Summary
Eksperimentelle metoder til at høste voksne stamceller fra hundetarm- og levervæv for at etablere 3D-organoidkulturer er beskrevet. Desuden diskuteres laboratorieteknikkerne til at sikre ensartet vækst og tilvejebringe standardprocedurer til høst, biobank og genoplivning af hundetarm- og leverorganoidkulturer.
Abstract
Hunde udvikler komplekse multifaktorielle sygdomme analogt med mennesker, herunder inflammatoriske sygdomme, metaboliske sygdomme og kræft. Derfor repræsenterer de relevante store dyremodeller med det translationelle potentiale til humanmedicin. Organoider er 3-dimensionelle (3D), selvmonterede strukturer afledt af stamceller, der efterligner mikroanatomien og fysiologien i deres oprindelsesorgan. Disse translationelle in vitro-modeller kan bruges til lægemiddelpermeabilitet og opdagelsesapplikationer, toksikologivurdering og til at give en mekanistisk forståelse af patofysiologien af multifaktorielle kroniske sygdomme. Desuden kan hundeorganoider forbedre livet for selskabshunde, give input inden for forskellige områder af veterinærforskning og lette personlige behandlingsapplikationer inden for veterinærmedicin. En lille gruppe donorer kan oprette en biobank af organoidprøver, hvilket reducerer behovet for kontinuerlig vævshøst, da organoidcellelinjer kan subdyrkes på ubestemt tid. Heri præsenteres tre protokoller, der fokuserer på kulturen af tarm- og leverkolseorganoider afledt af voksne stamceller. Canine Organoid Isolation Protocol skitserer metoder til behandling af væv og indlejring af celleisolatet i en understøttende matrix (opløselig ekstracellulær membranmatrix). Hundeorganoid vedligeholdelsesprotokollen beskriver organoidvækst og vedligeholdelse, herunder rengøring og passering sammen med passende timing for ekspansion. Organoid Harvesting and Biobanking Protocol beskriver måder at udvinde, fryse og bevare organoider til yderligere analyse.
Introduction
Gnavere er den mest anvendte dyremodel til biomedicinsk og translationel forskning1. De er usædvanligt nyttige til at undersøge grundlæggende molekylær patogenese af sygdommene, selv om deres kliniske relevans for kroniske multifaktorielle sygdomme for nylig er blevet stillet spørgsmålstegn ved2. Hundemodellen udviser flere fordele i forhold til gnavere3,4. Hunde og mennesker deler ligheder i metabolomics og intestinal mikrobiom, der udviklede sig på grund af forbrug af menneskelig kost gennem forskellige perioder af deres domesticering5,6,7. Ligheder mellem hundes og menneskets mave-tarm-anatomi og fysiologi er et andet af eksemplerne8.
Derudover deler hunde ofte lignende miljøer og livsstil med deres ejere9. Hundens længere levetid i forhold til gnavere giver mulighed for en naturlig udvikling af mange kroniske tilstande10. Inflammatorisk tarmsygdom eller metabolisk syndrom er eksempler på multifaktorielle kroniske sygdomme, der deler vigtige ligheder mellem mennesker og hunde11,12. Prækliniske forsøg med hunde, der involverer hunde med naturligt forekommende sygdomme, kan generere mere pålidelige data end dem, der er opnået fra gnavermodeller13. For at minimere brugen af levende dyreforskning og overholde principperne i 3R'erne (Reduce, Refine, Replace)14 er der imidlertid opstået alternativer til in vivo-test ved hjælp af 3D in vitro-hundeorganoider15.
Organoider er selvsamlede 3D-stamcelleafledte strukturer, der rekapitulerer fysiologien og mikroanatomien i deres oprindelige organer16,17. Denne teknologi blev først beskrevet af Sato et al. i 200917 og tillod mere oversættelige in vitro-undersøgelser i epitelcellelinjer, end det tidligere var muligt ved hjælp af 2D-kræftcellekulturer18,19,20. Organoider er nyttige in vitro-modeller i mange biomedicinske discipliner såsom i præklinisk toksikologiske21,22,23, absorptions- eller metabolismeundersøgelser24,25,26,27,28 samt i personlige medicinske tilgange29,30,31 . Den vellykkede kultur af hundes tarmorganoider er blevet beskrevet for første gang i 201912, mens leverorganoider afledt af en hund først blev rapporteret af Nantasanti et al. i 201532. Hundeorganoider er siden blevet anvendt med succes i undersøgelser, der undersøger kroniske enteropatier hos hunde, gastrointestinale stromale tumorer, kolorektal adenocarcinom12 og Wilsons sygdom33,34.
Mens voksne stamceller kan høstes via obduktioner, kræver organoidteknologien ikke altid ofring af dyrene. Endoskopiske og laparoskopiske biopsier eller endda finnålespirater af organer35 er en levedygtig kilde til voksne stamceller til epitelorganoidisolering12. Udbredt anvendelse af sådanne ikke-invasive teknikker i veterinærpraksis letter mulighederne for omvendt translationel forskning (oversættelse af oplysninger fra veterinær klinisk praksis til human klinisk praksis og omvendt)15. Yderligere fremskridt inden for organoidteknologi kan sikres ved standardisering af organoidkultur og vedligeholdelsesmetoder. Den organoidprotokol, der præsenteres her, er delvist baseret på tidligere offentliggjort arbejde af Saxena et al. fra 201536, og metoder blev tilpasset til at passe til specifikationer for hundetarm og leverorganoidkultur. Den overordnede arbejdsgang for hundens organoidprotokoller er afbildet i figur 1.
Canine Organoid Isolation Protocol introducerer metoder til opnåelse af prøver fra endoskopiske, laparoskopiske og kirurgiske biopsier samt obduktioner. Den skitserer den indledende forbehandling af vævsprøver og metoder, der anvendes til transport til laboratoriet. Materialer og reagenser, der er nødvendige for organoidisolering, er opsummeret i afsnittet 'Forberedelse til isolering'. Processen med isolering af voksne stamceller fra vævsprøver er nærmere beskrevet. Endelig diskuteres processen med plettering af organoider i kuppellignende strukturer ved hjælp af en opløselig ekstracellulær membranmatrix.
Den anden protokol, Canine Organoid Maintenance Protocol, beskriver metoder til dokumentation og dyrkning af organoider. Medieændringer og deres hyppighed diskuteres i dette afsnit. Desuden beskrives laboratorieprocedurerne såsom passaging og rengøring af cellekulturerne, som er afgørende for at sikre en vellykket vedligeholdelse af 3D-hundeorganoider. Passende passaging er et kritisk trin i protokollen, og mulige justeringer og fejlfinding af dette trin diskuteres yderligere i manuskriptet.
Den sidste protokol er Canine Organoid Harvesting and Biobanking Protocol, der indeholder metoder til fremstilling af fuldvoksne organoider til paraffinindlejring og RNA-konservering. Metoder til biobanking af organoidprøver i flydende nitrogenlagring er også beskrevet her. Endelig diskuteres måderne til optøning af frosne prøver og støtte deres vækst.
Afslutningsvis har denne artikel til formål at tilvejebringe konsekvente procedurer for hundeorganoidkultur gennem standardisering af protokoller mellem laboratorier. Dermed har manuskriptet til formål at lette reproducerbarheden af data fra hundeorganoidmodeller for at øge deres relevans i translationel biomedicinsk forskning.
