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Biology

Aislamiento de levaduras y mohos cultivables de los suelos para investigar la estructura de la población de hongos

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/63396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, McMaster University

Summary

Este protocolo es un método eficaz y rápido de cultivo de levaduras y el moho Aspergillus fumigatus a partir de grandes conjuntos de muestras de suelo en tan solo 7 días. Los métodos se pueden modificar fácilmente para acomodar una variedad de medios de incubación y temperaturas según sea necesario para los experimentos.

Abstract

El suelo alberga una increíble cantidad de vida microbiana, y cada gramo contiene hasta miles de millones de células bacterianas, arqueas y fúngicas. Los hongos multicelulares como los mohos y los hongos unicelulares, ampliamente definidos como levaduras, cumplen funciones esenciales en los ecosistemas del suelo como descomponedores de material orgánico y como fuentes de alimento para otros habitantes del suelo. La diversidad de especies de hongos en el suelo depende de una multitud de factores climáticos como la lluvia y la temperatura, así como de las propiedades del suelo, incluida la materia orgánica, el pH y la humedad. La falta de un muestreo ambiental adecuado, especialmente en regiones de Asia, África, América del Sur y América Central, dificulta la caracterización de las comunidades de hongos del suelo y el descubrimiento de nuevas especies.

Caracterizamos comunidades de hongos del suelo en nueve países de seis continentes utilizando ~ 4,000 muestras de suelo y un protocolo desarrollado en el laboratorio para el aislamiento de levaduras y mohos. Este protocolo comienza con un enriquecimiento selectivo separado para levaduras y el moho médicamente relevante Aspergillus fumigatus, en medios líquidos mientras inhibe el crecimiento bacteriano. Las colonias resultantes se transfieren a medios sólidos y se procesan posteriormente para obtener cultivos puros, seguidos de la caracterización genética posterior. La identidad de las especies de levadura se establece a través de la secuenciación de su región espaciadora transcrita interna (ITS) del grupo de genes de ARN ribosómico nuclear, mientras que la estructura de la población global de A. fumigatus se explora a través del análisis de marcadores de microsatélites.

El protocolo se aplicó con éxito para aislar y caracterizar las poblaciones de levadura del suelo y A. fumigatus en Camerún, Canadá, China, Costa Rica, Islandia, Perú, Nueva Zelanda y Arabia Saudita. Estos hallazgos revelaron información muy necesaria sobre los patrones globales en la diversidad de levaduras del suelo, así como la estructura de la población mundial y los perfiles de resistencia antifúngica de A. fumigatus. Este artículo presenta el método de aislamiento tanto de levaduras como de A. fumigatus a partir de muestras internacionales de suelo.

Introduction

Los hongos en los ecosistemas del suelo desempeñan un papel esencial en la descomposición de la materia orgánica, el ciclo de nutrientes y la fertilización del suelo1. Tanto los enfoques independientes del cultivo (es decir, secuenciación de alto rendimiento) como los centrados en el cultivo son ampliamente utilizados en el estudio de los hongos del suelo 2,3. Si bien la gran cantidad de datos generados por la secuenciación de metacódigo de barras de alto rendimiento es útil para dilucidar patrones a gran escala en la estructura y diversidad de la comunidad, el enfoque dependiente de la cultura puede proporcionar información altamente complementaria sobre las estructuras taxonómicas y funcionales de las comunidades de hongos, así como perfiles más específicos de organismos individuales a través de la diversidad aguas abajo y los análisis funcionales debido a la disponibilidad de cultivos de hongos puros.

A pesar de que rara vez superan los miles de células por gramo de suelo, las levaduras, ampliamente definidas como hongos unicelulares, son descomponedores esenciales y fuentes de alimento para otros habitantes del suelo 4,5. De hecho, las levaduras pueden ser los hongos predominantes del suelo en biosferas frías como la Antártida continental 6,7. El suelo es también un reservorio primario de levaduras médicamente relevantes que causan infecciones oportunistas graves en humanos y otros mamíferos8. A pesar de las similitudes morfológicas, las especies de levadura son filogenéticamente diversas y se encuentran entre los hongos filamentosos en dos filos principales, Ascomycota y Basidiomycota, dentro del reino fúngico9. Las levaduras carecen de una firma de ADN definitoria en el gen de código de barras fúngico, la región espaciadora transcrita interna (ITS) del grupo de genes de ARN ribosómico nuclear10, lo que las hace indistinguibles de otros hongos en las investigaciones de metagenómica y, por lo tanto, requieren el uso de métodos dependientes del cultivo para aislar especies de levaduras.

El siguiente protocolo se implementó para caracterizar las comunidades de levadura del suelo de nueve países e identificar las tendencias y patrones globales en la diversidad de levaduras del suelo 9,11,12. Los enfoques de metagenómica son de uso limitado cuando se estudian grupos específicos de organismos como las levaduras 2,3. Debido a su diversidad filogenética, las levaduras no se pueden distinguir de otros hongos basándose solo en la secuencia de ADN. Por lo tanto, el estudio de las poblaciones de levadura requiere el uso continuo del aislamiento dependiente del cultivo. Sin embargo, el cultivo a menudo consume mucho más tiempo y requiere más personal para realizar los experimentos. Por lo tanto, el protocolo se ha optimizado y optimizado para un procesamiento más rápido con personal limitado. La principal ventaja del cultivo es que las especies de levadura identificadas son levaduras vivas y no muertas, y por lo tanto es más probable que sean verdaderos habitantes del suelo en lugar de células transitorias presentes en los suelos. Se ha estimado que aproximadamente el 40% del ADN fúngico en el suelo son contaminantes de otros ambientes, extracelulares, o provienen de células que ya no están intactas, lo que provoca enfoques de secuenciación de alto rendimiento para sobreestimar la riqueza de hongos hasta en un 55%13. El aislamiento dependiente del cultivo puede confirmar fácilmente la identidad de las especies de levadura con el beneficio adicional de asegurar el cultivo puro para ser utilizado en análisis posteriores. De hecho, se identificaron cultivos puros de 44 nuevas especies de levaduras putativas utilizando este protocolo de aislamiento del suelo que permitió el uso de una variedad de métodos para estudiar sus propiedades taxonómicas y funcionales en detalle14.

