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Biology

Isolamento de Leveduras culturais e moldes de solos para investigar estrutura populacional fúngica

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/63396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, McMaster University

Summary

Este protocolo é um método eficaz e rápido de cultivo de leveduras e o molde Aspergillus fumigatus de grandes conjuntos de amostras de solo em apenas 7 dias. Os métodos podem ser facilmente modificados para acomodar uma gama de mídias de incubação e temperaturas conforme necessário para experimentos.

Abstract

O solo é hospedeiro de uma quantidade incrível de vida microbiana, com cada grama contendo até bilhões de células bacterianas, arqueais e fúngicas. Fungos multicelulares, como moldes e fungos unicelulares, amplamente definidos como leveduras, cumprem papéis essenciais nos ecossistemas do solo como decomposição de material orgânico e como fontes de alimento para outros moradores do solo. A diversidade de espécies fúngicas no solo depende de uma infinidade de fatores climáticos, como chuvas e temperatura, bem como propriedades do solo, incluindo matéria orgânica, pH e umidade. A falta de amostragem ambiental adequada, especialmente em regiões da Ásia, África, América do Sul e América Central, dificulta a caracterização das comunidades fúngicas do solo e a descoberta de novas espécies.

Caracterizamos comunidades fúngicas do solo em nove países em seis continentes usando ~4.000 amostras de solo e um protocolo desenvolvido em laboratório para o isolamento de leveduras e moldes. Este protocolo começa com enriquecimento seletivo separado para leveduras e o molde medicamente relevante Aspergillus fumigatus, em mídia líquida enquanto inibe o crescimento bacteriano. As colônias resultantes são então transferidas para mídias sólidas e processadas para obter culturas puras, seguidas pela caracterização genética a jusante. A identidade das espécies de leveduras é estabelecida através do sequenciamento de sua região espacial transcrita interna (ITS) do aglomerado genético ribossômico nuclear RNA, enquanto a estrutura populacional global de A. fumigatus é explorada através da análise de marcadores microsatélites.

O protocolo foi aplicado com sucesso para isolar e caracterizar as populações de leveduras de solo e A. fumigatus nos Camarões, Canadá, China, Costa Rica, Islândia, Peru, Nova Zelândia e Arábia Saudita. Esses achados revelaram insights muito necessários sobre padrões globais na diversidade de leveduras do solo, bem como estrutura populacional global e perfis de resistência antifúngica de A. fumigatus. Este artigo apresenta o método de isolar as duas leveduras e a. fumigatus de amostras internacionais de solo.

Introduction

Os fungos nos ecossistemas do solo desempenham papéis essenciais na decomposição da matéria orgânica, no ciclismo de nutrientes e na fertilização do solo1. Tanto abordagens independentes da cultura (ou seja, sequenciamento de alto rendimento) quanto abordagens dependentes da cultura são amplamente utilizadas no estudo dos fungos do solo 2,3. Embora a grande quantidade de dados gerados pelo sequenciamento de metabarcode de alto rendimento seja útil para a elucidação de padrões em larga escala na estrutura comunitária e na diversidade, a abordagem dependente da cultura pode fornecer informações altamente complementares sobre as estruturas taxonômicas e funcionais das comunidades fúngicas, bem como perfis mais específicos de organismos individuais através da diversidade a jusante e análises funcionais devido à disponibilidade de culturas fúngicas puras.

Apesar de raramente exceder milhares de células por grama de solo, as leveduras, amplamente definidas como fungos unicelulares, são decompodoras essenciais e fontes de alimento para outros moradores do solo 4,5. Na verdade, as leveduras podem ser os fungos do solo predominantes em biosferas frias, como a Antártida continental 6,7. O solo também é um reservatório primário de leveduras medicamente relevantes que causam infecções oportunistas graves em humanos e outros mamíferos8. Apesar das semelhanças morfológicas, as espécies de levedura são filogeneticamente diversas e ocorrem entre fungos filamentosos em dois filos, Ascomycota e Basidiomycota, dentro do reino fúngico9. As leveduras não possuem uma assinatura de DNA definidora no gene de codificação de barras fúngicas, a região interna do espaçador transcrito (ITS) do aglomerado genético RNA ribossômiconuclear 10, tornando-as indistinguíveis de outros fungos em investigações metagenômicas e, assim, exigindo o uso de métodos dependentes da cultura para isolar espécies de leveduras.

O protocolo abaixo foi implementado para caracterizar comunidades de leveduras de solo de nove países e identificar tendências e padrões globais na diversidade de leveduras do solo 9,11,12. As abordagens metagenômicas são de uso limitado ao estudar grupos direcionados de organismos como leveduras 2,3. Devido à sua diversidade filogenética, as leveduras não podem ser distinguidas de outros fungos baseados apenas na sequência de DNA. Assim, estudar populações de leveduras requer o uso contínuo do isolamento dependente da cultura. No entanto, a cultura é muitas vezes significativamente mais demorada e requer mais pessoal para realizar os experimentos. Portanto, o protocolo foi otimizado e simplificado para um processamento mais rápido com pessoal limitado. A principal vantagem da colheita é que as espécies de leveduras identificadas são leveduras vivas e não mortas, e, portanto, são mais propensas a serem verdadeiros moradores do solo do que células transitórias presentes nos solos. Estima-se que aproximadamente 40% do DNA fúngico no solo são contaminantes de outros ambientes, extracelulares, ou vêm de células que não estão mais intactas, causando abordagens de sequenciamento de alto rendimento para superestimar a riqueza fúngica em até 55%13. O isolamento dependente da cultura pode confirmar prontamente a identidade das espécies de leveduras com o benefício adicional de garantir a cultura pura para ser usada em análises a jusante. De fato, culturas puras de 44 espécies putativas de novas leveduras foram identificadas usando este protocolo de isolamento do solo que permitiu o uso de uma série de métodos para estudar suas propriedades taxonômicas e funcionais no detalhe14.

