Analyses de la protéinurie, de l’infiltration rénale des leucocytes et du dépôt rénal de protéines chez les souris LMR/LPR sujettes au lupus

La fonction première du rein est l’élimination des substances toxiques par l’urine tout en maintenant l’homéostasie de l’eau et des sels¹. Cette fonction est menacée chez les patients atteints de lupus érythémateux disséminé (LED), conduisant à ce que l’on appelle la néphrite lupique (LN). La LN est une conséquence de l’attaque du système immunitaire sur les reins, entraînant une inflammation rénale persistante, perdant ainsi sa capacité à nettoyer les déchets du sang et à réguler les concentrations de sel et de liquide. Cela conduira éventuellement à une insuffisance rénale, qui peut être fatale. Au cours du processus néphritique, les cellules B circulantes, les cellules T et les monocytes sont recrutés dans le rein, sécrétant des chimiokines, des cytokines et des autoanticorps formant des complexes immunitaires. Cela entraîne finalement des lésions des cellules endothéliales, des lésions membraneuses, une atrophie tubulaire rénale et une fibrose².

LMR/Mp-Fas lpr (LMR/^lpr) Les souris sujettes au lupus sont un modèle de souris classique présentant des signes cliniques semblables au lupus qui ressemblent à SLE³ humains. Ce modèle a joué un rôle déterminant dans la compréhension de l’une des principales causes de mortalité chez les patients atteints de LED à la lupie (LN)⁴. Dans le LED humain et chez la souris, le LN se caractérise par une inflammation progressive déclenchée par le dépôt rénal de complexes immuns, suivie de l’activation du complément, du recrutement de cellules inflammatoires et de la perte de la fonction rénale⁵. Le dépôt du complexe immunitaire est la première étape pour induire la production de chimiokines et de cytokines par les cellules rénales intrinsèques, ce qui élargit la réponse inflammatoire en recrutant des cellules immunitaires⁶. Le protocole actuel présente plusieurs techniques pour suivre la progression de la maladie rénale qui analysent l’infiltration cellulaire et le dépôt de complexes immuns.

L’urine recueillie chaque semaine permet de détecter et de visualiser l’évolution de la protéinurie avant, pendant et après l’apparition du lupus. La protéinurie en tant que biomarqueur peut déterminer la progression biologique de la LN. Les autres avantages de cette technique sont qu’elle est non invasive, rentable et facile à mettre en œuvre⁷. Lorsque le rein fonctionne parfaitement, le taux de protéinurie est constamment bas; Cependant, chez les souris LMR/LPR, après l’âge de 8-9 semaines, on observe une augmentation progressive du taux de protéinurie, qui est finalement suffisamment élevé pour provoquer une insuffisance rénale⁸. Plusieurs bandelettes de réactifs et réactifs colorimétriques sont disponibles dans le commerce pour surveiller le problème. Cependant, le test de Bradford est bon marché et très précis pour déterminer l’apparition de la protéinurie et l’évolution de la néphrite lupique. Ce test est rapide et le réactif n’est pas affecté par la présence de solvants, de tampons, d’agents réducteurs et d’agents chélatants métalliques qui peuvent se trouver dans votre échantillon 9,10,11.

Un aspect important à considérer est l’infiltration cellulaire dans le rein. Ces infiltrats favorisent la pathogenèse en déclenchant la sécrétion de facteurs solubles tels que les cytokines pour aggraver l’inflammation¹². Pour mieux comprendre quelles populations cellulaires sont présentes dans les infiltrats, une méthode utile consiste à isoler les leucocytes¹³. Ici, la détection de l’infiltration rénale des cellules B est utilisée comme exemple. La procédure commence par un processus de digestion avec de la désoxyribonucléase (DNase) et de la collagénase, suivi d’une séparation du gradient de densité qui élimine les débris, les globules rouges et les granulocytes denses. La raison de l’isolement des lymphocytes B (CD19+) et des plasmocytes (CD138⁺) est que les reins lupiques peuvent concentrer ces cellules¹⁴. Il est suggéré que la présence de cellules B dans de petits agrégats dans le rein peut indiquer une expansion clonale et, par conséquent, la production d’immunoglobulines (Ig). Les plasmocytes sont bien connus pour être présents dans ces agrégats ainsi que¹⁵. Une fois les leucocytes isolés, le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) peut être utilisé pour analyser les cellules d’intérêt lors de la coloration avec différents anticorps conjugués à la fluorescence.

