Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Naturlig transformasjon, proteinuttrykk og kryokonservasjon av den filamentøse cyanobakterien Phormidium lacuna

Published: February 1, 2022 doi: 10.3791/63470
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

Summary

Phormidium lacuna er en filamentøs cyanobakterie som ble isolert fra marine bergspoler. Denne artikkelen beskriver isolering av filamenter fra naturlige kilder, DNA-ekstraksjon, genomsekvensering, naturlig transformasjon, uttrykk for sfGFP, kryokonservasjon og motilitetsmetoder.

Abstract

Cyanobakterier er fokus for grunnleggende forskning og bioteknologiske prosjekter der solenergi brukes til biomasseproduksjon. Phormidium lacuna er en nylig isolert filamentøs cyanobakterie. Dette dokumentet beskriver hvordan nye filamentøse cyanobakterier kan isoleres fra marine fjellpooler. Den beskriver også hvordan DNA kan utvinnes fra filamenter og hvordan genomene kan sekvenseres. Selv om transformasjon er etablert for mange encellede arter, er det sjeldnere rapportert for filamentøs cyanobakterier. En forenklet metode for naturlig transformasjon av P. lacuna er beskrevet her. P. lacuna er det eneste medlemmet av ordren Oscillatoriales som naturlig transformasjon er etablert for. Dette dokumentet viser også hvordan naturlig transformasjon brukes til å uttrykke superfolder grønt fluorescerende protein (sfGFP). En endogen cpcB-promotor induserte omtrent 5 ganger sterkere uttrykk enn cpc560, A2813 eller psbA2-promotører fra Synechocystis sp. PCC6803. Videre ble det etablert en metode for kryopreservering av P. lacuna og Synechocystis sp.CPP 6803, og metoder for å vurdere motilitet i et flytende medium og på agar- og plastoverflater er beskrevet.

Introduction

Cyanobakterier er prokaryote organismer som bruker fotosyntese som energikilde 1,2. Forskning er i økende grad fokusert på cyanobakterielle arter. Flere cyanobakterier kan forvandles med DNA3. Gener kan slås ut eller overekspressert i disse artene. Transformasjonen er imidlertid begrenset til noen få arter 4,5,6,7,8,9,10,11, og det kan være vanskelig å etablere transformasjon i stammer fra kultursamlinger eller wild8. Stammer av de filamentøse artene Phormidium lacuna (figur 1) ble isolert fra marine bergspoler, der miljøforhold, som saltkonsentrasjoner eller temperatur, svinger over tid. Disse filamentøse cyanobakteriene kan brukes som modellorganismer for rekkefølgen Oscillatoriales12 som de tilhører.

Under forsøk på å teste genoverføring ved elektroporasjon13,14 ble det funnet at P. lacuna kan forvandles ved naturlig transformasjon15. I denne prosessen blir DNA tatt opp naturlig av noen celler. Sammenlignet med andre metoder for transformasjon 16,17, har naturlig transformasjon fordelen av ikke å kreve flere verktøy som kan komplisere prosedyren. For eksempel krever elektroporasjon riktige cuvettes, intakte ledninger og valg av riktig spenning. P. lacuna er for tiden det eneste Oscillatoriales-medlemmet som er utsatt for naturlig transformasjon. Fordi den opprinnelige protokollen er basert på elektroporasjonsprotokoller, inkluderte den fortsatt flere vasketrinn som kan være unødvendige. Ulike tilnærminger ble testet for å forenkle protokollen, noe som førte til transformasjonsprotokollen som presenteres her.

Genomsekvensen er avgjørende for videre molekylære studier basert på genutslag eller overekspression. Selv om genomsekvenser kan oppnås med neste generasjons sekvenseringsmaskiner innen korte perioder, kan utvinning av DNA være vanskelig og avhenger av arten. Med P. lacuna ble flere protokoller testet. En modifisert cetyl trimethyl ammoniumbromid (CTAB)-basert metode ble deretter etablert, noe som resulterte i akseptabel renhet av DNA og DNA-utbytter av hver rensesyklus for fortsatt arbeid i laboratoriet. Genomet av fem stammer kan sekvenseres med denne protokollen. Det neste logiske transformasjonstrinnet var å etablere proteinuttrykk i P. lacuna.

SfGFP som brukes som markørprotein i denne protokollen kan påvises med ethvert fluorescensmikroskop. Alle promotører som ble testet kunne brukes til P. lacuna sfGFP-uttrykk. Det økende antallet stammer som følge av transformasjon har resultert i behovet for en metode for lagring av kulturene. Slike metoder er etablert for Escherichia coli og mange andre bakterier18. I standardprotokoller fremstilles glyserolkulturer, overføres i flytende nitrogen og lagres ved -80 °C. Denne metoden krever bare noen få trinn og er svært pålitelig for de artene den er etablert for. Standardprotokollen var ikke mulig for P. lacuna fordi levende celler ikke kunne gjenopprettes i alle tilfeller. Men da glyserol ble fjernet etter opptining, overlevde celler i alle forsøk. Enkle metoder presenteres for analyse av motilitet av P. lacuna, som kan kombineres med knockout mutagenese for å undersøke type IV pili eller rollen som fotoreseptorer. Disse analysene er forskjellige fra enkeltcellede cyanobakterier 19,20,21 og kan også være nyttige for andre Oscillatoria.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolasjon fra naturmiljøet

MERK: Grønne alger, diatomer, filamentøse cyanobakterier og andre mikroalger kan isoleres. Protokollen kan brukes til alle mikroalgaarter fra bergspoler som vokser under laboratorieforhold. Filamentøs cyanobakterier som tilhører Oscillatoriales kan lett gjenkjennes av deres bevegelse og filamentøse form. Arten kan identifiseres i semipure tilstand ved genomsekvensering eller 16S rRNA-sekvensering.

  1. Overfør flytende sjøvannsprøver fra marine fjellpooler (dvs. hulrom i den steinete kysten) til 50 ml kolber. Legg merke til det nøyaktige stedet eller koordinatene til den naturlige kilden for hver kolbe. Hvis det er mulig, filtrer innholdet gjennom 50 μm garn for å redusere mengden dyreplankton. Oppbevar prøvene ved 4 °C til de kan subkultureres.
  2. Overfør 1 ml kulturer til 10 cm Petri-retter som inneholder 3% bacto-agar i f/2 medium22,23 (se materialtabellen). Forbered opptil 20 plater. Dyrk under hvitt lys på 50 μmol m-2 s-1.
    MERK: Høyere lysintensiteter kan brukes til dyrking. Intensitet opptil 400 μmol m-2 s-1 kan brukes til P. lacuna, selv om andre arter kan være mer lysfølsomme.
  3. Etter en uke, overfør de ønskede cellene til friske agarplater ved hjelp av sterile tang. Isoler cellene under et kikkertmikroskop under sterile forhold. Oppbevar den gamle agarplaten ved 4 °C til cellene dukker opp og vokser på den nye agarplaten.
  4. Gjenta dette overføringstrinnet hver uke for å eliminere forurensning. Bruk det blotte øye for å oppdage tung forurensning og et mikroskop med 400x forstørrelse for ytterligere kontroller for forurensning.
  5. Hvis en prøve virker fri for forurensning, test for bakteriell eller soppforurensning på agarplater. Overfør en brøkdel av kulturen med en inokulasjonssløyfe til en LB24 agarplate (10 cm diameter), hold platen ved romtemperatur, og kontroller veksten av forurensninger over 1-3 dager.
  6. Hvis en steril filamentøs cyanobakteriell art oppnås, bruk den til videre kulturarbeid. Dyrk P. lacuna i væske eller på bacto-agarplater. Bruk 250 ml kolber med 50 ml f/2 medium eller f/2+ medium for flytende kultur.