Figur 1: Arbejdsgang af hundeorganoidprotokoller. Canine Organoid Isolation Protocol beskriver forberedelsen af de materialer, der er nødvendige for organoidisolering, høst af en vævsprøve (ved hjælp af obduktioner, endoskopiske, laparoskopiske og kirurgiske biopsier) og vejledning om celle dissociation og plettering af den cellulære population. Hundeorganoidvedligeholdelsesprotokollen diskuterer rengøring og passering af organoidkulturen. Organoid Harvesting and Biobanking Protocol diskuterer forberedelsen af organoidprøver til paraffinindlejring og yderligere organoidkarakterisering. Metoder til biobankorganoidkulturer og genoplivning af dem fra opbevaring i flydende nitrogen diskuteres også. Klik her for at se en større version af denne figur.
Protocol
Forskningen blev godkendt og udført i overensstemmelse med Institutional Animal Care and Use Committee ved Iowa State University (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017).
BEMÆRK: Følgende afsnit (trin 1-3) beskriver protokollen om isolering af hundeorganoider.
1. Forberedelse til isolation
- Transportrør: Før organoidisolering (typisk 24 timer før) skal du fylde et 50 ml konisk rør med 10 ml Dulbeccos modificerede Eagle Medium / Næringsstofblanding F-12 (Advanced DMEM / F12) beriget med 0,2 ml Pen Strep.
- For laparoskopiske, snit eller excisionelle biopsier skal du forberede yderligere tre 50 ml koniske rør. Fyld disse rør med 10 ml komplet chelateringsopløsning (1x CCS; se tabel 1).
BEMÆRK: For trin 1.2 kan 2 mM N-acetylcystein (NAC) i fosfatbufret saltvand (PBS) også anvendes som en traditionel opløsning, der anvendes til stamcellehøst. Der blev ikke observeret nogen forskelle ved brug af 1x CCS eller NAC i PBS. Begge opløsninger tilsættes for at frigive celler i opløsningen. - Hold rørene ved 4 °C natten over, og transporter rørene på is i resten af protokollen.
- Fem 15 ml centrifugerør forberedes med 5 ml 1x CCS, et 15 ml centrifugerør med 3 ml 1x CCS, et tomt 15 ml centrifugerør (supernatantrør) og et 15 ml centrifugerør med 5 ml 1x CCS og 2 ml føtalt kvægserum (FBS).
BEMÆRK: Ovenstående kan udarbejdes inden isolationsdagen, hvis flere prøver vil blive behandlet. For illustration, se isolationsrørets layout i figur 2. - På isolationsdagen skal du forberede en petriskål, skalpel, isspand og kold Advanced DMEM / F12 i biosikkerhedsskabet. Anbring det krævede antal cellekulturplader med 24 brønde i inkubatoren (37 °C; 5 % CO2-atmosfære ) for at forvarme.
- Placer opløselig ekstracellulær membranmatrix (ECM; se tabel over materialer) på is for at begynde optøning.
BEMÆRK: Nedsænkning i is beskytter mod hurtig optøning og hjælper med at undgå størkning. En kasse med pipettespidser kan placeres i fryseren for at hjælpe med at plette den opløselige ECM. - Prechill en centrifuge til 4 °C.
- Flyt komplette medier med vækstfaktorerne "CMGF+" eller "organoid media" (se tabel 1 for sammensætning) fra fryseren/køleskabet til et vandbad på 37 °C. Undgå direkte lyseksponering, når det er muligt.
Figur 2: Isolationsrørets layout. Anbefalet opsætning til vævshøstning inkluderer 10 ml avanceret DMEM / F12 og 0,2 ml Pen Strep i et 50 ml centrifugerør. Derudover kræves tre 50 ml rør fyldt med 10 ml 1x CCS til kirurgiske biopsier eller obduktioner. Anbefalet rørlayout til isoleringstrin omfatter fem rør, der indeholder 5 ml 1x CCS, der skal bruges under CCS-vasketrin. Det første rør bruges som et prøverør, der indeholder hakket væv, og de resterende rør tjener som reservoirer på 1x CCS, der skal tilsættes til det første rør. Det sjette rør indeholder 3 ml 1x CCS til skylning af det resterende væv fra prøverøret, når det overføres til en 6-brønds plade. Disse seks rør vil blive brugt før EDTA-inkubationstrinnet. Et rør med 5 ml 1x CCS og 2 ml FBS tjener som et prøverør efter EDTA-inkubation, og supernatant fra dette rør overføres med stamceller til et tomt rør resten af isoleringen. Hold rørene ved 4 °C, før isolationen påbegyndes. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Vævshøst
- Intestinale endoskopiske og laparoskopiske biopsier (diameter 2,8 mm) kan erhverves ved hjælp af store biopsi tang. Høst mindst otte endoskopiske prøver pr. tarmsted.
- Saml prøver direkte i transportrør og læg dem på is.
- Til kirurgiske biopsier og obduktioner høstes vævsstykker med en størrelse på 0,5 cm x 0,5 cm og placeres i det første 1x CCS-rør.
BEMÆRK: For tarmbiopsier skal du fjerne det resterende tarmindhold og skrabe slimhindelaget med en skalpel for at fjerne villi. Hvis prøver er rigelige, kan yderligere biopsier indsamles i kryovialer indeholdende RNA-opbevaringsreagens (1 ml) eller paraffinindlejret til fremtidig sammenligning mellem organoider og deres oprindelsesvæv. I tilfælde af at biopsier indtages til TEM-analyse, må villi ikke skrabes og opbevares i konserveringsmiddel (3 % paraformaldehyd og 3 % glutaraldehyd i fosfatbufret saltvand (PBS)) og opbevares ved 4 °C. - Ryst 1x CCS-røret kraftigt i ~ 30 s, og overfør derefter prøven til et nyt 1x CCS-rør ved hjælp af tang. Gentag denne proces to gange.
- Overfør prøven fra det sidste 1x CCS-rør til transportrøret (Advanced DMEM / F12 + Pen Strep) og bring prøven tilbage til laboratoriet.
BEMÆRK: Prøver, der er forbehandlet på denne måde, kan også sendes natten over på is (send ikke på tøris).
3. Organoid isolering
BEMÆRK: Udfør isolering ved hjælp af aseptiske teknikker i et biosikkerhedsskab. Se figur 3 for arbejdsgang for isolering af hundeorganoider.
- Ryst vævsprøven i transportrøret i ~ 30 s og fjern overdreven supernatant, indtil der er 0,5 ml tilbage i røret ved langsom pipettering nær væskeoverfladen. Sørg for ikke at kassere noget væv.
- Overfør væv og resterende supernatant til en steril petriskål. Brug en engangsskalpel (eller steriliseret tang og saks) til at skære og hakke vævet i mindre stykker (størrelse på 1 mm2), der ligner en moskonsistens i ca. 5 minutter.
- Pipet hakket væv med væske fra petriskålen til det første CCS-rør. Tilsæt 2 ml avanceret DMEM/F12 til petriskålen, skyl det resterende væv, og overfør det til det første CCS-rør.
- Vortex 1x CCS-røret i 5 s cirka fem gange. Lad biopsier sætte sig til bunden af 15 ml-røret (ca. 1 min), og fjern supernatanten, indtil der er 5 ml tilbage i røret. Overfør 1x CCS fra det nye rør til prøverøret.
- Gentag det forrige trin for de næste to rør. På de sidste to vaske skal du fjerne supernatanten ned til 3 ml, der er tilbage i røret.
- Overfør biopsierne og 1x CCS fra prøverøret til en brønd i en 6-brønds plade. Derefter tilsættes 3 ml 1x CCS til prøverøret, hvirvles forsigtigt for at samle resterende væv og overføres til den samme brønd på pladen.