El siguiente protocolo también se puede utilizar para aislar mohos presentes en el suelo, como A. fumigatus. Aspergillus fumigatus es un moho termófilo y saprófito con una amplia distribución global en el suelo15. Se ha aislado de numerosos entornos clínicos y no clínicos. El muestreo no clínico comúnmente incluye aire, desechos orgánicos (compost, polvo de sierra, desechos de bulbos de tulipanes) y suelo (suelos agrícolas, de jardín y naturales)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus es un patógeno oportunista humano que causa una serie de infecciones denominadas colectivamente aspergilosis, que afectan a más de 8 millones de personas en todo el mundo16,20. Aproximadamente 300.000 personas en todo el mundo sufren de aspergilosis invasiva, que es la forma más grave de aspergilosis16. Dependiendo de factores como la población de pacientes, el sitio de infección y la eficacia de la terapia antifúngica, la tasa de mortalidad puede ser tan alta como el 90%. En las últimas décadas, la resistencia a las terapias antifúngicas ha aumentado, lo que requiere esfuerzos de vigilancia global en poblaciones clínicas y ambientales para rastrear estos genotipos de resistencia 21,22,23. Dada su capacidad para crecer a temperaturas superiores a 50 °C, esta temperatura puede aprovecharse para seleccionar aislados de A. fumigatus del suelo utilizando métodos dependientes del cultivo. Los aislados de Aspergillus fumigatus se genotipan comúnmente en nueve loci de repetición corta en tándem (STR) altamente polimórficos, que han demostrado tener un alto poder discriminatorio entre cepas24. Estos genotipos STR se pueden comparar con otras poblaciones previamente encuestadas para rastrear la propagación de los genotipos de A. fumigatus, incluidos los genes de resistencia a los medicamentos, en todo el mundo.

A continuación describimos un protocolo para el aislamiento rápido de levaduras y A. fumigatus de muestras de suelo de una manera dependiente del cultivo. Dependiendo de la cantidad de suelo obtenido por muestra, las muestras de suelo se pueden compartir entre los dos protocolos. En comparación con métodos similares que aíslan levadura y A. fumigatus del suelo, este protocolo utiliza 10 veces menos suelo por aislado obtenido. Los estudios que intentan aislar A. fumigatus del suelo requieren entre 1 y 2 g de suelo por aislado, mientras que este protocolo requiere solo 0.1-0.2 g de suelo 18,19,25. Este protocolo utiliza plásticos y contenedores más pequeños que facilitan su diseño de alto rendimiento. Por lo tanto, se puede procesar un mayor número de muestras utilizando menos espacio para equipos como incubadoras y tambores. Las muestras de suelo se pueden procesar completamente para obtener aislamientos en tan solo 7 días. Este protocolo ha sido optimizado para permitir el procesamiento de hasta 150-200 muestras por día por persona.

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Protocol

NOTA: Cualquier paso que utilice muestras internacionales de suelo y / o esporas y micelios de A. fumigatus requiere trabajar dentro de un gabinete de bioseguridad para organismos de nivel 2 (BSCII).