2. DNA-ekstraksjon

MERK: Denne metoden er tatt i bruk fra 25 26

  1. Forbered to kolber med 50 ml f/2 medium. Inokuler hver med ~ 1 ml P. lacuna filamenter fra andre voksende kulturer. Hold kulturene i 7 dager eller lenger under agitasjon (horisontal rotasjon) ved 50 o/min under hvitt lys (50 μmol m-2 s-1) ved 25 °C.
  2. Behandle kulturen med ultralyd (se materialtabellen) i 2 min med full energi. Mål OD ved 750 nm; kontroller at det er ~0,5. Fortsett å vokse kulturene hvis OD er for lav.
  3. Samle filamentene med 5000 × g, 20 min sentrifugering. Fjern supernatanten. Overfør filamentene med restvæske til kammeret til en fransk presse27. Sett presset fra den franske pressen til 20.000 psi og trekk ut cellene.
    MERK: Den franske pressen vil lyse alle cellene og frigjøre DNA; sterke skjærkrefter vil produsere 1500 bp DNA-fragmenter.
  4. Sentrifuger prøven i 10 min ved 10.000 × g og fjern supernatanten.
  5. Tilsett 400 μL lysisbuffer (4 M urea, 0,1 M Tris/Cl, pH 7,4) og 50 μL proteinase K (10 mg/ml) i pelletsen. Varm prøven til 55 °C i 60 minutter med risting ved 550 o/min.
  6. Tilsett 1 ml DNA-ekstraksjonsbuffer (3 % CTAB, 1,4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 M Tris/Cl, 1 % Sarkosyl, 0,1 M DTT, pH 8) og inkuber i 60 minutter ved 55 °C og 550 o/min. Overfør løsningene til sentrifugeringsrør, og tilsett to mengder kloroform/isoamylalkohol (24/1).
  7. Etter risting, sentrifuger prøven i 5 min ved 9000 × g. Overfør den øvre, vandige fasen til reaksjonshylser og tilsett 1 ml iskald etanol og 50 μL 3 M natriumacetat.
  8. Virvel prøven og plasser den ved -20 °C i 1 time eller lenger.
  9. Sentrifuge i 5 min ved 10.000 × g (4 °C) og kast supernatanten. Vask pelletsen med 70% etanol.
  10. Sentrifuger prøven igjen. Fjern supernatanten og tørk pelletsen over natten. Løs opp DNA-et i nukleasefritt vann. Mål DNA-spekteret for å sjekke om OD 260 nm/OD 280 nm er mellom 1,6 og 1,9.
  11. Analyser størrelsen på DNA-et på en agarose elektroforesegel28.
  12. Sekvenser det genomiske DNA-et etter neste generasjons sekvensering i 300 sykluser, med en parret-end innstilling og leselengde på 150 baser (se materialtabellene).
  13. Utfør samlingen med riktig dataprogram; se eksemplet som er angitt i materiallisten.
  14. Send utkastet til RAST-serveren for merknad.
    MERK: Last opp DNA-sekvenser for å få fullstendig merknad i løpet av få minutter.

3. Naturlig transformasjon og GFP-uttrykk

MERK: Transformasjon er basert på en plasmid vektor forplantet i E. coli; pGEM-T eller pUC19 kan brukes som ryggradsvektorer. Kloningsteknikker er etablert i mange laboratorier; se også standardprotokollene28 og artiklene om transformasjonsvektorer for P. lacuna15,29. Eksempler på vektorer for sfGFP-uttrykk er beskrevet i delen representative resultater. Detaljer om fire ennå upubliserte vektorer er gitt i Supplemental File 1.