O protocolo abaixo também pode ser usado para isolar moldes presentes no solo, como A. fumigatus. Aspergillus fumigatus é um molde termofílico e saprofítico com ampla distribuição global no solo15. Foi isolado de inúmeros ambientes clínicos e não clínicos. A amostragem não clínica geralmente inclui ar, detritos orgânicos (composto, pó de serra, resíduos de bulbos de tulipas) e solo (solos agrícolas, de jardim e naturais)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus é um patógeno oportunista humano que causa uma série de infecções coletivamente denominadas aspergillose, afetando mais de 8 milhões de pessoas em todo o mundo, 16,20. Aproximadamente 300.000 pessoas em todo o mundo sofrem de aspergillose invasiva, que é a forma mais grave de aspergillose16. Dependendo de fatores como a população do paciente, local de infecção e eficácia da terapia antifúngica, a taxa de mortalidade pode ser de até 90%. Nas últimas décadas, a resistência às terapias antifúngicas aumentou, exigindo esforços globais de vigilância tanto em populações clínicas quanto ambientais para rastrear esses genótipos de resistência 21,22,23. Dada a sua capacidade de crescer a temperaturas acima de 50 °C, esta temperatura pode ser explorada para selecionar para A. fumigatus isolados do solo usando métodos dependentes da cultura. Os isolados aspergillus fumigatus são comumente genótipos em nove loci de repetição de tandem curto altamente polimórfico (STR), mostrando ter alto poder discriminatório entre cepas24. Esses genótipos str podem ser comparados com outras populações previamente pesquisadas para rastrear a disseminação de genótipos A. fumigatus, incluindo genes de resistência a drogas, em todo o mundo.

Abaixo descrevemos um protocolo para o isolamento rápido de leveduras e A. fumigatus a partir de amostras de solo de forma dependente da cultura. Dependendo da quantidade de solo obtida por amostra, as amostras de solo podem ser compartilhadas entre os dois protocolos. Em comparação com métodos similares que isolam leveduras e A. fumigatus do solo, este protocolo utiliza 10x menos solo por isolado obtido. Estudos que tentam isolar A. fumigatus do solo requerem entre 1 e 2 g de solo por isolante, enquanto este protocolo requer apenas 0,1-0,2 g de solo 18,19,25. Este protocolo utiliza plásticos e recipientes menores que facilitam seu design de alta produtividade. Portanto, um número maior de amostras pode ser processado usando menos espaço para equipamentos como incubadoras e tambores de rolo. As amostras de solo podem ser totalmente processadas para obter isolados em apenas 7 dias. Este protocolo foi otimizado para permitir o processamento de até 150-200 amostras por dia por pessoa.

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Protocol

NOTA: Quaisquer etapas utilizando amostras internacionais de solo e/ou esporos de fumigatus e micélios requerem o trabalho dentro de um gabinete de biossegurança para organismos de nível 2 (BSCII).

