Le présent protocole décrit une méthode pour suivre la progression du lupus chez la souris. Deux procédures supplémentaires sont présentées pour caractériser la néphrite lupique basée sur l’infiltration cellulaire et le dépôt de protéines dans les reins.
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Article de méthode
Analyses de la protéinurie, de l’infiltration rénale des leucocytes et du dépôt rénal de protéines chez les souris LMR/LPR sujettes au lupus
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le lupus érythémateux disséminé (LED) est une maladie auto-immune sans remède connu et se caractérise par une inflammation persistante de nombreux organes, y compris les reins. Dans de telles circonstances, le rein perd sa capacité à nettoyer les déchets du sang et à réguler les concentrations de sel et de liquide, conduisant éventuellement à une insuffisance rénale. Les femmes, en particulier celles en âge de procréer, sont diagnostiquées neuf fois plus souvent que les hommes. La maladie rénale est la principale cause de mortalité chez les patients atteints de LED. Le présent protocole décrit une méthode simple et rapide pour mesurer les niveaux de protéines excrétées dans l’urine recueillie, en suivant la progression du lupus au fil du temps. En outre, une approche pour isoler les cellules mononucléaires rénales est fournie en fonction de la sélection de la taille et de la densité pour étudier l’infiltration rénale des leucocytes. De plus, une méthode immunohistochimique a été développée pour caractériser le dépôt de protéines dans les glomérules et l’infiltration leucocytaire dans l’espace tubulo-interstitiel. Ensemble, ces méthodes peuvent aider à étudier la progression de l’inflammation chronique associée aux reins des souris LMR / LPR sujettes au lupus.
Introduction
La fonction première du rein est l’élimination des substances toxiques par l’urine tout en maintenant l’homéostasie de l’eau et des sels1. Cette fonction est menacée chez les patients atteints de lupus érythémateux disséminé (LED), conduisant à ce que l’on appelle la néphrite lupique (LN). La LN est une conséquence de l’attaque du système immunitaire sur les reins, entraînant une inflammation rénale persistante, perdant ainsi sa capacité à nettoyer les déchets du sang et à réguler les concentrations de sel et de liquide. Cela conduira éventuellement à une insuffisance rénale, qui peut être fatale. Au cours du processus néphritique, les cellules....
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Protocole
Le présent protocole est approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de Virginia Tech. Étant donné que la maladie du lupus a une incidence plus élevée chez les femelles, seules les souris LMR / LPR femelles ont été utilisées. Le prélèvement de l’échantillon a commencé à l’âge de 4 semaines et s’est terminé à 15 semaines. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux) et ont été élevées et maintenues dans un environnement exempt d’agents pathogènes spécifiques conformément aux lignes directrices institutionnelles.
1. Test de protéinurie
- Re....
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Résultats
Le protocole utilise plusieurs méthodes pour évaluer les LMR / lpr chez les souris pour la néphrite lupique. Tout d’abord, une procédure est décrite pour étudier l’augmentation des niveaux de protéinurie due à un dysfonctionnement rénal au fil du temps. Comme le montre la figure 1, des souris femelles ont été traitées avec un gavage oral de 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) comme groupe témoin et avec le probiotique Lactobacillus reuteri comme groupe de trait.......
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Discussion
La LN est l’une des principales causes de mortalité chez les patients atteints de LED et les facteurs aggravant la maladie restent incertains. L’application de ce protocole consiste à caractériser la fonction rénale à l’aide de multiples méthodes, y compris la mesure de la protéinurie, l’analyse FACS de leucocytes rénaux isolés et la coloration par immunofluorescence de sections rénales congelées.
Un point important à considérer lors de la collecte d’urine est que l’on doit être cohérent avec .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.
Remerciements
Nous remercions le Flow Cytometry Core Facility, le laboratoire d’histopathologie, le Fralin Imaging Center du Virginia Polytechnic Institute et l’Université d’État pour leur soutien technique. Ce travail est soutenu par diverses subventions internes et NIH.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 10x solution saline tris-tamponnée (tbs) | thermo Fisher Scientific | J60764. K2 | |
| 2-mercaptoéthanol | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Anti-humain/souris C3 | Cedarlane | CL7632F | |
| Anti-souris CD138 BV711 | Biolegend | 142519 | |
| Anti-souris CD45 AF700 | Biolegend | 103127 | |
| Albumine sérique bovine | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
| Collagénase D | Sigma-Aldrich | 11088882001 | |
| Microscope confocal LSM 880 | Zeiss | LSM 880 | |
| Coplin | jar Fisher Scientific | 50-212-281 | |
| Cryomoule | Fisher Scientific | NC9511236 | |
| Gradient de densité moyen | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Percoll Eau traitée DEPC | Thermo Fisher Scientific | AM9906 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| dsDNA-EC | InvivoGen | tlrl-ecdna | |
| Ethylènediamineacide tétraacétique | Fisher Scientific | S311-500 | EDTA |
| EVOS M5000 Système d’imagerie microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | |
| FACS Fusion Trieur de cellules | BD Biosciences | FACS Fusion Sérum | |
| fœtal bovin - Premium, Inactivé par la chaleur | R& D systems | S11150H | |
| Fisherbrand Plaques de polystyrène 96 puits | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Graphpad prisme | GraphPad | N/A | |
| Hank' s Solution saline équilibrée | Thermo Fisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Logiciel ImageJ | National Institutes of Health | N/A | |
| Lactobacillus reuteri Kandler et al. | ATCC | 23272 | |
| MEM acides aminés non essentiels | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| MRL/MpJ-Fas lpr /J Souris (MRL/lpr) | Jackson Lab | 485 | |
| Vernis à ongles | N/A | N/A | Tout magasin conventionnel |
| Composé O.C.T | Tisse-Tek | 4583 | |
| Stylo PAP | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Moules d’encastrement jetables Peel-A-Way | Polysciences | R-30 | |
| Pénicilline-Streptomycine | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 70011069 | |
| Pierce 20x TBS Buffer | Thermo Fisher Scientific | 28358 | |
| Pierce Coomassie Plus (Bradford) Kit | de dosageThermo Fisher Scientific | 23236 | Albumine standard incluse |
| ProLon Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Sérum anti-souris purifié pour rats CD16/CD32 | BD Biosciences | 553141 | bloc FcR |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Pyruvate de sodium | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | N/A | Logiciel SoftMax Pro 6.1 |
| Passoires à cellules stériles 100 & micro ; M | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Chlorhydrate de vancomycine | Goldbio | V-200-1 | |
| Zombie Aqua | Biolegend | 423102 | colorant fluorescent pour l’analyse par cytométrie en flux |
Références
- Tsokos, G. C. Systemic Lupus Erythematosus. New England Journal of Medicine. 365 (22), 2110-2121 (2011).
- Davidson, A., Aranow, C. Lupus nephritis: lessons from murine models. Nature Reviews Rheumatology. 6 (1), 13-20 (2010).
- Maldonado, M. A., et al.
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Réimpressions et autorisations