  1. Utfør alle trinn ved hjelp av sterilt materiale under sterile laboratorieforhold (ren benk, sterilt glasstøy).
  2. Inokuler 2 x 50 ml f/2 flytende medium i to 250 ml kolber med 2 x 1 ml P. lacunafilamenter fra en løpekultur. Dyrk i hvitt lys (50 μmol m-2 s-1) under agitasjon (horisontal rotasjon, 50 rpm) i ~ 5 dager ved 25 °C.
  3. Forbered ~ 200 μg av transformasjonsvektor-DNA ved hjelp av et midi prep kit (se materialtabellen) i henhold til produsentens instruksjoner.
  4. Homogeniser 100 ml P. lacuna celle suspensjon (se materialtabellen) ved 10.000 rpm i 3 min. Mål OD ved 750 nm (ønsket verdi = 0,35).
  5. Sentrifuger cellesuspensjonen i 15 min ved 6000 × g. Fjern supernatanten, og suspender pelletsen i 800 μL (totalt volum inkludert restvæske og filamenter) av gjenværende væske og ekstra f / 2 + medium.
  6. Ta åtte f/2+ bacto-agarplater (10 cm diameter) som inneholder 120 μg/ml kanamycin. Pipette 10 μg DNA inn i midten av hver agarplate. Umiddelbart pipette 100 μL celleoppheng i midten av hver agarplate (på toppen av DNA).
  7. Hold agarplaten uten lokk på den rene benken slik at overflødig væske kan fordampe. Lukk platen og dyrk den i hvitt lys ved 25 °C i 2 dager.
  8. Fordel filamentene til hver agarplate med en inokulasjonssløyfe på flere friske f/2+ bacto-agarplater som inneholder 120 μg/ml kanamycin. Dyrk platene i hvitt lys ved 25 °C og kontroller kulturene regelmessig under et mikroskop.
  9. Identifiser levende, forvandlede filamenter etter 7-28 dager under mikroskopet. Se etter sunne, grønne filamenter (figur 2) som er forskjellige fra andre filamenter. Hvis disse grønne filamentene kan identifiseres, fortsetter du med neste trinn; Ellers må du oppbevare platen i ytterligere 7 dager.
  10. Bruk tang til å overføre disse identifiserte levende filamentene til 50 ml flytende f/2+ medium med 250 μg/ml kanamycin. Dyrk i hvitt lys ved 25 °C på en shaker (horisontal rotasjon, 50 o/min). Vær oppmerksom på vekst i opptil fire uker.
  11. Overfør filamentene tilbake til agarmediet som inneholder 250 μg/ml kanamycin og vent til filamentene vokser. Etter flere dager overfører du enkeltfilamenter til en fersk agarplate med en høyere konsentrasjon av kanamycin, for eksempel 500 μg/ml. Behold originalplaten.
  12. Forsikre deg om at filamentene forplantes i en høy konsentrasjon av kanamycin i flytende kultur eller på agar. Øk kanamycinkonsentrasjonen igjen for å øke segregeringen.
    MERK: Transformert P. lacuna vokser i opptil 10.000 μg/ml kanamycin. Andre arter tolererer kanskje ikke så høye konsentrasjoner.
  13. Hvis resistente celler dyrkes og fordeles bredt over en plate, test integrasjonen av innsatsen i genomet til P. lacuna ved å utføre PCR med ytre og indre primere.
    1. Bruk primere som er designet for kloning av innsettingen som indre primere.
    2. For utforming av de ytre primerne, velg sekvenser som er 5' og 3' av det foreslåtte innsettingsstedet på genomet til P. lacuna , men utenfor innsettingen.
    3. For PCR-reaksjoner, bruk indre primere og ytre primere. Bruk de motstandsdyktige stammene og den ville typen.
      MERK: Indre primere indikerer at innsatsen er til stede; ytre primere viser at innsatsen er satt inn ved riktig locus.
  14. For hver PCR-reaksjon plasserer du ~ 10 mg av filamentene direkte i PCR-rørene og utfører PCR i henhold til standardprotokollene24. Hvis det ikke oppnås noe produkt, varierer glødetemperaturen og vask filamentene med vann.
    MERK: Mange forskjellige polymeraser kan brukes i PCR. Standard polymeraser, som Taq polymerase, har en høyere feilfrekvens enn feilkontroll av polymeraser, som er dyrere. Denne analytiske PCR-en krever ingen feilkontroll av polymerase. Feilkontroll av polymerase bør imidlertid testes hvis ingen PCR-produkter oppnås med en standard polymerase.
  15. Analyser PCR-produktene til den motstandsdyktige linjen på agarose elektroforese24.
    1. Sammenlign båndposisjoner med markøren, og sammenlign den ville typen og transformeringen. Med indre og ytre primere, se etter et større bånd for transformanten enn den ville typen (på grunn av innsetting av motstandskassett) eller to bånd for transformanten: en med størrelsen på wild-type bandet og en større. Som sistnevnte tilfelle indikerer ufullstendig segregering, fortsett dyrking med høye kanamycinkonsentrasjoner.
      MERK: For mer informasjon om PCR og elektroforese, se 15,24 eller annen standard litteratur.
  16. For GFP-uttrykk: Observer enkeltfilamenter med et fluorescensmikroskop (se materialtabellen) ved en forstørrelse av målet satt til 40x eller 63x. Ta et lysfeltoverføringsbilde og et fluorescensbilde. Bruk følgende innstillinger for GFP: 470 nm bandpass for eksitasjon, 525 nm bandpass for utslipp og en 495 nm bjelkesplitter, innledende eksponeringstid på 500 ms.
  17. Juster eksponeringstiden for klare fluorescenssignaler, og unngå mettende intensiteter. Prøv å bruke samme innstilling for alle eksempler.
  18. Siden de ville filamentene også vil vise fluorescens, kan du ta bilder med samme innstillinger som ovenfor for denne bakgrunnsfluorescensen.
    MERK: Belastningen som uttrykker GFP må ha et høyere signal; Ellers uttrykker den ikke GFP.
  19. Basert på eksponeringstider og pikselintensitetene til fluorescensbildene, kan du beregne og sammenligne GFP-innholdet i de forskjellige filamentene.

4. Kryokonservasjon

MERK: P. lacuna og den encellede cyanobakterien Synechocystis sp. PCC 6803 brukes. Den nåværende metoden fungerer bedre for P. lacuna.

  1. Dyrk P. lacuna eller Synechocystissp PCC 6803 i minst 10 dager i 10 ml f/2+ eller BG-11 medium, henholdsvis under hvitt lys (50 μmol m-2 s-1) ved 25 °C under agitasjon (horisontale rotasjoner, 50 o/min).
  2. Homogeniser P. lacunakulturen (se materialtabellen) ved 10.000 o/min i 3 min eller med en ultralydenhet (se materialtabellen) i 2 minutter ved full energi. Bestem OD 750 nm av en av kulturene for å sjekke om verdien er mellom 1 og 7.
  3. Samle cellene ved sentrifugering ved 6000 × g i 15 min. Fjern supernatanten.
  4. Suspender cellepellet i 800 μL f/2+ eller BG-11 medium (sluttvolum) og overfør til en 2 ml kryolegeme. Tilsett 800 μL av en 50% glyseroloppløsning til cellesuspensjonen. Lukk hetteglasset og bland ved gjentatt invertering.
  5. Overfør kryonalen til flytende nitrogen og oppbevar den i en kryoboks i en -80 °C fryser. Legg merke til plasseringen av boksen i fryseren og koordinatene til prøven i boksen.
  6. For utvinning av cellene, ta ut kryo toårig og tine innholdet ved romtemperatur. Overfør innholdet til et 2 ml reaksjonsrør.
  7. Vask prøven to ganger. For 1m vask, sentrifuge ved 6000 × g i 5 min. Fjern supernatanten, og bruk pelletsen på nytt i 2 ml f/2+ eller BG-11 medium. For denandre vasken , nyligrifuge ved 6000 × g i 5 min, fjern supernatanten og suspender pellet i 2 ml f / 2 + eller BG-11 medium.
  8. For å sjekke integriteten til disse cellene som er klare for dyrking, overfør pellet til 9 ml medium og dyrk dem i hvitt lys (50 μmol m-2 s-1) under agitasjon (55 rpm). Sammenlign OD 750 nm av kulturen på den første dagen og etter 1 uke.

5. Motilitet av Phormidium lacuna

MERK: Tre forskjellige analyser vil bli beskrevet. Den samme kulturen brukes i alle tilfeller.

