfarkt eller myokardiskemi-reperfusjonsskade hos mus ved presisjonsligering av venstre fremre nedadgående koronararterie gjennom mikromanipulasjon.
Abstract
Akutt hjerteinfarkt er en vanlig hjerte- og karsykdom med høy dødelighet. Myokardreperfusjonsskade kan motvirke de gunstige effektene av hjertereflow og indusere sekundær myokardskade. En enkel og reproduserbar modell for hjerteinfarkt og myokardiskemi-reperfusjonsskade er et godt verktøy for forskere. Her beskrives en tilpassbar metode for å lage en myokardinfarkt (MI) modell og MIRI ved presisjonsligering av venstre fremre synkende koronararterie (LAD) gjennom mikromanipulasjon. Nøyaktig og reproduserbar ligaturposisjonering av LAD bidrar til å oppnå konsistente resultater for hjerteskade. ST-segmentendringer kan bidra til å identifisere modellens nøyaktighet. Serumnivået av hjertetroponin T (cTnT) brukes til å vurdere myokardskaden, hjerteultralyd brukes til å evaluere myokardial systolisk funksjon, og Evans-Blue / trifenyltetrazoliumkloridfarging brukes til å måle infarktstørrelse. Generelt reduserer denne protokollen prosedyrens varighet, sikrer kontrollerbar infarktstørrelse og forbedrer musens overlevelse.
Introduction
Akutt hjerteinfarkt (AMI) er en vanlig hjerte- og karsykdom på verdensbasis og bærer høy dødelighet1. Fremskritt innen teknologi gjør tidlig og effektiv revaskularisering tilgjengelig for AMI-pasienter. Etter disse behandlingene hos noen pasienter kan myokardiskemi-reperfusjonsskade (MIRI) forekomme2. Det er derfor av stor betydning å forstå virkningsmekanismene og hvordan man kan forbedre MI/MIRI. Mus er mye brukt som modeller på grunn av deres lave kostnader, raske avlstid og letthet for å gjøre genetiske endringer3. Forskere har utviklet forskjellige metoder for å modellere MIRI og MI i dyr 4,5,6,7,8,9. Denne strategien fremmer forskning, men de ulike kriteriene og metodene som brukes, kompliserer tolkningen av resultater blant forskerteam.
Hos mus har MI blitt indusert av isoproterenol10, kryoskade 11,12 eller cauterization13. MI kan lett induseres av isoproterenol, men den patofysiologiske prosessen er forskjellig fra den i klinisk MI. Kryoskadeindusert MI har dårlig konsistens, fremkaller overdreven myokardskade rundt venstre fremre nedadgående koronararterie (LAD), og kan lett indusere arytmi. Cauterization-indusert MI er ganske forskjellig fra den naturlige prosessen med hjerteinfarkt, og den inflammatoriske reaksjonen i det brennende området er mer intens; I tillegg har den kirurgiske tilnærmingen tekniske vanskeligheter. Videre er det noen laboratorier14 som utvikler MI-modell hos minigriser ved hjelp av ballongblokkering eller embolisering eller trombosemetode gjennom intervensjonsteknikk. Alle disse metodene kan forårsake okklusjon av kranspulsårene direkte, men å trenge koronar angiografi-enheter og fremfor alt de altfor tynne musekoronararteriene gjør at disse operasjonene ikke er praktiske. For MIRI var forskjellene mellom ulike modeller ganske beskjedne, for eksempel bruk av respirator/mikromanipulasjon eller ikke 5,6.
Her beskrives en enkel og pålitelig metode som kan indusere MI og MIRI-modellen, tilpasset fra tidligere publiserte metoder 4,5,6,7,8,9,15. Denne metoden kan simulere patofysiologiske prosesser ved direkte blokkering av LAD gjennom ligering. Videre, ved å lindre ligeringen, kan denne modellen også simulere reperfusjonsskade. I denne protokollen brukes et dissekerende mikroskop for LAD-visualisering. Deretter kan forskeren enkelt identifisere LAD. Deretter fører nøyaktig ligering av LAD til reproduserbar og forutsigbar blodokklusjon og ventrikulær iskemi. Videre kan elektrokardiografi (EKG) endringer brukes til å bekrefte iskemi og reperfusjon i tillegg til fargeendringene i LAD observert under et mikroskop. Denne strategien fører til kortere prosedyrevarighet, lavere risiko for kirurgiske komplikasjoner og færre eksperimentelle mus som trengs. Metodene for troponin-T-testen, hjerte ultralyd og trifenyltetrazoliumklorid (TTC) farging er også beskrevet. Samlet sett er denne protokollen nyttig for studier av MI/MIR-mekanismen, så vel som for oppdagelse av legemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrestudier er godkjent av Animal Care and Utilization Committee ved Huazhong University of Science and Technology (Wuhan, Kina).