- Tilsæt 150 μL 0,5 M EDTA (for at opnå et samlet volumen på 6,15 ml i en brønd). Anbring 6-brøndspladen på en 20°, 24 omdr./min. nøddeblander/vipper ved 4 °C. Inkuber leverprøverne i 10 minutter og tarmprøverne i 1 time på den bevægelige vipper.
- Transporter pladen med 6 brønde tilbage til biosikkerhedsskabet. Overfør hakket væv og væske til et 1x CCS / FBS-rør og lad vævene sætte sig. Transporter supernatanten (denne del omfatter nu frie stamceller) og ca. 0,2 ml af den øverste del af vævet til det tomme rør.
- Røret, der indeholder prøven, drejes ned (700 x g i 5 minutter ved 4 °C). Stamceller pelleteres nu sammen med hakket væv. Fjern og kassér supernatanten forsigtigt for ikke at forstyrre pillen.
- Resuspend pillen i Advanced DMEM / F12 og drej røret igen (700 x g i 5 minutter ved 4 ° C). Aspirer supernatanten og forstyr ikke pelleten.
- Beregn volumenet af opløselig ECM, der er nødvendigt til såning af de dissocierede celler og væv. Brug 30 μL opløselig ECM pr. Brønd af en 24-brønds plade for at opnå korrekt såtæthed.
BEMÆRK: Integrer en prøve efter isolering i 4 til 6 brønde af en 24-brønds plade (dvs. baseret på mængden af hakket væv i prøven). - Tilsæt det beregnede volumen af opløselig ECM til prøverøret og pipetter langsomt op og ned for at undgå dannelse af bobler. Frø suspensionen midt i brøndene, så den opløselige ECM kan danne en kuppellignende struktur.
BEMÆRK: Brug af pipettespidser fra en -20 °C fryser hjælper med at plette opløselig ECM. Hvis vævsstykker er større end P200-pipettespidsen, skal du bruge brede koldspidser eller skære kolde P1000-spidser for at hjælpe med plettering. Opbevar prøven med den opløselige ECM på is, når det er muligt. - Transporter pladen til en inkubator (37 °C; 5 % CO2-atmosfære ), og lad den opløselige ECM størkne i ~30 minutter.
- Bland ROCK-hæmmer og GSK3β i CMGF+ (koncentrationer i tabel 1). Tilsæt 500 μL af denne opløsning (CMGF+ R/G) til hver brønd. Anbring pladen i inkubatoren (37 °C; 5 % CO2-atmosfære ).
Figur 3: Arbejdsgang for isolering af hundeorganoider. Den høstede vævsprøve overføres til en petriskål og hakkes korrekt. Prøven overføres derefter til et 1x CCS-rør, og vasketrin udføres. Til EDTA-inkubationen i en 6-brønds plade overføres prøven derefter til et rør indeholdende 1x CCS og FBS. Efter at vævet har lagt sig, overføres supernatanten med en lille mængde væv til et tomt rør. Prøven spindes derfor, supernatanten fjernes, og pillen resuspendes i Advanced DMEM/F12. Røret drejes igen, og supernatanten aspireres og kasseres. Opløselig ECM tilsættes til røret, blandes, og prøven er belagt i en 24-brønds plade. Pladen inkuberes derfor (37 °C; 5 % CO2-atmosfære ) i 30 minutter, og der tilsættes derefter medier. Klik her for at se en større version af denne figur.
BEMÆRK: Følgende afsnit (trin 4 og 5) beskriver protokollen til vedligeholdelse af hundeorganoider. Skift medier i henhold til tabel 2 , og kontroller organoiderne dagligt for tegn på apoptose, forurening, overbelægning og løsrivelse af opløselig ECM. Daglige noter skal tages i henhold til figur 4 for nøjagtigt at overvåge forhold og eksperimentelle virkninger på kulturerne. Se supplerende tabel 1 for en skabelon, der giver mulighed for nøjagtig og reproducerbar organoidkulturrelateret notetaking. For leverorganoider skal du bruge CMGF+ forbedret med ROCK-hæmmer og GSK3β.
Figur 4: Organoid størrelse og densitet guide. (A) Organoid størrelsesdiagram for nøjagtig sporing af organoid vækst. Størrelsesguiden indeholder ekstra små (XS), små (S), mellemstore (M), store (L) og ekstra store (XL) kategorier. (B) Densitetsvejledningen består af meget lav densitet (VLD), lav densitet (LD), medium densitet (MD), høj densitet (HD) og meget høj densitetskategorier (VHD). C) Repræsentative billeder af bakteriel og svampekontaminering af organoidprøven. (D) Repræsentative billeder af organoidoverbelægning og apoptose. Den objektive forstørrelse er angivet i hvert panel. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Anbefaling om medieændring | ||||||
| Mandag | Tirsdag | Onsdag | Torsdag | Fredag | Lørdag | Søndag |
| 500 μL | NIELSEN | 500 μL | NIELSEN | 750 μL | NIELSEN | NIELSEN |
Tabel 2: Anbefaling om medieændring. En anbefalet tidslinje for ugentlig medieændring. Medier (500 μL CMGF+ for tarmorganoider eller 500 μL CMGF+ R/G for leverorganoider) anbefales at skiftes hver anden dag. For at tage højde for de ekstra timer i en weekend tilføjes 750 μL medier fredag eftermiddag, hvor medierne opdateres mandag morgen.
4. Rengøring af organoid
BEMÆRK: Organoid rengøring eller passaging skal udføres regelmæssigt for at opretholde organoidkulturens sundhed. Udfør rengøringsproceduren, når apoptose i kulturen, tilstedeværelse af snavs, overfyldning af organoiderne eller løsrivelse af opløselig ECM bemærkes. Se figur 4D.
- Fjern mediet fra brøndene, mens pladen vippes for at undgå ødelæggelse af den opløselige ECM.
BEMÆRK: Hvis opløselig ECM-løsrivelse er betydelig, anbefales det at overføre mediet til 15 ml-røret for at undgå at miste fragmenter af opløselig ECM, der indeholder prøven. - Tilsæt 0,5 ml forkølet avanceret DMEM/F12 til hver brønd for at opløse matrixkuplerne ved gentagen pipettering ved hjælp af en P1000-spids (undgå at skabe for store bobler). Overfør den organoidholdige opløste matrix til et 15 ml centrifugerør. Hold røret på is, og hvis lydstyrken er lavere end 6 ml, skal du langsomt fylde røret med Advanced DMEM / F12 for at nå et samlet volumen på 6 ml.
- Drej røret (700 x g i 5 minutter ved 4 °C), og fjern alt supernatanten, mens du sørger for ikke at forstyrre pillen.
- Tilsæt det krævede volumen opløselig ECM (30 μL pr. Brønd for at opnå korrekt såningstæthed) og langsomt resuspend pelleten ved pipetteblanding. Plade suspensionen i midten af den 24-brønds plade for at danne en kuppel.
- Anbring pladen i en inkubator (37 °C; 5 % CO2-atmosfære ) i ~30 minutter, og tilsæt derefter det passende medievolumen (tabel 2).
5. Organoid passaging
BEMÆRK: Passaging udføres typisk 5-7 dage efter den indledende dyrkning for at udvide organoidcellelinjen. Organoidkulturer kan typisk udvides i forholdet 1:3. Billeder af sunde kulturer klar til passage kan ses i figur 4. Organoider skal være mindst mellemstore.
- Udfør trin 4.1 til 4.3.
- Fjern supernatanten, der efterlader 0,5 ml i røret. Sørg for ikke at forstyrre pillen.