  1. Dyrk P. lacuna i f/2 medium under horisontal agitasjon (50 o/min) i hvitt lys (50 μmol m-2 s-1) i ~5 dager til estimert OD 750 nm er 0,35. Oppbevar prøven ved 4 °C til bruk.
  2. Homogeniser filamentene (se materialtabellen) ved 10 000 o/min i 3 minutter eller med ultralyd (se materialtabellen) i 1 min ved maksimal effekt og syklus på 1. Mål OD 750 nm. Hvis over 0,35, fortynn fraksjonen med f / 2 medium. Bruk denne løsningen i motilitetsanalyser i trinn 5.3, 5.4 og 5.5.
  3. Analyse for bevegelse i flytende medium
    1. For direkte observasjon av motilitet, overfør 8 ml medium som inneholder P. lacuna (fra trinn 5.2) til en 6 cm Petri-tallerken. Vent noen minutter til prøven når romtemperatur. Dekk Petri-parabolen med cellofanfolie.
    2. Plasser et mikroskopsklie på x-y-bordet til et standard mikroskop med et kamera. Slå på mikroskoplyset. Ideelt sett må du alltid bruke de samme elektriske og optiske innstillingene for belysningen. Flytt et mål på 4x eller 10x inn i lysets bane.
    3. Plasser Petri-retten på toppen av lysbildet. Juster enkeltfilamenter eller filamentbunter etter x-, y- og z-bevegelser på bordet.
      MERK: På grunn av det tredimensjonale arrangementet kan bare en del av den aktuelle delen være i fokus. Cellofanfolie gjør det mulig å justere fokuset uten begrensning.
    4. Vær oppmerksom på bevegelser av enkeltfilamenter eller bunter. Pass på at objektivlinsen ikke berører væsken. Ta opp filamentbevegelsene med et standard mikroskopkamera (se Supplerende video S1).
  4. Analyse for bevegelse på overflaten
    1. For observasjon av filamentmotilitet på agarflater, lag 6 cm Petri-retter med f / 2 bacto-agar. Sørg for at agaren er høy nok til at objektivlinsen kommer nær agaroverflaten. Alternativt kan du lage et ~ 3 mm tykt agarlag og registrere filamentene gjennom agaren (hold platen opp ned eller bruk et invertert mikroskop).
    2. Pipette 0,5 ml av en oppløsning som inneholder P. lacuna (fra trinn 5.2) på bacto-agaroverflaten på en 6 cm Petri-tallerken. La væsken komme inn i overflaten. Lukk Petri-parabolen og følg bevegelsen av filamentene på overflaten ved hjelp av et 4x eller 10x mål.
    3. Forsikre deg om at de samme elektriske og optiske innstillingene til mikroskopet brukes gjennom hele opptaket og i etterfølgende opptak.
    4. Ta opp tidsforløpopptak ved hjelp av et okulært kamera og minidatamaskinsystem. Kontroller at tidsintervallet mellom etterfølgende bilder er 5 s-1 min. Programmer Linux-skriptet til minidatamaskinen for å kontrollere tidsforløpopptaket. Se Tilleggsfil 2 for eksempel skript og Tilleggsvideo S2 som eksempel.
  5. Analyse for fototaxis
    1. For fototaxis-eksperimenter klargjør du lysdiodeholdere (LED)-holdere (her, med en 3D-skriver) der de valgte 5 mm lysdiodene er montert for å bestråle et område på 20 mm2 nedenfra og over (figur 3). Bruk om nødvendig mange LED-holdere parallelt, og koble hver LED elektrisk gjennom en motstand og potensiometer til en justerbar strømforsyning. Mål og juster LED-intensitetene, avhengig av eksperimentet. Forsikre deg om at hele innstillingen er i et mørkt rom eller en lukket mørk beholder.
    2. Plasser 8 ml av mediet som inneholder P. lacuna (fra trinn 5.2) i en 6 cm Petri-tallerken. Juster lysintensiteten på LED-lampen. Lukk Petri-fatet med lokket og legg det på en LED-holder slik at LED-lampen er i midten av Petri-parabolen.
    3. Etter ønsket varighet (vanligvis 2 dager), ta et bilde av Petri-parabolen med et smarttelefonkamera rettet direkte mot plasseringen av lysbehandlingen. Bruk et hvitt LED-panel for bestråling av prøven. Bruk de manuelle innstillingene til kameraet; unngå refleksjoner av lys; juster alltid for å få samme avstand mellom kameralinsen og prøven. Kontroller at eksponeringsinnstillingene gir et bilde som passer for senere analyser ved hjelp av ImageJ.
    4. Kvantifisere diameteren på den sentrale sirkelen av filamenter ved hjelp av ImageJ-programvare.
      1. Åpne ImageJ, klikk på Fil | Åpne, velg ønsket fil, og klikk Enter.
      2. Velg Rett-knappen (med en rett linje). Trykk på venstre museknapp for å tegne en linje fra den ene enden av Petri-parabolen til motsatt ende. Forsikre deg om at linjen passerer gjennom midten av filamentsirkelen.
      3. Trykk CTRL-K på tastaturet, eller klikk Analyser | Tegn inn profil på ImageJ-menyen. Se etter et x-y-vindu med pikselintensiteter plottet kontra avstand - en 1D-profil av Petri-parabolen. Kontroller at den laveste pikselintensiteten er litt over 0 og den høyeste verdien under 255.
      4. Beregne en gjennomsnittsverdi for pikselintensiteten utenfor sirkelen og en annen gjennomsnittsverdi for pikselintensiteten i sirkelen. Ved y-plasseringen mellom disse verdiene beregner du x-verdiene på begge sider av sirkelen ved å peke med musen på disse plasseringene. Noter begge verdiene og beregn forskjellen.
      5. Få den høyeste x-verdien ved å peke musen mot y-aksen til høyre. Vær oppmerksom på at denne verdien e representerer diameteren på Petri-parabolen. Hvis denne diameteren er 5 cm, beregner du diameteren på den sentrale filamentsirkelen som d/ e × 5 cm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter de ovennevnte metodene ble 5 forskjellige stammer av P. lacuna isolert fra bergspoler og sekvensert (figur 1 og tabell 1). Alle kulturer var sterile etter ~ 1 år med subkulturering unntatt P. lacuna HE10JO. Denne stammen er fortsatt forurenset med Marivirga Atlantica, en marin bakterie. Under påfølgende Helgoland-utflukter ble andre filamentøse cyanobakterier isolert fra steinbassenger, som er forskjellige fra P. lacuna og må karakteriseres.

Flere DNA-ekstraksjons- og rensemetoder ble testet for P. lacuna. De beste resultatene ble oppnådd med en optimalisert CTAB-metode som beskrevet ovenfor. DNA-utbyttet var 310 ± 50 μg/ml, OD 260 nm/OD 280 nm var 1,7 ± 0,03, og OD 260 nm/OD 230 nm var 0,78 ± 0,04 (n = 17). Genomsekvensering viste at DNA-et til alle stammer var litt annerledes, som forventet (tabell 1). Kjerneproteinsekvenser viste en maksimal forskjell på 0,04 % (tabell 2). Selv om alle trekkgenomer var ufullstendige, kan man anta at >98% av genomet til HE10JO30 ble sekvensert. Denne beregningen er basert på antall ufullstendige åpne leserammer. Delvise proteinsekvenser kan enkelt identifiseres etter RAST-merknad av HE10DO og HE10JO. I HE10JO hadde 60 proteiner av ~4500 en manglende N- eller C-terminalsekvens. Genomesekvensene finnes i tillegget (Supplemental File 3, Supplemental File 4, Supplemental File 5, Supplemental File 6 og Supplemental File 7).