1. Aislamiento de levadura del suelo

  1. Preparación de soluciones antibacterianas y antifúngicas
    1. Suspenda el polvo de cloranfenicol en etanol al 70% para preparar una solución madre de 50 g/L. Esterilizar mediante filtración con jeringa y conservar a 4 °C.
      NOTA: Este antibiótico evitará el crecimiento de la mayoría de las bacterias durante el aislamiento de levaduras en el suelo. Como las bacterias resistentes al cloranfenicol aún pueden crecer, la morfología de la colonia debe tenerse en cuenta cuidadosamente al distinguir las levaduras de las bacterias. Se pueden agregar antibióticos adicionales a los medios cuando se trabaja con suelo sospechoso de contener cepas bacterianas resistentes a los antibióticos. La contaminación bacteriana en medios suplementados con cloranfenicol no fue un problema encontrado al aislar levaduras de suelos ambientales.
    2. Suspenda el polvo de benomilo en DMSO para preparar una solución madre de 5 g/L. Esterilizar mediante filtración con jeringa y conservar a 4 °C.
      NOTA: Este fármaco antifúngico selectivo previene el crecimiento de la mayoría de los hongos filamentosos sin afectar el crecimiento de levaduras durante el aislamiento de levaduras en el suelo26,27.
  2. Preparación de medios de cultivo y equipos estériles
    1. Para preparar el caldo YEPD (Extracto de Levadura-Peptona-Dextrosa), agregue 10 g de Extracto de Levadura, 20 g de peptona y 20 g de dextrosa a 1 L de agua doble destilada. Revuelva hasta que esté bien mezclado y en autoclave durante 40 min a 121 °C. Conservar a temperatura ambiente hasta su uso.
    2. Medio de agar sólido YEPD
      1. Mezcle 10 g de extracto de levadura, 20 g de peptona, 20 g de dextrosa y 20 g de agar en 1 L de agua. Revuelva bien para mezclar y autoclave durante 40 min a 121 °C.
      2. Una vez suficientemente enfriado, agregue 1 ml de cloranfenicol y benomilo de soluciones madre para llevar las concentraciones finales de los dos antimicrobianos a 50 mg / L y 5 mg / L, respectivamente.
      3. Mezclar bien revolviendo y verter en placas de Petri de 10 cm de diámetro. Dejar a temperatura ambiente durante la noche para fijar y almacenar a 4 °C hasta su uso.
        NOTA: A partir de 1 L de YEPD, se pueden verter aproximadamente 40 placas.
    3. Esterilice los palitos aplicadores de punta lisa de madera y los esparcidores de células reutilizables mediante autoclave y guárdelos a temperatura ambiente.
  3. Incubación del suelo en caldo líquido
    1. Prepare un conjunto de tubos de cultivo estériles de 13 ml etiquetándolos con id de muestra de suelo.
    2. Usando una pipeta serológica, agregue 5 ml de caldo YEPD suplementado con cloranfenicol y benomilo en cada tubo.
    3. Trabajando en un BSCII, transfiera ~ 0.1 g de tierra al tubo de cultivo apropiado usando un aplicador estéril de madera de punta plana.
      NOTA: Use un aplicador fresco para cada muestra de suelo y deseche inmediatamente después de su uso para evitar la contaminación cruzada entre muestras.
    4. Cubra el tubo de forma segura hasta la primera parada para evitar derrames, pero aún así permita el intercambio de aire durante la incubación. Incubar los tubos de cultivo en un tambor de rodillos durante 24 h a una temperatura que se considere óptima para maximizar el crecimiento de la levadura.
      NOTA: La temperatura de incubación debe decidirse en función de la temperatura media anual del país de origen de las muestras de suelo. Por ejemplo, al aislar levaduras de suelo de Islandia, los tubos de cultivo se incubaron a 14 ° C, mientras que los suelos de Arabia Saudita se incubaron a 30 ° C. Debido al crecimiento más lento de la levadura a temperaturas más bajas, el tiempo de incubación podría tener que extenderse hasta 72 h.
  4. Transfiera el sobrenadante al medio sólido.
    1. Utilizando el conjunto de placas de Agar YEPD + cloranfenicol + benomilo preparadas en el Paso 1.2, etiquételas con la identificación de la muestra de suelo.
    2. Retire los tubos de cultivo preparados en el paso 1.3 del tambor de rodillos. Trabajando en un BSCII, vórtice brevemente el tubo para dibujar las partículas del suelo y las células que pueden haberse asentado en la parte inferior de nuevo en suspensión.
    3. Usando una micropipeta, transfiera 100 μL del sobrenadante a una placa. Use un esparcidor celular estéril y reutilizable para esparcir el líquido a fondo y uniformemente sobre la superficie del agar.
      NOTA: Trabajar en conjuntos de 10 muestras puede acelerar significativamente este proceso. Pipetear el sobrenadante en 10 placas primero y luego realizar la propagación. Utilice un esparcidor fresco para cada muestra para evitar la contaminación cruzada entre muestras.
    4. Apilar las placas en bolsas de plástico, sellar e incubar boca abajo durante 2-3 días a la misma temperatura utilizada anteriormente para la incubación de caldo líquido hasta que el crecimiento microbiano sea visible.
  5. Detección de levaduras y rayas para colonias individuales
    1. Después de permitir un tiempo de incubación suficiente (generalmente 2-3 días, pero puede tomar más tiempo a temperaturas más bajas), inspeccione las placas en un BSCII para detectar cualquier crecimiento de levadura. Busque levaduras cremosas, redondas y mates que se distingan fácilmente de las colonias bacterianas y de moho.
      NOTA: Algunas levaduras producen pigmentos de color y pueden aparecer negras / marrones, amarillas o rojas, pero su textura y forma general de colonia sería similar a las levaduras no pigmentadas.
    2. Seleccione una colonia similar a la levadura de cada placa para su posterior procesamiento.
      NOTA: Si se observa más de un tipo de morfología en una sola placa, seleccione una colonia representativa para cada tipo morfológico.
    3. Usando palos aplicadores estériles de madera de punta lisa, transfiera cada colonia seleccionada a una placa y raya fresca de YEPD + cloranfenicol + benomilo para colonias individuales. Realiza tres rachas separadas.
      1. Veta hacia adelante y hacia atrás más de un tercio de la placa usando una varilla aplicadora. Comience la segunda y tercera racha rayando el aplicador a través de la racha anterior una vez. Use una nueva barra aplicadora para cada raya.
        NOTA: Use una placa por aislado. Deseche los aplicadores inmediatamente después de su uso para evitar la contaminación cruzada entre muestras.
    4. Apilar las placas en bolsas de plástico, sellar e incubar boca abajo durante 2-3 días a la misma temperatura utilizada anteriormente hasta que las colonias individuales se hagan visibles.
  6. Identificación de especies de levaduras mediante secuenciación ITS
    1. Seleccione una colonia única bien separada por aislado de suelo y subcultivo en una placa fresca de YEPD + cloranfenicol + benomilo para obtener más células. Incubar durante 2-3 días a la misma temperatura utilizada anteriormente.
    2. Cosechar las células recién cultivadas y suspenderlas en tubos congeladores de -80 °C que contengan 1 ml de glicerol esterilizado al 30% en agua de doble destilación para crear suspensiones celulares. Mantenga estas suspensiones a -80 °C como soluciones de stock.
    3. Utilizar células frescas para realizar colonias PCR (reacción en cadena de la polimerasa) con cebadores ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') e ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') para amplificar el gen del código de barras fúngico, ITS9. Utilice las siguientes condiciones de termociclado: un paso de desnaturalización inicial a 95 °C durante 10 min seguido de 35 ciclos de (i) 95 °C durante 30 s, (ii) 55 °C durante 30 s y (iii) 72 °C durante 1 min.
      NOTA: La PCR de colonias tiene una alta tasa de éxito y un tiempo de respuesta más rápido que la extracción de ADN seguida de PCR.
    4. Si la PCR de colonia falla repetidamente para una cepa, extraiga el ADN utilizando el protocolo de elección y realice its PCR utilizando el ADN genómico extraído como plantilla (use las mismas condiciones de termociclado que las anteriores).
      NOTA: Se recomienda una extracción de ADN basada en cloroformo relativamente barata28.
    5. Realice la secuenciación de Sanger para determinar la secuencia de ADN de la región ITS amplificada para cada cepa.
    6. Comparar la secuencia ITS obtenida de las cepas de levadura con secuencias depositadas en bases de datos públicas como NCBI GenBank y UNITE para establecer la identidad de la especie.