MERK: Hannmus C57BL/6J (8-10 uker) brukes som modeller. Mus har fri tilgang til mat og vann og er avlet i spesifikke patogenfrie forhold. Rommet holdes under kontrollert temperatur (22 °C ± 2 °C) og fuktighet (45 %-65 %). Mus blir utsatt for et 12-timers lys / mørkt miljø på Animal Care Facility of Tongji Medical School (Wuhan, Kina) i henhold til retningslinjene fastsatt av denne institusjonen. Bruk sterile mikrokirurgiske instrumenter og kirurgiske forsyninger. Kirurgiske hansker og masker kreves gjennom hele prosedyren. Den eksperimentelle arbeidsflyten er vist i figur 1A.
1. Preoperativ forberedelse
- Bruk rektangulært operasjonsbord (OT) med forvarmet varmepute (37 °C) under hele operasjonsprosedyren (figur 1B). Desinfiser brettet med ultrafiolett lys og 70% alkohol før prosedyren starter.
- Vei alle musene nøyaktig for å beregne dosen av bedøvelsesmidler som trengs. Deretter bedøves musene med ketamin (80 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) via intraperitoneal injeksjon. Sørg for passende dybde av anestesi ved fravær av en tilbaketrekningsrefleks til tåklemming og blinkreflekser.
- Plasser musen liggende på OT med gasbind under hodet for å unngå overoppheting av øynene. Påfør oftalmisk salve på øynene for å forhindre at de tørker ut.
- Barber pelsen på venstre prekordialbryst med en elektrisk barberhøvel. Bruk en pelsfjerningskrem på den ferdigbarberte brystkassen og masser jevnt med en steril bomullspinne i ~1 min. Tørk overflødig løs pels med gasbind.
- Bruk povidon-jod, etterfulgt av 70% alkohol for å rengjøre området. Dekk thoraxen med gasbind.
- Bruk en 4-0 sutur under de øvre fortennene og fest den til ankerpunktet (nær kanten av OT over nesen) for å holde munnen litt åpen og lette kanylering.
- Trekk halen for å holde kroppen rett, og fest halen til OT ved hjelp av tape. Fest de fire lemmene og stram dem på de andre ankerpunktene. Det er viktig at du ikke strekker de fremre lemmene for mye; Ellers kan det oppstå respiratorisk kompromiss.
- Bruk buet tang og tang for å åpne kjeven og løfte tungen. Bruk en belysning for å tydelig visualisere halsen og glottis.
- Sett en 22-G kanyle forsiktig med en stump og avkortet nål inn i luftrøret gjennom munnen ~ 1 cm ned i halsen. Bruk den ene hånden til å holde tungen, flytt den litt oppover med butt tang, og bruk samtidig den andre hånden til å forsiktig sette røret inn i luftrøret. Vær forsiktig så du ikke setter røret inn i spiserøret.
- Fjern kanylen forsiktig. Kontroller intubasjonen ved å plassere slangen i vannet slik at bobler dannes før du kobler til ventilatoren.
- Koble endotrakealrøret til en ventilator satt til 120/min og tidalvolumet justert til 250 μL.
MERK: Respiratorinnstillingen justeres etter kroppsvekt (generelt krever høyere kroppsvekt et høyere tidalvolum). - Verifiser intubasjon ved å sjekke bilateral symmetrisk brystekspansjon. Deretter festes tilkoblingen til OT med tape for å unngå at røret faller av.
- Plasser EKG-elektroder på potene og koble dem til EKG-opptakeren. Overvåk hjertets elektrofysiologi gjennom hele prosedyren.
2. Toraktomi
- Fjern gasbindet på thoraxen. Desinfiser igjen med 70% alkohol for snittområdene ved hjelp av tre skrubbesykluser. Deretter dekker musen med en steril kirurgisk drapering med et hull over det kirurgiske feltet for å redusere forurensning av operasjonsstedet.
- Lag et skrå hudsnitt (0,8-1,0 cm) langs venstre midtklavikulære linje med en steril skalpell.