1. Isolamento da levedura do solo

  1. Preparação de soluções antibacterianas e antifúngicas
    1. Suspenda o pó de clororamfenícol em 70% de etanol para preparar uma solução de estoque de 50 g/L. Esterilize por filtragem de seringa e armazene a 4 °C.
      NOTA: Este antibiótico evitará o crescimento da maioria das bactérias durante o isolamento da levedura do solo. Como as bactérias resistentes ao clororamfenicol ainda podem crescer, a morfologia da colônia deve ser cuidadosamente levada em consideração ao distinguir leveduras de bactérias. Antibióticos adicionais podem ser adicionados à mídia ao trabalhar com o solo suspeito de conter cepas bacterianas resistentes a antibióticos. A contaminação bacteriana em meios com suplementos de clororamfenícol não foi um problema encontrado ao isolar leveduras de solos ambientais.
    2. Suspenda o pó de benomyl no DMSO para preparar uma solução de estoque de 5 g/L. Esterilize por filtragem de seringa e armazene a 4 °C.
      NOTA: Esta droga antifúngica seletiva previne o crescimento da maioria dos fungos filamentosos sem afetar o crescimento da levedura durante o isolamento da levedura do solo26,27.
  2. Preparação de mídia cultural e equipamentos estéreis
    1. Para preparar o caldo YEPD (Levedura Extract-Peptone-Dextrose), adicione 10 g de Extrato de Levedura, 20 g de peptona e 20 g de dextrose a 1 L de água duplamente destilada. Mexa até ficar bem misturado e autoclave por 40 min a 121 °C. Armazene em temperatura ambiente até o uso.
    2. Meio ágar sólido YEPD
      1. Misture 10 g de extrato de levedura, 20 g de peptone, 20 g de dextrose e 20 g de ágar em 1 L de água. Mexa bem para misturar e autoclave por 40 min a 121 °C.
      2. Uma vez resfriado o suficiente, adicione 1 mL de clororamfenicol e benomyl de soluções de estoque para trazer as concentrações finais dos dois antimicrobianos a 50 mg/L e 5 mg/L, respectivamente.
      3. Misture bem mexendo e despeje em pratos petri de 10 cm de diâmetro. Deixe em temperatura ambiente durante a noite para definir e armazenar a 4 °C até usar.
        NOTA: A partir de 1 L de YEPD, aproximadamente 40 placas podem ser derramadas.
    3. Esterilizar varas aplicadoras de ponta simples de madeira e espalhadores de células reutilizáveis por autoclaving e armazenar à temperatura ambiente.
  3. Incubação de solo em caldo líquido
    1. Prepare um conjunto de tubos de cultura estéreis de 13 mL rotulando-os com iD amostra de solo.
    2. Usando uma pipeta sorológica, adicione 5 mL de caldo YEPD suplementado com clorofenicol e benomyl em cada tubo.
    3. Trabalhando em um BSCII, transfira ~0,1 g de solo para o tubo de cultura apropriado usando um aplicador de ponta simples estéril e de madeira.
      NOTA: Use um aplicador fresco para cada amostra de solo e descarte imediatamente após o uso para evitar a contaminação cruzada entre as amostras.
    4. Tampe o tubo com segurança para a primeira parada para evitar derramamentos, mas ainda assim permita a troca de ar durante a incubação. Incubar os tubos de cultura em um tambor de rolo por 24 h a uma temperatura considerada ótima para maximizar o crescimento da levedura.
      NOTA: A temperatura de incubação deve ser decidida com base na temperatura média anual do país de origem das amostras do solo. Por exemplo, ao isolar as leveduras do solo da Islândia, os tubos de cultura foram incubados a 14 °C, enquanto os solos da Arábia Saudita foram incubados a 30 °C. Devido ao crescimento mais lento da levedura em temperaturas mais baixas, o tempo de incubação pode ter que ser estendido por até 72 h.
  4. Transfira o supernante para o meio sólido.
    1. Utilizando o conjunto de placas de ágar YEPD + chloramphenicol + benomyl preparadas na Etapa 1.2, rotule-as com o ID amostra do solo.
    2. Remova os tubos de cultura preparados na etapa 1.3 do tambor de rolo. Trabalhando em um BSCII, brevemente vórtice do tubo para desenhar partículas de solo e células que podem ter se estabelecido na parte inferior de volta em suspensão.
    3. Usando uma micropipette, transfira 100 μL do supernatante para uma placa. Use um espalhador de células estéril e reutilizável para espalhar o líquido completamente e uniformemente sobre a superfície do ágar.
      NOTA: Trabalhar em conjuntos de 10 amostras pode acelerar significativamente esse processo. Pipeta o supernatante em 10 placas primeiro e, em seguida, executar a propagação. Use um spreader fresco para cada amostra para evitar a contaminação cruzada entre as amostras.
    4. Empilhe as placas em sacos plásticos, lacre e incubar de cabeça para baixo por 2-3 dias na mesma temperatura usada anteriormente para incubação de caldo líquido até que o crescimento microbiano seja visível.
  5. Detecção de leveduras e listras para colônias únicas
    1. Depois de permitir tempo suficiente de incubação (tipicamente de 2 a 3 dias, mas pode levar mais tempo a temperaturas mais baixas), inspecione as placas em um BSCII para qualquer crescimento de levedura. Procure por leveduras cremosas, redondas e foscas que são facilmente distinguidas das colônias bacterianas e de moldes.
      NOTA: Algumas leveduras produzem pigmentos coloridos e podem parecer preto/marrom, amarelo ou vermelho, mas sua textura e forma da colônia geral seriam semelhantes às leveduras não pigmentadas.
    2. Selecione uma colônia semelhante a uma levedura de cada placa para processamento posterior.
      NOTA: Se mais de um tipo de morfologia for observado em uma única placa, selecione uma colônia representativa para cada tipo morfológico.
    3. Usando varas aplicadora de ponta simples e estéreis, de ponta simples, transfira cada colônia selecionada para uma placa fresca de YEPD + clororamfenicol + benomyl e listras para colônias únicas. Faça três raias separadas.
      1. Listrar para frente e para trás mais de um terço da placa usando uma vara aplicadora. Comece a segunda e terceira sequência, espalhando o aplicador pela sequência anterior uma vez. Use um novo bastão aplicador para cada raia.
        NOTA: Use uma placa por isolação. Descarte os aplicadores imediatamente após o uso para evitar a contaminação cruzada entre as amostras.
    4. Empilhe as placas em sacos plásticos, lacre e incubar de cabeça para baixo por 2-3 dias na mesma temperatura usada anteriormente até que colônias únicas se tornem visíveis.
  6. Identificação de espécies de leveduras via sequenciamento ITS
    1. Selecione uma colônia única bem separada por solo isolado e subcultura em uma placa fresca de YEPD + clororamfenicol + benomyl para obter mais células. Incubar por 2-3 dias na mesma temperatura usada anteriormente.
    2. Colher as células recém-cultivadas e suspendê-las em tubos congeladores de -80 °C contendo 1 mL de glicerol esterilizado em água duplamente destilada para criar suspensões celulares. Mantenha estas suspensões a -80 °C como soluções de estoque.
    3. Use células frescas para realizar a colônia PCR (reação em cadeia de polimerase) com primers ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') e ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') para amplificar o gene de codificação de barras fúngicos, ITS9. Use as seguintes condições de termociclismo: uma etapa inicial de desnaturação a 95 °C por 10 min seguido por 35 ciclos de (i) 95 °C para 30 s, (ii) 55 °C para 30 s e (iii) 72 °C para 1 min.
      NOTA: O COLONY PCR tem uma alta taxa de sucesso e um tempo de retorno mais rápido do que a extração de DNA seguido pelo PCR.
    4. Se a colônia PCR falhar repetidamente para uma cepa, extrair DNA usando o protocolo de escolha e executar seu PCR usando DNA genômico extraído como modelo (use as mesmas condições termociclantes que acima).
      NOTA: Recomenda-se uma extração de DNA relativamente barata à base de clorofórmio28.
    5. Execute o sequenciamento de Sanger para determinar a sequência de DNA da região DE ITS amplificada para cada cepa.
    6. Compare a sequência DE ITS obtida das cepas de leveduras com sequências depositadas em bancos de dados públicos como NCBI GenBank e UNITE para estabelecer a identidade das espécies.