2. Aislamiento de Aspergillus fumigatus del suelo

  1. Preparar 1 ml de caldo de dextrosa Sabouraud estéril (SDB) suplementado con el antibiótico cloranfenicol por muestra de suelo.
    1. Añadir 10 g de peptona y 20 g de dextrosa a 1 L de agua destilada. Autoclave a 121 °C durante 40 min.
    2. Deje que el SDB se enfríe a ~ 50 ° C, agregue 1 ml de 50 g / L de cloranfenicol para llevar la concentración a 50 mg / L.
      NOTA: El cloranfenicol se prepara igual que se describió anteriormente para el aislamiento de levaduras. Además de inhibir el crecimiento bacteriano, el cloranfenicol también previene la producción de gas a partir de bacterias que harán que los tubos se abran durante la etapa de incubación detallada en el Paso 2.2.
    3. Asepticamente alícuota 1 mL de SDB en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL por muestra de suelo utilizando una pipeta mecánica.
  2. Agregue tierra a los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
    1. Coloque una capa de banco o un acolchado absorbente dentro de un BSCII para ayudar en la eliminación del suelo derramado.
    2. Usando barras aplicadoras en autoclave, transfiera aproximadamente 0,1 g de tierra a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 1 ml de SBD. Cierre el tubo y el vórtice. Incubar el suelo suspendido a 50 °C durante 3 días.
      NOTA: No se requiere agitación durante la incubación.
  3. Cosecha micelia de caldo inoculado en el suelo
    1. Prepare placas de agar de extracto de malta (MEA).
      1. Por litro de MEA: añadir 20 g de extracto de malta, 20 g de dextrosa, 6 g de peptona y 15 g de agar a 1 L de agua destilada. Autoclave a 121 °C durante 40 min.
      2. Deje que el MEA se enfríe a ~ 50 ° C, luego agregue 1 ml de 50 g / L de cloranfenicol para llevar a una concentración final de 50 mg / L.
    2. Transfiera el micelio del caldo inoculado por el suelo a las placas MEA.
      1. Identifique los inóculos del suelo que tienen un crecimiento micelial visible en el límite SDB a aire.
      2. Use palos aplicadores de punta lisa de madera esterilizados para transferir el micelio al centro de una placa MEA. Incubar las placas MEA a 37 °C durante 3 días.
  4. Selección de micelios con propiedades morfológicas de A. fumigatus .
    1. Identificar colonias de moho que tengan propiedades morfológicas características de A. fumigatus (crecimiento similar al ante verde).
    2. Trabajando en un BSCII, use palos aplicadores de madera esterilizados de punta lisa o un lazo de inoculación para cosechar conidios / micelios raspando la superficie una vez. Transfiera las esporas / micelios al centro de una placa MEA rayando en el agar para colonias individuales. Incubar a 37 °C durante 2 días.
      NOTA: Como múltiples cepas de A. fumigatus y / u otros hongos pueden estar presentes en la placa, es importante rayar para colonias individuales. Se puede utilizar el protocolo de rayado de colonia única en el Paso 1.5.3 en el protocolo de aislamiento de levadura.
    3. Usando un palo aplicador estéril o un bucle de inoculación, subcultivar una sola colonia generada en el Paso 2.4.1.2 en MEA rayando la colonia una vez. Extienda las esporas cosechadas en el centro de la placa. Incubar a 37 °C durante 2 días.
  5. Recolección de esporas/micelios de A. fumigatus para almacenamiento en cultivo
    1. Prepare una solución estéril de glicerol al 30% (para una solución de 100 ml, agregue 30 ml de glicerol al 100% mezclado con 70 ml de agua de doble destilación, esterilizada a 121 ° C durante 40 min).
    2. Trabajando en un BSCII, use una pipeta p1000 para aspirar 1 ml de la solución de glicerol al 30%. Dispense 1 ml de solución de glicerol sobre la colonia de A. fumigatus para cosechar esporas / micelios.
      1. Debido a la hidrofobicidad de las esporas / micelios de A. fumigatus , use la punta de la pipeta para rascar una región densamente esporulada de la placa.
        NOTA: Cuando se dispensa glicerol en el rasguño, el glicerol se adheriría al área del rasguño en lugar de rodar sobre el agar.
      2. Dispense lentamente el glicerol en el área del rasguño para desalojar las esporas y suspenderlas en la solución de glicerol.
      3. Una vez que esté completamente dispensado, incline ligeramente la placa y aspire la suspensión de esporas / micelios de glicerol.
        NOTA: Se aspirarán aproximadamente de 750 a 800 μL.
      4. Transfiera el aspirado a un tubo congelador estéril y guárdelo a -80 °C. Si es necesario, cree material de trabajo repitiendo los pasos 2.5.2.1 a 2.5.2.4.
  6. Identificación fenotípica de cepas de A. fumigatus
    1. Utilizando el stock de esporas creado a partir del paso 2.5.2, cree una dilución de 100x en agua.
      1. Aspirar 10 μL de las cepas de micelios y esporas y dispensar en 990 μL de agua. Vórtice la suspensión.
    2. Dispense 10 μL de la suspensión de esporas diluida en un portaobjetos de microscopio estándar.
    3. OPCIONAL: Manche la suspensión micelial y de esporas con azul de metileno.
      1. Para manchar con azul de metileno, fije los conidios y los conidióforos al portaobjetos pasando el portaobjetos sobre un quemador Bunsen hasta que se seque.
      2. Aplicar azul de metileno durante 1-2 min y lavar con agua.
      3. Seque la diapositiva con papel secante.
    4. Usando un microscopio compuesto a un aumento de 400x, vea la suspensión y localice los conidióforos. Compare la morfología del conidióforo observada con la morfología del conidióforo de A. fumigatus .
  7. Identificación molecular de cepas de A. fumigatus
    1. Extraiga ADN de cada aislado siguiendo protocolos comunes de extracción de ADN fúngico.
    2. Utilizando cebadores específicos de los genes Aspergillus β-tubulina (β-tub1 y β-tub4), ejecutar PCR y obtener la secuencia para los productos amplificados, siguiendo los protocolos descritos por Alcazar-Fuoli et al.17.
      1. Compare las secuencias obtenidas con las secuencias depositadas en bases de datos públicas como NCBI GenBank utilizando BLAST.
      2. Confirme que las secuencias de deformación son una coincidencia superior con las secuencias de A. fumigatus en la base de datos.
    3. Alternativa al paso 2.7.2, ejecute una reacción de PCR multiplex dirigida a los tipos de apareamiento de A. fumigatus MAT1-1 y MAT1-229.
      1. Utilice las siguientes tres secuencias de cebador en la reacción multiplex PCR: AFM1: 5'-CCTTGACGCGATGGGGTGG-3'; AFM2: 5′-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3′; AFM3: 5′-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3′.
      2. Utilice los siguientes parámetros del termociclador: 5 min a 95 °C, 35 ciclos de 30 s a 95 °C, 30 s a 60 °C y 1 min a 72 °C antes de un último 5 min a 72 °C.
      3. Ejecute la electroforesis en gel para identificar los productos; busque 834 pb MAT-1 o 438 pb MAT1-2. Utilice cepas de A. fumigatus que hayan confirmado la amplificación del tipo de apareamiento como controles positivos y negativos.
  8. Genotipado de microsatélites de cepas de A. fumigatus mediante análisis de fragmentos
    NOTA: Aunque los pasos enumerados a continuación cubren ampliamente el genotipado de A. fumigatus en nueve loci de microsatélites (STR), solo se han destacado algunas consideraciones importantes. Para obtener más información sobre el genotipado str de A. fumigatus, consulte De Valk et al.24,30.
    1. Preparar tres mezclas maestras multiplex de PCR utilizando los cebadores STRAf previamente descritos por De Valk et al.24.
      1. Etiquete fluorescentemente los cebadores hacia adelante para determinar el tamaño del fragmento a través de la electroforesis capilar. Asegúrese de que la concentración de los cebadores delanteros sea la mitad (0,5 μM) que la de los cebadores inversos (1 μM) dentro de la mezcla maestra.
        NOTA: Para obtener los mejores resultados, use etiquetas fluorescentes que tengan longitudes de onda de absorbancia que coincidan con las del estándar de tinte elegido utilizado durante la electroforesis capilar.
      2. Use polimerasa de arranque en caliente para obtener los mejores resultados.
      3. Utilice una concentración de ADN de 0,1 ng por reacción.
    2. Ejecute la PCR multiplex para cada cepa utilizando el siguiente programa de PCR: 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de 95 °C durante 30 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 60 s, seguido de 72 °C durante 10 min y una retención a 4 °C.
    3. Compruebe si hay productos amplificados a través de la electroforesis en gel.
    4. Diluya los productos al nivel deseado (típicamente ~ 50x) según lo recomendado por los especialistas en análisis de fragmentos y ejecute la electroforesis capilar. Realice tres tiradas para cada cepa, y cada tirada cubrirá tres reacciones multiplexadas con tres sondas fluorescentes diferentes.
    5. Para determinar el tamaño de fragmento correcto para cada uno de los nueve loci STR, utilice un software capaz de análisis de fragmentos.
      1. Recuperar los datos brutos obtenidos de la electroforesis capilar. Puntúe los tamaños de los fragmentos en función del pico más grande utilizando el software de análisis de fragmentos (por ejemplo, Osiris).
      2. Convierta los tamaños de fragmento en números repetidos para cada uno de los nueve loci. Utilizar los tamaños de fragmento de los números de repetición de la cepa de referencia Af293 descrita anteriormente por De Valk et al.24.
        NOTA: Pueden ocurrir ligeras variaciones en el tamaño de los fragmentos entre diferentes plataformas de electroforesis capilar. Por lo tanto, es importante incluir una cepa de referencia común (y una escalera interna) con un tamaño de fragmento conocido para cada uno de los nueve loci para las cepas de genotipado.

