Summary
Experimentele methoden om volwassen stamcellen uit intestinale en leverweefsels van honden te oogsten om 3D-organoïde culturen vast te stellen, worden beschreven. Bovendien worden de laboratoriumtechnieken besproken om een consistente groei te garanderen en standaard operationele procedures te bieden om intestinale en hepatische organoïdeculturen van honden te oogsten, biobank en nieuw leven in te blazen.
Abstract
Honden ontwikkelen complexe multifactoriële ziekten analoog aan mensen, waaronder ontstekingsziekten, stofwisselingsziekten en kanker. Daarom vertegenwoordigen ze relevante grote diermodellen met het translationele potentieel naar de menselijke geneeskunde. Organoïden zijn 3-dimensionale (3D), zelfgeassembleerde structuren afgeleid van stamcellen die de microanatomie en fysiologie van hun orgaan van oorsprong nabootsen. Deze translationele in vitro modellen kunnen worden gebruikt voor medicijnpermeabiliteit en ontdekkingstoepassingen, toxicologische beoordeling en om een mechanistisch begrip te bieden van de pathofysiologie van multifactoriële chronische ziekten. Bovendien kunnen hondenorganoïden het leven van gezelschapshonden verbeteren, input leveren op verschillende gebieden van veterinair onderzoek en gepersonaliseerde behandelingstoepassingen in de diergeneeskunde vergemakkelijken. Een kleine groep donoren kan een biobank van organoïde monsters creëren, waardoor de noodzaak voor continue weefseloogst wordt verminderd, omdat organoïde cellijnen voor onbepaalde tijd kunnen worden gesubkweekt. Hierin worden drie protocollen gepresenteerd die zich richten op de kweek van intestinale en hepatische canine organoïden afgeleid van volwassen stamcellen. Het Canine Organoid Isolation Protocol schetst methoden om weefsel te verwerken en het celisolaat in te bedden in een ondersteunende matrix (opgeloste extracellulaire membraanmatrix). Het Canine Organoid Maintenance Protocol beschrijft organoïde groei en onderhoud, inclusief reiniging en passaging, samen met de juiste timing voor uitbreiding. Het Organoid Harvesting and Biobanking Protocol beschrijft manieren om organoïden te extraheren, te bevriezen en te bewaren voor verdere analyse.
Introduction
Knaagdieren zijn het meest gebruikte diermodel voor biomedisch en translationeel onderzoek1. Ze zijn buitengewoon nuttig voor het onderzoeken van de fundamentele moleculaire pathogenese van de ziekten, hoewel hun klinische relevantie voor chronische multifactoriële ziekten onlangs in twijfel is getrokken2. Het hondenmodel vertoont verschillende voordelen ten opzichte van knaagdieren3,4. Honden en mensen delen overeenkomsten in metabolomica en darmmicrobioom die zich ontwikkelden als gevolg van consumptie van menselijke voeding gedurende verschillende perioden van hun domesticatie5,6,7. Overeenkomsten tussen de gastro-intestinale anatomie en fysiologie van honden en mensen is een van de voorbeelden8.
Bovendien delen honden vaak vergelijkbare omgevingen en levensstijlen met hun eigenaren9. De langere levensduur van honden in vergelijking met knaagdieren zorgt voor de natuurlijke ontwikkeling van tal van chronische aandoeningen10. Inflammatoire darmaandoeningen of metabool syndroom zijn voorbeelden van multifactoriële chronische ziekten die belangrijke overeenkomsten hebben tussen mensen en honden11,12. Preklinische onderzoeken bij honden waarbij honden met van nature voorkomende ziekten betrokken zijn, kunnen betrouwbaardere gegevens genereren dan die van knaagdiermodellen13. Om het gebruik van levend dieronderzoek te minimaliseren en te voldoen aan de principes van de 3V's (Reduce, Refine, Replace)14, zijn er alternatieven voor in vivo testen met behulp van 3D in vitro canine organoïden naar voren15.
Organoïden zijn zelfgeassembleerde 3D-stamcel-afgeleide structuren die de fysiologie en microanatomie van hun oorspronkelijke organen samenvatten16,17. Deze technologie werd voor het eerst beschreven door Sato et al. in 200917 en maakte meer vertaalbare in vitro studies in epitheelcellijnen mogelijk dan voorheen mogelijk was met behulp van 2D-kankercelculturen18,19,20. Organoïden zijn nuttige in vitro modellen in vele biomedische disciplines, zoals in preklinische toxicologische21,22,23, absorptie- of metabolismestudies24,25,26,27,28, evenals in gepersonaliseerde medische benaderingen29,30,31 . De succesvolle cultuur van intestinale organoïden bij honden is voor het eerst beschreven in 201912, terwijl leverorganoïden afgeleid van een hond voor het eerst werden gemeld door Nantasanti et al. in 201532. Canine organoïden zijn sindsdien met succes gebruikt in studies naar canine chronische enteropathieën, gastro-intestinale stromale tumoren, colorectaal adenocarcinoom12 en wilson's disease33,34.
Hoewel volwassen stamcellen kunnen worden geoogst via obducties, vereist de organoïde technologie niet altijd het offeren van de dieren. Endoscopische en laparoscopische biopsieën, of zelfs fijnnaaldspiraten van organen35, zijn een levensvatbare bron van volwassen stamcellen voor epitheliale organoïde-isolatie12. Wijdverbreid gebruik van dergelijke niet-invasieve technieken in de dierenartspraktijk vergemakkelijkt de mogelijkheden voor omgekeerd translationeel onderzoek (vertaling van informatie van de veterinaire klinische praktijk naar de klinische praktijk bij de mens en vice versa)15. Verdere vooruitgang van organoïde technologie kan worden gewaarborgd door de standaardisatie van organoïde cultuur en onderhoudsmethoden. Het organoïdeprotocol dat hier wordt gepresenteerd, is gedeeltelijk gebaseerd op eerder gepubliceerd werk van Saxena et al. uit 201536, en methoden werden aangepast aan de specifieke kenmerken van de intestinale en hepatische organoïdecultuur van honden. De totale workflow van de canine organoid protocollen is weergegeven in figuur 1.
Canine Organoid Isolation Protocol introduceert methoden voor het verkrijgen van monsters van endoscopische, laparoscopische en chirurgische biopsieën, evenals obducties. Het schetst de eerste voorbehandeling van weefselmonsters en methoden die worden gebruikt voor transport naar het laboratorium. Materialen en reagentia die nodig zijn voor organoïde-isolatie worden samengevat in de sectie 'Voorbereiding op isolatie'. Het proces van volwassen stamcelisolatie uit weefselmonsters wordt verder in detail beschreven. Ten slotte wordt het proces van het platen van organoïden in koepelachtige structuren met behulp van een opgeloste extracellulaire membraanmatrix besproken.
Het tweede protocol, Canine Organoid Maintenance Protocol, beschrijft methoden voor het documenteren en kweken van organoïden. Veranderingen in de media en hun frequentie worden in deze sectie besproken. Verder worden de laboratoriumprocedures beschreven, zoals het passeren en reinigen van de celculturen, die essentieel zijn voor het succesvolle onderhoud van 3D-canine organoïden. Passende passageing is een kritieke stap van het protocol en mogelijke aanpassingen en probleemoplossing van deze stap worden verder besproken in het manuscript.
Het laatste protocol is Canine Organoid Harvesting and Biobanking Protocol met methoden voor het bereiden van volgroeide organoïden voor paraffine-inbedding en RNA-conservering. Methoden voor het biobanken van organoïdemonsters in vloeibare stikstofopslag worden hier ook beschreven. Ten slotte worden de manieren besproken om bevroren monsters te ontdooien en hun groei te ondersteunen.