Interessant nok ble stammer av samme art isolert fra to øyer, Helgoland og Giglio. Den lineære avstanden mellom begge øyene er 1400 km. Det må være en sammenheng mellom begge steder, for eksempel med skip via sjøen eller, mer sannsynlig, av trekkfugler. Mange fuglearter finnes på begge øyene, og mange av dem er trekkfugler. Mangfoldet innenfor P. lacuna stammer på en øy var større enn mellom nærmeste Helgoland og Giglio stammer (Tabell 2). Dette indikerer en intens utveksling mellom begge steder.

Den naturlige transformasjonen ble testet med HE10DO som den største belastningen og med HE10JO. Den nåværende protokollen er enklere enn protokollen beskrevet tidligere12 på grunn av redusert antall vasketrinn og færre overføringstrinn etter transformasjon. Denne nye metoden brukes kontinuerlig i laboratoriet; ~15 vellykkede transformasjoner ble oppnådd.

KanR-motstandskassett ble vanligvis integrert i det homologe stedet definert av de tilstøtende områdene, som vist av PCR ved hjelp av indre og ytre primere. Som de fleste cyanobakterier er P. lacuna polyploid. Den kan ha mer enn 100 kromosomer per celle12. En PCR-test med ytre primere ~ 1 uke etter transformasjonen har vanligvis 2 bånd på elektroforesegelen, en med størrelsen på wild-type-båndet og ett langsommere trekkbånd som indikerer innsetting av motstandskassett (figur 4). Dobbeltbåndet angir at bare en underfraksjon av kromosomene inneholder innsettingen. Etter 4 ukers utvelgelse på kanamycin er segregering vanligvis fullført, og bare ett stort PCR-bånd vises på geler. Når det gjelder transformasjonen med pMH1 (se nedenfor), var segregeringen imidlertid fullført etter mer enn 3 måneder.

Vektorene pAK1, pAK2, pAK3 og pMH1 ble konstruert for tester på sfGFP-uttrykk. I pAK1, pAK2 og pAK3 er sfGFP-genet under kontroll av henholdsvis cpc560- og A2813- og psbA2-promotorene. Disse promotørene er fra Synechocystis sp. PCC 6803 eller Synechococcus sp. PCC 700231. For bygging av disse vektorene ble sfGFP-promotoren og terminatorsekvensene hentet fra vektorer som brukes til transformasjon av Synechococcus sp. PCC 700231. De relevante sekvensene ble integrert i det homologe chwA (sc_7_37) stedet for pFN1 (eller pFN_7_37_KanR15). pMH1-uttrykksvektoren ble konstruert av DNA-syntese ved hjelp av P. lacuna-sekvenser som maler (Supplemental File 6). Sekvensene cpcB-cpcA (phycocyanin ß og phycocyanin α) av P. lacuna arrangeres serielt. En 100 bp intergenisk region skiller begge kodeområdene. Den syntetiske sekvensen inneholdt denne endogene cpcB-cpcA-sekvensen og cpcB-promotoren. SfGFP- og KanR-kassetten er plassert bare 3' av cpcB stop codon (5' av cpcA). Hele den syntetiske sekvensen med cpcB-promotor, cpcB, sfGFP, KanR, cpcA (5' til 3') klones i pUC19. Et kart vises i figur 5. Flere detaljer om kloning av pAK1, pAK2 og pAK3 og den fullstendige sekvensen av pMH1 er gitt i Supplemental File 1.

Alle de 4 transformantene (med pAK1, pAK2, pAK3 og pMH1) uttrykte GFP; alle fluorescensnivåer var over bakgrunnsfluorescensen av ville filamenter (figur 6). pMH1-transformantene med ufullstendig segregering avslørte et GFP-signal som var svært variabelt mellom filamentene. Fluorescenssignalet ble jevnt fordelt når segregeringen var fullført (figur 6E). Mikroskopsignalene til pAK1-, pAK2- og pAK3-transformanter var like, men ~5 ganger svakere enn pMH1 (figur 6E).

Den etablerte kryokonservasjonsmetoden er basert på en metode som ble etablert for E. coli. Da 2 vasketrinn ble utført for fjerning av glyserol etter opptining, overlevde 15 av 15 P. lacunaprøver (tabell 3). Denne protokollen kan også brukes for Synechocystis PCC 6803, men bare med 2 vasketrinn og ikke med 1 (tabell 3).

Et annet trekk ved Oscillatoriales filamenter er deres motilitet: P. lacuna filamenter beveger seg kontinuerlig på overflater (figur 7) og i et flytende medium (figur 8). Begge typer bevegelse kan studeres lett i Petri retter uten eller med agar medium. Tidsforløpopptak er nødvendig fordi bevegelsen på agar er langsom. Filamenter beveger seg mot lyskjeglen hvis en lysstråle kommer nedenfra (figur 3). Effektene av lysintensitet, bølgelengde og tid kan enkelt studeres med et enkelt oppsett. Fotoreseptorene for denne effekten er ennå ikke klare. Mulige kandidater kan adresseres med knockout mutanter. Mekanismen som ligger til grunn for hvordan filamentene finner lyset er også uklar. For dette spørsmålet er det nødvendig med et infrarødt system for å registrere filamentene under bevegelsen fra mørke til lys.