2. Isolamento de Aspergillus fumigatus do solo

  1. Prepare 1 mL de caldo de dextrose Sabouraud estéril (SDB) suplementado com o antibiótico clororamfenicol por amostra de solo.
    1. Adicione 10 g de peptone e 20 g de dextrose a 1 L de água destilada. Autoclave a 121 °C por 40 min.
    2. Deixe o SDB esfriar a ~50 °C, adicione 1 mL de 50 g/L de clororamfenicol para levar a concentração a 50 mg/L.
      NOTA: O clorofenicol é preparado o mesmo descrito acima para o isolamento da levedura. Além de inibir o crescimento bacteriano, o clororamfenicol também impede a produção de gás a partir de bactérias que farão com que os tubos se abram durante a etapa de incubação detalhada no Passo 2.2.
    3. Alíquota asepticamente 1 mL de SDB em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL por amostra de solo usando uma pipeta mecânica.
  2. Adicione o solo a tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL.
    1. Coloque o casaco de banco ou o estofamento absorvente dentro de um BSCII para ajudar no descarte de solo derramado.
    2. Utilizando varas aplicadoras autoclavadas, transfira aproximadamente 0,1 g de solo para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL contendo 1 mL de SBD. Feche o tubo e o vórtice. Incubar o solo suspenso a 50 °C por 3 dias.
      NOTA: Não é necessário tremer durante a incubação.
  3. Colheita micelial de caldo inoculado de solo
    1. Prepare as placas de ágar extrato de malte (MEA).
      1. Por litro de MEA: adicione 20 g de extrato de malte, 20 g de dextrose, 6 g de peptone e 15 g de ágar a 1 L de água destilada. Autoclave a 121 °C por 40 min.
      2. Deixe o MEA esfriar a ~50 °C, em seguida, adicione 1 mL de 50 g/L clororamfenicol para trazer a uma concentração final de 50 mg/L.
    2. Transfira a micélia do caldo inoculado de solo para placas mea.
      1. Identifique o solo inóculo que tenha crescimento micelial visível no SDB até a fronteira do ar.
      2. Use varas de aplicador de madeira esterilizada para transferir a micélia para o centro de uma placa MEA. Incubar as placas MEA a 37 °C durante 3 dias.
  4. Seleção de micélio com propriedades morfológicas A. fumigatus .
    1. Identifique colônias de moldes que tenham propriedades morfológicas A. fumigatus características (camurça verde como crescimento).
    2. Trabalhando em um BSCII, use varas de aplicadora de madeira esterilizada ou um laço de inoculação para colher conidia/mycelia raspando a superfície uma vez. Transfira os esporos/mycelia para o centro de uma placa MEA, correndo para o ágar para colônias únicas. Incubar a 37 °C por 2 dias.
      NOTA: Como várias cepas de A. fumigatus e/ou outros fungos podem estar presentes na placa, é importante a raia para colônias únicas. O protocolo de listras de uma única colônia no Passo 1.5.3 no protocolo de isolamento da levedura pode ser usado.
    3. Usando uma vara aplicadora estéril ou laço de inoculação, subcultura uma única colônia gerada na Etapa 2.4.1.2 no MEA, espalhando a colônia uma vez. Espalhe os esporos colhidos no centro da placa. Incubar a 37 °C por 2 dias.
  5. Colheita de esporos de A. fumigatus /mycelia para armazenamento de cultura
    1. Prepare uma solução estéril de 30% de glicerol (para uma solução de 100 mL, adicione 30 mL de 100% glicerol misturado com 70 mL de água dupla destilada, esterilizada a 121 °C por 40 min).
    2. Trabalhando em um BSCII, use uma pipeta p1000 para aspirar 1 mL da solução de 30% de glicerol. Dispense a solução de 1 mL de glicerol na colônia A. fumigatus para colher esporos/mycelia.
      1. Devido à hidroofobidade dos esporos de A. fumigatus /mycelia, use a ponta da pipeta para arranhar uma região densamente esporlada da placa.
        NOTA: Quando o glicerol é dispensado no arranhão, o glicerol aderiria à área de arranhão em vez de rolar sobre o ágar.
      2. Distribua lentamente o glicerol na área de risco para desalojar os esporos e suspendê-los na solução de glicerol.
      3. Uma vez totalmente dispensado, incline levemente a placa e aspire a suspensão glicerol spore/mycelia.
        NOTA: Aproximadamente 750 a 800 μL serão aspirados.
      4. Transfira o aspirado para um tubo congelador estéril e armazene a -80 °C. Se necessário, crie ações de trabalho repetindo as etapas 2.5.2.1 para 2.5.2.4.
  6. Identificação fenotípica de cepas A. fumigatus
    1. Usando o estoque de esporos criado a partir da etapa 2.5.2, crie uma diluição de 100x na água.
      1. Aspire 10 μL dos estoques de mycelial e esporos e dispense em 990 μL de água. Vórtice a suspensão.
    2. Dispense 10 μL da suspensão do esporo diluído em um slide de microscópio padrão.
    3. OPCIONAL: Colora a suspensão micelial e esporo com azul metileno.
      1. Para colorir com azul de metileno, fixar as conidia e os conidioforos no slide passando o slide sobre um queimador de Bunsen até secar.
      2. Aplique azul de metileno por 1-2 min e lave com água.
      3. Seque o slide com papel manchador.
    4. Usando um microscópio composto a 400x de ampliação, visualize a suspensão e localize os conidioforos. Compare a morfologia conidiophore observada com a morfologia de A. fumigatus conidiophore.
  7. Identificação molecular de cepas de A. fumigatus
    1. Extrair DNA de cada isolado seguindo protocolos comuns de extração de DNA fúngico.
    2. Usando primers específicos dos genes Aspergillus β-tubulin (β-tub1 e β-tub4), execute o PCR e obtenha a sequência para os produtos amplificados, seguindo protocolos descritos por Alcazar-Fuoli et al.17.
      1. Compare as sequências obtidas com sequências depositadas em bancos de dados públicos, como o NCBI GenBank usando o BLAST.
      2. Confirme se as sequências de tensão são uma combinação superior às sequências de A. fumigatus no banco de dados.
    3. Alternativa ao passo 2.7.2, execute uma reação multiplex PCR visando os tipos de acasalamento A. fumigatus MAT1-1 e MAT1-229.
      1. Use as seguintes três sequências de primer na reação multiplex PCR: AFM1: 5'-CCTTGACGCGATGGGGGGGG-3'; AFM2: 5′-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3′; AFM3: 5'-CGGAAATCTGATGTCGCCACGG-3′.
      2. Utilize os seguintes parâmetros termociclísticos: 5 min a 95 °C, 35 ciclos de 30 s a 95 °C, 30 s a 60 °C e 1 min a 72 °C antes de um final de 5 min a 72 °C.
      3. Executar eletroforese de gel para identificar os produtos; procure por 834 bp MAT-1 ou 438 bp MAT1-2. Use cepas A. fumigatus que confirmaram a amplificação do tipo de acasalamento como controles positivos e negativos.
  8. Genotipagem microsatélite de A. fumigatus se esforça através da análise de fragmentos
    NOTA: Embora as etapas listadas abaixo cobrem amplamente o genotipagem A. fumigatus em nove loci microsatélite (STR), apenas algumas considerações importantes foram destacadas. Para obter detalhes sobre a genotipagem A. fumigatus STR, consulte De Valk et al.24,30.
    1. Prepare três mixes mestres de multiplex PCR usando os primers STRAf descritos anteriormente por De Valk et al.24.
      1. Rotular fluorescentemente primers para a frente para determinar o tamanho do fragmento através da eletroforese capilar. Certifique-se de que a concentração dos primers dianteiros seja metade (0,5 μM) das primers inversas (1 μM) dentro da mistura mestre.
        NOTA: Para obter os melhores resultados, use etiquetas fluorescentes que tenham comprimentos de onda de absorção que correspondam aos do padrão de corante escolhido usado durante a eletroforese capilar
      2. Use polimerase de início quente para obter melhores resultados.
      3. Use uma concentração de DNA de 0,1 ng por reação.
    2. Execute o multiplex PCR para cada cepa usando o seguinte programa PCR: 95 °C para 10 min, 40 ciclos de 95 °C para 30 s, 60 °C para 30 s e 72 °C para 60 s, seguido por 72 °C para 10 min e um porão de 4 °C.
    3. Verifique se há produtos amplificados através da eletroforese em gel.
    4. Diluir os produtos ao nível desejado (tipicamente ~50x) conforme recomendado por especialistas em análises de fragmentos e executar eletroforese capilar. Realize três corridas para cada cepa, com cada corrida cobrindo três reações multiplexadas com três sondas fluorescentes diferentes.
    5. Para determinar o tamanho correto do fragmento para cada um dos nove loci str, use um software capaz de analisar fragmentos.
      1. Recuperar os dados brutos obtidos da eletroforese capilar. Marque os tamanhos dos fragmentos com base no maior pico usando o software de análise de fragmentos (por exemplo, Osiris).
      2. Converta os tamanhos dos fragmentos em números repetidos para cada um dos nove loci. Use os tamanhos de fragmentos dos números repetidos da cepa de referência Af293, conforme descrito anteriormente por De Valk et al.24.
        NOTA: Pequenas variações nos tamanhos dos fragmentos podem ocorrer entre diferentes plataformas de eletroforese capilar. Assim, é importante incluir uma cepa de referência comum (e uma escada interna) com tamanho de fragmento conhecido para cada um dos nove loci para cepas genotipadas.

