Analyses de la protéinurie, de l’infiltration rénale des leucocytes et du dépôt rénal de protéines chez les souris LMR/LPR sujettes au lupus

Summary

Le présent protocole décrit une méthode pour suivre la progression du lupus chez la souris. Deux procédures supplémentaires sont présentées pour caractériser la néphrite lupique basée sur l’infiltration cellulaire et le dépôt de protéines dans les reins.

Abstract

Le lupus érythémateux disséminé (LED) est une maladie auto-immune sans remède connu et se caractérise par une inflammation persistante de nombreux organes, y compris les reins. Dans de telles circonstances, le rein perd sa capacité à nettoyer les déchets du sang et à réguler les concentrations de sel et de liquide, conduisant éventuellement à une insuffisance rénale. Les femmes, en particulier celles en âge de procréer, sont diagnostiquées neuf fois plus souvent que les hommes. La maladie rénale est la principale cause de mortalité chez les patients atteints de LED. Le présent protocole décrit une méthode simple et rapide pour mesurer les niveaux de protéines excrétées dans l’urine recueillie, en suivant la progression du lupus au fil du temps. En outre, une approche pour isoler les cellules mononucléaires rénales est fournie en fonction de la sélection de la taille et de la densité pour étudier l’infiltration rénale des leucocytes. De plus, une méthode immunohistochimique a été développée pour caractériser le dépôt de protéines dans les glomérules et l’infiltration leucocytaire dans l’espace tubulo-interstitiel. Ensemble, ces méthodes peuvent aider à étudier la progression de l’inflammation chronique associée aux reins des souris LMR / LPR sujettes au lupus.

Introduction

La fonction première du rein est l’élimination des substances toxiques par l’urine tout en maintenant l’homéostasie de l’eau et des sels¹. Cette fonction est menacée chez les patients atteints de lupus érythémateux disséminé (LED), conduisant à ce que l’on appelle la néphrite lupique (LN). La LN est une conséquence de l’attaque du système immunitaire sur les reins, entraînant une inflammation rénale persistante, perdant ainsi sa capacité à nettoyer les déchets du sang et à réguler les concentrations de sel et de liquide. Cela conduira éventuellement à une insuffisance rénale, qui peut être fatale. Au cours du processus néphritique, les cellules B circulantes, les cellules T et les monocytes sont recrutés dans le rein, sécrétant des chimiokines, des cytokines et des autoanticorps formant des complexes immunitaires. Cela entraîne finalement des lésions des cellules endothéliales, des lésions membraneuses, une atrophie tubulaire rénale et une fibrose².

LMR/Mp-Fas lpr (LMR/^lpr) Les souris sujettes au lupus sont un modèle de souris classique présentant des signes cliniques semblables au lupus qui ressemblent à SLE³ humains. Ce modèle a joué un rôle déterminant dans la compréhension de l’une des principales causes de mortalité chez les patients atteints de LED à la lupie (LN)⁴. Dans le LED humain et chez la souris, le LN se caractérise par une inflammation progressive déclenchée par le dépôt rénal de complexes immuns, suivie de l’activation du complément, du recrutement de cellules inflammatoires et de la perte de la fonction rénale⁵. Le dépôt du complexe immunitaire est la première étape pour induire la production de chimiokines et de cytokines par les cellules rénales intrinsèques, ce qui élargit la réponse inflammatoire en recrutant des cellules immunitaires⁶. Le protocole actuel présente plusieurs techniques pour suivre la progression de la maladie rénale qui analysent l’infiltration cellulaire et le dépôt de complexes immuns.

L’urine recueillie chaque semaine permet de détecter et de visualiser l’évolution de la protéinurie avant, pendant et après l’apparition du lupus. La protéinurie en tant que biomarqueur peut déterminer la progression biologique de la LN. Les autres avantages de cette technique sont qu’elle est non invasive, rentable et facile à mettre en œuvre⁷. Lorsque le rein fonctionne parfaitement, le taux de protéinurie est constamment bas; Cependant, chez les souris LMR/LPR, après l’âge de 8-9 semaines, on observe une augmentation progressive du taux de protéinurie, qui est finalement suffisamment élevé pour provoquer une insuffisance rénale⁸. Plusieurs bandelettes de réactifs et réactifs colorimétriques sont disponibles dans le commerce pour surveiller le problème. Cependant, le test de Bradford est bon marché et très précis pour déterminer l’apparition de la protéinurie et l’évolution de la néphrite lupique. Ce test est rapide et le réactif n’est pas affecté par la présence de solvants, de tampons, d’agents réducteurs et d’agents chélatants métalliques qui peuvent se trouver dans votre échantillon 9,10,11.

Un aspect important à considérer est l’infiltration cellulaire dans le rein. Ces infiltrats favorisent la pathogenèse en déclenchant la sécrétion de facteurs solubles tels que les cytokines pour aggraver l’inflammation¹². Pour mieux comprendre quelles populations cellulaires sont présentes dans les infiltrats, une méthode utile consiste à isoler les leucocytes¹³. Ici, la détection de l’infiltration rénale des cellules B est utilisée comme exemple. La procédure commence par un processus de digestion avec de la désoxyribonucléase (DNase) et de la collagénase, suivi d’une séparation du gradient de densité qui élimine les débris, les globules rouges et les granulocytes denses. La raison de l’isolement des lymphocytes B (CD19+) et des plasmocytes (CD138⁺) est que les reins lupiques peuvent concentrer ces cellules¹⁴. Il est suggéré que la présence de cellules B dans de petits agrégats dans le rein peut indiquer une expansion clonale et, par conséquent, la production d’immunoglobulines (Ig). Les plasmocytes sont bien connus pour être présents dans ces agrégats ainsi que¹⁵. Une fois les leucocytes isolés, le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) peut être utilisé pour analyser les cellules d’intérêt lors de la coloration avec différents anticorps conjugués à la fluorescence.

L’immunofluorescence est l’une des méthodes de détection immunohistochimique (IHC) qui permet la visualisation fluorescente des protéines dans des échantillons de tissus rénaux de 4 μm d’épaisseur. D’autres méthodes de détection de l’IHC dépendent de la nature des analytes, de la chimie de liaison et d’autres facteurs¹⁶. L’immunofluorescence est une méthode d’identification rapide qui expose l’antigène à son anticorps homologue marqué avec un fluorochrome spécifique (ou un colorant fluorescent). Lorsqu’il est excité, il produit de la lumière qu’un microscope à fluorescence peut détecter. Cette technique permet d’observer le dépôt du complément C3 et des IgG2a¹⁷. Une activation excessive en cascade du complément pourrait être associée à une réponse immunitaire incontrôlée et à une perte de fonction¹⁸. Le dépôt immunitaire d’autoanticorps anti-double brin d’ADN (anti-ADNds) dans le rein est une préoccupation majeure¹⁹, où ceux avec l’isotype IgG2a ont été associés à LN²⁰. Plus précisément, les anticorps anti-ADNds présentent plus de pathogénicité et d’affinité pour les matières nucléaires, formant des complexes immuns²¹. Lorsque l’IgG2a est présente, la cascade du complément, y compris C3, est activée pour éliminer les complexes immuns²². Les marqueurs C3 et IgG2a peuvent être quantifiés individuellement ou superposés pour établir leur corrélation.

Notamment, la mesure de la créatinine sérique est une autre technique fiable qui peut être utilisée avec une hématurie microscopique et des biopsies rénales pour diagnostiquer LN²³. Cependant, la présence de protéinurie est un indicateur fort de lésions glomérulaires. En ce sens, la surveillance du niveau de protéinurie pendant le lupus peut détecter l’apparition de la maladie et compléter d’autres méthodes de diagnostic du lupus. De plus, les complexes immuns déposés dans les glomérules peuvent induire une réponse inflammatoire, activer le système du complément et recruter davantage de cellules inflammatoires. Un autre point remarquable de ce protocole est l’infiltration des cellules B dans le rein. Ceci, avec les cellules T infiltrées, amplifie les réponses immunitaires locales qui déclenchent des dommages aux organes. Il est important de noter que la classification du LN n’est pas seulement basée sur les changements morphologiques glomérulaires observés en microscopie, mais aussi sur les dépôts immunitaires observés avec l’immunofluorescence. Par conséquent, dans ce protocole, des méthodes précises et rentables pour l’analyse de la fonction rénale sont proposées en laboratoire.

Protocol

Le présent protocole est approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de Virginia Tech. Étant donné que la maladie du lupus a une incidence plus élevée chez les femelles, seules les souris LMR / LPR femelles ont été utilisées. Le prélèvement de l’échantillon a commencé à l’âge de 4 semaines et s’est terminé à 15 semaines. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux) et ont été élevées et maintenues dans un enviro…

Representative Results

Le protocole utilise plusieurs méthodes pour évaluer les LMR / lpr chez les souris pour la néphrite lupique. Tout d’abord, une procédure est décrite pour étudier l’augmentation des niveaux de protéinurie due à un dysfonctionnement rénal au fil du temps. Comme le montre la figure 1, des souris femelles ont été traitées avec un gavage oral de 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) comme groupe témoin et avec le probiotique Lactobacillus reuteri co…

Discussion

La LN est l’une des principales causes de mortalité chez les patients atteints de LED et les facteurs aggravant la maladie restent incertains. L’application de ce protocole consiste à caractériser la fonction rénale à l’aide de multiples méthodes, y compris la mesure de la protéinurie, l’analyse FACS de leucocytes rénaux isolés et la coloration par immunofluorescence de sections rénales congelées.

Un point important à considérer lors de la collecte d’urine est que l’on…

Materials

10x Tris-Buffered Saline (TBS)	Thermo Fisher Scientific	J60764.K2
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985-023
Anti-Human/Mouse C3	Cedarlane	CL7632F
Anti-Mouse CD138 BV711	Biolegend	142519
Anti-Mouse CD45 AF700	Biolegend	103127
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418-100G
Collagenase D	Sigma-Aldrich	11088882001
Confocal Microscope LSM 880	Zeiss	LSM 880
Coplin jar	Fisher Scientific	50-212-281
Cryomold	Fisher Scientific	NC9511236
Density gradient medium	GE Healthcare	17-1440-02	Percoll
DEPC-Treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9906
DNase I	Sigma-Aldrich	D4527
dsDNA-EC	InvivoGen	tlrl-ecdna
Ethylenediaminetetraacetic Acid	Fisher Scientific	S311-500	EDTA
EVOS M5000 Microscope imaging system	Thermo Fisher Scientific	AMF5000
FACS Fusion Cell sorter	BD Biosciences	FACS Fusion
Fetal Bovine Serum – Premium, Heat Inactivated	R&D systems	S11150H
Fisherbrand 96-Well Polystyrene Plates	Fisher Scientific	12-565-501
Graphpad prism	GraphPad	N/A
Hank’s Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14175-079
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A
Lactobacillus reuteri Kandler et al.	ATCC	23272
MEM non-essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140-050
MRL/MpJ-Fas lpr /J Mice (MRL/lpr)	Jackson Lab	485
Nail enamel	N/A	N/A	Any conventional store
O.C.T compound	Tisse-Tek	4583
PAP pen	Sigma-Aldrich	Z377821
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Polysciences	R-30
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	70011069
Pierce 20x TBS Buffer	Thermo Fisher Scientific	28358
Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay kit	Thermo Fisher Scientific	23236	Albumin standard included
ProLon Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36934
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553141	FcR block
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
Sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-070
SpectraMax M5	Molecular Devices	N/A	SoftMax Pro 6.1 software
Sterile cell Strainers 100 µM	Fisher Scientific	22363549
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
Vancomycin Hydrochloride	Goldbio	V-200-1
Zombie Aqua	Biolegend	423102	fluorescent dye for flow cytometry analysis