Kortom, dit artikel heeft tot doel consistente organoïde kweekprocedures voor honden te bieden door de standaardisatie van interlaboratoriumprotocollen. Hiermee wil het manuscript de reproduceerbaarheid van gegevens afgeleid van canine organoïde modellen vergemakkelijken om hun relevantie in translationeel biomedisch onderzoek te vergroten.
Figuur 1: Workflow van canine organoid protocollen. Het Canine Organoid Isolation Protocol beschrijft de voorbereiding van de materialen die nodig zijn voor organoïde-isolatie, het oogsten van een weefselmonster (door middel van obducties, endoscopische, laparoscopische en chirurgische biopsieën) en richtlijnen voor celdissociatie en plating van de cellulaire populatie. Het Canine Organoid Maintenance Protocol bespreekt het reinigen en doorgeven van de organoïde cultuur. Het Organoid Harvesting and Biobanking Protocol bespreekt de voorbereiding van organoïde monsters voor paraffine-inbedding en verdere organoïde karakterisering. Methoden om organoïde culturen te biobanken en ze te doen herleven uit opslag in vloeibare stikstof worden ook besproken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Het onderzoek werd goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee van Iowa State University (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017).
OPMERKING: In de volgende sectie (stappen 1-3) wordt het Canine Organoid Isolation Protocol beschreven.
1. Voorbereiding op isolatie
- Transportbuizen: Vul vóór organoïde-isolatie (meestal 24 uur eerder) een conische buis van 50 ml met 10 ml Dulbecco's modified eagle medium / voedingsmengsel F-12 (advanced DMEM / F12) verrijkt met 0,2 ml pen streptokokken.
- Voor laparoscopische, incisie- of excisiebiopten bereidt u drie extra conische buisjes van 50 ml voor. Vul deze buizen met 10 ml complete chelaatoplossing (1x CCS; zie tabel 1).
OPMERKING: Voor stap 1.2 kan 2 mM N-Acetylcysteïne (NAC) in Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) ook worden gebruikt als een traditionele oplossing die wordt gebruikt voor het oogsten van stamcellen. Er werden geen verschillen waargenomen bij het gebruik van 1x CCS of NAC in PBS. Beide oplossingen worden toegevoegd om cellen in de oplossing vrij te maken. - Houd de buizen 's nachts op 4 °C en transporteer de buizen over ijs voor de rest van het protocol.
- Bereid vijf centrifugebuizen van 15 ml met 5 ml 1x CCS, één centrifugebuis van 15 ml met 3 ml 1x CCS, één lege centrifugebuis van 15 ml (supernatantbuis) en één centrifugebuis van 15 ml met 5 ml 1x CCS en 2 ml foetaal runderserum (FBS).
OPMERKING: Het bovenstaande kan vóór de dag van isolatie worden voorbereid als er meerdere monsters worden verwerkt. Zie ter illustratie de indeling van de isolatiebuis in figuur 2. - Bereid op de dag van isolatie een petrischaal, scalpel, ijsemmer en koude Advanced DMEM / F12 voor in de bioveiligheidskast. Plaats het vereiste aantal 24-well celkweekplaten in de incubator (37 °C; 5% CO2-atmosfeer ) om voor te verwarmen.
- Plaats opgeloste extracellulaire membraanmatrix (ECM; zie Tabel met materialen) op ijs om te beginnen met ontdooien.
OPMERKING: Onderdompeling in ijs beschermt tegen snel ontdooien en helpt stolling te voorkomen. Een doos met pipetpunten kan in de vriezer worden geplaatst om te helpen bij het platen van de opgeloste ECU. - Prechill een centrifuge tot 4 °C.
- Verplaats complete media met groeifactoren "CMGF+" of "organoïde media" (zie tabel 1 voor samenstelling) van de vriezer/koelkast naar een waterbad van 37 °C. Vermijd directe blootstelling aan licht waar mogelijk.
Figuur 2: Indeling isolatiebuis. Aanbevolen opstelling voor weefseloogst omvat 10 ml Advanced DMEM /F12 en 0,2 ml Pen Strep in een centrifugebuis van 50 ml. Bovendien zijn drie buizen van 50 ml gevuld met 10 ml 1x CCS vereist voor chirurgische biopsieën of obducties. De aanbevolen buisindeling voor isolatiestappen omvat vijf buizen met 5 ml 1x CCS voor gebruik tijdens CCS-wasstappen. De eerste buis wordt gebruikt als een monsterbuis met het gehakte weefsel en de resterende buizen dienen als reservoirs van 1x CCS die aan de eerste buis moeten worden toegevoegd. De zesde buis bevat 3 ml 1x CCS voor het spoelen van het resterende weefsel uit de monsterbuis bij overdracht naar een 6-well plaat. Deze zes buizen zullen worden gebruikt vóór de EDTA-incubatiestap. Een buis met 5 ml 1x CCS en 2 ml FBS dient als monsterbuis na EDTA-incubatie en supernatant uit deze buis wordt met stamcellen overgebracht naar een lege buis voor de rest van de isolatie. Houd de buizen bij 4 °C voordat u met de isolatie begint. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Weefsel oogsten
- Intestinale endoscopische en laparoscopische biopsieën (diameter 2,8 mm) kunnen worden verkregen met behulp van een grote biopsietang. Oogst ten minste acht endoscopische monsters per darmplaats.
- Verzamel monsters rechtstreeks in transportbuizen en plaats ze op ijs.
- Oogst voor chirurgische biopsieën en obducties weefselstukken met een afmeting van 0,5 cm x 0,5 cm en plaats ze in de eerste 1x CCS-buis.
OPMERKING: Verwijder voor darmbiopten de resterende darminhoud en schraap de mucosale laag met een scalpel om villi te verwijderen. Als er monsters in overvloed zijn, kunnen aanvullende biopsieën worden verzameld in cryovieren die RNA-opslagreagens (1 ml) of paraffine-ingebed bevatten voor toekomstige vergelijking tussen organoïden en hun weefsel van oorsprong. In het geval van het nemen van biopten voor TEM-analyse, schraap de villi niet en bewaar het monster niet in conserveermiddel (3% paraformaldehyde en 3% glutaaraldehyde in fosfaatbuffered saline (PBS)) en bewaar het bij 4 °C. - Schud de 1x CCS-buis krachtig gedurende ~ 30 s en breng het monster vervolgens over naar een nieuwe 1x CCS-buis met een tang. Herhaal dit proces twee keer.
- Breng het monster over van de laatste 1x CCS-buis naar de transportbuis (Advanced DMEM/F12 + Pen Strep) en breng het monster terug naar het laboratorium.
OPMERKING: Monsters die op deze manier zijn voorbehandeld, kunnen ook 's nachts op ijs worden verzonden (niet op droogijs verzenden).
3. Organoïde isolatie
OPMERKING: Voer isolatie uit met behulp van aseptische technieken in een bioveiligheidskast. Zie figuur 3 voor de workflow voor orgaanolatie van honden.
- Schud weefselmonster in de transportbuis gedurende ~ 30 s en verwijder overtollig supernatant totdat er nog 0,5 ml in de buis zit door langzaam te pipetteren in de buurt van het vloeistofoppervlak. Zorg ervoor dat u geen weefsel weggooit.
- Breng weefsel en restant over in een steriel petrischaaltje. Knip en hak het weefsel met behulp van een wegwerp scalpel (of gesteriliseerde tang en schaar) in kleinere stukjes (grootte van 1 mm2) die lijken op een pureeconsistentie gedurende ongeveer 5 minuten.
- Pipetteer het gehakte weefsel met vloeistof uit de petrischaal naar de eerste CCS-buis. Voeg 2 ml Advanced DMEM/F12 toe aan de petrischaal, spoel het resterende weefsel door en breng het over naar de eerste CCS-buis.