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Representative Results

Isolamento da levedura do solo
O protocolo de isolamento da levedura acima foi implementado para cultivar leveduras a partir de amostras de solo originárias de 53 locais em nove países 9,12. No total, 1.473 cepas de levedura foram isoladas de 3.826 amostras de solo. Dadas as diferentes condições climáticas dos nove países originários, a melhor temperatura de incubação para cada país foi determinada com base em sua temperatura média anual (Tabela 1). Dado o crescimento mais lento da levedura a 14 °C, amostras de solo da Islândia foram incubadas em um tambor de rolo por mais 48 h (96-120 h no total). Após 2-3 dias de incubação em meio sólido, o crescimento microbiano foi visível em placas para todas as amostras (Figura 1A). Uma colônia selecionada aleatoriamente para cada morfologia de levedura presente em uma placa foi listrada para colônias únicas em placas frescas (Figura 1B).

A taxa de isolamento bem-sucedido da levedura difere entre os países (Tabela 1). Por exemplo, 97 cepas de levedura foram cultivadas a partir de 562 amostras de solo da Arábia Saudita (17,3%), enquanto 261 leveduras foram cultivadas a partir de 300 amostras de solo canadense (87%). Uma análise de rarefação deve ser realizada para determinar se foi realizada amostragem suficiente do solo para obter estimativas precisas da verdadeira diversidade de leveduras em locais amostrados. Um exemplo de análise de rarefação para cada país foi pré-formado onde o índice de diversidade de Shannon foi usado como medida da diversidade de leveduras do solo (Figura 2). As curvas de rarefação resultantes se aproximaram da assíntota de saturação indicando que a amostragem adicional não teria rendido mais diversidade de leveduras.

O sequenciamento da região de ITS revelou que os 1.473 isolados de levedura podem ser categorizados em 134 espécies distintas. Isso incluiu 90 espécies conhecidas e 44 espécies potencialmente novas. Aplicamos um modelo de efeitos mistos para identificar preditores da diversidade global de leveduras do solo cultural, quantificada pelo índice de diversidade de Shannon31. Neste modelo, a precipitação anual média, temperatura média anual, elevação e distância ao equador dos locais amostrais foram colocadas como efeitos fixos, enquanto o país amostral foi definido como efeito aleatório9. Este modelo identificou precipitação anual média significativamente correlacionada com o índice de diversidade de Shannon (p = 0,012), enquanto não foram encontradas correlações significativas entre outras variáveis preditoras e o índice de diversidade de Shannon9.