- Utfør stump disseksjon av subkutant vev for å eksponere ribbeina under. Vær forsiktig så du ikke skader kar, ribber og lunger. Stopp blødningen ved å bruke sterile bomullsapplikatorer.
- Identifiser og gjør et snitt på ca 6-8 mm i det tredje interkostalrommet. Deretter utfører stump disseksjon av vev i kystrommet for å åpne brysthulen. Vær forsiktig så du ikke skader den indre thoraxarterien.
- Bruk tang til å spenne over interkostalrommet. Sett inn forhåndssteriliserte hjemmelagde tilbaketrekkere (figur 1C) i ribbeholderen og trekk tilbake for å spre snittet til ~ 6 mm i bredden. Fest tilbaketrekkerne til OT med gummibånd.
- Fjern det omkringliggende vevet forsiktig for å eksponere hjertet fullt ut. Trekk av perikardiet forsiktig med buede tang uten å skade hjertet. Nå er et klart syn på hjertet tilgjengelig.
3. LAD ligering
MERK: LAD vises som en tynn rød linje som går vinkelrett fra nær toppunktet og ned gjennom venstre ventrikkel. LAD er lys rød farge, så vær forsiktig så du ikke tar feil av den for en blodåre. Vanligvis er ligeringsstedet ~ 1-2 mm under venstre auricle. Denne ligeringsposisjonen vil produsere ca 40% -50% av iskemien i venstre ventrikel. En høyere posisjon vil skape en mer omfattende infarktsone. Et mer distalt sted vil skape en mindre infarktsone.
- Bruk et dissekerende mikroskop og rett et fokusert og passende lys for LAD-visualisering. Trykk forsiktig på stedet under den valgte ligeringsposisjonen for å forstørre LAD midlertidig (≤5 s per gang). Sjekk LAD på nytt på denne måten.
- Bruk en konisk nål (3/8, 2,5 x 5) for å passere en 8-0 silke ligatur under LAD under et dissekerende mikroskop. Vær forsiktig med nåldybden: ikke for dypt til å gå inn i venstre ventrikkel og ikke for grunt for å unngå å skade LAD.
- Bind ligaturen med en løs dobbeltknute. Sløyfediameteren er ca. 2-3 mm.
- Plasser en 2-3 mm PE-10-slange i en sløyfe parallelt med arterien.
- Stram ligatursløyfen forsiktig til den er rundt arterien og slangen. Fest deretter løkken med en slipknot. Pass på at du ikke skader myokardveggen med overdreven tiltrekkingstrykk.
MERK: Ligering utføres ikke for sham-operasjonsgruppen. - Bekreft opphør av blodstrømmen i LAD: observer en blekere farge i LVs fremre vegg etter ligering. I tillegg indikerer signifikant ST-elevasjon innen noen få hjerteslag også okklusjon16. Hvis permanent ligering er nødvendig (f.eks. MI), fjern PE-10-slangen og bind LAD direkte med en knute. Fortsett den gjenværende prosedyren som nevnt i trinn 4.3 nedenfor.
- Fjern retractorene fra snittet. Lukk deretter såret midlertidig med en bulldogklemme. Iskemi varighet er i henhold til eksperimentell design. Kontroller at musen fortsatt er koblet til ventilatoren.
4. Reperfusjon
- Når iskemiperioden avsluttes, fjern bulldogklemmen og sett inn retractorene igjen for å åpne snittet og avsløre hjertet (spesielt ligeringsstedet).
- Løsne slipknot og fjern PE-10-slangen. Bekreft restaureringen av blodstrømmen i dette trinnet ved å observere fargeendringen tilbake til rosa-rød innen 20 s. Se samtidig EKG nøye: en potensiell oppløsning av ST-elevasjon antyder også reperfusjon.
- La 8-0 stå ligatur in situ for påfølgende Evans-Blue og TTC farging. I andre tilfeller, fjern suturen på dette trinnet.
- Fjern tilbaketrekkerne og lukk snittet ved å suturere den tredje og fjerde ribben med en 4-0 nylonsutur. Vær forsiktig så du ikke skader lungen. Skyv ut luften som kan være fanget i brysthulen ved å trykke brystet forsiktig mens du knytter suturknutene.
- Lukk muskellagene med kontinuerlige suturer. Lukk huden med en 4-0 nylonsutur; Kontinuerlige suturer og avbrutte suturer er akseptable.