- Tilsæt 0,5 ml trypsinlignende protease (se materialetabel), bland korrekt ved at aspirere med en pipette og inkuber i vandbadet på 37 °C (inkuber tarmorganoider i 8 minutter eller leverorganoider i 10 minutter). Fortsæt med at blande opløsningen ved at svirpe røret flere gange på inkubationens halvtidspunkt.
- Flyt røret, der indeholder prøven, tilbage til et biosikkerhedsskab, og tilsæt langsomt 6 ml forkølet avanceret DMEM / F12 for at inaktivere trypsinlignende protease og stoppe dissociationen af cellerne.
- Drej røret (700 x g i 5 minutter ved 4 °C), og fjern supernatanten. Sørg for ikke at forstyrre pillen.
- Udfør trin 4.4. og 4.5.
BEMÆRK: Følgende afsnit (trin 6-9) beskriver Organoid Harvesting and Biobanking Protocol. Organoidkulturer skal være fri for væv, der er blevet fjernet under tidligere passager. Kulturer bør også være sunde, i det mindste store i størrelse og medium til høj i densitet. Billeder af sunde kulturer, der er klar til downstream-applikationer, kan ses i figur 4. Flytning nedstrøms med bevarelse og høst af suboptimale organoidkulturer kan have en negativ indvirkning på karakteriseringsresultaterne og biobankens levedygtighed. Gennemgå det anbefalede pladelayout med 24 brønde i figur 5.
Figur 5: Anbefalet pladelayout med 24 brønde. Det anbefalede layout af 24-brøndpladen til grundlæggende karakterisering efter udvidelse af organoidkulturen. Paraffinindlejring af seks brønde (mellemstore til store organoider med medium til høj densitet) vil typisk give mulighed for en høj koncentration af organoider i en histologiblok. Fire brønde af organoider kan samles til en kryovial med RNA-lagringsreagens til downstream-applikationer. Fjorten brønde bruges til biobanking af organoidprøverne og giver materiale til op til syv kryokonserverede hætteglas. Klik her for at se en større version af denne figur.
6. Fiksering af organoider
- Fjern medier fra brønden, og sørg for ikke at forstyrre den opløselige ECM-kuppel.
- Der tilsættes 500 μL formalin-eddikesyre-alkoholopløsning, der tjener som fikseringsmiddel (FAA; sammensætning i tabel 1).
- Opbevar organoider ved stuetemperatur. Efter 24 timer aspirerer FAA og fylder brønden med 70% ethanol. Pak pladerne ind med et laboratoriefleksisk filmtape (se Materialetabel) for at undgå hurtig fordampning. Organoiderne er nu klar til paraffinindlejring. Paraffinindlejringen af organoidkulturen udføres i traditionelle metalbaseforme.
7. RNA-konservering
- Fjern medier fra brøndene, og sørg for ikke at forstyrre den opløselige ECM-kuppel.
- Brug 0,5 ml forkølet avanceret DMEM / F12 pr. Brønd til at opløse opløselige ECM-kupler ved gentagne gange at pipettere op og ned (undgå at skabe for store bobler). Overfør organoiderne til et 15 ml centrifugerør. Hold røret på is, og hvis lydstyrken er lavere end 6 ml, skal du langsomt fylde røret med Avanceret DMEM / F12 for at nå 6 ml af det samlede volumen.
- Drej røret (700 x g i 5 minutter ved 4 °C), og fjern alt supernatanten. Sørg for ikke at forstyrre pillen.
- Tilsæt 100 μL PBS til prøverøret og resuspend pillen ved skånsom pipettering. Overfør indholdet af prøverøret til et kryovial.
- Tilsæt 900 μL RNA-lagringsreagens (se tabel over materialer) til prøverøret og bland for at indsamle eventuelle resterende organoider. Overfør disse resterende organoider til kryovialet og opbevar dem ved -80 ° C (typisk vil fire brønde samlet til en kryovial være tilstrækkelige til downstream-applikationer, herunder qPCR- og RNA-sekventering).
BEMÆRK: En kryovial producerer typisk i alt 4.000 ng RNA (målt via spektrofotometeranalyse).
8. Organoid biobanking
BEMÆRK: Biobanking forekommer normalt 3-4 dage efter passage. Tegnene på apoptose bør ikke være til stede i kulturen for at udføre denne metode. Se figur 4 for at henvise til størrelse og densitet, der er passende til frysning. Biobank medium til ekstra store organoider ved mellemstore til meget høje densiteter. Et nødfrysningstrin kan følges, hvis en organoid cellelinje er særlig sjælden, eller yderligere levedygtighed ikke er garanteret. Følg de samme trin for normal organoid biobanking (trin 8.1 til 8.4). Nødfrysning sker med mindre og mindre tætte kulturer. Pool så mange brønde af voksende organoider i en kryovial efter trin 8.1 til 8.4. Husk, at et tilstrækkeligt antal organoider skal holdes i live i et forsøg på at udvide kulturen (nødfrysning er simpelthen en backupprocedure for at beskytte mod muligt tab af kultur via forurening eller andre uventede hændelser).
- Følg trin 7.1 til 7.3.
- Der tilsættes 1 ml frysemedie pr. kryovial (sammensætning i tabel 1) til prøverøret, og pillen forsigtigt suspenderes igen ved at pipettere op og ned.
- Overfør 1 ml af opløsningen til en kryovial (forholdet mellem to brønde/kryovial) og hold kryovialerne på is.
- Kryovialerne overføres fra is til en frysebeholder (genopfyldes reservoiret regelmæssigt med isopropanol) og overføres straks til -80 °C. Prøverne flyttes til flydende nitrogen (-196 °C) til langtidsopbevaring efter 24 timer.
BEMÆRK: En alkoholfri cellefrysningsbeholder kan også bruges i stedet for en traditionel. Sørg for, at prøverne ikke optøes under transport fra -80 °C til langtidslagring af flydende nitrogen. Gentagen optøning reducerer cellekulturens levedygtighed.
9. Genoplivning fra opbevaring af flydende nitrogen
BEMÆRK: Når du vælger at optø en organoidlinje, skal en delmængde af de genoplivede organoider genfryses og udskiftes i biobanken så hurtigt som muligt med mindst en (helst flere) kryovialer.
- Læg opløselig ECM på is for langsomt at tø op, læg en 24-brønds plade i inkubatoren (37 ° C; 5% CO2-atmosfære ), og forbered de nødvendige reagenser såsom et 15 ml rør og avanceret DMEM / F12.
- En kryovial, der indeholder en organoidprøve, genvindes fra opbevaring af flydende nitrogen, og den overføres straks til et varmebad (37 °C) i 2 minutter.
- Overfør indholdet af kryovialet til et 15 ml centrifugerør i et biosikkerhedsskab. Tilføj langsomt forkølet avanceret DMEM/F12 for at nå et samlet volumen på 6 ml.
- Drej røret (700 x g i 5 minutter ved 4 °C). Fjern supernatanten, og sørg for ikke at forstyrre pillen.
- Tilsæt 180 μL (30 μL pr. Brønd) opløselig ECM til pelleten og plade denne suspension i den forvarmede 24-brønds plade. En kryovial kan belægges til seks brønde af en 24-brønds plade.
- Anbring pladen med 24 brønde i inkubatoren (37 °C; 5 % CO2-atmosfære ) i ~30 minutter, og tilsæt CMGF+ R/G (for tarmorganoider, skift til CMGF+ i 24 til 48 timer).
BEMÆRK: Når en prøve er belagt og vokser i pladen med 24 brønde, skal den have lov til at komme sig i mindst 2 dage, før den passerer for at øge levedygtigheden.
Representative Results
Hundens organoidprotokol genererer typisk ~ 50.000 til ~ 150.000 tarm- eller leverceller pr. Brønd af en 24-brønds plade. Repræsentative organoider kan ses i figur 6.