- Vortex de 1x CCS buis voor 5 s ongeveer vijf keer. Laat biopten bezinken op de bodem van de buis van 15 ml (ongeveer 1 minuut) en verwijder het supernatant totdat er nog 5 ml in de buis zit. Breng de 1x CCS over van de nieuwe buis naar de monsterbuis.
- Herhaal de vorige stap voor de volgende twee buizen. Verwijder bij de laatste twee wasbeurten het supernatant tot 3 ml die in de buis achterblijft.
- Breng de biopten en 1x CCS van de monsterbuis over naar één put van een 6-well plaat. Voeg vervolgens 3 ml 1x CCS toe aan de monsterbuis, draai voorzichtig om het resterende weefsel te verzamelen en breng over naar dezelfde put van de plaat.
- Voeg 150 μL van 0,5 M EDTA toe (om een totaal volume van 6,15 ml in een put te bereiken). Plaats de 6-well plaat op een 20°, 24-rpm notenmixer/rocker bij 4°C. Incubeer de levermonsters gedurende 10 minuten en de darmmonsters gedurende 1 uur op de bewegende rocker.
- Transporteer de 6-putplaat terug naar de bioveiligheidskast. Breng gehakt weefsel en vloeistof over op een 1x CCS / FBS-buis en laat de weefsels bezinken. Transporteer het supernatant (dit deel bevat nu vrije stamcellen) en ongeveer 0,2 ml van het bovenste deel van het weefsel naar de lege buis.
- Draai de buis met het monster naar beneden (700 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C). Stamcellen worden nu samen met het gehakte weefsel gepelletiseerd. Verwijder en gooi het bovennatuurlijk voorzichtig weg om de pellet niet te verstoren.
- Resuspend de pellet in Advanced DMEM/F12 en draai de buis opnieuw (700 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C). Zuig het bovennatuurlijke middel op en verstoor de pellet niet.
- Bereken het volume opgeloste ECM dat nodig is voor het zaaien van de gedissocieerde cellen en weefsels. Gebruik 30 μL opgeloste ECM per put van een 24-well plaat om de juiste zaaidichtheid te bereiken.
OPMERKING: Sluit een monster na isolatie in 4 tot 6 putten van een 24-putplaat in (d.w.z. op basis van de hoeveelheid gehakt weefsel in het monster). - Voeg het berekende volume opgeloste ECM toe aan de monsterbuis en pipetteer langzaam op en neer om de vorming van bellen te voorkomen. Zaai de suspensie in het midden van de putten zodat de opgeloste ECU een koepelachtige structuur kan vormen.
OPMERKING: Het gebruik van pipetpunten uit een vriezer van -20 °C helpt bij het plateren van opgeloste ECM. Als weefselbrokken groter zijn dan de P200-pipetpunt, gebruik dan brede koude uiteinden of snijd koude P1000-tips om te helpen bij het plateren. Bewaar het monster met de opgeloste ECM waar mogelijk op ijs. - Transporteer de plaat naar een incubator (37 °C; 5% CO2-atmosfeer ) en laat de opgeloste ECM gedurende ~ 30 minuten stollen.
- Meng ROCK-remmer en GSK3β in CMGF+ (concentraties in tabel 1). Voeg 500 μL van deze oplossing (CMGF+ R/G) toe aan elke put. Plaats de plaat in de incubator (37 °C; 5% CO2-atmosfeer ).
Figuur 3: Canine organoid isolatie workflow. Het geoogste weefselmonster wordt overgebracht naar een petrischaaltje en op de juiste manier gehakt. Het monster wordt vervolgens overgebracht naar een 1x CCS-buis en er worden wasstappen uitgevoerd. Voor de EDTA-incubatie in een 6-putsplaat wordt het monster vervolgens overgebracht naar een buis met 1x CCS en FBS. Nadat het weefsel is bezinkt, wordt het supernatant met een kleine hoeveelheid weefsel overgebracht naar een lege buis. Het monster wordt vervolgens gesponnen, het supernatant wordt verwijderd en de pellet wordt geresuspendeerd in Advanced DMEM/F12. De buis wordt opnieuw gesponnen en het supernatant wordt aangezogen en weggegooid. Opgeloste ECM wordt aan de buis toegevoegd, gemengd, en het monster wordt verguld in een 24-well plaat. De plaat wordt vervolgens gedurende 30 minuten geïncubeerd (37 °C; 5% CO2-atmosfeer ) en vervolgens worden media toegevoegd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
OPMERKING: In de volgende sectie (stappen 4 en 5) wordt het Canine Organoid Maintenance Protocol beschreven. Verander de media volgens tabel 2 en controleer de organoïden dagelijks op tekenen van apoptose, besmetting, overbevolking en loslating van opgeloste ECM. Dagelijkse aantekeningen moeten worden gemaakt volgens figuur 4 om de omstandigheden en experimentele effecten op de culturen nauwkeurig te controleren. Zie aanvullende tabel 1 voor een sjabloon dat nauwkeurige en reproduceerbare organoïdecultuurgerelateerde aantekeningen mogelijk maakt. Gebruik voor leverorganoïden CMGF+ verrijkt met ROCK-remmer en GSK3β.
Figuur 4: Organoïde maat- en dichtheidsgids. (A) Organoïde groottetabel voor het nauwkeurig volgen van organoïdegroei. De dimensioneringsgids bevat extra kleine (XS), kleine (S), middelgrote (M), grote (L) en extra grote (XL) categorieën. (B) De dichtheidsgids bestaat uit categorieën met zeer lage dichtheid (VLD), lage dichtheid (LD), gemiddelde dichtheid (MD), hoge dichtheid (HD) en zeer hoge dichtheid (VHD). (C) Representatieve beelden van bacteriële en schimmelbesmetting van het organoïdemonster. (D) Representatieve beelden van organoïde overbevolking en apoptose. De objectieve vergroting wordt in elk paneel aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Aanbeveling voor mediawijzigingen | ||||||
| Maandag | Dinsdag | Woensdag | Donderdag | Vrijdag | Zaterdag | Zondag |
| 500 μL | N.V.T | 500 μL | N.V.T | 750 μL | N.V.T | N.V.T |
Tabel 2: Aanbeveling voor mediawijzigingen. Een aanbevolen tijdlijn van wekelijkse mediaverandering. Media (500 μL CMGF+ voor intestinale organoïden, of 500 μL CMGF+ R/G voor leverorganoïden) wordt aanbevolen om om de dag te worden vervangen. Om rekening te houden met de extra uren in een weekend, wordt 750 μL media toegevoegd op vrijdagmiddag, terwijl media op maandagochtend worden vernieuwd.
4. Organoïde reiniging
OPMERKING: Organoïde reiniging of passaging moet regelmatig worden uitgevoerd om de gezondheid van de organoïde cultuur te behouden. Voer de reinigingsprocedure uit wanneer apoptose in de cultuur, aanwezigheid van puin, overbevolking van de organoïden of loslating van opgeloste ECM wordt opgemerkt. Zie figuur 4D.
- Verwijder de media uit de putten terwijl u de plaat kantelt om vernietiging van de opgeloste ECU te voorkomen.
OPMERKING: Als het opgeloste ECM-losmaken aanzienlijk is, wordt geadviseerd om de media over te brengen naar de buis van 15 ml om te voorkomen dat fragmenten van opgelost ECM die het monster bevatten, verloren gaan. - Voeg 0,5 ml voorgekookte Advanced DMEM/F12 toe aan elke put om de matrixkoepels op te lossen door herhaaldelijk te pipetteren met behulp van een P1000-tip (vermijd het creëren van overmatige bubbels). Breng de organoïde-bevattende opgeloste matrix over in een centrifugebuis van 15 ml. Houd de buis op ijs en als het volume lager is dan 6 ml, vul de buis dan langzaam met Advanced DMEM/F12 om een totaal volume van 6 ml te bereiken.
