Summary
监测非创伤性脑室内出血啮齿动物模型中的颅内压在目前的文献中并不常见。在本文中，我们展示了一种在大鼠动物模型中测量脑室内出血期间颅内压、平均动脉压和脑灌注压的技术。
Abstract
脑室内出血的幸存者通常留下明显的长期记忆障碍;因此，利用脑室内出血动物模型进行研究至关重要。在这项研究中，我们寻找了测量大鼠非创伤性脑室内出血期间颅内压、平均动脉压和脑灌注压的方法。实验设计包括三个Sprague Dawley组：假，标准200μl脑室内出血和载体对照组。通过引入实质内光纤压力传感器，在所有组中都获得了精确的颅内压测量值。根据颅内压和平均动脉压值的知识计算脑灌注压。正如预期的那样，脑室内出血组和载体对照组在脑室内注射自体血和人工脑脊液时，颅内压均分别升高，随后脑灌注压下降。增加实质内光纤压力传感器有利于监测精确的颅内压变化。
Introduction
脑室内出血（IVH）是颅内出血（ICH）的一种，是一种毁灭性的疾病，具有很高的死亡率和发病率。IVH的特征是血液制品在颅内脑室内的积聚。孤立性脑室内出血不常见，通常发生在成人1.它可能与高血压出血、颅内动脉瘤破裂或其他血管畸形、肿瘤或创伤有关1.IVH导致继发性脑损伤以及脑积水的发展2。IVH的幸存者在受伤后通常会留下明显的功能，记忆和认知障碍。据报道，这些长期认知和记忆缺陷在高达44%的非物质文化遗产3幸存者中。在蛛网膜下腔出血（SAH）中，另一种类型的ICH中，众所周知，大约一半的幸存者会有记忆缺陷，对于那些除了SAH之外还有IVH的患者，结果往往明显更差4，5，6。
IVH后记忆功能障碍的潜在机制仍有待阐明。利用具有功能和记忆功能障碍的非创伤性IVH动物模型进行体内研究对于发现此类患者的潜在治疗靶点至关重要。IVH后记忆和功能障碍更严重的动物模型将是研究这些变化的最佳方法。资深作者的实验室也一直在专门研究高颅内压（ICP）在IVH大鼠模型中记忆缺陷发展中的作用。因此，在IVH期间精确测量ICP的方法对于研究非常重要。在本文中，我们报告了在IVH大鼠模型中精确测量ICP的方法。虽然ICP监测以前已用于创伤性ICH和蛛网膜下腔出血动物模型，但自发性IVH啮齿动物模型中的ICP监测并不像文献中常见报道的那样7，8。因此，本文提出的实验设计包括三组Sprague Dawley大鼠：假手术、标准200μl脑室内出血和载体对照。IVH组采用自体脑室内注射血液模型。对于载体对照动物，使用无菌乳酸林格氏溶液的心室内注射。术中记录ICPs、平均动脉压（MAP）和脑灌注压（CPP），结果在此报告。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有研究方法和动物护理/维护均按照加州大学戴维斯分校的机构指南进行。加州大学戴维斯分校的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准了所有动物使用方案和实验程序（IACUC协议#21874）。
1. 动物饲养
- 获得8-10个月大的Sprague-Dawley大鼠。在任何实验程序之前，将大鼠饲养在动物饲养室中，并在随意进食和水的12小时光照/黑暗循环后，在笼子中允许至少1周的一般适应。
2. 麻醉和术前程序
- 用4%异氟醚麻醉大鼠4分钟。将大鼠的牙齿仰卧挂在插管平台上，并使用气管插管和喉镜在气管内插管。
- 将麻醉和插管的大鼠放在呼吸机上（2%异氟醚和O 2 / N 2载气）。如果观察到对后腿夹伤等疼痛刺激没有反应，则对大鼠进行充分麻醉。
- 插入直肠温度计以连续监测温度。
- 使用无菌技术执行所有操作程序。手术前，剪下头部和股骨区域的头发，并用三种Betadine和70%酒精交替擦洗皮肤。
- 通过暂时将大鼠从呼吸机中取出并用连接到 10 mL 注射器的 PE-50 管吸出分泌物来吸出任何积聚的呼吸道分泌物。
- 用无菌人造泪液眼膏保护大鼠的眼睛。
- 在头皮切口之前，将局部布比卡因（~0.1 mL 的 0.25% 溶液）注射到皮肤和皮下组织中。
3. 手术方案
- 放置心室内针和颅内压 （ICP） 监测仪
- 将大鼠置于立体定向框架中的俯卧位置，并用耳巴固定大鼠。
- 用 15 刀片手术刀沿中线切开 1.5 厘米的头皮切口。
- 用纱布轻轻按压止血。
- 使用无菌棉尖涂抹器，将骨膜与颅骨分开，直到可见前臼标志。
- 使用立体定位并标记前鼻，并标记出两个双侧毛刺孔的位置，即前膛侧 1.4 mm 和后侧 0.9 mm。
- 使用手持式钻头，在左右半球创建这两个小（最大 2 毫米）颅毛刺孔。用无菌乳酸林格氏溶液冲洗掉任何多余的骨屑。
- 在右半球，将 22-G 导引套管放置在毛刺孔水平处，将 28 G 针穿过套管插入右侧心室深度（相对于前膛 4.6 mm），以产生 IVH。
- 将光纤压力传感器连接到读出单元。打开读出单元并确保所选单位以毫米汞柱为单位。然后，通过将传感器的尖端浸入装有乳酸林格溶液的小烧杯中来启动传感器，直到读出单元读出零。一旦它在乳酸铃声溶液中归零，就可以插入了。
- 在左半球，将压力传感器轻轻插入皮层 2-3 mm 深度，以进行实时 ICP 监测。
- 股动脉插管和平均动脉压 （MAP） 监护仪的插入
- 插入ICP监视器后，转动大鼠的下躯干，以便于进入左大腿和腹股沟区域。
- 无菌制备和局部布比卡因给药后，用 15 刀片手术刀在后肢上做一个 1.5 cm 的皮肤切口。
- 首先用止血器浅表解剖左股动脉，然后在显微镜下用细尖的镊子解剖更深的层。识别深蓝色股静脉以帮助定位邻近动脉。
- 使用3-0丝线绑住股动脉远端，并在股动脉近端放置一个临时金属夹。