Para comparar esse protocolo baseado em cultura com métodos independentes da cultura, comparamos esses achados a um estudo anterior de Tedersoo e colegas que investigaram a diversidade global de fungos do solo usando metagenômica2. Tedersoo e colegas realizaram sequenciamento de alto rendimento da região do ITS no DNA extraído diretamente de amostras de solo de 39 países, quatro dos quais, ou seja, Camarões, Canadá, China e Nova Zelândia, também foram amostrados neste estudo. Realizamos pesquisas BLAST para identificar sequências DE ITS presentes em ambos os conjuntos de dados32, e descobrimos que 26% das sequências de ITS tinham uma correspondência significativa (> 98,41% de identidade nucleotídea) no conjunto de dados metagenômicas. No entanto, <3% corresponderam a uma sequência fúngica do mesmo país, enquanto os 23% restantes corresponderam a uma sequência fúngica encontrada em um país diferente9. Tivemos mais sucesso do que o estudo da metagenômica ao anotar as sequências de ITS com a identidade das espécies de leveduras. Tedersoo e colegas relataram um total de 50.589 unidades taxonômicas operacionais fúngicas (OTUs), com o número de OTUs de levedura não conhecido. Dessas OTUs fúngicas, 33% foram apenas anotadas como environmental_sequence (724, 1,4%), uncultured_soil_fungus (2.405, 4,8%), uncultured_ectomycorrhizal_fungus (1.407, 2,8%) ou uncultured_fungus (11.898, 23,5%).

Isolamento de fumigatus aspergillus do solo
Após 3 dias de incubação do solo a 50 °C em 1 mL de SDB em um tubo de microcentrifuuge, a micélia pode ser encontrada crescendo dentro do SDB, no SDB para o limite de ar, e/ou nas paredes internas. Aspergillus fumigatus mycelia são tipicamente encontrados crescendo no SDB para a fronteira do ar, mas também podem ser colhidos logo abaixo da superfície SDB. Após esta etapa, as micícias são transferidas para o MEA e cultivadas por 3 dias a 37 °C. O crescimento micelial nas placas só pode formar a morfologia de camurça verde típica de A. fumigatus (Figura 3A). Mais comumente, outros moldes termotolerantes podem estar presentes dentro do mesmo solo e crescer com A. fumigatus na mesma placa ou por eles mesmos (Figura3B-D). As taxas de isolamento de aspergillus fumigatus podem variar entre locais geográficos, semelhantes ao encontrado para leveduras de solo. Por exemplo, em Vancouver, Canadá, 251 isolados foram obtidos através deste método de 540 amostras de solo (46,5%) (resultados inéditos). Em contrapartida, dentro de Camarões, foram colhidos 51 isolados de A. fumigatus de 495 amostras de solo (10,3%)33.

A. fumigatus conidiophore estrutura pode ser visto e identificado usando microscopia de luz. Conidioforos têm uma bola na morfologia de vara (Figura 4). Além disso, os imidioforos A. fumigatus são uniseriados, onde os fialides, ligados às cadeias de conidia, são anexados diretamente à vesícula esférica. Em outras espécies de Aspergillus , os conidioforos são biserinatos, onde os fialides estão conectados à metulae anexada à vesícula.

Vários programas de software estão disponíveis para realizar a análise de fragmentos dos dados brutos da eletroforese capilar, convertendo o espectro de eletroforese capilar em tamanhos de fragmentos. Figura 5 é um cromatógrafo gerado pelo programa Osíris. Os três canais que visualizam os comprimentos do fragmento de A. fumigatus dinucleotídeo (2A, 2B e 2C), trinucleotídeo (3A, 3B e 3C) e tetranucleotídeo (4A, 4B e 4C) STR loci são mostrados. Além disso, artefatos PCR que ocorrem se a concentração de DNA da amostra durante o PCR é muito alta também são mostrados. Os picos mais altos de cada cor representam os tamanhos de fragmentos dos três loci str nesta trama.

A variação genética presente entre os genótipos A. fumigatus STR pode ser visualizada usando o poppr de pacote R. O script R bruvo.msn cria uma matriz de distâncias genéticas de Bruvo entre cada par de genótipos. Essa matriz é então usada para gerar uma rede de abrangência mínima (MSN). Um MSN de alta qualidade pode então ser gerado usando o script R plot_poppr_msn ou imsn (Figura 6). Uma análise discriminatória dos componentes principais (DAPC) é outro método para visualizar as relações genéticas entre as cepas (Figura 7). O dapc script R no adegenet do pacote R é usado para executar DAPC e pode ser usado com antecedentes de grupos conhecidos ou desconhecidos. Com antecedentes de grupos desconhecidos, ele usa agrupamento de meios K para identificar o provável número de grupos de indivíduos.