Figure 1
Figur 1: Stammer av Phormidium lacuna samlet fra Helgoland og Giglio. Filamenter forplantes i 11 dager på f/2 agar i 6 cm Petri-retter. (A) stamme GI08AO; (B) stamme GI08IO; (C) stamme GI09CO; (D) stamme HE10DO; (E) stamme HE10JO; (F) stamme HE15M2G1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Phormidium lacuna filamenter 5 uker etter transformasjon. SfGFP-uttrykksvektoren pMH1 ble brukt. f/2+ medium med 120 μg/ml kanamycin. De grønne filamentene er motstandsdyktige og levende; andre filamenter har dødd. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Phototaxis-eksperiment. Venstre: LED-holder med 4 røde lysdioder, koblet til en justerbar strømforsyning. På toppen av hver LED er det en 6 cm Petri-tallerken med 8 ml av en Phormidium lacunakultur . Høyre: Petriskål med P. lacuna etter 2 dager på den røde LED-lampen (15 μmol m-2 s-1). Forkortelse: LED = lysdiode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Integrasjon og segregering av innsats etter transformasjon av Phormidium lacuna med pAK1. PCR med ytre primere. De forventede størrelsene på produktet uten og med innsats er henholdsvis 2371 og 5016 bp. Venstre kjørefelt: markør, baner 1, 2, 3, 4: PCR-produkter av filamenter 7 dager, 11 dager, 14 dager og 17 dager etter isolering av en motstandsdyktig filament (4 uker etter transformasjon), henholdsvis. Lane 5: PCR-produkt av villtype (fra en annen gel). I 7 dagers prøve er innsatsen til stede i en liten brøkdel av kromosomene. Denne brøkdelen øker til 17 dager, der ingen wild-type bånd er synlige, det vil si at segregering er fullført. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Vektor for sfGFP-uttrykk under kontroll av endogene cpcB-promotorer . Oransje: Phormidium lacuna homolog sekvens, fiolett / blå: pUC-19 vektor ryggrad, grønn: sett inn med sfGFP og KanR. Forkortelser: sfGFP = superfolder grønt fluorescerende protein; KanR = kanamycinmotstand. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Uttrykk for sfGFP i Phormidum lacuna. Fluorescensbilder av P. lacuna wild-type filamenter (A) og etter transformasjon med pAK1 (B), pAK2 (C), pAK3 (D) og pMH1 (E). I pMH1 plasseres sfGFP-genet 3' av fycocyanin ß-genet og derfor drevet av den endogene cpcß-promotoren ; I de andre tilfellene er sfGFP drevet av henholdsvis cpc560, A2813 eller psbA2spromotører fra Synechocystis PCC 6803. Fluorescensinnstillingene er spesifikke for GFP; Alle bilder ble tatt opp med samme integrasjonstid og optiske innstillinger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Sammenslått bilde av Phormidium lacuna på agaroverflate ved 4x forstørrelse. Det første bildet presenteres i rødt, det andre (tatt 1 min senere) i grønt. Legg også merke til sporene på agaren. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Sammenslått bilde av Phormidium lacuna i flytende medium. Tidsintervallet mellom begge bildene var 10 s. Det første bildet skrives ut i rødt. den andre er trykt i grønt. Sammenligning av begge fargene viser bevegelsen innen 10 s. Skalalinje = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

belastning HE10JO HE10DO GI08AO GI09CO HE15M2G1
Sammenhengende 104 174 218 102 154
totalt bp 48,19,017 47,88,491 47,78,775 36,69,922 45,98,395

Tabell 1: Phormidium lacuna stammer.

Gi09CO HE10DO HE10JO HE15M2G1
Gi08AO 42 40 0 42
Gi09CO 2 42 0
HE10DO 40 2
HE10JO 42

Tabell 2. Aminosyreforskjeller mellom stammer i sekvenser av 20 kjerneproteiner med 10 876 aminosyrer.

Celletetthet OD 750 nm 1 1 3 3 5 5 7 7
Vasker 1 2 1 2 1 2 1 2
Synechocystis PCC 6803 2/5 5/5 1/4 4/4 0/4 4/4 0/4 3/4
Phormidium lacuna HE10DO 4/4 4/4 4/4 4/4 3/ 4 4/4 3/3 3/3

Tabell 3: Kryokonservasjonsforsøk med Synechocystis PCC 6803 og Phormidium lacuna HE10DO cyanobakterier. Det første tallet viser antall kulturer som overlevde etter frysing / tining; Det andre tallet viser de totale forsøkene.

Supplerende video S1: Bevegelse av Phormidium lacuna filamenter i flytende løsning, uten tidsforløp. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Supplerende video S2: Bevegelse av Phormidium lacuna filaments på agar overflate, med time-lapse. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Supplemental File 1: Kloning av vektorer for transformasjon av Phormidium lacuna. Liste over transformasjonsvektorer; liste over primere for kloning; sekvensen av pMH1 i gb-format. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplemental File 2: Shell skript (sh) for Raspberry Pi minicomputer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: DNA-sekvens av HE152G1. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 4: DNA-sekvens av GI08AO. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 5: DNA-sekvens av GI09CO. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 6: DNA-sekvens av HE10DO. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 7: DNA-sekvens av HE10JO. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om mange stammer av cyanobakterier er tilgjengelige fra kultursamlinger 32,33,34,35,36, er det fortsatt etterspørsel etter nye cyanobakterier fra naturen fordi disse artene er tilpasset spesifikke egenskaper. P. lacuna ble samlet inn fra bergbassenger og er tilpasset variasjoner av saltkonsentrasjoner og temperatur30. Stammer av denne arten ble funnet under utflukter i 2008, 2009 og 2010. Med prosedyren beskrevet her ble 5 stammer av P. lacuna isolert, og 4 av disse stammene var sterile. Stammen P. lacuna HE10JO er permanent forurenset med bakterien Marivirga atlantica, en marin bakterie identifisert av rRNA og genomsekvensering. Denne bakterien kunne ikke skilles fra cyanobakterien til tross for anvendelsen av mekanisk separasjon, vekst ved forskjellige temperaturer, behandlinger med antibiotika eller kjemiske behandlinger. Til tross for forurensningen kan P. lacuna HE10JO dyrkes på samme måte som de andre stammene. I senere utflukter ble andre medlemmer av Oscillatoriales funnet, som ennå ikke er analysert i detalj. P. lacuna ble ikke funnet igjen. Det er ikke klart hvorfor P. lacuna ble isolert i etterfølgende år og to forskjellige steder, men ikke funnet senere. Dens overflod er absolutt avhengig av ikke-uforutsigbare forhold. Temperatur, saltkonsentrasjoner og uorganiske eller organiske næringsstoffer er svært variable i bergbassenger. Derfor kan artssammensetningen svinge over tid på en uforutsigbar måte.

Naturlig transformasjon er etablert for forskjellige cyanobakterier, for det meste encellede arter. Den filamentøse P. lacuna er den eneste arten av ordren Oscillatoriales som naturlig transformasjon er etablert for. Transformasjonen var nesten alltid vellykket med den nåværende protokollen. Generelt varierer antall resistente filamenter etter en transformasjonsstudie betydelig, og noen ganger mislykkes transformasjonen, noe som resulterer i tap av verdifull tid. Det anbefales derfor å utføre flere transformasjonsprosjekter parallelt. Tiden for fullstendig segregering, vanligvis 4 uker etter isolering av den motstandsdyktige stammen, kan også variere. Fordi det ikke er noen garanti for fullstendig segregering etter vekst på kanamycin, er det avgjørende å utføre PCR-testene ved hjelp av ytre og indre primere.

Hver vektor må inneholde 2 x 500-1000 bp homologe sekvenser, for eksempel forsterket fra verten av PCR og avbrutt av en motstandskassett (f.eks. kanamycinkassetten KanR som brukes her)37,38. For uttrykk må en promotor, kodesekvens (f.eks. for sfGFP39), terminator og motstandskassett klones mellom de homologe sekvensene. Kloningsstrategiene er artsspesifikke og avhenger av målet med eksperimentet.