L’immunofluorescence est l’une des méthodes de détection immunohistochimique (IHC) qui permet la visualisation fluorescente des protéines dans des échantillons de tissus rénaux de 4 μm d’épaisseur. D’autres méthodes de détection de l’IHC dépendent de la nature des analytes, de la chimie de liaison et d’autres facteurs¹⁶. L’immunofluorescence est une méthode d’identification rapide qui expose l’antigène à son anticorps homologue marqué avec un fluorochrome spécifique (ou un colorant fluorescent). Lorsqu’il est excité, il produit de la lumière qu’un microscope à fluorescence peut détecter. Cette technique permet d’observer le dépôt du complément C3 et des IgG2a¹⁷. Une activation excessive en cascade du complément pourrait être associée à une réponse immunitaire incontrôlée et à une perte de fonction¹⁸. Le dépôt immunitaire d’autoanticorps anti-double brin d’ADN (anti-ADNds) dans le rein est une préoccupation majeure¹⁹, où ceux avec l’isotype IgG2a ont été associés à LN²⁰. Plus précisément, les anticorps anti-ADNds présentent plus de pathogénicité et d’affinité pour les matières nucléaires, formant des complexes immuns²¹. Lorsque l’IgG2a est présente, la cascade du complément, y compris C3, est activée pour éliminer les complexes immuns²². Les marqueurs C3 et IgG2a peuvent être quantifiés individuellement ou superposés pour établir leur corrélation.

Notamment, la mesure de la créatinine sérique est une autre technique fiable qui peut être utilisée avec une hématurie microscopique et des biopsies rénales pour diagnostiquer LN²³. Cependant, la présence de protéinurie est un indicateur fort de lésions glomérulaires. En ce sens, la surveillance du niveau de protéinurie pendant le lupus peut détecter l’apparition de la maladie et compléter d’autres méthodes de diagnostic du lupus. De plus, les complexes immuns déposés dans les glomérules peuvent induire une réponse inflammatoire, activer le système du complément et recruter davantage de cellules inflammatoires. Un autre point remarquable de ce protocole est l’infiltration des cellules B dans le rein. Ceci, avec les cellules T infiltrées, amplifie les réponses immunitaires locales qui déclenchent des dommages aux organes. Il est important de noter que la classification du LN n’est pas seulement basée sur les changements morphologiques glomérulaires observés en microscopie, mais aussi sur les dépôts immunitaires observés avec l’immunofluorescence. Par conséquent, dans ce protocole, des méthodes précises et rentables pour l’analyse de la fonction rénale sont proposées en laboratoire.

Le présent protocole est approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de Virginia Tech. Étant donné que la maladie du lupus a une incidence plus élevée chez les femelles, seules les souris LMR / LPR femelles ont été utilisées. Le prélèvement de l’échantillon a commencé à l’âge de 4 semaines et s’est terminé à 15 semaines. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux) et ont été élevées et maintenues dans un environnement exempt d’agents pathogènes spécifiques conformément aux lignes directrices institutionnelles.