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Representative Results

Aislamiento de levadura del suelo
El protocolo de aislamiento de levaduras anterior se implementó para cultivar levaduras a partir de muestras de suelo originarias de 53 ubicaciones en nueve países 9,12. En total, se aislaron 1.473 cepas de levadura de 3.826 muestras de suelo. Dadas las diferentes condiciones climáticas de los nueve países de origen, la mejor temperatura de incubación para cada país se determinó en función de su temperatura media anual (Tabla 1). Dado el crecimiento más lento de la levadura a 14 ° C, las muestras de suelo de Islandia se incubaron en un tambor de rodillos durante 48 h adicionales (96-120 h en total). Después de 2-3 días de incubación en medio sólido, el crecimiento microbiano fue visible en placas para todas las muestras (Figura 1A). Una colonia seleccionada al azar para cada morfología de levadura presente en una placa fue rayada para colonias individuales en placas frescas (Figura 1B).

La tasa de aislamiento exitoso de levaduras difirió entre los países (Tabla 1). Por ejemplo, se cultivaron 97 cepas de levadura a partir de 562 muestras de suelo de Arabia Saudita (17,3%), mientras que se cultivaron 261 levaduras a partir de 300 muestras de suelo canadienses (87%). Se debe realizar un análisis de rarefacción para determinar si se ha realizado un muestreo suficiente del suelo para obtener estimaciones precisas de la verdadera diversidad de levaduras en los lugares muestreados. Se preformó un ejemplo de análisis de rarefacción para cada país donde se utilizó el índice de diversidad de Shannon como medida de la diversidad de levaduras del suelo (Figura 2). Las curvas de rarefacción resultantes se acercaron a la asintota de saturación, lo que indica que no era probable que el muestreo adicional hubiera producido más diversidad de levaduras.