Figure 1
Figura 1: Isolamento da levedura a partir de amostras de solo. (A) O crescimento microbiano é visível no ágar sólido após 2-3 dias de incubação. Colônias de leveduras podem ser vistas intercaladas entre outras colônias fúngicas/bacterianas. Uma colônia representativa de leveduras para cada tipo morfológico em uma placa é selecionada para listras para colônias únicas. (B) Três raias são realizadas para obter colônias únicas de isolados de leveduras. Uma placa foi usada para obter cada isolado do solo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Análise de rarefação da amostragem do solo. Em cada um dos nove países amostrados, a diversidade da levedura do solo, quantificada pelo índice de diversidade de Shannon, aborda a saturação à medida que o número de amostras de solo aumenta. Este número foi adaptado a partir de 9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Morfologia de crescimento de aspergillus fumigatus em Sabouraud dextroseagar. (A) Morfologia de crescimento de camurça verde semelhante a A. fumigatus. (B-D) A. crescimento de fumigatus com outros moldes termofílicos presentes na amostra do solo. A. conidição fumigatus é visivelmente reduzida em B e D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Foto de um Aspergillus fumigatus conidiophore sob um microscópio leve. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Saída de Osíris de nove loci de microsatélite de uma cepa de Aspergillus fumigatus . As saídas correspondem ao (A) Dinucleotídeo (2A, 2B e 2C), trinucleotídeo (B) (3A, 3B e 3C) e (C) tetranucleotídeo (4A, 4B e 4C) STR loci. As etiquetas fluorescentes do primer avançado de 5' são: A = 6-FAM; B = HEX; C = ATTO550. Os produtos de reação multiplex foram diluídos 30x antes da eletroforese capilar. O padrão de corante LIZ600 foi usado durante a eletroforese capilar. Os dados brutos foram analisados utilizando-se o software de análise de pico Osiris identificando picos potenciais entre 60 e 400 bp. Vários artefatos PCR são picos fora de escala que causam sangramento de fluorescência, picos de gagueira e picos N-1 (C). Abreviaturas: 6-FAM = 6-carboxyfluoresceína; HEX = hexaclorofluoresceína; STR = repetições de tandem curto; RFU = unidades de fluorescência relativa; BPS = pares de base. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Rede de abrangência mínima mostrando a relação genética entre MLGs de A. fumigatus da Islândia e Territórios do Noroeste no Canadá. Cada nó representa um MLG, onde o tamanho do nó corresponde ao número de cepas para cada MLG. Nós que são mais geneticamente similares têm bordas mais escuras e grossas, enquanto nós geneticamente distantes têm bordas mais claras e finas. Este número foi adaptado a partir de 34. Abreviaturas: ISL = Islândia; NWT = Territórios do Noroeste no Canadá; MLG = genótipo multilocus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Agrupamento genético utilizando Análise Discriminatória de Componentes Principais (DAPC) da Islândia, NWT, Eurasian, Norte-Americano e Oceaniano A. fumigatus . Os isolados foram genótipados em nove loci microsatélites e clonados corrigidos, totalizando 1.703 genótipos multilocus únicos. Os genótipos foram coloridos de acordo com as origens geográficas. Este número foi adaptado a partir de 34. Abreviaturas: DAPC = análise discriminatória dos componentes principais; NWT = Territórios do Noroeste; ISL = Islândia; CMR = Camarões; CAN = Hamilton, Ontário, Canadá; BEL = Bélgica; FRA = França; DEU = Alemanha; IND = Índia; NLD = Países Baixos; NOR = Noruega; NZL = Nova Zelândia; ESP = Espanha; CHE = Suíça; EUA = Estados Unidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

País Temperatura de incubação (°C) Amostras de solo Leveduras isola Espécies conhecidas/ Novas espécies
Camarões 30 493 110 10/9
Canadá 23 300 261 34/12
China 23 340 230 23/5
Costa Rica 30 388 95 20/2
França 23 327 175 12/2
Islândia 14 316 211 11/0
Nova Zelândia 23 610 155 14/4
Peru 23 490 139 30/9
Arábia Saudita 30 562 97 8/1
Total 3826 1473 90/44

Tabela 1: Isolamento da levedura do solo de nove países em seis continentes. A temperatura de incubação de amostras de solo de cada país foi determinada com base em sua temperatura média anual. Os resultados aqui apresentados são adaptados a partir de 9,12.

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Discussion

O protocolo desenvolvido para isolar leveduras e A. fumigatus do solo é um método rápido e eficiente para processamento de solo de alto rendimento e isolamento fúngico. O protocolo requer apenas uma pequena quantidade de solo (0,1-0,2 g) por amostra, permitindo que mais locais sejam amostrados com esforço semelhante. O tempo de retorno rápido garante que os resultados possam ser obtidos em um curto espaço de tempo e permite tempo para solução de problemas e repetição de experimentos, se necessário. Este protocolo pode ser facilmente replicado em muitas configurações de laboratório usando equipamentos padrão de microbiologia e cultura celular. No entanto, ao isolar leveduras ou moldes de solo internacional, são necessárias medidas extras de precaução. Todos os equipamentos plásticos não descartáveis, como bandejas plásticas e espalhadores de células, devem ser esterilizados por submersão em alvejante de 10%, seguido de autoclavagem. O revestimento de banco usado deve ser selado em um saco plástico e esterilizado em uma autoclave antes de descartar.

Para notar, o número e a identidade das leveduras isoladas usando o protocolo acima podem ser limitados pelas condições de incubação e mídia utilizada. Por exemplo, a incubação de 24 horas no tambor de rolo pode favorecer o isolamento de leveduras aeróbicas de rápido crescimento sobre espécies de crescimento lento. Além disso, o uso de meio levem para isolamento de leveduras rico em nutrientes pode ter excluído espécies de leveduras com diferentes requisitos e preferências de nutrientes. Além disso, a maioria dos locais amostrados aqui experimentam variações sazonais de temperatura e outras condições climáticas ao longo do ano. Se o tempo e os recursos permitirem, as mesmas amostras de solo podem ser processadas sob uma gama de temperaturas diferentes para permitir o isolamento de uma gama mais ampla de leveduras que habitam esses solos.