- Draai de buis (700 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C) en verwijder al het supernatant terwijl u ervoor zorgt dat de pellet niet wordt verstoord.
- Voeg het vereiste volume opgelost ECM toe (30 μL per put om de juiste zaaidichtheid te bereiken) en voer de pellet langzaam opnieuw op door pipetmenging. Plaats de ophanging in het midden van de 24-putplaat om een koepel te vormen.
- Plaats de plaat gedurende ~30 minuten in een incubator (37 °C; 5% CO2-atmosfeer ) en voeg vervolgens het juiste volume media toe (tabel 2).
5. Organoïde passaging
OPMERKING: Passaging wordt meestal 5-7 dagen na de eerste kweek uitgevoerd om de organoïde cellijn uit te breiden. Organoïde culturen kunnen meestal worden uitgebreid in een verhouding van 1: 3. Beelden van gezonde culturen die klaar zijn voor passage zijn te zien in figuur 4. Organoïden moeten minstens middelgroot zijn.
- Voer stap 4.1 tot en met 4.3 uit.
- Verwijder het supernatant en laat 0,5 ml in de buis. Zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort.
- Voeg 0,5 ml trypsine-achtig protease toe (zie Materiaaltabel), meng goed door te aspirateren met een pipet en incubeer in het waterbad van 37 °C (incubeer intestinale organoïden gedurende 8 minuten of leverorganoïden gedurende 10 minuten). Blijf de oplossing mengen door de buis meerdere keren te draaien op het halftijdse punt van de incubatie.
- Verplaats de buis met het monster terug naar een bioveiligheidskast en voeg langzaam 6 ml voorgekookte Advanced DMEM/F12 toe om trypsine-achtig protease te inactiveren en de dissociatie van de cellen te stoppen.
- Draai de buis (700 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort.
- Voer stap 4.4 uit. en 4.5.
OPMERKING: In de volgende sectie (stappen 6-9) wordt het organoïde harvesting and biobanking protocol beschreven. Organoïde culturen moeten vrij zijn van weefsel dat tijdens eerdere passages is verwijderd. Culturen moeten ook gezond zijn, op zijn minst groot in omvang en gemiddeld tot hoog in dichtheid. Beelden van gezonde culturen die klaar zijn voor downstream-toepassingen zijn te zien in figuur 4. Stroomafwaarts bewegen met behoud en oogst van suboptimale organoïde culturen kan een negatieve invloed hebben op de karakteriseringsresultaten en de levensvatbaarheid van de biobank. Bekijk de aanbevolen 24-well plaat lay-out in Figuur 5.
Figuur 5: Aanbevolen 24-well plaat lay-out. De aanbevolen lay-out van de 24-well plaat voor basiskarakterisering na uitbreiding van de organoïde cultuur. Paraffine-inbedding van zes putten (middelgrote tot grote organoïden van gemiddelde tot hoge dichtheid) zal meestal een hoge concentratie organoïden in een histologieblok mogelijk maken. Vier putten van organoïden kunnen worden samengevoegd tot één cryoviaal met RNA-opslagreagens voor downstream-toepassingen. Veertien putten worden gebruikt voor het biobanken van de organoïde monsters en leveren materiaal voor maximaal zeven gecryopreserveerde injectieflacons. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Fixatie van organoïden
- Verwijder media uit de put en zorg ervoor dat u de opgeloste ECM-koepel niet verstoort.
- Voeg 500 μL formaline-azijnzuur-alcoholoplossing toe die als fixeermiddel dient (FAA; samenstelling in tabel 1).
- Store organoïden bij kamertemperatuur. Adem na 24 uur FAA op en vul de put met 70% ethanol. Wikkel platen met een laboratorium flexibele filmband (zie Tabel met materialen) om snelle verdamping te voorkomen. De organoïden zijn nu klaar voor paraffine-inbedding. De paraffine-inbedding van de organoïde cultuur wordt uitgevoerd in traditionele metalen basisvormen.
7. RNA-conservering
- Verwijder media uit de putten en zorg ervoor dat u de opgeloste ECM-koepel niet verstoort.
- Gebruik 0,5 ml voorgekookte Advanced DMEM/F12 per put om opgeloste ECM-koepels op te lossen door herhaaldelijk op en neer te pipetteren (vermijd het creëren van overmatige bubbels). Breng de organoïden over in een centrifugebuis van 15 ml. Houd de buis op ijs en als het volume lager is dan 6 ml, vult u de buis langzaam met Advanced DMEM/F12 om 6 ml van het totale volume te bereiken.
- Draai de buis (700 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C) en verwijder al het supernatant. Zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort.
- Voeg 100 μL PBS toe aan de monsterbuis en resuspend de pellet door zachtjes pipetteren. Breng de inhoud van de monsterbuis over naar een cryoviaal.
- Voeg 900 μL RNA-opslagreagens (zie materiaaltabel) toe aan de monsterbuis en meng om eventuele resterende organoïden te verzamelen. Breng deze resterende organoïden over naar het cryoviale en bewaar ze bij -80 °C (meestal zijn vier putten samengevoegd tot één cryoviaal voldoende voor downstream-toepassingen, waaronder qPCR- en RNA-sequencing).
OPMERKING: Eén cryovial produceert doorgaans in totaal 4.000 ng RNA (gemeten via spectrofotometeranalyse).
8. Organoïde biobanking
OPMERKING: Biobanking vindt meestal 3-4 dagen na passage plaats. De tekenen van apoptose mogen niet aanwezig zijn in de cultuur om deze methode uit te voeren. Zie figuur 4 voor de referentiegrootte en dichtheid die geschikt zijn voor bevriezing. Biobank medium tot extra grote organoïden bij gemiddelde tot zeer hoge dichtheden. Een noodbevriezingsstap kan worden gevolgd als een organoïde cellijn bijzonder zeldzaam is of als verdere levensvatbaarheid niet is gegarandeerd. Volg dezelfde stappen voor normale organoïde biobanking (stappen 8.1 tot 8.4). Noodbevriezing wordt gedaan met kleinere en minder dichte culturen. Bundel zoveel bronnen van groeiende organoïden in één cryoviale volgens stap 8.1 tot 8.4. Houd er rekening mee dat een voldoende aantal organoïden in leven moet worden gehouden in een poging om de cultuur uit te breiden (noodbevriezing is gewoon een back-upprocedure om te beschermen tegen mogelijk verlies van cultuur door besmetting of andere onverwachte gebeurtenissen).
- Volg stap 7.1 tot en met 7.3.
- Voeg 1 ml vriesmedium per cryoviaal (samenstelling in tabel 1) toe aan de monsterbuis en pipetteer de pellet voorzichtig door op en neer te pipetteren.
- Breng 1 ml van de oplossing over naar één cryoviaal (verhouding van twee putjes/cryoviaal) en houd de cryovialen op ijs.
- Breng de cryovialen van ijs over in een vriescontainer (vul het reservoir regelmatig bij met isopropanol) en breng onmiddellijk over tot -80 °C. Verplaats de monsters naar vloeibare stikstof (-196 °C) voor langdurige opslag na 24 uur.
OPMERKING: Een alcoholvrije celbevriezingscontainer kan ook worden gebruikt in plaats van een traditionele. Zorg ervoor dat de monsters niet ontdooien tijdens het transport van de -80 °C naar de langdurige opslag van vloeibare stikstof. Herhaald ontdooien vermindert de levensvatbaarheid van de celkweek.
9. Heropleving van de opslag van vloeibare stikstof
OPMERKING: Bij de keuze om een organoïde lijn te ontdooien, moet een subset van de gereanimeerde organoïden zo snel mogelijk opnieuw worden ingevroren en in de biobank worden vervangen door ten minste één (bij voorkeur meer) cryovialen.