Denne transformasjonsmetoden kan også være mulig med andre Oscillatoriales-stammer eller andre cyanobakterier: naturlig transformasjon er basert på type IV pili, som finnes i nesten alle andre cyanobakterielle genomer 3,15,40. Derfor kan den nåværende metoden stimulere til nye studier med andre arter. Fordi type IV pili også er relevant for motilitet, er det viktig å se etter forhold der cyanobakterier er motile.

Geninnsetting er basert på homolog rekombinasjon og resulterer i en forstyrrelse av de homologe stedene. Derfor brukes transformasjon ofte til gen knockout. Uttrykket av det innsatte genet vil bli indusert hvis en aktiv promotor og en kodingssekvens er integrert i det homologe stedet. I P. lacuna var promotoraktiviteten avhengig av arten. Promotorene cpc560, A2813 og psbA2 fra Synechocystis PCC sp 6803 eller Synechococcus sp. PCC 7002 31 og cpcB-promotoren til P. lacuna kan drive sfGFP-uttrykk . Av disse konstruksjonene induserte den endogene cpcB-promotoren det sterkeste uttrykket, selv om sfGFP-genet ligger 3' av fycocyanin ß-genet. Dette indikerer en mer generell bruk av endogene promotorer i cyanobakterielt uttrykk.