1. Test de protéinurie

1. Recueillir l’urine en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Stérilisez la hotte en pulvérisant de l’éthanol à 70%. Placez une feuille de plastique stérile sur la surface. Préparez des pointes, des tubes de 1,5 mL et une pipette pour recueillir environ 20 μL du liquide.
      NOTE: Les embouts et les tubes doivent être stériles et sans aucun prétraitement.
   2. Prenez la cage et vaporisez de l’éthanol à 70% avant de la mettre à l’intérieur de la hotte.
   3. Tenez la souris d’une main et utilisez l’autre main pour masser doucement la région ventrale de haut en bas.
   4. Utilisez un tube ou une pipette de 1,5 ml pour recueillir l’urine directement ou, si l’échantillon tombe, prélevez-la sur la feuille de plastique. Utilisez des gants, des draps et des embouts frais pour chaque échantillon.
      REMARQUE: Si cela ne fonctionne pas, utilisez un bécher stérile pour isoler la souris, puis recueillez l’urine du bécher après que la souris ait uriné.
   5. Remettez la souris dans la cage. Retirez une autre souris et répétez les étapes 1.1.3-1.1.4.
      REMARQUE: Nettoyez toujours la feuille de plastique et le bécher avec de l’éthanol à 70% après avoir prélevé l’échantillon pour chaque souris. Au moins cinq souris par groupe sont nécessaires pour la signification statistique. Les échantillons d’urine peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à utilisation jusqu’à 12 mois.
2. Quantifier les protéines par la méthode de Bradford²⁴.
   1. Laissez les échantillons d’urine, l’albumine standard et le réactif de Bradford arriver à température ambiante (RT) en les gardant à l’extérieur du congélateur pendant 10-20 min.
      REMARQUE : Le réactif Bradford et l’étalon d’albumine sont inclus dans une trousse disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux). La concentration initiale de l’étalon d’albumine est de 2 mg/mL. Les dilutions en série (1:2 six fois) doivent être effectuées avec de l’eau.
   2. Ajouter le réactif de Bradford à une plaque de 96 puits (200 μL/puits), non dilué.
   3. Pipeter 5 μL d’échantillon d’urine non diluée par puits et utiliser l’embout pour pipeter plusieurs fois de haut en bas pour bien mélanger.
   4. Ajouter les étalons (400, 200, 100, 50, 25, 12,5 mg/dL) en double. Laissez quelques puits comme blancs.
      REMARQUE : L’ajout d’échantillons et de normes doit être effectué rapidement.
   5. Laisser reposer pendant 5-10 min à RT.
   6. Lire la plaque à 595 nm dans un lecteur de plaque conformément au protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).

2. Isolement des cellules rénales

1. Euthanasier la souris avec du CO₂ (débit: 30%-70% volume/min, pour atteindre l’inconscience ou la mort) dans une chambre suivie d’une luxation cervicale. Procéder à la dissection pour prélever les deux reins. Placez un rein et demi dans un milieu C10 glacé. Mettez l’autre moitié du rein dans la TCO (étape 3.1.1).
   NOTE: C10 est fabriqué avec RPMI 1640 complété par 10% de sérum bovin fœtal, 1 mM de pyruvate de sodium, 1% de 100x MEM acides aminés non essentiels, 10 mM de HEPES, 55 μM de 2-mercaptoéthanol et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine (voir le tableau des matières).
2. Couper les reins en grains granulométriques (1-2 mm³ pièces) et les digérer dans 5 mL de tampon de digestion contenant 1 mg/mL de collagénase et 0,2 mg/mL de DNase I (voir le tableau des matières) dans un milieu RPMI 1640 contenant 10 mmol/L de HEPES pendant 1 h avec agitation douce continue à 37 °C.
   REMARQUE : Ajouter un tampon de digestion de 1 mL dans un tube stérile de 2 mL et utiliser des ciseaux stériles pour hacher le rein.
3. Ajouter 10 mL de 1x PBS glacé contenant 10 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et incuber pendant 10 minutes sur de la glace. Puis vortex la suspension deux fois.
4. Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine de 100 μM et laver avec 10 ml de HBSS-plein.
   REMARQUE: HBSS-full contient 5 mM d’EDTA, 0,1% BSA et 10 mM de HEPES.
5. Centrifuger à 350 x g pendant 10 min à RT.
6. Préparer une solution de percollation isotonique mère (SIP) à 30 %, 37 % et 70 %.
   REMARQUE : Mélanger 1 partie de volume de 10x PBS et 9 parties de volume de Percoll pour préparer le SIP (voir le tableau des matières); utilisez HBSS-full pour diluer le SIP à 30 %, 37 % et 70 % SIP.
7. Resuspendre les cellules dans 5 mL de SIP à 30 % et charger 37 % de 5 mL (en haut) et 70 % en 5 mL (en bas), en faisant un gradient SIP, lentement avec une pipette à pâte à pâtisserie.
8. Centrifuger avec Up9 down0 (ou frein 0) à 1000 x g pendant 30 min à RT.
9. Recueillir les leucocytes de l’interface 37%-70% et les remettre en suspension dans 5 mL de C10.
10. Centrifuger à 350 x g pendant 10 min à 4 °C.
11. Remettez en suspension la pastille de la cellule dans 3 mL de tampon FACS. Les cellules sont prêtes pour la coloration FACS.
    REMARQUE: Le tampon FACS contient 1x PBS et 0,1% d’albumine sérique bovine (BSA).
12. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant (SN), en laissant environ 50 μL.
    NOTE: Pour retirer le surnageant, verser ou pipeter soigneusement la solution loin du solide ou utiliser un vide semi-automatique pour aspirer le surnageant.
13. Ajouter 50 μL de bloc FcR (voir le tableau des matériaux) par tube (prédilué 1/50 dans 1x PBS); Mélanger et incuber sur la glace dans l’obscurité pendant 10 min.
14. Ajouter 2 ml de tampon FACS au lavage.
15. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 °C et éliminer le SN, en laissant environ 50 μL.
16. Ajouter 20 μL du colorant fluorescent approprié (diluer 1/100 avec 1x PBS, voir le tableau des matériaux) et laisser reposer pendant 15 à 30 minutes sur la glace.
17. Ajouter 50 μL de mélange d’anticorps 15 par tube : CD138-BV711 (1/200 dans 1x PBS) et CD45-AF700 (1/200 dans^1x PBS) (voir Tableau des matériaux).
18. Incuber sur la glace dans l’obscurité pendant 15 à 30 minutes et ajouter 3 ml de tampon FACS.
19. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 °C et vide SN, laissant environ 50 μL. Resuspendre dans 200 μL de 1x PBS. Celui-ci est maintenant prêt à être analysé par cytométrie de flux.