La secuenciación de la región ITS reveló que los 1.473 aislados de levadura se pueden clasificar en 134 especies distintas. Esto incluyó 90 especies conocidas y 44 especies potencialmente nuevas. Aplicamos un modelo de efectos mixtos para identificar predictores de la diversidad global de levaduras cultivables del suelo, cuantificada por el índice de diversidad de Shannon31. En este modelo, la precipitación media anual, la temperatura media anual, la elevación y la distancia al ecuador de las ubicaciones de muestreo se ajustaron como efectos fijos, mientras que el país de muestreo se estableció como un efecto aleatorio9. Este modelo identificó que la precipitación media anual se correlacionó significativamente con el índice de diversidad de Shannon (p = 0,012), mientras que no se encontraron correlaciones significativas entre otras variables predictoras y el índice de diversidad de Shannon9.

Para comparar este protocolo basado en el cultivo con los métodos independientes del cultivo, comparamos estos hallazgos con un estudio previo de Tedersoo y sus colegas que investigó la diversidad global de hongos del suelo utilizando metagenómica2. Tedersoo y sus colegas realizaron una secuenciación de alto rendimiento de la región ITS en ADN extraído directamente de muestras de suelo de 39 países, cuatro de los cuales, a saber, Camerún, Canadá, China y Nueva Zelanda, también fueron muestreados en este estudio. Se realizaron búsquedas BLAST para identificar las secuencias its presentes en ambos conjuntos de datos32, y se encontró que el 26% de las secuencias ITS tenían una coincidencia significativa (identidad de nucleótidos >98,41%) en el conjunto de datos de metagenómica. Sin embargo, <3% coincidió con una secuencia fúngica del mismo país, mientras que el 23% restante coincidió con una secuencia fúngica encontrada en un país diferente9. Tuvimos más éxito que el estudio de metagenómica al anotar las secuencias its con la identidad de las especies de levadura. Tedersoo y sus colegas informaron un total de 50,589 unidades taxonómicas operativas de hongos (OTU), con el número de OTU de levadura no conocido. De estas OTU fúngicas, el 33% fueron simplemente anotadas como environmental_sequence (724, 1.4%), uncultured_soil_fungus (2,405, 4.8%), uncultured_ectomycorrhizal_fungus (1,407, 2.8%), o uncultured_fungus (11,898, 23.5%).

Aislamiento de Aspergillus fumigatus del suelo
Después de 3 días de incubación del suelo a 50 °C en 1 mL de SDB en un tubo de microcentrífuga, se puede encontrar micelio creciendo dentro del SDB, en el límite de SDB a aire y / o en las paredes interiores. El micelio de Aspergillus fumigatus se encuentra típicamente creciendo en el límite de SDB a aire, pero también se puede cosechar justo debajo de la superficie de SDB. Después de este paso, los micelios se transfieren a MEA y se cultivan durante 3 días a 37 ° C. El crecimiento micelial en las placas sólo puede formar la morfología de gamuza verde típica de A. fumigatus (Figura 3A). Más comúnmente, otros mohos termotolerantes pueden estar presentes dentro del mismo suelo y crecer con A. fumigatus en la misma placa o por sí mismos (Figura3B-D). Las tasas de aislamiento de Aspergillus fumigatus pueden variar entre ubicaciones geográficas, similar a lo que se ha encontrado para las levaduras del suelo. Por ejemplo, dentro de Vancouver, Canadá, se obtuvieron 251 aislamientos a través de este método de 540 muestras de suelo (46,5%) (resultados no publicados). Por el contrario, en Camerún se recolectaron 51 aislados de A. fumigatus de 495 muestras de suelo (10,3%)33.

La estructura del conidióforo de A. fumigatus se puede ver e identificar mediante microscopía de luz. Los conidióforos tienen una bola en la morfología del palo (Figura 4). Además, los conidióforos de A. fumigatus son uniseriados, donde los fialides, unidos a las cadenas de conidios, están unidos directamente a la vesícula esférica. En otras especies de Aspergillus, los conidióforos son biseriados, donde los fialides están conectados a metulae unidos a la vesícula.

Varios programas de software están disponibles para realizar el análisis de fragmentos de los datos en bruto de la electroforesis capilar, convirtiendo el espectro de electroforesis capilar en tamaños de fragmentos. La Figura 5 es un cromatograma generado por el programa Osiris. Se muestran los tres canales que visualizan las longitudes de los fragmentos de loci STR de A. fumigatus dinucleótido (2A, 2B y 2C), trinucleótido (3A, 3B y 3C) y tetranucleótido (4A, 4B y 4C). Además, también se muestran artefactos de PCR que ocurren si la concentración de ADN de la muestra durante la PCR es demasiado alta. Los picos más altos de cada color representan los tamaños de fragmento de los tres loci STR en esta gráfica.

La variación genética presente entre los genotipos STR de A. fumigatus se puede visualizar utilizando el paquete R poppr. El script R bruvo.msn crea una matriz de distancias genéticas de Bruvo por pares entre cada par de genotipos. Esta matriz se utiliza para generar una red de expansión mínima (MSN). A continuación, se puede generar un MSN de alta calidad utilizando el script R plot_poppr_msn o imsn (Figura 6). Un análisis discriminatorio de los componentes principales (DAPC) es otro método para visualizar las relaciones genéticas entre las cepas (Figura 7). El script de R dapc en el paquete de R adegenet se utiliza para realizar DAPC y se puede utilizar con grupos anteriores conocidos o desconocidos. Con grupos anteriores desconocidos, utiliza la agrupación de medios K para identificar el número probable de grupos de individuos.