- 将第二个光纤压力传感器连接到已启动的读出单元。将压力传感器插入聚乙烯 （PE-50） 管中，聚乙烯 （PE-50） 管插入 Tuohy Borst 然后关闭。将 Tuohy Borst 连接到一端连接到 1 mL 注射器的 3 路旋塞阀，另一端连接到带有 PE-50 管的 22-G 针头。
- 在显微镜下，用微型剪刀进行2毫米的股动脉切开术，并用连接到其余装置的PE-50管插管。
- 脑室内注射
- 使用 1 mL 注射器吸出 500 μL 血液，然后转动 3 路旋塞阀，使压力传感器读取 MAP。
- 将连接到PE-50管的28-G脑室内针头与IVH动物的吸血和载体对照动物的乳酸林格氏体一起灌注。然后将该针插入引导套管至右侧心室深处。
- 以 100 μL/min 的速度，用拇指泵送 1 mL 注射器，将血液或无菌乳酸林格氏溶液 （200 μL） 注入右侧心室。在此之前和脑室内注射期间，监测和记录 ICP、动脉血压和直肠温度。
- 监控并记录注射后的 ICP 和 MAP 值。
- 关闭
- 完成脑室内注射后，取出插入股动脉的压力传感器的PE-50管，并将临时夹子敷在股动脉上以防止出血。
- 使用 3-0 丝线绑住股动脉的近端部分。
- 使用3-0丝以中断的方式关闭股骨切口。
- 用脑室内针和ICP监测仪移除导引套管。
- 用骨蜡密封毛刺孔。
- 以中断的方式用3-0丝缝合线关闭颅切口。
- 在切口处应用局部布比卡因，术后注射0.35mL卡洛芬（5mg / kg）。在动物恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让它们无人看管。
- 让大鼠在手术后在监督下完全康复，并在康复后将它们送回家中的笼子，并免费获得食物和水。
4. 术后管理
- 每天检查所有术后动物，持续七天，以监测其恢复、神经系统状态、行为、体重和切口。
- 在手术时以及术后第1和第2天通过皮下注射给予0.35mL卡洛芬（5mg / kg）。
- 术后第7天以无菌方式拆线。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
颅内、平均动脉和脑灌注压
在所有动物的术中监测ICP和MAP（图1）。大鼠年龄为8-10个月大，平均体重为495±17克。还收集了实时ICP图（图2）。排除假手术组，IVH和载体对照组在脑室内注射期间ICP显着增加（图3）。与车辆对照组（36.5 mmHg）相比，IVH组（43 mmHg）的ICP峰值更高。然后，在这些动物组中，ICP在脑室内注射后5分钟内迅速下降并恢复正常。光纤传感器已成功用于实时监测ICP和MAP。观察到MAP在整个过程中保持相似，而CPP在脑室内注射血液或乳酸林格氏溶液时降低（图3）。
图 1：实验设置 。 （A） 毛刺孔的位置。（B）描述整个实验装置。缩写：A-P，前轴到后轴;M-L，内侧至侧轴。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：ICP 记录。 （A）假动物，（B）IVH和（C）载体对照动物的实时颅内压（ICP）记录。箭头表示 IVH/LR 注射的开始。每组 N=1。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：ICP、MAP 和 CPP 图。 （A） IVH 和载体对照动物心室注射前、心室注射期间和心室注射后的平均颅内压 （ICP）、（B） 平均动脉压 （MAP） 和 （C） 平均脑灌注压 （CPP） 值。每组 N=1。请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本研究调查了在非创伤性IVH大鼠模型中测量ICP，MAP和CPP的机制。记录以下组的结果：假，VH 200μL和载体对照（人工脑脊液脑室内注射）动物。选择该实验设计来研究如何在IVH注射期间监测ICP，因为我们假设ICP的峰值可能导致更显着的继发性脑损伤，从而导致IVH动物模型中的记忆缺陷。因此，本研究的目标是建立一个IVH动物模型，客观监测非创伤性IVH后的ICP，MAP和CPP，以便我们可以在未来的实验中进一步应用，重点关注IVH诱导的ICP对后续记忆功能障碍的影响。这项初步研究发现，使用分别引入左外侧心室和股动脉的光纤压力传感器可以精确监测ICP和MAP。脑室内注射血液和人工脑脊液时ICP显著增加。此外，在脑室内注射期间，相应的CPP降低。
本研究的主要关注点之一是找到一种方法来准确监测和记录压力（ICP和MAP）的微小变化。这是使用光纤压力传感器完成的。光纤传感器必须很小，以精确测量压力的最小变化。使用的光纤传感器绝缘在电缆护套中以保护其。护套的外径为0.9毫米，传感器尖端本身的直径为420微米。我们确保大鼠ICP和MAP值可以落入该传感器的正常工作压力范围（-50 mmHg至+300 mmHg）。此外，光纤传感器的精度也很小，±1 mmHg（Opsens 解决方案）。
目前大多数临床前ICH模型目前使用啮齿动物用全血输注和胶原酶（注射胶原酶以损伤细胞外基质导致IVH）模型作为两种最常见的实验设计9，10。全血输注模型涉及通过开颅术或毛刺孔输注血液，不仅在大鼠中也有报道，而且在猪和灵长类动物中也有报道。然而，没有一种动物模型是完美的，每种模型都有自己的优点和缺点9，10。关于结局，行为、脑水肿、细胞死亡和血肿大小是ICH研究中测试的一些最常见的终点。在评估认知和记忆功能障碍的行为测试中，大多数使用莫里斯水迷宫测试10。我们尚未发现在IVH非创伤性大鼠模型中客观测量ICP的研究。