Figur 6: Repræsentative billeder af hundeorganoider. Billeder af organoider isoleret ved hjælp af denne protokol er afbildet. (A,B) Tarmorganoider afledt af tolvfingertarmen (taget ved 10x og 5x objektiv forstørrelse). Bemærk tilstedeværelsen af ældre budded organoider og yngre sfæroider. (C,D) Hunde enteroider fra den nederste del af jejunum (taget ved 10x og 20x objektiv forstørrelse). (E,F) Ileale enteroider (taget ved 20x og 5x objektiv forstørrelse) og (G,H) kolonoider (taget ved 10x objektiv forstørrelse). (I) Et repræsentativt billede af leverorganoider taget ved 20x objektiv forstørrelse. De fleste af organoiderne er i deres spirende form. Yngre leversfæroider kan også ses på billedet. (J) Repræsentativt billede, der viser en sjældenhepatisk organoid, der danner en kanallignende struktur (taget ved 10x objektiv forstørrelse). Skaleringsbjælken (500 μm) findes i øverste venstre hjørne af hvert billede. Klik her for at se en større version af denne figur.
Enteroider og kolonoider afledt ved hjælp af denne protokol blev tidligere karakteriseret af Chandra et al. i 201912. Hunde tarmorganoider består af en regelmæssig cellulær population af tarmepitelet. Anvendelse af RNA in situ-hybridisering , ekspression af stamcellebiomarkører (Leucin-rig gentagelse indeholdende G-proteinkoblet receptor 5 - LGR5 og SRY-Box transkriptionsfaktor 9 - SOX9), Paneth Cell Biomarker (Ephrin type-B-receptor 2 - EPHB2), absorberende epitelcellemarkører (alkalisk phosphatase - ALP) og enteroendokrin markør (Neurogenin-3 - Neuro G3)12 blev bekræftet. Alcian Blue farvning blev udført på paraffinindlejrede dias for at bekræfte tilstedeværelsen af bægerceller. Derudover blev funktionelle assays såsom optisk metabolisk billeddannelse (OMI) eller cystisk fibrose transmembrane konduktansregulator (CFTR) hævelsesassay udført for at bekræfte organoidernes metaboliske aktivitet. Hundeorganoider fra hunde diagnosticeret med inflammatorisk tarmsygdom, gastrointestinale stromale tumorer (GIST) eller kolorektal adenocarcinom blev også isoleret ved hjælp af denne protokol12.
Efter stamcelleisolering starter leverorganoider deres livscyklus som ekspanderende sfæroider, og efter ~ 7 dage bliver de til spirende og differentierende organoider. Hundesphetiske sfæroider isoleret og dyrket i henhold til denne protokol blev målt for at kvantificere deres vækst og bestemme den ideelle tid til passage. Sfæroider afledt af laparoskopiske leverbiopsier af raske voksne hunde (n = 7) blev målt i løbet af deres første 7 dyrkningsdage. Repræsentative billeder blev taget, og den langsgående (a) og diagonale (b) radius af sfæroiderne (n = 845) blev målt i hele kulturen. Volumenet (V), overfladearealet (P), 2D-ellipsearealet (A) og omkredsen (C) af sfæroiderne blev beregnet. Beregningerne og resultaterne af eksperimentet er opsummeret i figur 7. 2D-ellipseområde og omkreds blev brugt til at vurdere organoidkulturens sundhed ved hjælp af lysmikroskopi. Disse værdier kan tjene som en vejledning til beslutninger om kulturvedligeholdelse.
Kort fortalt udvidede sfæroider sig hurtigt i volumen, overfladeareal, 2D-ellipseareal og omkreds. Måledataene fra de syv beagler blev beregnet i gennemsnit for følgende beregninger. Volumenet steg med 479% (±6%) fra dag 2 til 3. Samtidig steg sfæroidoverfladearealet og 2D-ellipsearealet med henholdsvis 211% (±208%) og 209% (±198%). 2D-ellipseomkredsen steg fra dag 2 til 3 med 73% (±57%). Stigningen i det samlede volumen af leverorganoider fra dag 2-7 var mere end 365 gange, overfladeareal og 2D-ellipseareal steg 49 gange, og 2D-ellipseomkredsen steg seks gange.
Dernæst blev sfæroider afledt af to voksne hundeprøver yderligere dyrket efter passage og indsamlet hver dag (dag 2-7) til RNA in situ-hybridisering (RNA ISH). Hundesonder blev designet (sondeliste er angivet som supplerende tabel 2), og mRNA-ekspression blev evalueret for stamcellemarkører (LGR5), markører, der er specifikke for cholangiocytter (cytokeratin 7 - KRT-7 og aquaporin 1 - AQP1) samt hepatocytmarkører (gaffelkasseprotein A1 - FOXA1; og cytokrom P450 3A12 - CYP3A12). Markørernes udtryk blev vurderet semi-kvantitativt (repræsentative billeder i figur 8). Sfæroider udtrykte fortrinsvis cholangiocytmarkøren KRT-7 fra 1% til 26% i signalareal / samlet areal af celler. AQP1 blev ikke udtrykt i organoidprøverne, uden tvivl fordi dets tilstedeværelse i hundes leverprøver er sparsom. Stamcellemarkørekspressionen (LGR5) varierede mellem 0,17 % og 0,78 %, mens hepatocytmarkører blev udtrykt i lavere grad ved 0,05%-0,34% for FOXA1 og 0,03%-0,28% for CYP3A12.
Figur 7: Hepatiske sfæroide målinger. (A) Hepatisk sfæroid vækst blev observeret hver dag af kulturer fra dag 2-7. Sfæroider blev først dannet på dag 2, og de sidste sfæroider startede den spirende proces på dag 7. Et efterfølgende eksperiment brugte to hundeorganoidlinjer efter passage til at høste sfæroider hver dag til paraffinindlejring for at udføre RNA ISH (dag 2-billedet blev taget ved 40x, dag 6-billedet ved 10x, og resten af billederne blev taget ved 20x forstørrelse). (B) En leversfæroidklynge er vist fastgjort til en vævsklump indlejret i opløselig ECM 4 dage efter isolering. Langsgående og diagonale radier af sfæroiderne blev målt (billede taget ved 10x). Panel (C) viser den formel, der bruges til beregninger for at udlede volumen (V), overfladeareal (P), 2D-ellipseareal (A) og omkreds (C). Til disse beregninger blev det antaget, at hundespepatiske sfæroider er ideelle sfæroider. Resultater af målinger af leversfæroiders volumen, overfladeareal, 2D-ellipseareal og 2D-ellipseomkreds for individuelle vækstdage er afbildet i panel (D). Fejllinjer repræsenterer standardfejlen i gennemsnittet (SEM). (E) mRNA-ekspression af KRT-7, LGR5, FOXA1 og CYP3A12 blev målt i prøver af leversfæroider hos hunde efter passage fra dag 2 til dag 7. AQP1 blev ikke udtrykt i disse prøver. En skalabjælke (5x: 500 μm; 10x: 200 μm; 20x: 100 μm; 40x: 50 μm) er til stede øverst til venstre i hvert billede. Objektiv forstørrelse noteret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Organoider ville sjældent ikke bryde op under passaging processen efter denne standardiserede teknik. Hvis dissociation ikke forekommer, kan passagetider justeres for at opnå optimal celleklyngeopløsning. Langvarig eksponering for trypsinlignende protease kan imidlertid påvirke organoidernes vækst negativt. Leverorganoider blev anvendt i et efterfølgende eksperiment for at undersøge den optimale dissociationstid og etablere en korrekt passaging metode. Kort fortalt blev leverorganoider fra to raske hunde (6 brøndreplikater hver) passeret med trypsinlignende protease i 12 minutter og 24 minutter. Prøver blev omrørt hvert 6. minut. Ved afslutningen af dissociationstidspunktet blev der tilsat 6 ml iskold Advanced DMEM/F12 til opløsningen, og prøverne blev spundet (700 x g i 5 minutter ved 4 °C). Supernatanten (Advanced DMEM/F12 med fortyndet trypsinlignende protease) blev fjernet, og pellets blev indlejret i opløselig ECM som beskrevet ovenfor (trin 4.4-4.5). Efter 12 timers dyrkning i opløselig ECM og CMGF+ R/G blev der observeret forskelle i begge prøver. En 12 minutters inkubation med trypsinlignende protease hæmmede ikke organoidvæksten. Væksten af organoider blev imidlertid negativt påvirket (se figur 9) ved hjælp af en 24 minutters inkubation.