5. Postoperativ behandling
- Følg musen nøye for tegn på utvinning fra anestesi, for eksempel bevegelse av halen eller whiskers. Etter det gjenopptar musen vanligvis et normalt pustemønster med en respirasjonsfrekvens på rundt 150 bpm. Ekstuber musen ved å fjerne røret sakte.
- Overvåk musen i ytterligere 3-5 minutter for å sikre at åndedrettsstress er fraværende.
- Administrer 100 mikrol buprenorfin (0,1 mg/ml, s.c.) etter at musen begynner å puste. For de neste 24 timene, gi en ekstra dose hver 4-6 timer. Gi ibuprofen som ekstra smertelindring i drikkevann som en 0,2 mg / ml løsning i 2 dager før og ≤7 dager etter operasjonen.
- Hold musene varme og reduser dødelighetsrisikoen ved å bruke varmeisolasjonstepper, da mus er utsatt for hypotermi etter anestesien.
6. Validering etter prosedyren
- Troponin-T test
- Samle blodprøver fra retroorbitale plexuser og isoler serumene ved sentrifugering (3000 × g, 10 min, romtemperatur).
- Fortynn 20 μL serum til 100 μL med saltoppløsning for troponin-T-testen. Oppbevar resten av prøvene ved -80 °C.
- Oppdag Troponin T (cTnT ved hjelp av et kommersielt sett i henhold til produsentens instruksjoner.
- Hjerte ultralyd
MERK: Hjerte ultralyd brukes til å evaluere hjertefunksjon og veggbevegelsesavvik på forskjellige stadier før og etter operasjonen i henhold til eksperimentell design17,18. Ulike parametere som ventrikkelveggtykkelse, ventrikkelvolum, ventrikkelhulediameter, ejeksjonsfraksjon og kortakseforkortelsesfraksjon måles.- Bedøv musene med ketamin (80 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) via intraperitoneal injeksjon.
- Barber brystet med en elektrisk barberhøvel. Bruk pelsfjerningskrem og masser jevnt. Tørk overflødig løs pels med gasbind.
- Plasser musen på OT og fest de fire lemmene med tape.
- Plasser ultralydsonden (30 MHz) på den fremre delen av hjertet ved ~ 30 ° til brystbenet. Sonden i denne visningen er justert med hjertets lange akse. Sett ultralydet i B-modus; Venstre ventrikkel, venstre atrium, mitralventil og stigende aorta kan identifiseres tydelig. Bruk videoopptak for å hente data for senere analyse.
- Ved å rotere transduseren 90 ° med klokken, få en parasternal kortaksevisning på nivået av papillærmusklene for å tydelig oppdage venstre og høyre ventrikkel. Bruk deretter B-modus og M-modus for å vurdere hjertefunksjon og morfometri.
- Beregn venstre ventrikkels endediastoliske diameter (Dd), endesystolisk diameter (Ds) og interventrikulær septumtykkelse ved å spesifisere tilsvarende plassering i ultralydbildene.
MERK: Maskinen vil manuelt beregne venstre ventrikkel endediastolisk volum (LVEDV) og end-systolisk volum (LVESV). Maskinen vil også beregne verdiene for brøkforkortelse (FS) og ejeksjonsfraksjon (EF) ved hjelp av formlene FS = (Dd-Ds) / Dd × 100% og EF = (LVEDV-LVESV) / LVEDV × 100%. Velg fem påfølgende hjertesykluser og få middelverdiene.
- Måling av hjerteinfarktstørrelse
MERK: Evans-Blue / TTC-farging brukes til å måle infarktstørrelsen fordi den kan evaluere vevets levedyktighet19. Det anbefales å flekke innen 72 timer etter reperfusjon fordi arret vil krympe. Dette trinnet utføres etter avliving av dyret med 200 mg/kg pentobarbitalnatrium via intraperitoneal injeksjon.- Eksponer hjertet igjen ved å følge de tidligere prosedyrene fra trinn 2.2-2.5. Deretter re-ligate LAD på det opprinnelige stedet validert av suturen nevnt i trinn 4.3 på slutten av ønsket reperfusjonsvarighet.
- Kanylere aorta og deretter perfusere hjertet med 0,3 ml 1% Evans Blue løsning. Myokardiet i den ikke-iskemiske regionen er farget blå. Etter perfusjon, fjern hjertet raskt ved å kutte aorta med saks.
- Vask deretter hjertet i KCl-oppløsning (30 mM) for å hindre at hjertet slår. Oppbevares ved -20 °C i ≥4 timer etter fjerning av omkringliggende fettvev.