- Plaats opgeloste ECM op ijs om langzaam te ontdooien, plaats een 24-well plaat in de incubator (37 °C; 5% CO2-atmosfeer ) en bereid de vereiste reagentia voor, zoals een buis van 15 ml en Advanced DMEM/F12.
- Recupereer een cryoviarium met een organoïdemonster uit de opslag van vloeibare stikstof en breng het onmiddellijk over naar een warmtebad (37 °C) gedurende 2 minuten.
- Breng de inhoud van het cryoviaal over naar een centrifugebuis van 15 ml in een bioveiligheidskast. Voeg langzaam vooraf geprechilled Advanced DMEM/F12 toe om een totaal volume van 6 ml te bereiken.
- Draai de buis (700 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C). Verwijder het supernatant en zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort.
- Voeg 180 μL (30 μL per put) opgeloste ECM toe aan de pellet en plaats deze suspensie in de voorverwarmde 24-well plaat. Eén cryovial kan worden verguld op zes putten van een 24-putplaat.
- Plaats de 24-well plaat in de incubator (37 °C; 5% CO2-atmosfeer ) gedurende ~ 30 minuten en voeg CMGF + R / G toe (voor intestinale organoïden, schakel over naar CMGF + in 24 tot 48 uur).
OPMERKING: Wanneer een monster wordt verguld en groeit in de 24-well plaat, moet het gedurende ten minste 2 dagen vóór het passeren worden laten herstellen om de levensvatbaarheid te vergroten.
Representative Results
Het canine organoïde protocol genereert meestal ~ 50.000 tot ~ 150.000 darm- of levercellen per put van een 24-well plaat. Representatieve organoïden zijn te zien in figuur 6.
Figuur 6: Representatieve beelden van hondenorganoïden. Afbeeldingen van organoïden die met behulp van dit protocol zijn geïsoleerd, worden afgebeeld. (A,B) Intestinale organoïden afgeleid van de twaalfvingerige darm (genomen bij 10x en 5x objectieve vergroting). Let op de aanwezigheid van oudere budded organoïden en jongere sferoïden. (C,D) Canine enteroïden uit het onderste deel van het jejunum (genomen bij 10x en 20x objectieve vergroting). (E,F) Ileale enteroïden (genomen bij 20x en 5x objectieve vergroting), en (G,H) colonoïden (genomen bij 10x objectieve vergroting). (I) Een representatief beeld van leverorganoïden genomen met een objectieve vergroting van 20x. De meeste organoïden zijn in hun ontluikende vorm. Jongere hepatische sferoïden zijn ook te zien op de foto. (J) Representatieve afbeelding met een zeldzame hepatische organoïde die een kanaalachtige structuur vormt (genomen bij 10x objectieve vergroting). De schaalbalk (500 μm) is aanwezig in de linkerbovenhoek van elke afbeelding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Enteroïden en colonoïden afgeleid met behulp van dit protocol werden eerder gekarakteriseerd door Chandra et al. in 201912. Canine intestinale organoïden zijn samengesteld uit een regelmatige cellulaire populatie van het darmepitheel. Met behulp van RNA in situ hybridisatie, de expressie van stamcel biomarkers (Leucine-Rich Repeat Containing G Protein-Coupled Receptor 5 - LGR5 en SRY-Box Transcription Factor 9 - SOX9), Paneth Cell Biomarker (Ephrin type-B receptor 2 - EPHB2), absorberende epitheelcelmarkers (Alkalische fosfatase - ALP) en entero-endocriene marker (Neurogenine-3 - Neuro G3)12 werd bevestigd. Alcian Blue-kleuring werd uitgevoerd op paraffine-ingebedde dia's om de aanwezigheid van Goblet-cellen te bevestigen. Daarnaast werden functionele assays zoals optische metabole beeldvorming (OMI) of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) zwellingstest uitgevoerd om de metabole activiteit van de organoïden te bevestigen. Canine organoïden van honden gediagnosticeerd met inflammatoire darmziekte, gastro-intestinale stromale tumoren (GIST) of colorectaal adenocarcinoom werden ook geïsoleerd met behulp van dit protocol12.
Na stamcelisolatie beginnen hepatische hondenorganoïden hun levenscyclus als expanderende sferoïden en na ~ 7 dagen veranderen ze in ontluikende en differentiërende organoïden. Canine hepatische sferoïden geïsoleerd en gekweekt volgens dit protocol werden gemeten om hun groei te kwantificeren en de ideale tijd voor passage te bepalen. Sferoïden afgeleid van laparoscopische leverbiopten van gezonde volwassen honden (n = 7) werden gemeten tijdens hun eerste 7 dagen van cultuur. Representatieve beelden werden gemaakt en de longitudinale (a) en diagonale (b) straal van de sferoïden (n = 845) werd gemeten in de hele cultuur. Het volume (V), het oppervlak (P), het 2D-ellipsoppervlak (A) en de omtrek (C) van de sferoïden werden berekend. De berekeningen en resultaten van het experiment zijn samengevat in figuur 7. 2D-ellipsgebied en omtrek werden gebruikt om de gezondheid van de organoïdecultuur te beoordelen met behulp van lichtmicroscopie. Deze waarden kunnen als leidraad dienen voor beslissingen over cultuuronderhoud.
Kortom, sferoïden breidden zich snel uit in volume, oppervlakte, 2D-ellipsoppervlak en omtrek. De meetgegevens van de zeven beagles werden gemiddeld voor de volgende berekeningen. Het volume steeg met 479% (±6%) van dag 2 tot 3. Tegelijkertijd namen het sferoïde oppervlak en het 2D-ellipsoppervlak toe met respectievelijk 211% (±208%) en 209% (±198%). De 2D-ellipsomtrek steeg van dag 2 tot 3 met 73% (±57%). De toename van het totale volume van leverorganoïden van dag 2-7 was meer dan 365 keer, het oppervlak en het 2D-ellipsoppervlak namen 49 keer toe en de 2D-ellipsomtrek nam zes keer toe.
Vervolgens werden sferoïden afgeleid van twee volwassen hondenmonsters na passage verder gekweekt en elke dag (dag 2-7) verzameld voor RNA in situ hybridisatie (RNA ISH). Canine-probes werden ontworpen (probe list is provided as Supplementary Table 2), and mRNA expression was evaluate for stem cell markers (LGR5), markers specific for cholangiocytes (cytokeratin 7 - KRT-7, and aquaporin 1 - AQP1), as well as hepatocyte markers (forkhead box protein A1 - FOXA1; and cytochrome P450 3A12 - CYP3A12). De expressie van de markers werd semikwantitatief beoordeeld (representatieve foto's in figuur 8). Sferoïden drukten bij voorkeur de cholangiocytmarker KRT-7 uit, variërend van 1% tot 26% in signaalgebied / totale oppervlakte van cellen. AQP1 werd niet uitgedrukt in de organoïde monsters, waarschijnlijk omdat de aanwezigheid ervan in canine hepatische monsters schaars is. De stamcelmarkerexpressie (LGR5) varieerde van 0,17% tot 0,78%, terwijl hepatocytmarkers in lagere mate tot expressie kwamen bij 0,05%-0,34% voor FOXA1 en 0,03%-0,28% voor CYP3A12.
Figuur 7: Hepatische sferoïde metingen. (A) Hepatische sferoïde groei werd waargenomen elke dag van culturen van dag 2-7. Sferoïden vormden zich voor het eerst op dag 2 en de laatste sferoïden begonnen het ontluikende proces op dag 7. Een volgend experiment gebruikte twee canine organoïde lijnen na passage om elke dag sferoïden te oogsten voor paraffine-embedding om RNA ISH uit te voeren (dag 2-afbeelding werd genomen bij 40x, dag 6-afbeelding bij 10x en de rest van de afbeeldingen werden genomen bij 20x vergroting). (B) Een hepatische sferoïde cluster wordt getoond bevestigd aan een weefselstuk ingebed in opgelost ECM 4 dagen na isolatie. Longitudinale en diagonale radii van de sferoïden werden gemeten (opname genomen bij 10x). Paneel (C) toont de formule die wordt gebruikt voor berekeningen om volume (V), oppervlakte (P), 2D-ellipsoppervlak (A) en omtrek (C) af te leiden. Voor deze berekeningen werd aangenomen dat canine hepatische sferoïden ideale sferoïden zijn. Resultaten van metingen van het volume, het oppervlak, het 2D-ellipsoppervlak en de 2D-ellipsomtrek van leversferoïden voor individuele groeidagen worden weergegeven in paneel (D). Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM). (E) mRNA-expressie van KRT-7, LGR5, FOXA1 en CYP3A12 werden gemeten in monsters van canine hepatische sferoïden na passage van dag 2 tot dag 7. AQP1 werd niet uitgedrukt in deze steekproeven. Een schaalbalk (5x: 500 μm; 10x: 200 μm; 20x: 100 μm; 40x: 50 μm) is linksboven in elke afbeelding aanwezig. Objectieve vergroting opgemerkt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Organoïden zouden zelden niet uiteenvallen tijdens het passaging-proces volgens deze gestandaardiseerde techniek. Als dissociatie niet optreedt, kunnen de passagetijden worden aangepast om optimale celclusterdesintegratie te bereiken. Langdurige blootstelling aan trypsine-achtig protease kan echter een negatieve invloed hebben op de groei van de organoïden. Leverorganoïden werden in een volgend experiment gebruikt om de optimale dissociatietijd te onderzoeken en een juiste passageingmethode vast te stellen. Kortom, leverorganoïden van twee gezonde honden (elk 6 goed gerepliceerde honden) werden gedurende 12 minuten en 24 minuten gepasseerd met trypsine-achtig protease. Monsters werden om de 6 minuten geagiteerd. Aan het einde van het dissociatietijdpunt werd 6 ml ijskoude Advanced DMEM/F12 aan de oplossing toegevoegd en werden monsters gesponnen (700 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C). Het supernatant (Advanced DMEM/F12 met verdund trypsine-achtig protease) werd verwijderd en de pellets werden ingebed in opgelost ECM zoals hierboven beschreven (stappen 4.4-4.5). Na 12 uur kweek in opgeloste ECM en CMGF+ R/G werden in beide monsters verschillen waargenomen. Een incubatie van 12 minuten met trypsine-achtig protease remde de groei van organoïden niet. De groei van organoïden werd echter negatief beïnvloed (zie figuur 9) met behulp van een incubatie van 24 minuten.
Figuur 9: Canine hepatische organoïde passage experiment. Representatieve beelden van organoïden afkomstig van twee honden (D_1 en D_2) gepasseerd met behulp van de trypsine-achtige protease incubatiemethode gedurende 12 min of 24 min. Controlemonsters werden gedurende 10 minuten gepasseerd met trypsine-achtig protease. Een schaalbalk (μm) is linksboven in elke afbeelding aanwezig en vertegenwoordigt 500 μm (5x objectieve vergroting). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Vervolgens werd het onderzoek uitgevoerd naar de overlevingskansen van canine hepatische organoïden afgeleid van dit protocol in een ongunstige omgeving (ontbering van structurele ondersteuning en voeding). Het onderzoek richtte zich op het bepalen van het volume van organoïde media en keldermatrix die nodig zijn voor de succesvolle groei en overleving van leverorganoïden en ook het vaststellen van de invloed van dergelijke omstandigheden op de organoïdecultuur. Overlevingskansen werden gemeten in een 96-putplaat met een beperkt aantal organoïden. Organoïden van twee honden werden gepasseerd zoals hierboven beschreven en ingebed (12 replicaties) in verschillende volumes opgelost ECM (10 μL of 15 μL). De cellen werden geplateerd in een concentratie van 400 cellen/10 μL put en 600 cellen/15 μL goed overeenkomend met 40.000 cellen/ml. Twee mediatypen (CMGF+, of CMGF+ R/G) werden toegevoegd in verschillende volumes (25 μL, 30 μL of 35 μL). De media werden nooit veranderd en er werden geen onderhoudsprocedures uitgevoerd. De overlevingskansen van de organoïden werden dagelijks gemonitord. Organoïde dood werd gedefinieerd als het oplossen van meer dan 50% van de organoïde structuren. De overlevingskans van organoïden in deze omstandigheden varieerde van 12,9 (±2,3) dagen tot 18 (±1,5) dagen, en de resultaten zijn samengevat in tabel 3. De twee monsters die het langst overleefden, waren organoïden afgeleid van honden ingebed in 15 μL opgeloste ECM en 30 μL CMGF + media. Beide monsters werden ingebed in opgelost ECM (30 μL) en verse media (500 μL) in een standaard 24-well plaat na 18 dagen deprivatie om ervoor te zorgen dat organoïde-expansie nog steeds mogelijk was (figuur 10).
| Mediatype | Gemiddelde (dagen overleefd) | Mediaan | Cv% | Gemiddelde (dagen overleefd) | Mediaan | Cv% | Gemiddelde (dagen overleefd) | Mediaan | Cv% | Gemiddelde (dagen overleefd) | Mediaan | Cv% | |
| Media (μL) | 30 | 25 | 35 | 30 | |||||||||
| ECM (μL) | 10 | 10 | 10 | 15 | |||||||||
| D_1 | CMGF + R / G | 12.50 | 13 | 11.57 | 12.83 | 13 | 4.50 | 11.83 | 11.5 | 12.91 | 12.08 | 13 | 12.46 |
| CMGF+ | 17.08 | 17 | 16.26 | 18.50 | 19 | 4.89 | 18.42 | 19 | 14.54 | 17.82 | 19 | 8.99 | |
| D_2 | CMGF + R / G | 13.67 | 14 | 13.36 | 13.00 | 13 | 12.70 | 14.00 | 14.5 | 17.23 | 13.08 | 13 | 8.90 |
| CMGF+ | 15.50 | 15 | 18.56 | 17.50 | 18 | 10.48 | 17.50 | 19 | 20.89 | 17.00 | 17 | 14.41 | |
| TOTAAL | CMGF + R / G | 13.08 | 13 | 13.13 | 12.92 | 13 | 9.39 | 12.92 | 13 | 17.52 | 12.58 | 13 | 11.22 |
| CMGF+ | 16.29 | 16.5 | 17.69 | 18.00 | 18.5 | 8.35 | 17.96 | 19 | 17.65 | 17.43 | 17 | 11.70 | |
| sterfte= meer dan 50% van de organoïde massa is niet levensvatbaar | |||||||||||||
Tabel 3: Resultaten van overlevingsexperimenten. Het experiment was gebaseerd op het ontberen van structurele ondersteuning of voeding van twee organoïde culturen. De resultaten omvatten de gemiddelde, mediane en standaarddeviatie (CV%) van individuele concentraties van opgeloste ECM en media bij individuele honden.
Figuur 10: Organoïden voedings- en structurele deprivatie. Organoïden werden opnieuw geplateerd in 24-putplaten om het vermogen tot expansie na deprivatie (A) te bevestigen. Representatieve beelden van dag 4 en dag 7 na de replating tonen de uitzetting van de organoïden, wat het vermogen bevestigt om levensvatbare organoïden visueel te identificeren (afbeeldingen worden genomen met 5x objectieve vergroting). Representatieve afbeeldingen van organoïden die als levend of dood worden beschouwd, zijn te zien in (B). Foto's worden gemaakt met 5x objectieve vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Hepatische sferoïden RNA in situ hybridisatie representatieve beelden. Representatieve beelden van LGR5, KRT7, FOXA1 en CYP3A12 markers werden genomen bij 60x objectieve vergroting van monsters vanaf dag 2-7 na passage. Positieve mRNA-moleculen kleuren rood. AQP1 werd niet uitgedrukt in de steekproeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Onvolledige samenstelling van de chelaatoplossing (ICS) | Eindconcentratie |
| 500 ml H2O | NA |
| 2,49 g Na2HPO4-2H2O | 4,98 mg/ml |
| 2,7 g KH2PO4 | 5,4 mg/ml |
| 14 g NaCl | 28mg/ml |
| 0,3 g KCl | 0,6 mg/ml |
| 37.5 g Sucrose | 75mg/ml |
| 25 g D-Sorbitol | 50mg/ml |
| Samenstelling van de complete chelaatoplossing (CCS) | V/V % of eindconcentratie |
| Onvolledige chelatieoplossing | 20% |
| Steriel H2O | 80% |
| DTT | 520 μM |
| Pen Strep | Pen: 196 U/mL; Strep 196 ug/ml |
| Organoïde media samenstelling | Eindconcentratie |
| Geavanceerde DMEM/F12 | NA |
| FBS | 8% |
| Glutamax | 2 meter |
| Hepes | 10 meter |
| Primocine | 100 μg/ml |
| B27 aanvulling | 1x |
| N2-aanvulling | 1x |
| N-Acetyl-L-cysteïne | 1mm |
| Murine EFG | 50 ng/ml |
| Murine Noggin | 100 ng/ml |
| Menselijke R-Spondin-1 | 500 ng/ml |
| Murine Wnt-3a | 100 ng/ml |
| [Leu15]-Gastrin I mens | 10 nM |
| Nicotinamide | 10 meter |
| A-83-01 | 500 nM |
| SB202190 (P38-remmer) | 10 μM |
| TMS (trimethoprim sulfamethoxazol) | 10 μg/ml |
| Aanvullende componenten | Eindconcentratie |
| ROCK-remmer (Y-27632) | 10 μM |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | 2,5 μM |
| Samenstelling van vriesmedia | V/V procent |
| Organoïde media en ROCK-remmer | 50% |
| FBS | 40% |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | 10% |
| FAA samenstelling | V/V procent |
| Ethanol (100%) | 50% |
| Azijnzuur, Glaciaal | 5% |
| Formaldehyde (37%) | 10% |
| Gedestilleerd water | 35% |
Tabel 1: Samenstelling van oplossingen en media. Een lijst met componenten en concentraties van onvolledige en complete chelaatoplossingen, CMGF + (organoïde media), vriesmedia en FAA.
Aanvullende tabel 1: Organoïde zorgsjabloon. Deze sjabloon maakt nauwkeurige en reproduceerbare organoïde notities voor elke dag mogelijk. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 2: RNA in situ hybridisatie probes. Lijst van sondes die speciaal zijn ontworpen voor mRNA-doelen van honden door een fabrikant van de technologie om RNA in situ hybridisatietechniek uit te voeren. Informatie over de betekenis van individuele markers, de naam van een sonde, het referentienummer en het doelgebied worden vermeld. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Discussion
Er is momenteel een gebrek aan gestandaardiseerde protocollen beschikbaar voor de isolatie en het onderhoud van canine hepatische en intestinale organoïden. Het vaststellen van standaard operationele procedures voor organoïde culturen is gerechtvaardigd om dit model toepasbaar te maken in verschillende laboratoriumomgevingen. In het bijzonder is het verstrekken van gestandaardiseerde bedrijfsprotocollen voor de cultuur van deze canine organoïde modellen de sleutel tot het karakteriseren van de normale groei van organoïden tijdens cultuur en passaging om optimale tijdspunten voor expansie en onderhoud af te leiden. Canine intestinale organoïden gekweekt met behulp van het protocol zijn eerder gekarakteriseerd door Chandra et al.12.
Een van de meest kritieke stappen van het protocol is het passeren van organoïden. De optimale tijd voor de eerste passage van leversferoïden werd bepaald op dag 7 na isolatie op basis van de hepatische sferoïde metingen. Het maximale volume van sferoïden werd bereikt op dag 7, en tegelijkertijd begonnen sferoïden te knopen en vormden ze leverorganoïden. De toename van het totale organoïde volume vanaf dag 2-7 na isolatie was meer dan 365 keer, wat suggereert dat de optimale passagetijd langer is dan de intestinale organoïdecultuur van de hond. Na 7 dagen in cultuur werden geen grove tekenen van cellulaire apoptose in de leversferoïde waargenomen, zelfs niet zonder reiniging of passaging (figuur 7). Het passeren van de intestinale en hepatische organoïden kan een uitdaging zijn, omdat de procedure kan leiden tot het verlies van cellen en veranderde levensvatbaarheid. De resultaten geven aan dat langdurige incubatie van leverorganoïden met trypsine-achtig protease (tot 12 min) de subcultuur niet negatief beïnvloedt. Het langer dan 24 minuten incuberen van de organoïden in trypsine-achtig protease kan schadelijk zijn voor de daaropvolgende subcultuur van de organoïden.
In geval van suboptimale breuk in de celclusters met de organoïde passage, kan mechanische dissociatie in plaats van langdurige incubatie met trypsine-achtig protease gunstiger zijn. Als er problemen worden ondervonden met de juiste dissociatie van de organoïden, kan worden geprobeerd de passageopbrengst te kort te vortexen. Aan de andere kant heeft vortexing het potentieel om een cultuur te ruïneren en cellen te beschadigen, dus het mag alleen worden gebruikt als andere procedures herhaaldelijk hebben gefaald. Het breken van leverorganoïden in enkele cellen verlaagt de groeisnelheid van de organoïden, terwijl het breken ervan in clusters van cellen hun levensvatbaarheid aanzienlijk kan verbeteren. Tien minuten werd gekozen als incubatietijd voor het organoïde protocol. Een incubatietijdpunt van 12 minuten werd als niet cytotoxisch beschouwd in vergelijking met een incubatietijd van 24 minuten in het trypsine-achtige protease-experiment.
Het overlevingsexperiment bevestigde dat canine hepatische organoïden tot 19,5 dagen konden overleven in ongunstige omstandigheden (structurele en nutritionele uitputting). Organoïden die deze aandoeningen het langst overleefden, werden gekweekt met CMGF + -media. Deze waarneming kan zijn veroorzaakt door de tragere groei van leverorganoïden in media die niet zijn aangevuld met Rock-remmer en GSK3β. Organoïde culturen met CMGF + R / G groeiden sneller en hebben hun bronnen mogelijk sneller uitgeput. Dit experiment opent mogelijkheden voor het miniaturiseren van de organoïdecultuur van honden om een systeemconversie met hoge doorvoer te bereiken. Een dergelijke technologie toont het potentieel om de ontdekking van geneesmiddelen of toxicologische studies tegen aanzienlijk lagere kosten te vergemakkelijken.
Enkele veel voorkomende problemen tijdens het onderhoud van de organoïde cultuur bij honden zijn onjuiste stolling van het monster bij het plateren, kweekbesmetting en het vaststellen van de juiste dichtheid en grootte van de organoïden. Als opgeloste ECM voortijdig stolt tijdens het beplating, plaats het dan onmiddellijk op ijs gedurende 10 minuten. Als opgeloste ECM geen koepelachtige structuren vormt, is het waarschijnlijk dat er niet genoeg media uit het monster zijn verwijderd. Als dit het geval is, verdunt u het monster met een meer opgeloste ECM totdat zich koepels vormen.