Figur 9: Forsøg med leverorganoidpassage hos hunde. Repræsentative billeder af organoider afledt af to hunde (D_1 og D_2) passeret ved hjælp af den trypsinlignende proteaseinkubationsmetode i 12 minutter eller 24 minutter. Kontrolprøver blev passeret med trypsinlignende protease i 10 minutter. En skalabjælke (μm) er til stede øverst til venstre i hvert billede og repræsenterer 500 μm (5x objektiv forstørrelse). Klik her for at se en større version af denne figur.
Dernæst blev undersøgelsen af overlevelsesevnen af hundes leverorganoider afledt af denne protokol i et ugunstigt miljø (berøvelse af strukturel støtte og ernæring) udført. Undersøgelsen fokuserede på at bestemme mængden af organoidmedier og kældermatrix, der var nødvendig for leverorganoids vellykkede vækst og overlevelse og også etablere sådanne betingelsers indflydelse på organoidkulturen. Overlevelsesevnen blev målt i en plade med 96 brønde med et begrænset antal organoider. Organoider fra to hunde blev passeret som beskrevet ovenfor og indlejret (12 replikater) i forskellige volumener af opløselig ECM (10 μL eller 15 μL). Cellerne blev belagt i en koncentration på 400 celler/10 μL brønd og 600 celler/15 μL brønd svarende til 40.000 celler/ml. To medietyper (CMGF+ eller CMGF+ R/G) blev tilsat i forskellige volumener (25 μL, 30 μL eller 35 μL). Medierne blev aldrig ændret, og der blev ikke udført vedligeholdelsesprocedurer. Organoidernes overlevelsesevne blev overvåget hver dag. Organoiddød blev defineret som opløsning af mere end 50% af organoidstrukturerne. Overlevelsesraten for organoider under disse forhold varierede fra 12,9 (±2,3) dage til 18 (±1,5) dage, og resultaterne er opsummeret i tabel 3. De to prøver, der overlevede længst, var organoider afledt af hunde indlejret i 15 μL opløselig ECM og 30 μL CMGF + -medier. Begge prøver blev indlejret i opløselig ECM (30 μL) og friske medier (500 μL) i en standard 24-brønds plade efter 18 dages deprivation for at sikre, at organoidudvidelse stadig var mulig (figur 10).
| Medietype | Middel (dage overlevede) | Median | CV% | Middel (dage overlevede) | Median | CV% | Middel (dage overlevede) | Median | CV% | Middel (dage overlevede) | Median | CV% | |
| Medier (μL) | 30 | 25 | 35 | 30 | |||||||||
| ECM (μL) | 10 | 10 | 10 | 15 | |||||||||
| D_1 | CMGF+ R/G | 12.50 | 13 | 11.57 | 12.83 | 13 | 4.50 | 11.83 | 11.5 | 12.91 | 12.08 | 13 | 12.46 |
| CMGF+ | 17.08 | 17 | 16.26 | 18.50 | 19 | 4.89 | 18.42 | 19 | 14.54 | 17.82 | 19 | 8.99 | |
| D_2 | CMGF+ R/G | 13.67 | 14 | 13.36 | 13.00 | 13 | 12.70 | 14.00 | 14.5 | 17.23 | 13.08 | 13 | 8.90 |
| CMGF+ | 15.50 | 15 | 18.56 | 17.50 | 18 | 10.48 | 17.50 | 19 | 20.89 | 17.00 | 17 | 14.41 | |
| TOTAL | CMGF+ R/G | 13.08 | 13 | 13.13 | 12.92 | 13 | 9.39 | 12.92 | 13 | 17.52 | 12.58 | 13 | 11.22 |
| CMGF+ | 16.29 | 16.5 | 17.69 | 18.00 | 18.5 | 8.35 | 17.96 | 19 | 17.65 | 17.43 | 17 | 11.70 | |
| død= mere end 50% af organoidmassen er ikke levedygtig | |||||||||||||
Tabel 3: Resultater af forsøg med overlevelsesevne. Eksperimentet var baseret på berøvelse af strukturel støtte eller ernæring af to organoidkulturer. Resultaterne omfatter middel-, median- og standardafvigelsen (CV%) af individuelle koncentrationer af opløselig ECM og medier hos individuelle hunde.
Figur 10: Organoider ernæringsmæssige og strukturelle afsavn. Organoider blev ombelagt i 24-brønds plader for at bekræfte evnen til ekspansion efter deprivation (A). Repræsentative billeder fra dag 4 og dag 7 efter replating viser udvidelsen af organoiderne, hvilket bekræfter evnen til at identificere levedygtige organoider visuelt (billeder er taget ved 5x objektiv forstørrelse). Repræsentative billeder af organoider, der betragtes som levende eller døde, ses i (B). Billeder tages ved 5x objektiv forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Hepatiske sfæroider RNA in situ hybridisering repræsentative billeder. Repræsentative billeder af LGR5-, KRT7-, FOXA1- og CYP3A12-markører blev taget ved 60x objektiv forstørrelse af prøver fra dag 2-7 efter passage. Positive mRNA-molekyler pletter rødt. AQP1 blev ikke udtrykt i prøverne. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Ufuldstændig chelateringsopløsning (ICS) sammensætning | Endelig koncentration |
| 500 ml H2O | NA |
| 2,49 g Na2HPO4-2H2O | 4,98 mg/ml |
| 2,7 g KH2PO4 | 5,4 mg/ml |
| 14 g NaCl | 28 mg/ml |
| 0,3 g KCl | 0,6 mg/ml |
| 37,5 g Saccharose | 75 mg/ml |
| 25 g D-Sorbitol | 50 mg/ml |
| Komplet chelateringsopløsning (CCS) sammensætning | V/V % eller endelig koncentration |
| Ufuldstændig chelationsopløsning | 20% |
| Steril H2O | 80% |
| DTT | 520 μM |
| Pen Strep | Pen: 196 U/mL; Strep 196 ug/ml |
| Organoid medie sammensætning | Endelig koncentration |
| Avanceret DMEM/F12 | NA |
| FBS | 8% |
| Glutamax | 2 mM |
| HEPES | 10 mM |
| Primocin | 100 μg/ml |
| B27-tillæg | 1x |
| N2 supplement | 1x |
| N-Acetyl-L-cystein | 1 mM |
| Murine EGF | 50 ng/ml |
| Murine Noggin | 100 ng/ml |
| Menneskelig R-Spondin-1 | 500 ng/ml |
| Murine Wnt-3a | 100 ng/ml |
| [Leu15]-Gastrin I menneske | 10 nM |
| Nicotinamid | 10 mM |
| A-83-01 | 500 nM |
| SB202190 (P38-hæmmer) | 10 μM |
| TMS (trimethoprim sulfamethoxazol) | 10 μg/ml |
| Yderligere komponenter | Endelig koncentration |
| ROCK-hæmmer (Y-27632) | 10 μM |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | 2,5 μM |
| Frysning af mediesammensætning | V/V procent |
| Organoide medier og ROCK-hæmmer | 50% |
| FBS | 40% |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | 10% |
| FAA sammensætning | V/V procent |
| Ethanol (100%) | 50% |
| Eddikesyre, Is | 5% |
| Formaldehyd (37%) | 10% |
| Destilleret vand | 35% |
Tabel 1: Sammensætning af opløsninger og medier. En liste over komponenter og koncentrationer af ufuldstændige og komplette chelateringsopløsninger, CMGF+ (organoidmedier), frysemedier og FAA.