Kombinasjonen av gen knockout og bevegelsesstudier vil belyse molekylære mekanismer for motilitet og fototaxis. LED-lyskilder kan gi lys for fototaxis-eksperimenter. Nesten hvilken som helst bølgelengde er tilgjengelig, og lysintensitet kan moduleres av en justerbar strømforsyning og potensiometere. LED-holdere kan bygges av 3D-skrivere for enkelt å realisere kombinasjoner av forskjellige lysdioder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Arbeidet ble støttet av Karlsruher Institute of Technology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclave 3870 ELV Tuttnauer 3870 ELV
Bacto Agar OttoNorwald 214010
BG-11 Freshwater Solution Sigma Aldrich C3061
BG-11 medium Merck 73816-250ML
Boric acid Merck 10043-35-3 H3BO3
Calcium chloride dihydrate Carl Roth 10035-04-8 CaCl2 · 2 H2O
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL Greiner 658190
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL Greiner 601975
Centrifuge LYNX 4000 Thermo Scientific 75006580 and rotor
Centrifuge microstar 17 VWR International N/A for up to 13,000 rpm
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) PanReac AppliChem 57-09-0 C19H42BrN
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 PanReac AppliChem
A1935
Cobalt(II) chloride hexahydrate Merck 7791-13-1 CoCl2 · 6 H2O
Copper(II) sulphate pentahydrate Merck 7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-Biotin Carl Roth 58-85-5  C10H16N2O3S
DNA ladder 1 kb New England Biolabs N3232
DNA ladder 100 bp New England Biolabs N3231
Electrical pipetting help accujet-pro S Brand GmbH 26360 for pipetting 1-25 mL
Ethanol VWR 64-17-5 C2H6O
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate Carl Roth 6381-92-6 EDTA-Na2 · 2 H2O
Fluorescence microscope ApoTome Zeiss
Fluorescence microscope Axio Imager 2 Zeiss
French Pressure Cell Press American Instrument Company N/A
Gel documation System Saffe Image Invitrogen
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu ADVANCED
Glassware, different
Glycerol Carl Roth 56-81-5 C3H8O3
Iron(III) chloride hexahydrate Merck 10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
Kanamycin Sigma-Aldrich 25389-94-0
Kanamycin sulphate Carl Roth 25389-94-0 C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) Sigma Aldrich 137-16-6 C15H28NO3 · Na
LB Broth (Lennox) Carl Roth X964.4
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight OSRAM cultivation of cyanobacteria
Light source, LED panel XL 6500K 140 W Bloom Star N/A cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1
Magnesium chloride hexahydrate Carl Roth 7791-18-6 MgCl2 · 6 H2O
Manganese(II) chloride tetrahydrate Serva 13446-34-9 MnCl2 · 4 H2O
Microscope DM750 Zeiss
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG REF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 + Conrad Electronics 2138863-YD for time-lapse recording
Ocular camera EC3 Leica for continuous recording up to 30 s
Ocular camera MikrOkular Full HD Bresser for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm Merck P5606-400EA
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm Merck P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000 Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µL Gilson SKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µL Gilson SKU: FA10004M
Plastic pipettes 10 mL, sterile Greiner 607107
Plastic tube, sterile, 15 mL Greiner 188271
Plastic tube, sterile, 50 mL Greiner 227261
Potassium bromide Carl Roth 7758-02-3 KBr
Potassium chloride Carl Roth 7447-40-7 KCl
Power supply Statron 3252-1 Statron Gerätetechnik GmbH
Power supply Voltcraft PPS 16005 Conrad Electronics for LED
Proteinase K Promega MC500C from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 polymerase New England Biolabs M0491S
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 Illumina
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 Illumina
Shaker Unimax 2010 Heidolph Instruments for cultivation
Sodium acetate Carl Roth 127-09-3 NaCH3COO
Sodium chloride Carl Roth 7647-14-5 NaCl
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Carl Roth 10049-21-5 NaH2PO4 · H2O
Sodium fluoride Carl Roth 7681-49-4 NaF
Sodium hydrogen carbonate Carl Roth 144-55-8 NaHCO3
Sodium molybdate dihydrate Serva 10102-40-6 Na2MoO4 · 2 H2O
Sodium nitrate Merck 7631-99-4 NaNO3
Sodium sulphate Carl Roth 7757-82-6 Na2SO4
Strontium chloride hexahydrate Carl Roth 10025-70-4 SrCl2 · 6 H2O
Thiamine hydrochloride Merck 67-03-8 C12H17ClN4OS · HCl
TRIS Carl Roth 77-86-1 C4H11NO3
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 Hielscher Ultrasound Technology UP100H
Ultraturrax Silent Crusher M Heidolph Instruments homogenizer
Urea Carl Roth 57-13-6 CH4N2O
Vitamin B12 Sigma 68-19-9 C63H88CoN14O14P
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin
Water Stills, Water treatment VEOLIA water technologies ELGA_21001
Zinc sulphate heptahydrate Sigma 7446-20-0 ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
gatb-minia program for DNA assembly https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based
ImageJ software for immage processing (pixel intensities, circle diameter)
RAST annotation server https://rast.nmpdr.org input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions
Culture media
Artificial seawater 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 -liquid medium artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ liquid medium f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4
f/2-agar 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4
Trace element solution 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
Vitamin solution 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
  2. Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evaluation of New Genetic Toolkits and Their Role for Ethanol Production in Cyanobacteria. Energies. 12 (18), 3515 (2019).
  3. Wendt, K. E., Pakrasi, H. B. Genomics approaches to deciphering natural transformation in cyanobacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 1259 (2019).
  4. Tandeau de Marsac, N., et al. A new approach for molecular cloning in cyanobacteria: cloning of an Anacystis nidulans met gene using a Tn901-induced mutant. Gene. 20 (1), 111-119 (1982).
  5. Porter, R. D. Transformation in cyanobacteria. Critical Reviews in Microbiology. 13 (2), 111-132 (1986).
  6. Joset, F. Transformation in Synechocystis PCC 6714 and 6803: preparation of chromosomal DNA. Methods in Enzymology. 167, 712-714 (1988).
  7. Tsinoremas, N. F., Kutach, A. K., Strayer, C. A., Golden, S. S. Efficient gene transfer in Synechococcus sp strains PCC-7942 and PCC-6301 by interspecies conjugation and chromosomal recombination. Journal of Bacteriology. 176 (21), 6764-6768 (1994).
  8. Matsunaga, T., Takeyama, H. Genetic engineering in marine cyanobacteria. Journal of Applied Phycology. 7 (1), 77-84 (1995).
  9. Frigaard, N. U., Sakuragi, Y., Bryant, D. A. Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation. Methods in Molecular Biology. 274, 325-340 (2004).
  10. Iwai, M., Katoh, H., Katayama, M., Ikeuchi, M. Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant and Cell Physiology. 45 (2), 171-175 (2004).
  11. Vioque, A. Transformation of cyanobacteria. Transgenic Microalgae as Green Cell. Leon, R., Galvan, A., Fernandez, E. , Springer. 12-22 (2007).
  12. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. Plos One. 15 (6), 0234440 (2020).
  13. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66 (1), 174-176 (2006).
  14. El Semary, N. A. Optimized electroporation-induced transformation in Microcystis aeruginosa PCC7806. Biotechnologie Agronomie Societe et Environnement. 14 (1), 149-152 (2010).
  15. Nies, F., Mielke, M., Pochert, J., Lamparter, T. Natural transformation of the filamentous cyanobacterium Phormidium lacuna. PLoS One. 15 (6), 0234440 (2020).
  16. Sode, K., Tatara, M., Takeyama, H., Burgess, J. G., Matsunaga, T. Conjugative gene-transfer in marine cyanobacteria - Synechococcus Sp, Synechocystis Sp and Pseudanabaena Sp. Applied Microbiology and Biotechnology. 37 (3), 369-373 (1992).
  17. Stucken, K., Ilhan, J., Roettger, M., Dagan, T., Martin, W. F. Transformation and conjugal transfer of foreign gGenes into the filamentous multicellular cyanobacteria (Subsection V) Fischerella and Chlorogloeopsis. Current Microbiology. 65 (5), 552-560 (2012).
  18. Bellali, S., Khalil, J. B., Fontanini, A., Raoult, D., Lagier, J. C. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiological Research. 236, 126454 (2020).
  19. Wallner, T., Pedroza, L., Voigt, K., Kaever, V., Wilde, A. The cyanobacterial phytochrome 2 regulates the expression of motility-related genes through the second messenger cyclic di-GMP. Photochemical & Photobiological Sciences. 19 (5), 631-643 (2020).
  20. Wilde, A., Fiedler, B., Borner, T. The cyanobacterial phytochrome Cph2 inhibits phototaxis towards blue light. Molecular Microbiology. 44 (4), 981-988 (2002).
  21. Bhaya, D., Takahashi, A., Grossman, A. R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 7540-7545 (2001).
  22. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  23. Kester, D. R., Duedall, I. W., Connors, D. N., Pytkowicz, R. M. Preparation of artificial seawater. Limnology and Oceanography. 12 (1), 176-179 (1967).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  25. Cold Spring Harbor Protocols. CTAB DNA extraction buffer. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (3), (2009).
  26. Singh, S. P., Rastogi, R. P., Häder, D. -P., Sinha, R. P. An improved method for genomic DNA extraction from cyanobacteria. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 27, 1225-1230 (2011).
  27. French, C. S., Milner, H. W. Disintegration of bacteria and small particles by high-pressure extrusion. Methods in Enzymology. 1, 64-67 (1955).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  29. Lamparter, T., et al. The involvement of type IV pili and phytochrome in gliding motility, lateral motility and phototaxis of the cyanobacterium Phormidium lacuna. bioRxiv. , (2021).
  30. Nies, F., et al. Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications. Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).
  31. Kachel, B., Mack, M. Engineering of Synechococcus sp. strain PCC 7002 for the photoautotrophic production of light-sensitive riboflavin (vitamin B2). Metabolic Engineering. 62, 275-286 (2020).
  32. Lukavsky, J., Cepak, V., Komarek, J., Kasparkova, M., Takacova, M. Catalogue of algal and cyanobacterial strains of culture collection of autotrophic organisms at Trebon. Algological Studies. 63, 59-112 (1992).
  33. Philbrick, J. B., Diner, B. A., Zilinskas, B. A. Construction and characterization of cyanobacterial mutants lacking the manganese-stabilizing polypeptide of photosystem-ii. Journal of Biological Chemistry. 266 (20), 13370-13376 (1991).
  34. Pinevich, A. V., Veprritskii, A. A., Gromov, B. V., Krautvald, K., Titova, N. N. Cellular and cultural properties and characterization of the pigment in Nostoc sp, a cyanobacterium unusually rich in c-phycoerythrin. Microbiology. 63 (5), 481-485 (1994).
  35. Schlosser, U. G., Friedl, T. Additions to the culture collection of algae at Gottingen since 1997. Nova Hedwigia. 71 (1-2), 243-262 (2000).
  36. Takano, H., Arai, T., Hirano, M., Matsunaga, T. Effects of intensity and quality of light on phycocyanin production by a marine cyanobacterium Synechococcus sp. 042902. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (6), 1014-1018 (1995).
  37. Carrer, H., Hockenberry, T. N., Svab, Z., Maliga, P. Kanamycin resistance as a selectable marker for plastid transformation in tobacco. Molecular and General Genetics: MGG. 241 (1-2), 49-56 (1993).
  38. Kaulen, H., Schell, J., Kreuzaler, F. Light-induced expression of the chimeric chalcone synthase-NptII gene in tobacco cells. EMBO Journal. 5 (1), 1-8 (1986).
  39. Cotlet, M., Goodwin, P. M., Waldo, G. S., Werner, J. H. A comparison of the fluorescence dynamics of single molecules of a green fluorescent protein: One- versus two-photon excitation. Chemphyschem. 7 (1), 250-260 (2006).
  40. Taton, A., et al. The circadian clock and darkness control natural competence in cyanobacteria. Nature Communications. 11 (1), 1688 (2020).

Tags

Biologi utgave 180
Naturlig transformasjon, proteinuttrykk og kryokonservasjon av den filamentøse cyanobakterien <em>Phormidium lacuna</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch,… More

Weber, N., Hofmeister, M., Wunsch, N., Kohler, A., Kaster, A. K., Vollmers, J., Kachel, B., Mack, M., Lamparter, T. Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (180), e63470, doi:10.3791/63470 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter