Summary
Den nåværende protokollen beskriver en kirurgisk prosedyre for å fjerne stigende aortabånd i en rottemodell av lungehypertensjon på grunn av venstre hjertesykdom. Denne teknikken studerer endogene mekanismer for omvendt ombygging i lungesirkulasjonen og høyre hjerte, og informerer dermed strategier for å reversere lungehypertensjon og/eller høyre ventrikulær dysfunksjon.
Abstract
Pulmonal hypertensjon på grunn av venstre hjertesykdom (PH-LHD) er den vanligste formen for PH, men dens patofysiologi er dårlig preget enn pulmonal arteriell hypertensjon (PAH). Som et resultat mangler godkjente terapeutiske inngrep for behandling eller forebygging av PH-LHD. Legemidler som brukes til å behandle PH hos PAH-pasienter anbefales ikke til behandling av PH-LHD, da redusert lungevaskulær resistens (PVR) og økt lungeblodstrøm i nærvær av økt venstresidet fyllingstrykk kan forårsake venstre hjertedekompensasjon og lungeødem. Nye strategier må utvikles for å reversere PH hos LHD-pasienter. I motsetning til PAH utvikler PH-LHD seg på grunn av økt mekanisk belastning forårsaket av overbelastning av blod i lungesirkulasjonen under venstre hjertesvikt. Klinisk, mekanisk lossing av venstre ventrikel (LV) ved aortaventil erstatning i aorta stenose pasienter eller ved implantasjon av LV assist enheter i sluttfasen hjertesvikt pasienter normaliserer ikke bare lungearterielle og høyre ventrikulære (RV) trykk, men også PVR, og dermed gir indirekte bevis for omvendt ombygging i lungevaskulaturen. Ved hjelp av en etablert rottemodell av PH-LHD på grunn av venstre hjertesvikt utløst av trykkoverbelastning med etterfølgende utvikling av PH, utvikles en modell for å studere de molekylære og cellulære mekanismene i denne fysiologiske omvendte ombyggingsprosessen. Spesielt ble det utført en aortadebandingsoperasjon, noe som resulterte i omvendt ombygging av LV-myokardiet og lossing. Parallelt var fullstendig normalisering av RV systolisk trykk og betydelig, men ufullstendig reversering av RV hypertrofi påviselig. Denne modellen kan presentere et verdifullt verktøy for å studere mekanismene for fysiologisk omvendt ombygging i lungesirkulasjonen og bobilen, med sikte på å utvikle terapeutiske strategier for behandling av PH-LHD og andre former for PH.
Introduction
Hjertesvikt er den ledende dødsårsaken i utviklede land og forventes å øke med 25% i løpet av det neste tiåret. Pulmonal hypertensjon (PH) - en patologisk økning av blodtrykket i lungesirkulasjonen - påvirker ca. 70% av pasientene med hjertesvikt i sluttfasen; Verdens helseorganisasjon klassifiserer PH som pulmonal hypertensjon på grunn av venstre hjertesykdom (PH-LHD)1. PH-LHD initieres av nedsatt systolisk og/eller diastolisk venstre ventrikkelfunksjon (LV) som resulterer i forhøyet fyllingstrykk og passiv overbelastning av blod inn i lungesirkulasjonen2. Selv om ph-LHD i utgangspunktet er reversibel, blir den gradvis fast på grunn av aktiv lungevaskulær ombygging i alle rom i lungesirkulasjonen, det vil si arterier, kapillærer og årer 3,4. Både reversibel og fast PH øke RV etterbelastning, i utgangspunktet kjøre adaptativ myokard hypertrofi, men til slutt forårsaker RV dilatasjon, hypokinese, fibrose, og dekompensasjon som gradvis fører til RV-feil 1,2,5,6. Som sådan akselererer PH sykdomsprogresjon hos hjertesviktpasienter og øker dødeligheten, spesielt hos pasienter som gjennomgår kirurgisk behandling ved implantasjon av venstre ventrikulære hjelpeenheter (LVAD) og / eller hjertetransplantasjon 7,8,9. For tiden finnes det ingen kurative terapier som kan reversere prosessen med lungevaskulær ombygging, så grunnleggende mekanistisk forskning i passende modellsystemer er nødvendig.
Det er viktig at kliniske studier viser at PH-LHD som hyppig komplikasjon hos pasienter med aortastenose kan forbedre seg raskt i den tidlige postoperative perioden etter aortaventilerstatning10. Analogt ble høy (>3 treenheter) preoperativ lungevaskulær resistens (PVR) som imidlertid var reversibel på nitroprusside bærekraftig normalisert etter hjertetransplantasjon i en 5-års oppfølgingsstudie11. På samme måte kan en tilstrekkelig reduksjon av både reversibel og fast PVR og forbedring av RV-funksjonen hos LHD-pasienter realiseres innen flere måneder ved å losse venstre ventrikel ved hjelp av implanterbar pulsatile og ikke-pulsatile ventrikulære hjelpeenheter 12,13,14. For tiden er de cellulære og molekylære mekanismene som driver omvendt ombygging i lungesirkulasjonen og RV-myokardiet uklart. Likevel kan deres forståelse gi viktig innsikt i fysiologiske veier som kan utnyttes terapeutisk for å reversere lungevaskulær og rv-ombygging i PH-LHD og andre former for PH.
En egnet preklinisk modell som tilstrekkelig replikerer de patofysiologiske og molekylære egenskapene til PH-LHD, kan brukes til translasjonelle studier i trykkoverbelastningsindusert kongestiv hjertesvikt på grunn av kirurgisk aortabånd (AoB) hos rotter 4,15,16. Sammenlignet med lignende hjertesvikt på grunn av trykkoverbelastning i murinmodellen av tverrgående aorta innsnevring (TAC)17, gir banding av stigende aorta over aortaroten i AoB-rotter ikke hypertensjon i venstre karotisarterie da båndstedet er proksimalt for utstrømningen av venstre karotisarterie fra aorta. Som et resultat forårsaker AoB ikke venstresidige nevronskader i cortex som er karakteristisk for TAC18, og som kan påvirke studieresultatet. Sammenlignet med andre gnagermodeller av kirurgisk indusert PH-LHD, viser rottemodeller generelt, og AoB spesielt, seg å være mer robuste, reproduserbare og gjenskape ombyggingen av lungesirkulasjonskarakteristikken for PH-LHD-pasienter. Samtidig er perioperativ dødelighet lav19. Økt LV-trykk og LV-dysfunksjon hos AoB-rotter induserer PH-LHD-utvikling, noe som resulterer i forhøyede RV-trykk og ombygging av bobiler. Som sådan har AoB-rottemodellen vist seg ekstremt nyttig i en rekke tidligere studier av uavhengige grupper, inkludert oss selv, for å identifisere patomekanismer av lungevaskulær ombygging og teste potensielle behandlingsstrategier for PH-LHD 4,15,20,21,22,23,24,25.
I den nåværende studien ble AoB-rottemodellen brukt til å etablere en kirurgisk prosedyre for aortadebanding for å studere mekanismer for omvendt ombygging i lungevaskulaturen og bobilen. Tidligere har myokard-omvendt ombyggingsmodeller som aortadebanding hos mus26 og rotter27 blitt utviklet for å undersøke de cellulære og molekylære mekanismene som regulerer regresjonen av venstre ventrikulær hypertrofi og teste potensielle terapeutiske alternativer for å fremme myokardiale bedring. Videre har et begrenset antall tidligere studier undersøkt effekten av aortadebanding på PH-LHD hos rotter og vist at aortadebanding kan reversere medial hypertrofi i lungearterioler, normalisere uttrykket for pre-pro-endothelin 1 og forbedre lunge hemodynamikk27,28, noe som gir bevis for reversibility av PH hos rotter med hjertesvikt. Her er de tekniske prosedyrene for debanding kirurgi optimalisert og standardisert, for eksempel ved å bruke en trakeotomi i stedet for endotrakeal intubasjon eller ved å bruke titan klips av en definert indre diameter for aorta banding i stedet for polypropylen suturer med en stump nål26,27, og dermed gi bedre kontroll over kirurgiske prosedyrer, økt reproduserbarhet av modellen og en forbedret overlevelsesgrad.
Fra et vitenskapelig perspektiv ligger betydningen av PH-LHD-debanding-modellen ikke bare i å demonstrere reversibiliteten til kardiovaskulær og lungefenotype i hjertesvikt, men enda viktigere, i identifisering av molekylære drivere som utløser og / eller opprettholder omvendt ombygging i lungearterier som lovende kandidater for fremtidig terapeutisk målretting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført etter "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (Institute of Laboratory Animal Resources, 8. utgave 2011) og godkjent av den lokale statlige dyrepleie- og brukskomiteen til det tyske statskontoret for helse- og sosialsaker (Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSO), Berlin; protokollnr. G0030/18). For det første ble kongestiv hjertesvikt kirurgisk indusert i juvenile Sprague-Dawley rotter ~ 100 g kroppsvekt (bw) (se Tabell over materialer) ved å plassere et titanklips med en 0,8 mm indre diameter på stigende aorta (aortabånd, AoB) som beskrevet tidligere29,30. I uke 3 etter AoB (figur 1) ble debanding (Deb) kirurgi utført for å fjerne klipsen fra aorta. De kirurgiske prosedyrene og valideringen av PH-reversering hos AoB-rotter som utføres, er skjematisk avbildet i figur 1.
1. Kirurgiske preparater
- Steriliser de nødvendige kirurgiske instrumentene (figur 2) ved autoklavering.
- Injiser rotte med karprofen (5 mg/kg kroppsvekt) (se Materialfortegnelse) intraperitonealt (dvs.) for analgesi 30 min før operasjonen.
- Bedøv rotte ved injeksjon av ketamin (87 mg/kg kroppsvekt) og xylazin (13 mg/kg kroppsvekt).
- Fjern håret fra dyrets hals og bryst ved hjelp av en elektrisk barbermaskin.
- Påfør en dråpe øyesalve for å beskytte øynene under operasjonen.
- Plasser rotten i en liggende stilling på et sterilisert kirurgisk bord. Fest forsiktig dyrets mage og lemmer med tape.
MERK: For å opprettholde kroppstemperaturen, plasser en varmematte på 37 °C under det kirurgiske bordet. Unngå oppvarming av hodeområdet for å forhindre tørking av øynene. - Desinfiser dyrehuden med povidon-jod/iodoforoppløsning. Legg merke til arr og suturer fra den primære AoB-operasjonen og draper det kirurgiske feltet.
- Sørg for tilstrekkelig dybde av anestesi ved tå klemming.
MERK: Anestesidybden må kontrolleres regelmessig under operasjonen.
2. Trakeotomi og mekanisk ventilasjon
MERK: Gjennom hele operasjonen, bytt hansker etter håndtering av ikke-sterilt utstyr.