Supplerende tabel 1: Skabelon til organoid pleje. Denne skabelon giver mulighed for nøjagtig og reproducerbar organoid notetaking for hver dag. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 2: RNA in situ-hybridiseringssonder. Liste over sonder specielt designet til hunde-mRNA-mål af en producent af teknologien til at udføre RNA in situ-hybridiseringsteknik. Oplysninger om betydningen af individuelle markører, navnet på en sonde, dens referencenummer og målregion er angivet. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Der mangler i øjeblikket standardiserede protokoller til isolering og vedligeholdelse af hundes lever- og tarmorganoider. Etablering af standardprocedurer for organoidkulturer er berettiget for, at denne model kan anvendes i forskellige laboratorieindstillinger. Specifikt er tilvejebringelse af standardiserede driftsprotokoller til dyrkning af disse hundeorganoidmodeller nøglen til at karakterisere organoidernes normale vækst under kultur og passaging for at udlede optimale tidspunkter for udvidelse og vedligeholdelse. Hunde tarmorganoider dyrket ved hjælp af protokollen har tidligere været karakteriseret ved Chandra et al.12.
Et af de mest kritiske trin i protokollen er passaging af organoider. Den optimale tid for den første passage af leversfæroider blev bestemt til at være på dag 7 efter isolering baseret på de hepatiske sfæroidmålinger. Det maksimale volumen af sfæroider blev opnået på dag 7, og samtidig begyndte sfæroider at knoppe og dannede leverorganoider. Stigningen i det samlede organoidvolumen fra dag 2-7 efter isolation var mere end 365 gange, hvilket tyder på, at den optimale passagetid er længere end hundens tarmorganoidkultur. Efter 7 dage i dyrkning blev der ikke observeret grove tegn på cellulær apoptose i leversfæroiden, selv uden rengøring eller passaging (figur 7). Passaging af tarm- og leverorganoider kan være udfordrende, da proceduren kan føre til tab af celler og ændret levedygtighed. Resultaterne tyder på, at langvarig inkubation af leverorganoider med trypsinlignende protease (op til 12 minutter) ikke påvirker subkulturen negativt. Inkubation af organoiderne i trypsinlignende protease i mere end 24 minutter kan være skadeligt for den efterfølgende subkultur af organoiderne.
I tilfælde af suboptimal brud i celleklyngerne med organoidpassagen kan mekanisk dissociation i stedet for langvarig inkubation med trypsinlignende protease være mere gavnlig. Hvis der opstår problemer med korrekt dissociation af organoiderne, kan kort hvirvel af prøverne forsøges for at forbedre passageudbyttet. På den anden side har hvirvel potentialet til at ødelægge en kultur og beskadige celler, så det bør kun bruges, når andre procedurer gentagne gange har fejlet. At bryde leverorganoider i enkeltceller sænker organoidernes væksthastighed, mens de brydes i klynger af celler, kan i høj grad forbedre deres levedygtighed. Ti minutter blev valgt som inkubationstid for organoidprotokollen. Et inkubationstidspunkt på 12 minutter blev anset for ikke cytotoksisk sammenlignet med en 24 minutters inkubation i det trypsinlignende proteaseeksperiment.
Overlevelsesforsøget bekræftede, at hundes leverorganoider kunne overleve i op til 19,5 dage under ugunstige forhold (strukturel og ernæringsmæssig udtømning). Organoider, der overlevede disse forhold længst, blev dyrket med CMGF + medier. Denne observation kan have været forårsaget af den langsommere vækst af leverorganoider i medier, der ikke er suppleret med Rock-hæmmer og GSK3β. Organoidkulturer med CMGF + R / G voksede hurtigere og kan have udtømt deres ressourcer hurtigere. Dette eksperiment åbner muligheder for at miniaturisere hundens organoidkultur for at opnå en systemkonvertering med høj gennemstrømning. En sådan teknologi viser potentialet til at lette lægemiddelopdagelse eller toksikologiske undersøgelser til en væsentligt reduceret pris.
Nogle almindelige problemer, der opstår under vedligeholdelse af hundeorganoidkultur, er forkert prøvestørkning ved plettering, kulturforurening og etablering af den korrekte tæthed og størrelse af organoiderne. Hvis opløselig ECM størkner for tidligt under plettering, skal du straks placere den på is i 10 minutter. Hvis opløselig ECM ikke danner kuppellignende strukturer, er det sandsynligt, at der ikke blev fjernet nok medier fra prøven. Hvis dette er tilfældet, fortyndes prøven med en mere opløselig ECM, indtil der dannes kupler.
Når der findes svampe- eller bakterieforurening i en hel plade (se figur 4), er den bedste løsning at kassere pladen. Behandling med svampedræbende eller antibiotiske lægemidler kan forsøges, men succesen med et sådant forsøg er ekstremt lavt. Hvis en enkelt brønd er forurenet i en plade, kan levedygtige og upåvirkede brønde rengøres (følg trin 4.1 til 4.5) til en ny plade og overvåges nøje. Hvis prøven allerede er nødfrosset, anbefales det at kassere hele prøven, da optøning af prøven udsætter inkubatoren for yderligere forureningsrisiko.
Sund organoidkultur bør være mindst i kategorien mellemstørrelse og medium densitet eller større. Optimal tæthed er afgørende for organoid kultur vækst. Lavere densitet skal korrigeres ved at rense organoiderne til medium densitet. Hvis situationen med ekstrem tæthed opstår (overbelægning), skal organoiderne udvides til flere brønde. Grove tegn på cellulær apoptose ledsager ofte både overbelægning og lav densitet af organoidkulturen. Hvis disse problemer ikke korrigeres i tide, vil hele organoidkulturen blive apoptotisk i løbet af få dage. Hvis organoider opnår ekstra stor størrelse eller meget høj densitet, skal kulturen bruges til et eksperiment, frysning eller fiksering.
Organoidmediet indeholder i øjeblikket 17 komponenter, og tilføjelsen af vækstfaktorer, der er nødvendige for vedligeholdelse og ekspansion af organoider, kan derfor være dyr. Dette problem kan løses ved at dyrke 2D-cellekulturer, der syntetiserer vækstfaktorerne for at producere betinget CMGF +. Cellekultur L-WRN producerer Wnt-3a, R-Spondin-3 og Noggin vækstfaktorer37. Cellekolonien bruger 90% DMEM / F12 og 10% FBS kulturmedier. Når kulturen opnår 90 procent sammenløb, høstes medier hver dag i 1 uge. De høstede medier blandes derefter med 2x CMGF+ (uden disse vækstfaktorer). Mens 2D-kulturer kan producere de nødvendige vækstfaktorer til en brøkdel af prisen, må den ekstra tid og forberedelse til at producere medierne forventes. Koncentrationerne af vækstfaktorer mellem konditionerede mediebatcher kan også variere37,38.