MacLellan等人最近的一篇综述发现了临床前ICH文献的许多关键问题9。MacLellan等人发现，绝大多数研究只报告积极的治疗效果。许多结果为阴性的研究发表在较低级别的期刊上或根本没有发表，这导致了不小的发表偏倚。他们还发现，许多研究没有描述随机化、动物年龄和性别等方法。缺乏盲法、缺乏报告生理变量以及统计能力是该评价中观察到的其他弱点。所有这些使得其他试图复制实验10的人具有挑战性。此外，一些研究，如Hatman等人，表明学习和记忆缺陷往往是急性的，并且早在动物模型11实验ICH后的8周内就会减少。因此，动物模型中的这些短期记忆效应可能无法准确反映人类受试者在ICH后发生的长期记忆和认知功能障碍。
这项研究并非没有局限性。一个主要的限制是动物的木材低。这是一项试点研究，未来的动物研究将包含更多数量的动物，以巩固本文观察到的结果。这项研究的另一个局限性是无法在整个手术期间充分监测MAP，因为尽管使用低肝素化盐水冲洗管道，股动脉和Tuohy Borst系统都很容易凝结。
总之，在本文中，我们报告了在非创伤性IVH大鼠动物模型中精确监测ICP，MAP和CPP的方法。诸如此类的研究将为建立更一致的IVH动物模型以及随后更严格的临床前研究铺平道路。对非创伤性IVH动物模型进行更高质量的临床前研究对于阐明未来IVH幸存者的潜在治疗选择至关重要。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
所有作者均未报告存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作由NINDS资助：K08NS105914
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% bupivacaine | Hospira, Inc. | 409115901 | |
| 1 mL syringe | Covetrus | 60734 | |
| 10% providine iodine solution | Aplicare | MSD093947 | |
| 20 mL syringe | Covidien | 8881520657 | |
| 22 G needles | Becton Dickinson | 305155 | |
| 28 G intraventricular needles | P technologies | 8IC313ISPCXC | C313I/SPC 28-Gneedles to fit 22-G guide cannula with 6 mm projection |
| 3-0 silk suture | Henry Schein, Inc. | SP116 | |
| 3-way-stopcock | Merti Medical Systems | M3SNC | |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Chemical | 30525-89-4 | |
| AnyMaze software | Any-Maze behavioral tracking software | Stoelting CO, USA | |
| Artificial ointment | Covetrus | 48272 | |
| Blood collection vials with EDTA | Becton Dickinson | 367856 | |
| Bone wax | CP Medical, Inc. | CPB31A | |
| Carprofen | Zoetis, Inc. | 54771-8507-1 | |
| Centrifuge | Beckman | BE-GS6R | Model GS-6R |
| Cotton tip applicators | Covetrus | 71214 | |
| Drill | Dremel | 1600A011JA | |
| Fiberoptic pressure sensors with readout units | Opsens Medical | OPP-M200-X-80SC- 2.0PTFE-XN-100PIT-P1 and LIS-P1-N-62SC | Opp-M200 packaged pressure sensors with LifeSens system |
| Forceps | 11923-13, 11064-07 | ||
| Gauze | Covetrus | 71043 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | 51330 | |
| Heating pad with rectal thermometer | CWE, Inc. | 08-13000 ,08-13014 | TC1000 Temperature controller |
| Hemostats | 13013-14, 13008-12 | ||
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter Healthcare Corp. | Y345583 | |
| Laryngoscope | American Diagnostic Corporation | 4080 | |
| Metal clip | Fine Scientic Tools | 18056-14 | |
| Micro scissors | Fine Scientic Tools | 15007-08 | |
| Microscope | Leica | model L2 | |
| Needle driver | 12003-15 | ||