- Med fin saks (figur 2A) gjør du et 7-10 mm langt cervical midline snitt (figur 3A).
- Ved hjelp av et par stumpe tang (figur 2B'), disseker livmorhalsen bløtvev for å eksponere de infrahyoide musklene. Split muskler i midtlinjen for å visualisere luftrøret. Klipp og fjern suturen fra den primære AoB-operasjonen.
- Lag ~2 mm luftrørssnitt mellom to bruskringer ved hjelp av vinklet Noyes vårsaks (figur 2C,3B). Sett trakealkanylen med ytre diameter 2 mm (figur 2D) inn i luftrøret og fest den med en 4-0 silke sutur (figur 2E,3C).
- Koble trakealkanylen til en mekanisk ventilator (se Materialfortegnelse) samtidig som du holder død plass til et minimum (figur 3D-E). Hold perioperativ lungeventilasjon med en luftveishastighet på 90 pust/min ved et tidevannsvolum (Vt) på 8,5 ml/kg kroppsvekt.
3. Aorta debanding
- Lag et ~20 mm langt hudinnsnitt mellom andre og tredje ribbe med fin saks (figur 3F).
- Ved hjelp av mindre kirurgisk saks (figur 2F) sprer du forsiktig muskler og kutter dem lag for lag (figur 3G). Lag et 10 mm lateralt snitt langs intercostalrommet mellom den andre og tredje ribben.
MERK: Midtlinjen må nærmer seg nøye for å unngå blødning. - Bruk en ribbespreder (figur 2G) til å utvide interkostalrommet mellom det andre og tredje ribbenet for å opprette et kirurgisk vindu (figur 3H).
- Ved hjelp av stumpe tang (figur 2B,B'), separer forsiktig tymusen fra hjertet og kanalarteriene for å visualisere aorta med klipsen (figur 4A).
- Hold klipsen ved hjelp av tangene og fjern forsiktig bindevevet rundt klipsen for å eksponere det.
MERK: Unngå å holde eller løfte aorta med tang, da det kan skade aorta som resulterer i blødning og dødelig utfall. - Ved hjelp av en nåleholder (figur 2H) åpner du klipsen (figur 4B) og fjerner den fra thoraxhulen.
- Før du lukker brystet, åpne lungeatelase, sørg for tilstrekkelig lungerekruttering uten overdistensjon, fortsett mekanisk ventilasjon med en Vt på 9,5 ml / kg kroppsvekt i ytterligere 10 minutter, og gå tilbake til en Vt på 8,5 ml / kg kroppsvekt for å rekruttere lungene og løse en mulig pneumothorax.
- Lukk de dype musklene ved en enkel avbrutt sutur ved hjelp av 4-0 silke. Koble deretter de øvre musklene og huden med en enkel kontinuerlig sutur (figur 5A, B).
4. Trakeal overflod
- Koble trakealkanylen fra ventilasjonsmaskinen. Observer rotte oppmerksomt til spontan pust er reetablert. Hvis dyret ikke puster spontant ved frakobling, kobler du til ventilatoren igjen og fortsetter å ventilere i ytterligere 5 minutter. Gjenta deretter prosedyren.
- Etter at spontan pust er reetablert, fjern kanylen fra luftrøret og rengjør væsken rundt luftrøret med svamppunkter (figur 2I) (se Materialfortegnelse).
- Lukk luftrøret med en enkel sutur med 6-0 prolen (figur 2E' og figur 5C). Lukk deretter infrahyoide muskler i en enkel avbrutt sutur ved hjelp av 4-0 silke (figur 5D), og koble huden i en enkel kontinuerlig sutur (figur 5E). Rengjør og desinfiser musklene og huden under prosessen med povidon-jod/iodoforoppløsning.
5. Postoperativ omsorg
- Etter å ha fullført den kirurgiske prosedyren, flytt dyret forsiktig til et gjenopprettingsbur med ekstra oksygen og en infrarød lampe for å holde dyrene varme og tilstrekkelig oksygenert under utvinningsfasen. Plasser oksygenmasken nær rottens snute. Bare hold ett dyr per gjenopprettingsbur når som helst.
- Etter at dyret våkner, flytt det forsiktig til et vanlig bur som leveres med vann og mat. For de neste 12 timer, kontroller helsestatusen til det opererte dyret i 2 timers intervaller.
- Etter å ha fullført den kirurgiske prosedyren, bruk analgesi daglig ved hjelp av i.p. injeksjon av karprofen (5 mg / kg kroppsvekt) i en uke.