3. Coloration par immunofluorescence

1. Effectuez le prélèvement d’échantillons.
   1. Intégrez le demi-rein dans le petit cryomoule en plastique avec le composé à température de coupe optimale (OCT) (voir le tableau des matériaux).
   2. Ajoutez de la glace sèche dans une boîte en mousse de polystyrène (voir le tableau des matériaux) et placez soigneusement le cryomoule sur la glace sèche. Assurez-vous que les cryomoules sont placés à plat.
      REMARQUE: Il faut 3-4 minutes pour que le composé OCT se solidifie et devienne blanc.
   3. Retirez le cryomoule et enveloppez-le dans du papier d’aluminium. Conserver à -80 °C jusqu’à nouvelle utilisation.
      REMARQUE: Celui-ci peut être conservé à -80 °C pendant au moins 1 an.
2. Effectuer la section et la fixation de l’échantillon.
   1. Couper les échantillons en sections de 4 μm, attendre au moins 2-3 heures pour sécher, puis fixer avec de l’acétone froide (à 4 °C) pendant 10 min.
      REMARQUE: Soyez prudent lorsque vous utilisez de l’acétone, qui nécessite une hotte chimique spécialisée.
   2. Après avoir fixé les lames, sécher à l’air libre pendant 0,5-1 h et les stocker pendant une courte période à -20 ° C ou pendant une longue période à -80 ° C.
3. Colorer les échantillons.
   1. Refixez les lames dans de l’acétone froide pendant 5-10 min.
   2. Laissez les sections se réchauffer à TA. Utilisez un stylo PAP (voir le tableau des matériaux) autour de la section et laissez-la sécher.
      REMARQUE: L’émail des ongles peut également être utilisé. Cette étape empêche la dilution des anticorps de flotter sur toute la lame.
   3. Placer les lames dans 1x solution saline tamponnée Tris (TBS) dans le pot Coplin (voir le tableau des matériaux) pendant 20 min, mettre le pot sur le shaker et agiter doucement.
   4. Versez 1x TBS et remplissez le pot avec 1x TBS, 5% BSA et 0,1% Tween 20. Incuber pendant 20 min sur le shaker, agiter doucement.
   5. Retirez les lames et essuyez le bas des lames. Si nécessaire, secouez les lames à sec. Ajouter 100 μL d’anticorps conjugués²⁵ C3-FITC (1/100) et IgG2a-PE (1/100) à la section (voir le tableau des matières). Incuber à TA dans une chambre humidifiée pendant 1 h.
   6. Laver la section 3 fois dans 1x TBS, 5% BSA et 0,1% Tween 20 pendant 10 min sur le shaker.
   7. Secouez les lames et montez la section avec un réactif antidécoloration (voir Tableau des matières) puis un couvercle.
   8. Conservez les lames à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient observées au microscope (p. ex., microscope confocal ou microscope à système d’imagerie). Quantifier les images à l’aide d’un logiciel et soustraire les signaux d’arrière-plan lors de la comparaison de l’intensité de fluorescence entre les régions.
   9. Pour l’analyse d’images à l’aide du logiciel ImageJ (voir Tableau des matériaux), décrivez la région souhaitée.
   10. Définissez les paramètres standard en cliquant sur Analyser, puis Définir les mesures et la zone de mesure pour obtenir les résultats.
   11. Transférez les données obtenues à partir des fenêtres de mesure vers une feuille de calcul.
       REMARQUE: Une petite zone peut être sélectionnée à partir de l’image comme arrière-plan; Il ne devrait pas avoir de fluorescence.
   12. Une fois cela fait, cliquez sur Analyser pour mesurer la région et transférer à nouveau les données vers la feuille de calcul précédente.
   13. Répétez les étapes 3.3.11 à 3.3.12 pour plusieurs régions.
   14. Calculer la fluorescence moyenne comme Fluorescence cellulaire corrigée (CCF) = Densité intégrée - (Région cellulaire sélectionnée x Fluorescence de fond moyenne).
   15. Calculez pour chaque région et analysez les données à l’aide du logiciel de représentation graphique et de statistiques (voir le tableau des matériaux).

Le protocole utilise plusieurs méthodes pour évaluer les LMR / lpr chez les souris pour la néphrite lupique. Tout d’abord, une procédure est décrite pour étudier l’augmentation des niveaux de protéinurie due à un dysfonctionnement rénal au fil du temps. Comme le montre la figure 1, des souris femelles ont été traitées avec un gavage oral de 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) comme groupe témoin et avec le probiotique Lactobacillus reuteri comme groupe de traitement, à une concentration de 109 ufc/mL, deux fois par semaine. Le traitement a commencé à l’âge de 3 semaines et s’est terminé à l’âge de 15 semaines. Le groupe de souris traitées avec L. reuteri avait une progression protéinurique plus agressive que le groupe témoin.

Figure 1 : Détection des niveaux de protéines dans l’urine de souris LMR/lpr au fil du temps. n = 5 souris par groupe. Les statistiques ont été effectuées avec le test de régression linéaire simple. *P < 0,05, **P < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 2 montre l’analyse FACS des leucocytes rénaux isolés. Les souris ont été traitées avec de la vancomycine (2 g / L) ou de la vancomycine plus E. coli dsDNA (80 μg) dans cette expérience. La vancomycine a été administrée avec l’eau potable pendant la période indiquée. Un gavage oral d’ADN bactérien a été administré aux souris traitées à la vancomycine une fois par semaine pendant quatre semaines consécutives à l’âge de 4, 5, 6 et 7 semaines. On s’attendait à ce que l’ADNds d’E. coli déclenche l’infiltration rénale des plasmocytes entraînant une altération de la fonction rénale, mais aucune différence significative n’a été trouvée.

Figure 2 : Analyse des plasmocytes dans les leucocytes rénaux isolés. (A) Stratégie de gating séquentiel : cellules totales, cellules individuelles, cellules vivantes, cellules CD45+, et enfin cellules CD138+. (B) Pourcentage de plasmocytes après traitement par van (vancomycine) ou van + ADN (vancomycine + E. coli dsDNA) pendant 3 semaines (n ≥ 5 souris par groupe). Aucune signification statistique (ns) n’a été observée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 3 montre la coloration par immunofluorescence du complément C3 et des IgG2a sur des sections rénales LMR/LPR féminines. Dans cette expérience, l’effet des facteurs environnementaux a été comparé concernant les dépôts rénaux de C3 et d’IgG2a. Les souris internes ont été élevées dans l’animalerie pendant plusieurs générations et ont été comparées à des souris récemment achetées auprès d’un vendeur. L’analyse immunohistochimique n’a révélé aucune différence entre les différentes installations.

Figure 3 : Détection des compléments C3 et IgG2a dans les coupes rénales par coloration par immunofluorescence. (A) Photos représentatives de coupes rénales colorées avec anti-C3-FITC (vert) et anti-IgG2a-PE (rouge). (B) Comparaison de la fluorescence cellulaire corrigée (CCF) entre les deux groupes (n ≥ 5 souris par groupe). Barre d’échelle = 100 μM. Aucune signification statistique (ns) n’a été observée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.