| Polyethylene tubing | Thermo Fisher Scientific | 14-170-12B | PE-50 tubing |
| Rats | Envigo | Sprague Dawley rats 8–10 months old | |
| Scalpel | 10010-00 | ||
| Scissors | 14090-11 | ||
| Stereotaxic instrument | Kopf instruments | Model 940 with ear bars | |
| Syringe pump | KD Scientific | 780100 | Model 100 series |
| Tuohy Borst | Abbott | 23242 | |
| Ventilator | Harvard rodent ventilator | 55-0000 | Model 683 |
References
- Gates, P. C., Barnett, H. J. M., Vinters, H. V., Simonsen, R. L., Siu, K.
- Strajle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K., Keep, R. F., Xi, G. Mechanisms of hydrocephalus after neonatal and adult intraventricular hemorrhage. Translational Stroke Research. 3, Suppl 1 25-38 (2012).
- Murao, K., Rossi, C., Cordonnier, C. Intracerebral hemorrhage and cognitive decline. Revue Neurologique. 169, 772-778 (2013).
- Al-Khindi, T., Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Cognitive and functional outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Stroke. 41, 519-536 (2010).
- Kreiter, K. T., et al. Predictors of cognitive dysfunction after subarachnoid hemorrhage. Stroke. 33, 200-208 (2002).
- Zanaty, M., et al. Intraventricular extension of an aneurysmal subarachnoid hemorrhage is an independent predictor of a worse functional outcome. Clinical Neurology and Neurosurgery. 170, 67-72 (2018).
- Gabrielian, L., Willshire, L. W., Helps, S. C., vanden Heuvel, C., Mathias, J., Vink, R. Intracranial pressure changes following traumatic brain injury in rats: lack of significant change in the absence of mass lesions or hypoxia. Journal of Neurotrauma. 28, 2103-2111 (2011).
- Kolar, M., Nohejlova, K., Duska, F., Mares, J., Pachl, J. Changes of cortical perfusion in the early phase of subarachnoid bleeding in a rat model and the role of intracranial hypertension. Physiological Research. 66, 545-551 (2017).
- Ariesen, M. J., Claus, S. P., Rinkel, G. J. E., Algra, A. Risk factors for intracerebral hemorrhage in the general population. A systematic review. Stroke. 34, 2060-2066 (2003).
- MacLellan, C. L., Paquette, R., Colbourne, F. A critical appraisal of experimental intracerebral hemorrhage research. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32, 612-627 (2012).
- Hartman, R., Lekic, T., Rojas, H., Tang, J., Zhang, J. H. Assessing functional outcomes following intracerebral hemorrhage in rats. Brain Research. 1280, 148-157 (2009).