- For å unngå bakteriell infeksjon, administrer amoksicillin (500 mg/l) i drikkevannet i en uke postoperativt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For det første ble vellykket aortadebanding bekreftet av transthoracic ekkokardiografi utført før og etter debandingsprosedyren hos AoB-dyr (figur 6). For dette formål ble aortabuen vurdert i parasternal lang akse (PLAX) B-modusvisning. Plasseringen av klippet på stigende aorta hos AoB dyr og fravær etter Deb operasjonen ble visualisert (Figur 6A, B). Deretter ble aortablodstrømmen evaluert ved pulserende Doppler-avbildning (figur 6C-F). Maksimal blodmengdehastighet hos AoB-dyr målt før og etter klipsen var 733,24 ± henholdsvis 17,39 mm/s og 5215,08 ± 48,05 mm/s (n = 8 dyr), henholdsvis (figur 6C,E), som viser en bratt gradient over AoB-området. Etter fjerning av klips var maksimal blodstrømhastighet 1093,79 ± henholdsvis 28,97 mm/s og 2578,73 ± 42,27 mm/s, på tilsvarende aortasteder, noe som viser en markert demping av gradienten i tråd med funksjonell debanding (figur 6D,F). For å sonde for reversering av venstre hjertesvikt ved aortadebanding, ble uttrykksnivåene av hjernens natriuretiske peptid (BNP), en klinisk rutineparameter for å vurdere hjertesykdom31, tilgjengelig i LV-myokardiet. I uke 3 og 5 etter aortabånd viste AoB-dyr en betydelig økt produksjon av BNP sammenlignet med sham-opererte kontroller. Til sammenligning uttrykte Deb-rotter i uke 5 BNP på nivåer som kan sammenlignes med skamdyr, noe som indikerer reversering av LV-svikt ved aortadebanding (figur 7A-C). Parallelt viste evaluering av LV-funksjon ved transthoracic ekkokardiografi en økt LV-utkasterfraksjon og LV-volum hos Deb-dyr sammenlignet med AoB-rotter (figur 7D-E). Mens LV-utkastelsesfraksjonen i Deb-dyr var sammenlignbar med sham rotter, klarte ikke LV-volum i Deb-rotter å normalisere seg fullt ut til verdier sett i skamgruppen, noe som indikerer at reversering av LV-funksjonen er ufullstendig.
For å undersøke om Deb dyr kan tjene som en preklinisk modell for å studere omvendt lungevaskulær og høyre ventrikulær (RV) ombygging i PH-LHD, venstre ventrikkel systolisk trykk (LVSP), og høyre ventrikkel systolisk trykk (RVSP) ble vurdert ved hjelp av et mikrotip Millar kateter. Kort fortalt ble rotter igjen bedøvet med ketamin (87 mg/kg kroppsvekt) og xylazin (13 mg/kg kroppsvekt), trakeotomisert og ventilert som beskrevet ovenfor. Hjertekateterisering ble utført etter median thoracotomy32 gjennom toppen av (først) venstre og (andre) høyre ventrikel, henholdsvis som direkte kateterisering av venstre ventrikel via den vaskulære ruten forhindres av aortabåndet i AoB dyr. Etter eutanasi ved en overdose av ketamin/xylazin ble hjertet utskilt, og ventrikulær hypertrofi ble vurdert som vekten av venstre ventrikel inkludert septum (LV +S) eller høyre ventrikel (RV) normalisert til kroppsvekt (BW). I samsvar med AoB rotter som en etablert modell for PH-LHD, viste AoB dyr en betydelig økt LVSP og RVSP og LV og RV hypertrofi sammenlignet med sham-opererte dyr ved 3 uker etter operasjonen (Figur 8A-F). Debanding (Deb) kirurgi utført i uke 3 etter AoB resulterte i en betydelig reduksjon av både LVSP og LV hypertrofi i forhold til AoB dyr uten Deb i uke 3 og uke 5 post-AoB, noe som viser at normalisering av LV hemodynamikk etter klipp fjerning fra aorta reversert LV remodeling (Figur 8C,D). Sammenlignet med AoB-rotter i uke 3 og uke 5, viste Deb-dyr også en betydelig reduksjon i RVSP og RV / BW, noe som viste vellykket reversering av PH-LHD (figur 8E, F). Spesielt var RVSP hos Deb-rotter sammenlignbar med verdier målt i skamdyr, noe som indikerer en fullstendig normalisering av RV hemodynamikk. Derimot ble RV-hypertrofi hos Deb-dyr bare delvis reversert med RV / BW, gjenværende betydelig økt sammenlignet med sham-kontroller (figur 8E, F).
Figur 1: Skjematisk fremstilling av kirurgiske prosedyrer og validering av PH-reversering hos AoB-rotter. Skjematisk skildrer de ulike eksperimentelle gruppene som brukes i den nåværende studien for å teste om debanding kirurgi reverserer PH-LHD. Sham, sham-opererte kontroller; AoB, aorta banding; Deb, debanding. Trekanter markerer tidspunktet for kirurgiske inngrep: primæroperasjon (sham eller AoB, rød) ved uke 0 og sekundær operasjon (Deb; grønn) i uke 3. Sirkler markerer sluttpunktanalysene der PH-LHD ble vurdert av henholdsvis LV- og RV-trykk og hypertrofimålinger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kirurgiske instrumenter. (A) Fin saks Wolframkarbid. (B) Moria Iris tangerer og (B') Serrated Graefe tang. Tangens spisser vises forstørret. (C) Noyes vårsaks. (D) Trakeal kanyle. (E, E') 4-0 og 6-0 suturer, henholdsvis. (F) Fin saks Wolframkarbid. (G) Ribbespreder. (H) Mathieu nålholder. (I) Svamp peker vev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Trakeotomi og thoracotomy. Bilder illustrerer de kirurgiske trinnene for trakeotomien. (A) Cervical midtlinje snitt. (B) Snitt av luftrøret mellom to bruskringer. (C) Trakeal kanyle satt inn i luftrøret og sikret med en sutur. (D) Trakealkanylen er koblet til en mekanisk ventilator. (E) Bilder illustrerer de kirurgiske trinnene for thoracotomy. (F) Hud snitt mellom andre og tredje ribber. (G) Kutting av muskler. (H) Opprettelse av et thorax kirurgisk vindu ved å spre den andre og den tredje ribben. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Visualisering av det aorta-innsnevrende klippet in vivo og ex vivo. (A) Bildet viser thoraxhulen til en AoB-rotte med en titanklips plassert på stigende aorta. (B) Bildet viser lukket og åpnet klipp ex vivo. Stjernen markerer den delen av klipsen som nåleholderen komprimerer in vivo for å åpne klipsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sårlukking. Bilder illustrerer lukkingen av de øvre thoraxmuskulaturen (A) og huden (B) med en enkel kontinuerlig sutur. Luftrøret (C) og de infrahyoide musklene (D) lukkes av en enkel sutur og huden på nakken (E) med en enkel kontinuerlig sutur. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Aortablodstrøm før og etter debanding kirurgi. (A-B) Visualisering av stigende aorta i en rotte med aorta banding (AoB, venstre) og en rotte etter debanding kirurgi (Deb, høyre) ved transthoracic ekkokardiografi. Pilen viser titanklemmen på aortaen i (A) fraværende i (B). (C,D) Pulserende bølge Doppler ekkokardiografiske bilder viser blodstrømmen før klippet i en AoB rotte (C) og blodstrøm i tilsvarende aorta segmentet i en Deb rotte (D) tatt en dag før og en dag etter aorta debanding kirurgi, henholdsvis. (E,F) Analogt viser bilder blodstrømmen i aortasegmentet etter klipsen i en AoB-rotte (E) og i det tilsvarende aortasegmentet i en Deb-rotte (F) tatt en dag før og en dag etter henholdsvis aortadebandingsoperasjonen. Turkis vertikale linjer illustrerer målinger av topp aortastrømningshastighet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Normalisering av venstre ventrikkelfunksjon ved aortadebanding. (A) Representative vestlige flekker viser proteinnivåer av BNP og med GAPDH som lastekontroll i venstre ventrikler (LV) av AoB-rotter i uke 3 etter aortabånd (n = 5) og i tilsvarende sham-kontroller (n = 5). (B) Representative vestlige flekker viser BNP og GAPDH i venstre ventrikler (LV) av AoB rotter i uke 5 etter aorta banding (n = 4), i Deb rotter i uke 5 (n = 5), og i sham kontroller på tilsvarende tidspunkt etter primær kirurgi (n = 4). (C) Box og whisker tomter viser kvantifisering av BNP uttrykk normalisert til GAPDH og sham kontroll på tilsvarende tidspunkt etter primær kirurgi. Bokser viser henholdsvis median, 25 og 75 persentiler. whiskers angir minimums- og maksimumsverdiene. For statistiske analyser ble student t-test33 brukt. *p-verdi < 0,05. (D) Stolpediagrammer (gjennomsnittlig ± standardavvik) viser LV-utkastfraksjon og volum i skam (n = 4), AoB (n = 9) og Deb (n = 7) dyr i uke 5 målt ved ekkokardiografi fra bilder i M- og B-modus. (E) Representative M-modus ekkokardiografiske bilder viser endringer i LV-brøkforkortelse hos sham-, AoB- og Deb-dyr i uke 5. For statistiske analyser ble Mann-Whitney U test33 brukt. *p-verdi < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Ventrikulær hemodynamikk normaliseres, og hjertehypertrofi reverseres ved aortadebanding. (A) Representative målinger av venstre ventrikkel (LV) og høyre ventrikkel (RV) blodtrykk hos en rotte 3 uker etter aortabånd (AoB) sammenlignet med tilsvarende skamkontroll. (B) Representative bilder viser hjertehypertrofi hos en AoB-rotte 3 uker etter aortabånd sammenlignet med sham-kontroll. (C-F) Box og whisker tomter viser venstre ventrikulær systolisk trykk (LVSP; C), LV hypertrofi ([LV+S]/BW; D), høyre ventrikulært systolisk trykk (RVSP; E) og RV hypertrofi (RV / BW; F) hos sham- og AoB-dyr ved 3 og 5 uker etter operasjonen, og normaliserte parametere (i forhold til 3- og 5-ukers AoB-grupper) hos Deb-rotter. Bokser viser henholdsvis median, 25 og 75 persentiler. whiskers angir minimums- og maksimumsverdiene. n = 9-12 dyr ble analysert for hemodynamiske målinger, og hjertevekt ble målt i n = 7-12 rotter per gruppe. For statistiske analyser ble Mann-Whitney U-testen brukt. *p-verdi < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her rapporteres en detaljert kirurgisk teknikk for aortadebanding i en rotte AoB-modell som kan brukes til å undersøke reversibiliteten til PH-LHD og de cellulære og molekylære mekanismene som driver omvendt ombygging i lungevaskulaturen og bobilen. Tre uker med aorta innsnevring hos juvenile rotter resulterer i PH-LHD tydelig som økt LV-trykk, LV hypertrofi, og samtidig økt RV-trykk og RV hypertrofi. Aorta debanding i uke 3 post-AoB var i stand til å losse LV og fullstendig reversere LV hypertrofi innen to uker etter Deb. Parallelt forårsaket aortadebanding også en full normalisering av RV-trykk og en delvis reversering av RV-hypertrofi.
Den nåværende modellen etterligner dermed kritiske aspekter av det kliniske scenariet der mekanisk lossing av LV av en implanterbar ikke-pulsatile LVAD med kontinuerlige strømningsegenskaper tidligere har vist seg å reversere PH hos pasienter med hjertesvikt34,35. I en retrospektiv analyse ble LVAD-støtte vist å redusere lungearterietrykket til lignende grader hos hjertesviktpasienter med enten reversibel eller fast PH, med fast PH definert som gjennomsnittlig lungearterietrykk >25 mm Hg, lungevaskulær resistens >2,5 treenhet og en gjennomsnittlig trykktranspulmonal gradient >12 mm Hg til tross for farmakologisk behandling35. Viktigst, disse funnene34,35 gir indirekte bevis på at venstre ventrikulær lossing ikke bare reduserer passiv lungebelastning og sekundære endringer i lungevaskulær tone, men utløser omvendt ombygging av lungevaskulaturen ved "fysiologiske" mekanismer, det vil si ved tilpasning til endret hemodynamikk. Grundige multi-omics analyser av cellulære og molekylære prosesser som driver omvendt ombygging i lungevaskulaturen kan åpne opp nye veier for å identifisere nye terapeutiske alternativer for behandling av PH hos hjertesviktpasienter og potensielt også i andre former for PH inkludert PAH. Den nåværende modellen for debanding i AoB-rotter gir en unik mulighet for slike analyser som fullstendig normalisering av RVSP bekrefter effektiv reversering av PH, og tillater dermed mekanistiske studier å identifisere veier med evnen til å gjenopprette homeostatiske prosesser i den syke lungevaskulaturen.
Med en lignende begrunnelse kan dagens modell videre benyttes til å studere intra- og intercellulære prosesser som driver omvendt ombygging av RV. RV-funksjonen har nylig blitt anerkjent som en betydelig prediktor for prognose for sykelighet og dødelighet ved hjerte- og karsykdommer. Likevel er ingen behandlinger klinisk godkjent for å forbedre RV-funksjonen36. Som sådan gir evnen til å studere omvendte ombyggingsprosesser i RV-myokardiet i en dyremodell en unik mulighet til å adressere et betydelig kunnskapsgap og et kritisk medisinsk behov.
Suksessen til den teknisk utfordrende aortadebandingsprosedyren hos AoB-rotter avhenger av kirurgiske ferdigheter og presise perioperative strategier. Skissert i det følgende er kritiske kirurgiske prosedyretrinn som kan forårsake perioperativ dødelighet ved overdreven blødning (1-5) eller utilstrekkelig åndedrett (6) og anbefalinger om å unngå disse komplikasjonene.
(1) Under en thoracotomy må midtlinjen nærmer seg nøye med saks for å unngå skade på den indre brystarterien. (2) For å visualisere hjertet og ledningsarteriene, bør tymus mobiliseres og flyttes forsiktig i kranialretningen. I debanding kirurgi, thymus vev er ofte koblet til hjertet og arterier via postoperative adhesjoner fra den opprinnelige AoB kirurgi. Disse vedheftene bør forsiktig separeres med et par stumpe tang for å unngå skade på kardiovaskulære strukturer. (3) I debanding kirurgi, aorta med klips er ofte innebygd i bindevev. Dette bindevevet må forsiktig dissekeres med stumpe tang for å visualisere klippet. Her utføres den transthoraciske ekkokardiografien før operasjonen et nyttig forberedelsestrinn, slik at du kan identifisere om klippet ligger nær aortaroten, midt i den stigende aortaen, eller i nærheten av den brachiocephalic arterien. Denne kunnskapen sparer dyrebar tid for klipptildeling under operasjonen. (4) Retningen på klipsen er et kritisk trinn som må vurderes nøye under den første aortabåndoperasjonen. For å lette optimal vurdering og rask åpning av klipsen under aortadebanding, bør den delen som må komprimeres av nåleholderen (figur 4B) orienteres ventralt. Klipp reorientering under debanding kirurgi er mulig, men med fare for skade på aorta. For klipsreorientering må klips holdes av tang mens omkringliggende bindevev fjernes forsiktig, da skal klipsen mobiliseres og dreies. Å holde aorta med tangen skal unngås. (5) For debanding skal klipsen holdes av en tang med den ene hånden og åpnes med en nåleholder med den andre hånden. Aorta trenger ikke løftes ventrally. (6) Etter å ha fullført debanding prosedyren, extubated PH-LHD rotter har betydelig risiko for respirasjonssvikt, med dyr som vanligvis dør innen 10-20 min etter operasjonen mens de fortsatt er under anestesi. Atelektase i venstre lunge er den vanligste dødsårsaken i denne perioden, og langvarig mekanisk ventilasjon før brystlukking bidrar til å rekruttere lungen og garanterer tilstrekkelig åndedrett etter operasjonen.
Vi foreslår også at sammenlignet med endotrakeal intubasjon som utført i tidligere studier 26,27, gir trakeostomi bedre kontroll over passende ventilasjon under kirurgiske prosedyrer, noe som er spesielt relevant under aortadebanding. Denne forestillingen er basert på følgende begrunnelse: (1) Trakeostomi, rutinemessig utført i vårt laboratorium for perioperativ lungeventilasjon, er en grei og sikker teknikk uten perioperative eller postoperative komplikasjoner. (2) Trakeostomi eliminerer risikoen for esophageal intubasjon eller trakeal skade; Det muliggjør presis posisjonering og fiksering av trakealkanylen og konstant visuell kontroll av kanylen under alle trinn i den kirurgiske prosedyren. (3) På tidspunktet for aortadebanding er AoB-dyr allerede i hjertesvikt og er mer følsomme for ekstra stress; Som et resultat kan de potensielle risikoene som følger med endotrakeal intubasjon legge til økt dødelighet. (4) Til slutt, når det opererte dyret er avventet fra respiratoren, men ikke klarer å utvikle spontan pust, gir en trakeostomi rask reintubasjon og gjenkobling med respiratoren, og dermed potensielt redde liv på grunn av evnen til langvarig postoperativ ventilasjon.
Den nåværende studien rapporterer en aorta debanding teknikk utført 3 uker etter første aorta banding hos rotter. For studier som tar sikte på å sammenligne omvendt ombygging av lungevaskulaturen og bobilen på ulike PH-stadier, kan de beskrevne prosedyrene også utføres på senere tidspunkter etter aortabånd. Likevel er forsiktighet berettiget som arr og bindevev rundt aorta vil sannsynligvis bli mer rikelig med tiden, ytterligere komplisere prosedyren og nødvendiggjøre ytterligere feilsøking og raffinement. Samtidig gjelder de grunnleggende prinsippene i den rapporterte protokollen fortsatt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære. Alle medforfattere har sett og er enige i innholdet i manuskriptet.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra DZHK (German Centre for Cardiovascular Research) til CK og WMK, BMBF (German Ministry of Education and Research) til CK innenfor rammen av VasBio, og til WMK innenfor rammen av VasBio, SYMPATH og PROVID, og German Research Foundation (DFG) til WMK (SFB-TR84 A2, SFB-TR84 C9, SFB 1449 B1, SFB 1470 A4, KU1218/9-1 og KU1218/11-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amoxicillin | Ratiopharm | PC: 04150075615985 | Antibiotic |
| Anti-BNP antibody | Abcam | ab239510 | Western Blotting |
| Aquasonic 100 Ultrasound gel | Parker Laboratories | BT-025-0037L | Echocardiography consumables |
| Bepanthen | Bayer | 6029009.00.00 | Eye ointment |
| Carprosol (Carprofen) | CP-Pharma | 401808.00.00 | Analgesic |
| Clip holder | Weck stainless USA | 523140S | Surgical instruments |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-12 | Surgical scissors |
| Fine scissors Tungsten carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Surgical scissors |
| High-resolution imaging system | FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Netherlands | VeVo 3100 | Echocardiography machine. Images were acquired with pulse-wave Doppler mode, M-mode and B-mode |
| Isoflurane | CP-Pharma | 400806.00.00 | Anesthetic |
| Ketamine | CP-Pharma | 401650.00.00 | Anesthetic |
| Mathieu needle holder | Fine Science Tools | 12010-14 | Surgical instruments |
| Mechanical ventilator (Rodent ventilator) | UGO Basile S.R.L. | 7025 | Volume controlled respirator |
| Metal clip | Hemoclip | 523735 | Surgical consumables |
| Microscope | Leica | M651 | Manual surgical microscope for microsurgical procedures |
| Millar Mikro-Tip pressure catheters | ADInstruments | SPR-671 | Hemodynamics assessment |
| Moria Iris forceps | Fine Science Tools | 11373-12 | Surgical forceps |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15013-12 | Surgical scissors |
| Povidone iodine/iodophor solution | B/Braun | 16332M01 | Disinfection |
| PowerLab | ADInstruments | 4_35 | Hemodynamics assessment |
| Prolene Suture, 4-0 | Ethicon | EH7830 | Surgical consumables |
| Rib spreader (Alm selfretaining retractor blunt, 70 mm, 2 3/4″) | Austos | AE-BV010R | Surgical instruments |
| Serrated Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | Surgical forceps |
| Silk Suture, 4-0 | Ethicon | K871 | Surgical consumables |
| Skin disinfiction solution (colored) | B/Braun | 19412M07 | Disinfection |
| Spectra 360 Elektrode gel | Parker Laboratories | TB-250-0241H | Echocardiography consumables |
| Sponge points tissue | Sugi | REF 30601 | Surgical consumables |
| Sprague-Dawley rat | Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, France | Study animals | |
| Tracheal cannula | Outer diameter 2 mm | ||
| Xylazin | CP-Pharma | 401510.00.00 | Anesthetic |
References
- Rosenkranz, S., et al. Pulmonary hypertension due to left heart disease: Updated recommendations of the cologne consensus conference 2011. International Journal of Cardiology. 154, Suppl 1 34-44 (2011).
- Rosenkranz, S., et al. Left ventricular heart failure and pulmonary hypertension. European Heart Journal. 37 (12), 942-954 (2016).
- Fayyaz, A. U., et al. Global Pulmonary vascular remodeling in pulmonary hypertension associated with heart failure and preserved or reduced ejection fraction. Circulation. 137 (17), 1796-1810 (2018).
- Hunt, J. M., et al. Pulmonary veins in the normal lung and pulmonary hypertension due to left heart disease. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (10), 725-736 (2013).
- Bursi, F., et al. Pulmonary pressures and death in heart failure: A community study. Journal of the American College of Cardiology. 59 (3), 222-231 (2012).
- Ryan, J. J., et al. Right ventricular adaptation and failure in pulmonary arterial hypertension. Canadian Journal of Cardiology. 31 (4), 391-406 (2015).
- Miller, W. L., Mahoney, D. W., Enriquez-Sarano, M. Quantitative Doppler-echocardiographic imaging and clinical outcomes with left ventricular systolic dysfunction: Independent effect of pulmonary hypertension. Circulation: Cardiovascular Imaging. 7 (2), 330-336 (2014).
- Kjaergaard, J., et al. Prognostic importance of pulmonary hypertension in patients with heart failure. The American Journal of Cardiology. 99 (8), 1146-1150 (2007).