- Skjær hjertet i tverrretningen i fem skiver med tykkelse 1 mm ved hjelp av en skarp skalpell. Vei skivene og rug dem deretter med 2 % TTC i 40 minutter ved 37 °C.
MERK: Etter inkubasjonen avgrenses infarktområdene som hvite, mens levedyktige vev i ikke-infarktområder forblir røde. - Fest skivene med 4% formaldehyd over natten.
MERK: Denne handlingen vil øke kontrasten mellom infarktområdet og ikke-infarktområdet. Det vil også krympe skivene. - Fotografer skivene med et digitalkamera. Deretter beregner du området i fare (AAR), infarktområdet og ikke-iskemisk sone ved hjelp av grafikkprogramvare.
MERK: Etter Evans-Blue/TTC dobbeltfarging er det blå området det "normale" området. De resterende områdene (inkludert hvite og røde) er "iskemirisiko" -områdene: det hvite området er hjerteinfarktområdet (IA), og det røde området er det iskemiske (men ikke infarkte) området. Ved å ta hensyn til inkonsekvensen av størrelser på hjerteskiver, blir resultatene justert for vekt.
Tildele:
A1-A5 for Areal av infarktsone / Område av hjerteskiven;
B1-B5 for Areal av ikke-infarkt sone / Område av hjerteskiven;
W1-W5 for Vekt av hjerteskiven.
Da:
Total vekt av infarkt myokard: W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5;
Totalvekt av ikke-infarkt myokard: W1 × B1 + W2 × B2 + W3 × B3 + W4 × B4+ W5 × B5;
Totalvekt av AAR = (W1 + W2 +W3 + W4 + W5) - (W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5)
Endelig:
Området for myokardiskemi beregnes som prosentandelen av AAR i venstre ventrikel:
Området for hjerteinfarkt beregnes som prosentandelen av IA i AAR:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den eksperimentelle arbeidsflyten er vist i figur 1A. Forskeren kan planlegge tidsnodene i henhold til eksperimentelt design ved studiestart. Varigheten av LAD ligering er i henhold til forskningsformålet. For MI kan forskningen ignorere reperfusjonstrinnet. Hjerte ultralyd er tilgjengelig på ulike stadier av studien fordi den er ikke-invasiv, mens Evans-Blue / TTC-farging kun kan utføres når musen ofres. For forskning som fokuserer på fibrose og ventrikulær remodellering, er observasjonstiden mye lengre.
De typiske bildene for deler av forsøksprosessen er vist i figur 2A, fra endotrakeal intubasjon, hudsnitt, torakotomi, LAD-identifisering, LAD-ligering til reperfusjon. For å verifisere myokardiskemi og reperfusjon er de representative EKG-bildene med signifikant ST-elevasjon etter ligering og oppløsning av ST-elevasjon når slipknuten er løsnet, vist i figur 2B.
Etter å ha tatt blodprøver fra alle mus, kan troponin-T-testen utføres for å validere infarkt. Figur 3A viser en signifikant økning av cTnT i MIRI- og MI-grupper sammenlignet med simuleringsgruppene. Figur 3B viser dobbeltfarging av Evans-Blue og TTC for fem påfølgende tverrsnitt av hjertet mellom humbuggruppen og MIRI-gruppen. Det blå området antyder det normale området, det hvite området antyder hjerteinfarktområdet, og det røde området antyder det iskemiske, men ikke infarkterte området. Figur 3C representerer langaksebildene av hjerteultralyd mellom simuleringsgruppen og MI-gruppen. Programvare kan brukes til å beregne forskjellige funksjonelle parametere, for eksempel en høyere verdi av ejeksjonsfraksjon for simuleringsgruppen i figur 3C sammenlignet med den i MI-gruppen.
Figur 1 Kirurgisk oppsett. (A) Oversikt over den eksperimentelle tidslinjen. (B) Operasjonsbord med forvarmet varmepute og tilkobling for EKG-elektroder. (C) Hjemmelagde retractors. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksperimentell prosess og EKG-forandringer. (A)Bilder av endotrakeal intubasjon, hudsnitt, torakotomi, LAD-identifikasjon, LAD-ligering og reperfusjon er vist i henholdsvis 1, 2, 3, 4, 5 og 6. (B) Typiske EKG-bilder av MI og MIRI etter ligering og reperfusjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Validering etter prosedyren. (A) Ekspresjon av hjertetroponin blant humbug, MIRI 24 h og MI 3 d grupper. (B) Evans -Blå / TTC dobbeltfarging for humbug og MIRI 24 h grupper. (C) Hjerteultralyd for humbug og MI-grupper. LVID; d, endediastolisk venstre ventrikulær indre dimensjon; LVID; s, systolisk venstre ventrikulær indre dimensjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De siste årene har etableringen av modeller for MI og MIRI i klinisk og vitenskapelig forskning utviklet seg raskt20,21. Imidlertid er det fortsatt noen spørsmål, for eksempel handlingsmekanismer og hvordan man kan forbedre MI/MIRI, som må løses. Her beskrives en modifisert protokoll for etablering av en murinmodell av MI og MIRI. Flere sentrale punkter må vurderes nøye.
Det første hovedpunktet er endotrakeal intubasjon. Noen prosedyrer6,9 involverer snitt av livmorhalshuden, vevseparasjon, etterfulgt av eksponering av sternohyoideusmuskelen for å se luftrøret. På den måten kan forskeren visualisere rørinnsetting i luftrøret. Dette er et godt skritt for å redusere risikoen for åndedrettsstress. I dagens metode kan forskeren tydelig visualisere glottisens lukking og åpning med å puste under en belysning og deretter enkelt sette røret inn i luftrøret. Derfor er et cervikal snitt ikke laget for å redusere hudtrauma og potensielle infeksjoner, noe som er viktig i forskning på inflammatorisk signalering. Visuelle laryngoskoper brukes mye i klinisk trakeal intubasjon: kanskje de også kan brukes til mus. Mares et al.22 rapporterte kontinuerlig maskeinhalasjonsanestesi uten endotrakeal intubasjon, som ble utført ved 2 % inhalasjon av isofluran etter 5 % isofluraninduksjon med oksygen administrert gjennom en ikke-invasiv maske plassert over nese og munn hos dyret. Det kan unngå vevskader og forbedre sikkerheten og effektiviteten av anestesi. Imidlertid er det nødvendig med en spesiell anestesimaskin for innånding. Videre kan flyktige anestetika forårsake fysisk skade på operatøren.
Det andre og viktigste nøkkelpunktet er identifisering og ligering av LAD. Hver feil i LAD-identifikasjon og ligering vil føre til inkonsekvente resultater: enten for stor infarktstørrelse som resulterer i død eller for liten infarktstørrelse som resulterer i feil. Ulike metoder kan brukes for å identifisere LAD og verifisere ligeringen. Her brukes et disseksjonsmikroskop for å lokalisere LAD. LAD vises vanligvis som en tynn rød linje som går vinkelrett fra nær toppunktet og ned gjennom venstre ventrikkel. Ved å trykke forsiktig på stedet under den valgte ligeringsposisjonen for å forstørre LAD midlertidig (≤5 s per gang), kan LAD kontrolleres igjen. Etter ligering verifiseres LAD-okklusjon av en blekere farge i fremre vegg av venstre ventrikkel og signifikant ST-elevasjon innen noen få hjerteslag. Deretter blir ligeringen ubundet, og reperfusjonen valideres ved en fargeendring tilbake til rosa-rød innen 20 s og potensiell oppløsning av ST-elevasjon ved EKG. Endelig brukes troponin-T-testen, TTC-farging og hjerteultralyd for å evaluere myokardskaden. Disse mange forsikringene og gjensidige verifikasjonene gjør de eksperimentelle resultatene svært pålitelige. Videre fremkaller mikromanipulasjon høyere nøyaktighet og færre komplikasjoner (f.eks. blødning). Et annet viktig spørsmål er antagelsen om at blodkarene til mus er normale, men faktisk varierer noen koronararterier sterkt, og selv sikkerhetssirkulasjon kan presentere23,24. Derfor er infarktstørrelsene noen ganger ikke konsistente, selv om ligasjonene anses å være på samme nivå. Fordelene med mikroskopet er utstilt her. Ligering kan ikke gjøres basert bare på erfaring eller anatomiske landemerker: LAD og dens retning må verifiseres tydelig før ligering, ellers vil resultatene være upålitelige. I noen eksperimenter 6,8 er mus i høyre laterale decubitusposisjon for enkelhets skyld å observere den fremre veggen av venstre ventrikkel og koronararterier etter hjerteeksponering.
Denne modellen har to hovedbegrensninger. For det første kan ikke LAD ligering simulere okklusjon av høyre koronararterie. Faktisk, på grunn av anatomiske forskjeller blant dyr25, strekker LAD seg vanligvis til hjertets topp hos mus og rotter, og venstre cirkumfleksgrener er ikke utviklet, så modellene hos mus og rotter etableres ved LAD ligering. For store og mellomstore dyr som kaniner og griser er LAD relativt kort, mens venstre cirkumfleksarterie dekker et stort område av hjertet, så ligering av venstre cirkumfleksarterie er valgt for å etablere modellen. Sicard et al.26 rapporterte en ny metode for å undersøke høyre ventrikulær dysfunksjon og biventrikulær interaksjon ved å ligere høyre koronararterie hos mus, noe som kunne avhjelpe denne begrensningen. Den andre begrensningen er inkonsistent infarktstørrelse på grunn av variasjon i koronaranatomi27 og kirurgens erfaring. Som diskutert ovenfor er mikroskopet svært viktig for å øke konsistensen ved å verifisere LAD og dens retning før ligering, og for en erfaren forsker kan justering av ligeringsposisjonen etter en fullstendig vurdering av vaskulær anatomi oppnås.
Noen andre saker fortjener omtale. For eksempel vil torakotomi og nålepiercing uunngåelig forårsake liten skade på muskler og myokard, noe som kan ha effekter på betennelse. I tillegg ble smertestillende midler rapportert å ha effekt på MI28. Derfor må disse faktorene tas i betraktning når man analyserer betennelse eller dens effekter på MI. For feilsøking er det flere faktorer som vil føre til musdød. For eksempel komplikasjoner relatert til hjerteinfarkt, bedøvelsesulykke og blødning. Videre kommer de inkonsekvente resultatene hovedsakelig fra upassende ligeringsposisjoner: for høy ligeringsposisjon vil indusere for stor infarktstørrelse til og med musdød; I mellomtiden vil falsk identifisering av LAD føre til modellfeil. Noen detaljer må forbedres i denne metoden. For eksempel ville det være bedre om en rektal sonde kunne settes inn for å overvåke temperaturen under prosedyren. Sist men ikke minst, bør eksperimentøren huske på forskjellene mellom dyreforsøk og kliniske realiteter, spesielt at 30 min iskemitid faktisk er ganske kort for klinisk. Vi oppfordrer forskeren til å ordne trinnene i henhold til eksperimentdesignet, inkludert iskemitiden. Bare på denne måten kan denne protokollen være nyttig for studier av mekanismen og behandlingen av MI/MIRI og medikamentoppdagelse.
Kort fortalt finnes det en enkel og reproduktiv murinmodell for MIRI og MI. Denne modellen kan brukes til studier av MI/MIRI-mekanismer og terapeutisk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (82070317, 81700390 til Jibin Lin, 8210021880 til Bingjie Lv og 82000428 til Boyuan Wang) og National Key R &D Program of China (2017YFA0208000 til Shaolin He).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % sodium chloride solution | Kelun Industry Group,China | - | |
| 4% paraformaldehyde fixing solution | Servicebio,China | G1101 | - |
| 4-0 silk suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | C412 | - |
| 8-0 suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products,China | H801 | - |
| Buprenorphine | IsoReag,China | IR-11190 | - |
| Camera | Canon,Japan | EOS 80D | - |
| Depilatory cream | Veet,French | - | |
| Elecsys Troponin T hs STAT | Roche,Germany | - | |
| Electrochemical luminescence immunoanalyzer | Roche,Germany | Elecsys 2010 | - |
| Evans blue | Sigma,America | E2129 | - |
| Eye scissors | Shanghai Medical Instruments,China | JC2303 | - |
| Haemostatic forceps | Shanghai Medical Instruments,China | J31020 | - |
| High frequency in vivo imaging systems | Visualsonics,Canada | Vevo2100 | - |
| Ibuprofen | PerFeMiKer,China | CLS-12921 | - |
| Intravenous catheter | Introcan,Germany | 4254090B | - |
| Ketamine | Sigma-Aldrich,America | K2753 | - |
| Medical alcohol | Huichang ,China | - | |
| Microneedle holders | Shanghai Medical Instruments,China | WA2040 | - |
| Microscopic shears | Shanghai Medical Instruments,China | WA1040 | - |
| Microsurgical forceps | Shanghai Medical Instruments,China | WA3020 | - |
| Mouse electrocardiograph | Techman,China | BL-420F | - |
| Needle holders | Shanghai Medical Instruments,China | JC3202 | - |
| operating floor | Chico,China | ZK-HJPT | - |
| PE-10 tube | Huamei,China | - | |
| Pentobarbital | Merck,America | 1030001 | - |
| Rodent Ventilator | Shanghai Alcott Biotech,China | ALC-V8S-P | - |
| Stereo microscope | Aomei Industry,China | SZM0745-STL3-T3 | - |
| Surgical thermostatic heating pad | Globalebio, China | GE0-20W | - |
| Triphenyltetrazolium chloride | Servicebio,China | G1017 | - |
| Xylazine | Huamaike Biochemicals and Life Science Research Prouducts,China | 323004 | - |
References
- Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P.
- Ibanez, B., Heusch, G., Ovize, M., Van de Werf, F. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury. Journal of the American College of Cardiology. 65 (14), 1454-1471 (2015).
- Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3896 (2012).
- Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury through ligation of the left anterior descending artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e51329 (2014).
- Xu, Z., McElhanon, K. E., Beck, E. X., Weisleder, N. A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Methods in Molecular Biology. 1717, 145-153 (2018).
- Muthuramu, I., Lox, M., Jacobs, F., De Geest, B. Permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice: a model of post-myocardial infarction remodelling and heart failure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52206 (2014).
- Reichert, K., et al. Murine left anterior descending (LAD) coronary artery ligation: An improved and simplified model for myocardial infarction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55353 (2017).
- Lugrin, J., Parapanov, R., Krueger, T., Liaudet, L. Murine myocardial infarction model using permanent ligation of left anterior descending coronary artery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59591 (2019).
- Li, X., et al. Cardioprotective effects of Puerarin-V on isoproterenol-induced myocardial infarction mice is associated with regulation of PPAR-Y/NF-Kappa B pathway. Molecules. 23 (12), 3322 (2018).
- Vanden Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: A comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
- Wang, D., et al. A cryoinjury model to study myocardial infarction in the mouse. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), e59958 (2019).
- Brooks, W. W., Garibaldi, B. A., Conrad, C. H. Myocardial injury in the mouse induced by transthoracic cauterization. Laboratory Animal Science. 48 (4), 374-378 (1998).
- Tao, B., et al. Preclinical modeling and multimodality imaging of chronic myocardial infarction in minipigs induced by novel interventional embolization technique. EJNMMI Research. 6 (1), 59 (2016).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circulation Research. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of myocardial ischemia and reperfusion injury in mice using surface pad electrocardiography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54814 (2016).
- Gnyawali, S. C., et al. High-frequency high-resolution echocardiography: First evidence on non-invasive repeated measure of myocardial strain, contractility, and mitral regurgitation in the ischemia-reperfused murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), e1781 (2010).
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. Murine echocardiography and ultrasound imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2100 (2010).
- Shibata, R., et al. Adiponectin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury through AMPK- and COX-2-dependent mechanisms. Nature Medicine. 11 (10), 1096-1103 (2005).
- Anderson, J. L., Morrow, D. A.
- Frank, A., et al. Myocardial ischemia reperfusion injury: From basic science to clinical bedside. Seminars in Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 16 (3), 123-132 (2012).
- Mares, R. G., et al. Studying the innate immune response to myocardial infarction in a highly efficient experimental animal model. Romanian Journal of Cardiology. 31 (3), 573-585 (2021).
- Fernandez, B., et al. The coronary arteries of the C57bl/6 mouse strains: Implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
- Zhang, R., Hess, D. T., Reynolds, J. D., Stamler, J. S. Hemoglobin S-nitrosylation plays an essential role in cardioprotection. Journal of Clinical Investigation. 126 (12), 4654-4658 (2016).
- Sorop, O., et al. Experimental animal models of coronary microvascular dysfunction. Cardiovascular Research. 116 (4), 756-770 (2020).
- Sicard, P., et al. Right coronary artery ligation in mice: A novel method to investigate right ventricular dysfunction and biventricular interaction. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 316 (3), 684-692 (2019).
- Chen, J., Ceholski, D. K., Liang, L., Fish, K., Hajjar, R. J. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 313 (2), 275-282 (2017).
- Kato, R., Foex, P. Myocardial protection by anesthetic agents against ischemia-reperfusion injury: An update for anesthesiologists. Canadian Journal of Anaesthesia. 49 (8), 777-791 (2002).