Voksne stamcelleafledte organoidkulturer af hunde er en unik biomedicinsk model, der kan hjælpe med at nå målene for One Health Initiative39. Organoidteknologien kan anvendes inden for mange grundlæggende og biomedicinske forskningsområder, der spænder fra udviklingsbiologi, patofysiologi, lægemiddelopdagelse og -testning, toksikologi til undersøgelse af infektionssygdomme og regenerativ medicin40. Translationel og omvendt translationel forskning er begge områder, hvor hundeorganoider er anvendelige15. Hunde er blevet brugt i århundreder i translationelle eksperimentelle omgivelser, og deres ledsagende dyrstatus har også lettet deres position som en af de mest udforskede arter inden for veterinærmedicin.
Afslutningsvis giver dette manuskript standardiserede driftsprotokoller til isolering, vedligeholdelse, høst og biobanking af hundes lever- og tarmorganoider for at lette anvendelsen af denne model på forskellige biomedicinske områder. Denne model er unikt egnet til at fremme omvendt translationel forskning som et redskab i One Health-initiativet til at fremme inter- og intradisciplinær deling af viden.
Disclosures
K. Allenspach er medstifter af LifEngine Animal Health og 3D Health Solutions. Hun fungerer som konsulent for Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics og Mars. J. P. Mochel er medstifter af LifEngine Animal Health og 3D Health Solutions. Dr. Mochel fungerer som konsulent for Ceva Animal Health og Ethos Animal Health. Andre forfattere har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at udtrykke taknemmelighed over for Veterinary Diagnostic Laboratory of Iowa State University medarbejdere, nemlig Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victoria J. Green og Jennifer M. Groeltz-Thrush, for rettidig behandling af de leverede prøver. Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra fakultetets opstart, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award og NSF SBIR sub-award til ISU # 1912948.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chelating solution | |||
| D-Sorbitol | Fisher Chemical | BP439-500 | |
| DTT | Promega | V3151 | |
| KCl | Fisher Chemical | P217-500 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655-100G | |
| Na2HPO4-2H2O | Sigma | S5136-100G | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S5-500 | |
| Organoid media | |||
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
| A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| FBS | Corning | 35-010-CV | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
| Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
| SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
| Trimethoprim | Sigma | T7883-5G | |
| Sulfamethoxazole | Sigma-Aldrich | S7507-10G | |
| Reagents | |||
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Chemicals | D128-500 | |
| EDTA, pH 8.0, 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
| Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
| PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| RNAlater Soln. | Invitrogen | AM7021 | RNA Storage Reagent |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
| Other | |||
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| ACD Hybez II Hybridization System | ACD a biotechne brand | 321710 | |
| Centrifuge Tube, 15 mL | Corning | 430766 | |
| CoolCell LX | Corning | BCS-405MC | |
| Cryogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Disposable Centrifuge Tube (50 mL) | Fisherbrand | 05-539-13 | |
| GyroMini Nutating mixer (Rocker) | Labnet | S0500-230V-EU | |
| Heat Bath | Lab-Line Instruments | 3000 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | SpectrophotometerAnalysis |
| Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
| Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Laboratory Flexible Film Tape |
| Protected Disposable Scalpels | Bard-Parker | 239844 | |
| RNAscope 2.5 HD Assay – RED | ACD a biotechne brand | 322350 | |
| RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents | ACD a biotechne brand | 322330 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | ACD a biotechne brand | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | ACD a biotechne brand | 310091 | |
| Tissue Culture Dish | Dot Scientific | 6676621 | |
| Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |
References
- Hickman, D. L., Johnson, J., Vemulapalli, T. H., Crisler, J. R., Shepherd, R.
- De Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: Are they the same? - Implications in cancer translational research. Journal of Nuclear Medicine. 51 (4), 501-504 (2010).
- Cannarozzi, G., Schneider, A., Gonnet, G. A phylogenomic study of human, dog, and mouse. PLoS Computational Biology. 3 (1), 0009-0014 (2007).
- Jacob, J. A. Researchers turn to canine clinical trials to advance cancer therapies. JAMA - Journal of the American Medical Association. 315 (15), 1550-1552 (2016).
- Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).
- Swanson, K. S., et al. Phylogenetic and gene-centric metagenomics of the canine intestinal microbiome reveals similarities with humans and mice. ISME Journal. 5 (4), 639-649 (2011).
- Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. Microbiome. 6 (1), 72 (2018).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Bontempo, V. Nutrition and health of dogs and cats: Evolution of petfood. Veterinary Research Communications. 29, 45-50 (2005).
- Allenspach, K., Gaschen, F. Canine chronic enteropathies: A review. Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. 145 (5), 209-222 (2003).
- Tribuddharatana, T., Kongpiromchean, Y., Sribhen, K., Sribhen, C. Biochemical alterations and their relationships with the metabolic syndrome components in canine obesity. Kasetsart Journal - Natural Science. 45 (4), 622-628 (2011).
- Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).
- Schaefer, K., Rensing, S., Hillen, H., Burkhardt, J. E., Germann, P. G. Is Science the only driver in species selection? An internal study to evaluate compound requirements in the minipig compared to the dog in preclinical studies. Toxicologic Pathology. 44 (3), 474-479 (2016).
- MacArthur Clark, J. The 3Rs in research: A contemporary approach to replacement, reduction and refinement. British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).
- Schneider, B., et al. Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: The one health initiative. CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).
- Lehmann, R., et al. Human organoids: A new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. S. Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936 (2018).
- Truskey, G. A. Human microphysiological systems and organoids as in vitro models for toxicological studies. Frontiers in Public Health. 6, 185 (2018).
- Caipa Garcia, A. L., Arlt, V. M., Phillips, D. H. Organoids for toxicology and genetic toxicology: applications with drugs and prospects for environmental carcinogenesis. Mutagenesis. , (2021).
- Augustyniak, J., et al. Organoids are promising tools for species-specific in vitro toxicological studies. Journal of Applied Toxicology. 39 (12), 1610-1622 (2019).
- Zietek, T., et al. Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - Update to the human model and expansion of applications. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).
- Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion. Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).
- Kar, S. K., et al. Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research. Veterinary Research. 52 (1), 1-17 (2021).
- Borcherding, D. C., et al. Sa1976 polyphenols reverse the pathologic effects of palmitic acid and high fat diet in canine enteroids. Gastroenterology. 158 (6), 486 (2020).
- Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).
- Zdyrski, C., et al. Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation. Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Kurr, L. A., Allenspach, K., Jergens, A., Mochel, J. P. Harnessing the biology of intestinal organoids to accelerate drug discovery in inflammatory bowel disease: A one health approach. The FASEB Journal. 34, 1 (2020).
- Nantasanti, S., et al. Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids. Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).
- Favier, R. P., et al. COMMD1-Deficient dogs accumulate copper in hepatocytes and provide a good model for chronic hepatitis and fibrosis. PLoS ONE. 7 (8), 42158 (2012).
- Kruitwagen, H. S., et al. Long-term survival of transplanted autologous canine liver organoids in a COMMD1-deficient dog model of metabolic liver disease. Cells. 9 (2), 410 (2020).
- Vilgelm, A. E., et al. Fine-needle aspiration-based patient-derived cancer organoids. iScience. 23 (8), 101408 (2020).
- Saxena, K., et al. Human intestinal enteroids: A new model to study human rotavirus infection, host restriction, and pathophysiology. Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).
- VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
- Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
- Mackenzie, J. S., Jeggo, M. The one health approach-why is it so important. Tropical Medicine and Infectious Disease. 4 (2), 88 (2019).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