Figure 1
Figura 1: Aislamiento de levadura a partir de muestras de suelo. (A) El crecimiento microbiano es visible en el agar sólido después de 2-3 días de incubación. Las colonias de levadura se pueden ver intercaladas entre otras colonias fúngicas / bacterianas. Se selecciona una colonia de levadura representativa para cada tipo morfológico en una placa para rayar colonias individuales. (B) Se realizan tres rayas para obtener colonias individuales de aislados de levadura. Se utilizó una placa para obtener cada aislado de suelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Análisis de rarefacción del muestreo de suelos. En cada uno de los nueve países muestreados, la diversidad de levaduras del suelo, cuantificada por el índice de diversidad de Shannon, se acerca a la saturación a medida que aumenta el número de muestras de suelo. Esta cifra fue adaptada de 9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Morfología de Aspergillus fumigatus en el dextroseagar de Sabouraud. (A) Morfología del crecimiento de A. fumigatus similar a una gamuza verde. (B-D) A. fumigatus crecimiento con otros mohos termófilos presentes dentro de la muestra de suelo. La conidiación de A. fumigatus se reduce visiblemente en B y D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Foto de un conidióforo de Aspergillus fumigatus bajo un microscopio de luz. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Salida de Osiris de nueve loci microsatélites de una cepa de Aspergillus fumigatus . Las salidas corresponden a los loci (A) Dinucleótido (2A, 2B y 2C), (B) trinucleótido (3A, 3B y 3C) y (C) tetranucleótido (4A, 4B y 4C). Las etiquetas fluorescentes de 5' de la imprimación delantera son: A = 6-FAM; B = HEX; C = ATTO550. Los productos de reacción multiplex se diluyeron 30 veces antes de la electroforesis capilar. El estándar de tinte LIZ600 se utilizó durante la electroforesis capilar. Los datos brutos se analizaron utilizando el software de análisis de picos Osiris identificando picos potenciales entre 60 y 400 pb. Varios artefactos de PCR son picos fuera de escala que causan sangrado de fluorescencia, picos de tartamudeo y picos de N-1 (C). Abreviaturas: 6-FAM = 6-carboxifluoresceína; HEX = hexaclorofluoresceína; STR = repeticiones cortas en tándem; RFU = unidades de fluorescencia relativas; BPS = pares de bases. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Red de expansión mínima que muestra la relación genética entre los MLG de A. fumigatus de Islandia y los Territorios del Noroeste en Canadá. Cada nodo representa un MLG, donde el tamaño del nodo corresponde al número de cepas para cada MLG. Los nodos que son genéticamente más similares tienen bordes más oscuros y gruesos, mientras que los nodos genéticamente distantes tienen bordes más claros y delgados. Esta cifra fue adaptada de 34. Abreviaturas: ISL = Islandia; NWT = Territorios del Noroeste en Canadá; MLG = genotipo multilocus. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Agrupación genética utilizando el análisis discriminante de componentes principales (DAPC) de las poblaciones de A. fumigatus de Islandia, NWT, Eurasia, América del Norte y Oceanía. Los aislados fueron genotipados en nueve loci de microsatélites y corregidos por clones, totalizando 1.703 genotipos multilocus únicos. Los genotipos fueron coloreados de acuerdo a los orígenes geográficos. Esta cifra fue adaptada de 34. Abreviaturas: DAPC = análisis discriminante de los componentes principales; NWT = Territorios del Noroeste; ISL = Islandia; CMR = Camerún; CAN = Hamilton, Ontario, Canadá; BEL = Bélgica; FRA = Francia; DEU = Alemania; IND = India; NLD = Países Bajos; NOR = Noruega; NZL = Nueva Zelanda; ESP = España; CHE = Suiza; Estados Unidos = Estados Unidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

País Temperatura de incubación (°C) Muestras de suelo Aislados de levadura Especies conocidas/ Especies novedosas
Camerún 30 493 110 10/9
Canadá 23 300 261 34/12
China 23 340 230 23/5
Costa Rica 30 388 95 20/2
Francia 23 327 175 12/2
Islandia 14 316 211 11/0
Nueva Zelanda 23 610 155 14/4
Perú 23 490 139 30/9
Arabia Saudí 30 562 97 8/1
Total 3826 1473 90/44

Tabla 1: Aislamiento de levaduras en el suelo de nueve países de seis continentes. La temperatura de incubación para las muestras de suelo de cada país se determinó en función de su temperatura media anual. Los resultados presentados aquí están adaptados de 9,12.

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Discussion

El protocolo desarrollado para aislar levaduras y A. fumigatus del suelo es un método rápido y eficiente para el procesamiento de suelos de alto rendimiento y el aislamiento de hongos. El protocolo solo requiere una pequeña cantidad de suelo (0.1-0.2 g) por muestra, lo que permite muestrear más sitios con un esfuerzo similar. El rápido tiempo de respuesta garantiza que los resultados se puedan obtener en un corto período de tiempo y permite tiempo para solucionar problemas y repetir experimentos si es necesario. Este protocolo se puede replicar fácilmente en muchos entornos de laboratorio utilizando equipos estándar de microbiología y cultivo celular. Sin embargo, al aislar levaduras o mohos del suelo internacional, se requieren medidas de precaución adicionales. Todos los equipos de plástico no desechables, como bandejas de plástico y esparcidores de células, deben esterilizarse por inmersión en lejía al 10%, seguida de autoclave. La capa de banco usada debe sellarse en una bolsa de plástico y esterilizarse en un autoclave antes de desecharla.

A tener en cuenta, el número y la identidad de las levaduras aisladas utilizando el protocolo anterior pueden estar limitados por las condiciones de incubación y los medios utilizados. Por ejemplo, la incubación de 24 h en el tambor de rodillos puede favorecer el aislamiento de levaduras aeróbicas de rápido crecimiento sobre especies de crecimiento lento. Además, el uso de medio YEPD rico en nutrientes para el aislamiento de levaduras puede haber excluido especies de levaduras con diferentes requisitos y preferencias de nutrientes. Además, la mayoría de los lugares muestreados aquí experimentan variaciones estacionales en la temperatura y otras condiciones climáticas durante todo el año. Si el tiempo y los recursos lo permiten, las mismas muestras de suelo se pueden procesar bajo un rango de diferentes temperaturas para permitir el aislamiento de una gama más amplia de levaduras que habitan en estos suelos.

Si bien los métodos independientes del cultivo son cruciales para dilucidar patrones a gran escala en la diversidad de hongos ambientales, no son lo suficientemente informativos para grupos específicos de hongos como las levaduras. El uso del aislamiento dependiente del cultivo permitió una investigación exhaustiva de la diversidad global de levaduras del suelo y sus predictores9. Si bien el estudio de metagenómica realizado por Tedersoo y sus colegas identificó predictores y patrones globales en la diversidad de hongos del suelo, no se pudo dilucidar la medida en que estos hallazgos se aplican específicamente a la diversidad delevaduras 2. Tedersoo y sus colegas identificaron la precipitación media anual como un importante impulsor climático de la diversidad de hongos del suelo en todo el mundo2. Este estudio encontró una correlación similar entre la precipitación media anual y la diversidad de levaduras cultivables en suelos globales, destacando que los métodos dependientes del cultivo pueden complementar y ampliar los hallazgos de los enfoques de secuenciación de alto rendimiento9.

La adición de cloranfenicol es un paso importante en la preparación de medios sólidos y líquidos para prevenir la interferencia del crecimiento de hongos por parte de bacterias. La adición de cloranfenicol a los medios líquidos es crucial ya que la falta de antibióticos permitirá que las bacterias presentes en el suelo fermenten. Esto conducirá a la producción de gases que abrirán por la fuerza tubos de microcentrífuga o tubos de cultivo de 13 ml utilizados durante la incubación del suelo en el protocolo. Si la contaminación bacteriana en cloranfenicol que contiene agar / caldo es un problema, el cloranfenicol puede ser sustituido o complementado con antibióticos más fuertes. Al aislar A. fumigatus del suelo, el caldo SD puede sustituirse por una solución de Tween 20 (0,2 M NaCl con Tween 20 al 1%) para ayudar a suspender los conidios hidrofóbicos de A. fumigatus 35,36. Después de la suspensión, 100 μL pueden ser chapados en agar SD e incubados a 50 °C.

Aspergillus fumigatus crece rápidamente y esporula abundantemente cuando se incuba solo en agar SD y medios MEA entre 22 ° C y 50 ° C. Sin embargo, dependiendo de qué otras especies termotolerantes estén presentes en la muestra de suelo, el crecimiento y la esporulación de A. fumigatus pueden verse obstaculizados (Figura 3A, D). En tal situación, se pueden requerir de uno a varios pasos de subcultivo para obtener una colonia pura para su posterior cosecha y caracterización.

El análisis de fragmentos de cepas de A. fumigatus en la Figura 5 se realizó utilizando el programa Osiris. Varios artefactos de PCR han sido destacados en la Figura 5C y son discutidos en detalle por De Valk et al.30. Los picos de tartamudeo B-1 que tienen valores de repetición más cortos son causados por el deslizamiento de la hebra durante la síntesis de la hebra antisentido por la ADN polimerasa. Los picos de N-1 ocurren si la concentración de ADN es demasiado alta durante la PCR. La concentración de ADN recomendada es de 0,1 ng como se indica en el protocolo anterior. Otro artefacto es el sangrado de colorante que se puede remediar utilizando etiquetas fluorescentes con longitudes de onda de absorbancia no superpuestas. Por ejemplo, las etiquetas fluorescentes 6-FAM, HEX y ATTO550, así como el estándar de tinte LIZ600, generan picos de fragmentos distintos (Figura 5). Por último, para evitar picos fuera de escala, diluya cada reacción de PCR (en este caso, fue ~ 50x dilución) antes de la electroforesis capilar. Para reducir aún más la fluorescencia de los cebadores delanteros no utilizados en la mezcla de reacción, reduzca a la mitad las concentraciones de imprimación hacia adelante en relación con los cebadores inversos al crear la mezcla maestra.

El alto rendimiento y la naturaleza conservadora de este protocolo permiten una adquisición relativamente rápida y fácil de muchas levaduras y mohos de los suelos. Sin embargo, hay dos limitaciones principales presentes con la metodología de muestreo. En primer lugar, las características morfológicas de las colonias de levadura cultivadas a partir del suelo se utilizaron para seleccionar especies únicas. Estos fueron luego subcultivados y utilizados para la identificación de especies a través de la secuenciación ITS. Esto se hizo para maximizar la representación de las especies de levadura presentes. Sin embargo, las especies de levadura que compartían morfologías similares o idénticas a las colonias seleccionadas pueden no ser subcultivadas. En segundo lugar, durante el aislamiento de A. fumigatus , como solo se selecciona una colonia individual por muestra de suelo, se perderá la presencia de múltiples individuos dentro de la muestra de suelo. Esto puede conducir a una subrepresentación de la verdadera diversidad genética presente dentro de la población de la muestra, ya que no se recogerán genotipos únicos presentes dentro de la misma muestra de suelo. Para mitigar este problema, durante el paso de la racha para una sola colonia después del primer cultivo en medios sólidos, se pueden recolectar varias colonias individuales para obtener genotipos adicionales. El pequeño volumen de suelo utilizado por muestra ayuda a minimizar esta limitación de muestreo en comparación con los métodos que utilizan mayores cantidades de suelo por muestra.

El uso de este protocolo de alto rendimiento y mano de obra eficiente para el aislamiento de levadura y moho aumentará el número de individuos dentro de la población del suelo mientras que utiliza menos esfuerzo por muestra. El aumento en el poder estadístico proporcionará una mejor imagen de las comunidades de levadura cultivables dentro del suelo y ayudará a caracterizar las poblaciones del suelo de A. fumigatus.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (Subvención No. ALLRP 570780-2021) y McMaster University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt Inc 72.690.001
Benomyl powder  Toronto Research Chemicals B161380
Chloramphenicol powder  Sigma-Aldrich SKU: C0378-5G
Dextrose Sigma-Aldrich SKU: D9434-500G
Fragment Analysis Software NCBI's Osiris https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence database NCBI GenBank  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence database UNITE  https://unite.ut.ee/
Peptone Sigma-Aldrich SKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders  Fisher Scientific 08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes  Sarstedt Inc 83.3902
Sterile 13 mL culture tubes  Sarstedt Inc 62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks  Fisher Scientific 23-400-112
Yeast extract Sigma-Aldrich SKU: Y1625-250G

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