Embora os métodos independentes da cultura sejam cruciais para a elucidação de padrões em larga escala na diversidade fúngica ambiental, eles não conseguem ser suficientemente informativos para grupos direcionados de fungos, como leveduras. O uso do isolamento dependente da cultura permitiu uma investigação abrangente da diversidade global de leveduras do solo e seus preditores9. Embora o estudo de metagenômica conduzido por Tedersoo e colegas tenha identificado preditores e padrões globais na diversidade fúngica do solo, a medida em que esses achados se aplicam especificamente à diversidade de leveduras não poderia ser elucidado2. Tedersoo e colegas identificaram a precipitação anual média como um grande motor climático da diversidade fúngica do solo em todo o mundo2. Este estudo encontrou uma correlação semelhante entre a precipitação anual média e a diversidade de leveduras culturais em solos globais, destacando que métodos dependentes da cultura podem complementar e expandir-se em achados de abordagens de sequenciamento de alto rendimento9.

A adição de clororamfenicol é um passo importante na preparação de mídia sólida e líquida para evitar a interferência do crescimento fúngico por bactérias. A adição de clororamfenicol à mídia líquida é crucial, pois a falta de antibióticos permitirá que as bactérias presentes no solo fermentem. Isso levará à produção de gases que abrirão à força tubos de microcentrifuuuge ou tubos de cultura de 13 mL usados durante a incubação do solo no protocolo. Se a contaminação bacteriana em clorofenicol contendo ágar/caldo for um problema, o clororamfenicol pode ser substituído ou suplementado com antibióticos mais fortes. Ao isolar A. fumigatus do solo, o caldo SD pode ser substituído por uma solução Tween 20 (0,2 M NaCl com 1% Tween 20) para ajudar a suspender a hidrofóbica A. fumigatus conidia35,36. Após a suspensão, 100 μL podem ser banhados em ágar SD e incubados a 50 °C.

Aspergillus fumigatus cresce rapidamente e esporula abundantemente quando incubado sozinho tanto na mídia SD ágar quanto mea entre 22 °C e 50 °C. No entanto, dependendo de que outras espécies termotolerantes estão presentes na amostra do solo, o crescimento e a esporulação de A. fumigatus podem ser dificultados (Figura 3A,D). Sob tal situação, pode-se exigir uma subcultura de uma a várias etapas de subcultura para obter uma colônia pura para posterior colheita e caracterização.

A análise de fragmentos das cepas de A. fumigatus na Figura 5 foi realizada utilizando-se o programa Osíris. Vários artefatos PCR foram destacados na Figura 5C e são discutidos em detalhes por De Valk et al.30. Picos de gagueira B-1 que têm valores de repetição mais curtos são causados pelo deslizamento do fio durante a síntese da cadeia anti-desamparada pela polimerase de DNA. Os picos N-1 ocorrem se a concentração de DNA for muito alta durante a PCR. A concentração de DNA recomendada é de 0,1 ng como indicado no protocolo acima. Outro artefato é o sangramento de corante que pode ser remediado usando rótulos fluorescentes com comprimentos de onda de absorção não sobrepostos. Por exemplo, os rótulos fluorescentes 6-FAM, HEX e ATTO550, bem como o padrão de corante LIZ600, geram picos de fragmentos distintos (Figura 5). Por último, para evitar picos fora de escala, diluir cada reação do PCR (neste caso, foi ~diluição de 50x) antes da eletroforese capilar. Para reduzir ainda mais a fluorescência dos primers avançados nãousuídos na mistura de reação, reduza pela metade as concentrações de primer dianteiros em relação aos primers invertidos ao criar a mistura mestre.

O alto rendimento e a natureza conservadora deste protocolo permite uma aquisição relativamente rápida e fácil de muitas leveduras e moldes de solos. No entanto, existem duas limitações principais presentes com a metodologia amostral. Primeiro, as características morfológicas das colônias de leveduras cultivadas a partir do solo foram utilizadas para selecionar para espécies únicas. Estes foram então subculturados e utilizados para identificação de espécies via sequenciamento its. Isso foi feito para maximizar a representação das espécies de leveduras presentes. No entanto, espécies de leveduras que compartilhavam morfologias semelhantes ou idênticas às colônias selecionadas podem não ser subculturadas. Em segundo lugar, durante o isolamento de A. fumigatus , como apenas uma colônia individual é selecionada por amostra de solo, a presença de múltiplos indivíduos dentro da amostra do solo será perdida. Isso pode levar a uma subrepresentação da verdadeira diversidade genética presente na população amostral, uma vez que genótipos únicos presentes na mesma amostra de solo não serão coletados. Para mitigar essa questão, durante a raia para a etapa de colônia única após a primeira culminagem em mídia sólida, várias colônias únicas podem ser coletadas para obter genótipos adicionais. O pequeno volume de solo utilizado por amostra ajuda a minimizar essa limitação amostral quando comparado com métodos que utilizaram maiores quantidades de solo por amostra.

O uso deste protocolo de alto rendimento e de mão-de-obra eficiente para o isolamento de levedura e mofo aumentará o número de indivíduos dentro da população do solo, ao mesmo tempo em que utiliza menos esforço por amostra. O aumento do poder estatístico proporcionará uma melhor imagem das comunidades de leveduras culturais dentro do solo e ajudará a caracterizar as populações de solos de A. fumigatus.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada por subsídios do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (Grant No. ALLRP 570780-2021) e Universidade McMaster.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt Inc 72.690.001
Benomyl powder  Toronto Research Chemicals B161380
Chloramphenicol powder  Sigma-Aldrich SKU: C0378-5G
Dextrose Sigma-Aldrich SKU: D9434-500G
Fragment Analysis Software NCBI's Osiris https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence database NCBI GenBank  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence database UNITE  https://unite.ut.ee/
Peptone Sigma-Aldrich SKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders  Fisher Scientific 08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes  Sarstedt Inc 83.3902
Sterile 13 mL culture tubes  Sarstedt Inc 62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks  Fisher Scientific 23-400-112
Yeast extract Sigma-Aldrich SKU: Y1625-250G

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