- Shah, R., et al. Pulmonary hypertension after heart transplantation in patients bridged with the total artificial heart. ASAIO Journal. 62 (1), 69-73 (2016).
- Tracy, G. P., Proctor, M. S., Hizny, C. S. Reversibility of pulmonary artery hypertension in aortic stenosis after aortic valve replacement. The Annals of Thoracic Surgery. 50 (1), 89-93 (1990).
- Lindelow, B., Andersson, B., Waagstein, F., Bergh, C. H. High and low pulmonary vascular resistance in heart transplant candidates. A 5-year follow-up after heart transplantation shows continuous reduction in resistance and no difference in complication rate. European Heart Journal. 20 (2), 148-156 (1999).
- Martin, J., et al. Implantable left ventricular assist device for treatment of pulmonary hypertension in candidates for orthotopic heart transplantation-a preliminary study. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 25 (6), 971-977 (2004).
- Gallagher, R. C., et al. Univentricular support results in reduction of pulmonary resistance and improved right ventricular function. ASAIO Transactions. 37 (3), 287-288 (1991).
- Beyersdorf, F., Schlensak, C., Berchtold-Herz, M., Trummer, G. Regression of "fixed" pulmonary vascular resistance in heart transplant candidates after unloading with ventricular assist devices. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 140 (4), 747-749 (2010).
- Hoffmann, J., et al. Mast cells promote lung vascular remodelling in pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 37 (6), 1400-1410 (2011).
- Litwin, S. E., et al. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation. 91 (10), 2642-2654 (1995).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- de Montgolfier, O., et al. High Systolic blood pressure induces cerebral microvascular endothelial dysfunction, neurovascular unit damage, and cognitive decline in mice. Hypertension. 73 (1), 217-228 (2019).
- Breitling, S., Ravindran, K., Goldenberg, N. M., Kuebler, W. M. The pathophysiology of pulmonary hypertension in left heart disease. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 309 (9), 924-941 (2015).
- Ranchoux, B., et al. Metabolic syndrome exacerbates pulmonary hypertension due to left heart disease. Circulation Research. 125 (4), 449-466 (2019).
- Zhang, H., Huang, W., Liu, H., Zheng, Y., Liao, L. Mechanical stretching of pulmonary vein stimulates matrix metalloproteinase-9 and transforming growth factor-beta1 through stretch-activated channel/MAPK pathways in pulmonary hypertension due to left heart disease model rats. PLoS One. 15, 0235824 (2020).
- Yin, J., et al. Sildenafil preserves lung endothelial function and prevents pulmonary vascular remodeling in a rat model of diastolic heart failure. Circulation: Heart Failure. 4 (2), 198-206 (2011).
- Yin, N., et al. Inhaled nitric oxide versus aerosolized iloprost for the treatment of pulmonary hypertension with left heart disease. Critical Care Medicine. 37 (3), 980-986 (2009).
- Breitling, S., et al. The mast cell-B cell axis in lung vascular remodeling and pulmonary hypertension. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (5), 710-721 (2017).
- Kerem, A., et al. Lung endothelial dysfunction in congestive heart failure: Role of impaired Ca2+ signaling and cytoskeletal reorganization. Circulation Research. 106 (6), 1103-1116 (2010).
- Goncalves-Rodrigues, P., Miranda-Silva, D., Leite-Moreira, A. F., Falcao-Pires, I. Studying left ventricular reverse remodeling by aortic debanding in rodents. Journal of Visualized Experiments. (173), e60036 (2021).
- Miranda-Silva, D., et al. Characterization of biventricular alterations in myocardial (reverse) remodelling in aortic banding-induced chronic pressure overload. Scientific Reports. 9, 2956 (2019).
- Chou, S. H., et al. The effects of debanding on the lung expression of ET-1, eNOS, and cGMP in rats with left ventricular pressure overload. Experimental Biology and Medicine. 231 (6), 954-959 (2006).
- Hentschel, T., et al. Inhalation of the phosphodiesterase-3 inhibitor milrinone attenuates pulmonary hypertension in a rat model of congestive heart failure. Anesthesiology. 106 (1), 124-131 (2007).
- Gs, A. K., Raj, B., Santhosh, K. S., Sanjay, G., Kartha, C. C. Ascending aortic constriction in rats for creation of pressure overload cardiac hypertrophy model. Journal of Visualized Experiments. (88), e50983 (2014).
- Angermann, C. E., Ertl, G. Natriuretic peptides--new diagnostic markers in heart disease. Herz. 29 (6), 609-617 (2004).
- Ordodi, V. L., Paunescu, V., Mic, F. A. Optimal access to the rat heart by transverse bilateral thoracotomy with double ligature of the internal thoracic arteries. American Association for Laboratory Animal Science. 47 (5), 44-46 (2008).
- Fay, D. S., Gerow, K. A biologist's guide to statistical thinking and analysis. WormBook. , 1-54 (2013).
- Etz, C. D., et al. Medically refractory pulmonary hypertension: treatment with nonpulsatile left ventricular assist devices. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (5), 1697-1705 (2007).
- Mikus, E., et al. Reversibility of fixed pulmonary hypertension in left ventricular assist device support recipients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 40 (4), 971-977 (2011).
- Zelt, J. G. E., Chaudhary, K. R., Cadete, V. J., Mielniczuk, L. M., Stewart, D. J. Medical therapy for heart failure associated with pulmonary hypertension. Circulation Research. 124 (11), 1551-1567 (2019).