Wanneer schimmel- of bacteriële besmetting in een hele plaat wordt aangetroffen (zie figuur 4), is de beste oplossing om de plaat weg te gooien. Behandeling met antischimmel- of antibiotica kan worden geprobeerd, maar het succes van een dergelijke poging is extreem laag. Als een enkele put in een plaat is verontreinigd, kunnen levensvatbare en niet-aangetaste putten worden gereinigd (volg stappen 4.1 tot 4.5) naar een nieuwe plaat en nauwlettend worden gecontroleerd. Als het monster al Emergency Frozen is geweest, is het raadzaam om het volledige monster weg te gooien, omdat het ontdooien van het monster de incubator blootstelt aan extra besmettingsrisico.
Gezonde organoïde cultuur moet ten minste in de categorie middelgroot en middelgroot of groter zijn. Optimale dichtheid is cruciaal voor de groei van organoïdenkweek. Lagere dichtheid moet worden gecorrigeerd door de organoïden te reinigen tot gemiddelde dichtheid. Als de situatie van extreme dichtheid optreedt (overbevolking), moeten de organoïden worden uitgebreid naar meer putten. Grove tekenen van cellulaire apoptose gaan vaak gepaard met zowel overbevolking als lage dichtheid van de organoïde cultuur. Als deze problemen niet op tijd worden gecorrigeerd, zal de hele organoïde cultuur binnen enkele dagen apoptotisch worden. Als organoïden een extra grote omvang of zeer hoge dichtheid bereiken, moet de cultuur worden gebruikt voor een experiment, bevriezing of fixatie.
Het organoïde medium bevat momenteel 17 componenten en de toevoeging van groeifactoren die nodig zijn voor organoïde onderhoud en expansie kan daarom duur zijn. Dit probleem kan worden opgelost door 2D-celculturen te kweken die de groeifactoren synthetiseren om geconditioneerde CMGF + te produceren. Celkweek L-WRN produceert Wnt-3a, R-Spondin-3 en Noggin groeifactoren37. De celkolonie gebruikt 90% DMEM/F12 en 10% FBS kweekmedia. Wanneer de cultuur 90 procent samenvloeiing bereikt, wordt media gedurende 1 week elke dag geoogst. De geoogste media worden vervolgens gemengd met 2x CMGF+ (zonder deze groeifactoren). Hoewel 2D-culturen de benodigde groeifactoren kunnen produceren tegen een fractie van de kosten, moet de extra tijd en voorbereiding om de media te produceren worden verwacht. Concentraties van groeifactoren tussen geconditioneerde mediabatches kunnen ook verschillen37,38.
Canine volwassen stamcel-afgeleide organoïde culturen zijn een uniek biomedisch model dat kan helpen bij het bereiken van de doelen van het One Health Initiative39. De organoïde technologie kan worden gebruikt in vele fundamentele en biomedische onderzoeksgebieden, variërend van ontwikkelingsbiologie, pathofysiologie, ontdekking en testen van geneesmiddelen, toxicologie tot de studie van infectieziekten en regeneratieve geneeskunde40. Translationeel en omgekeerd translationeel onderzoek zijn beide gebieden waar canine organoïden van toepassing zijn15. Honden worden al eeuwenlang gebruikt in translationele experimentele omgevingen en hun status van gezelschapsdier heeft ook hun positie als een van de meest onderzochte soorten in de diergeneeskunde vergemakkelijkt.
Kortom, dit manuscript biedt gestandaardiseerde operationele protocollen voor isolatie, onderhoud, oogsten en biobanking van canine hepatische en intestinale organoïden om de toepassing van dit model op verschillende biomedische gebieden te vergemakkelijken. Dit model is bij uitstek geschikt om reverse translationeel onderzoek te bevorderen als instrument van het One Health Initiative om het inter- en intradisciplinaire delen van kennis te bevorderen.
Disclosures
K. Allenspach is mede-oprichter van LifEngine Animal Health en 3D Health Solutions. Ze dient als consultant voor Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics en Mars. J.P. Mochel is mede-oprichter van LifEngine Animal Health en 3D Health Solutions. Dr. Mochel fungeert als consultant voor Ceva Animal Health en Ethos Animal Health. Andere auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
De auteurs willen dankbaarheid uitspreken aan de medewerkers van het Veterinary Diagnostic Laboratory van de Iowa State University, namelijk Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victoria J. Green en Jennifer M. Groeltz-Thrush, voor de tijdige verwerking van de verstrekte monsters. De auteurs willen de steun van de Faculty Startup, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award en NSF SBIR sub-award aan ISU # 1912948 erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chelating solution | |||
| D-Sorbitol | Fisher Chemical | BP439-500 | |
| DTT | Promega | V3151 | |
| KCl | Fisher Chemical | P217-500 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655-100G | |
| Na2HPO4-2H2O | Sigma | S5136-100G | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S5-500 | |
| Organoid media | |||
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
| A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| FBS | Corning | 35-010-CV | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
| Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
| SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
| Trimethoprim | Sigma | T7883-5G | |
| Sulfamethoxazole | Sigma-Aldrich | S7507-10G | |
| Reagents | |||
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Chemicals | D128-500 | |
| EDTA, pH 8.0, 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
| Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
| PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| RNAlater Soln. | Invitrogen | AM7021 | RNA Storage Reagent |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
| Other | |||
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| ACD Hybez II Hybridization System | ACD a biotechne brand | 321710 | |
| Centrifuge Tube, 15 mL | Corning | 430766 | |
| CoolCell LX | Corning | BCS-405MC | |
| Cryogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Disposable Centrifuge Tube (50 mL) | Fisherbrand | 05-539-13 | |
| GyroMini Nutating mixer (Rocker) | Labnet | S0500-230V-EU | |
| Heat Bath | Lab-Line Instruments | 3000 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | SpectrophotometerAnalysis |
| Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
| Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Laboratory Flexible Film Tape |
| Protected Disposable Scalpels | Bard-Parker | 239844 | |
| RNAscope 2.5 HD Assay – RED | ACD a biotechne brand | 322350 | |
| RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents | ACD a biotechne brand | 322330 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | ACD a biotechne brand | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | ACD a biotechne brand | 310091 | |
| Tissue Culture Dish | Dot Scientific | 6676621 | |
| Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |
References
- Hickman, D. L., Johnson, J., Vemulapalli, T. H., Crisler, J. R., Shepherd, R.
- De Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: Are they the same? - Implications in cancer translational research. Journal of Nuclear Medicine. 51 (4), 501-504 (2010).
- Cannarozzi, G., Schneider, A., Gonnet, G. A phylogenomic study of human, dog, and mouse. PLoS Computational Biology. 3 (1), 0009-0014 (2007).
- Jacob, J. A. Researchers turn to canine clinical trials to advance cancer therapies. JAMA - Journal of the American Medical Association. 315 (15), 1550-1552 (2016).
- Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).
- Swanson, K. S., et al. Phylogenetic and gene-centric metagenomics of the canine intestinal microbiome reveals similarities with humans and mice. ISME Journal. 5 (4), 639-649 (2011).
- Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. Microbiome. 6 (1), 72 (2018).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Bontempo, V. Nutrition and health of dogs and cats: Evolution of petfood. Veterinary Research Communications. 29, 45-50 (2005).
- Allenspach, K., Gaschen, F. Canine chronic enteropathies: A review. Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. 145 (5), 209-222 (2003).
- Tribuddharatana, T., Kongpiromchean, Y., Sribhen, K., Sribhen, C. Biochemical alterations and their relationships with the metabolic syndrome components in canine obesity. Kasetsart Journal - Natural Science. 45 (4), 622-628 (2011).
- Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).
- Schaefer, K., Rensing, S., Hillen, H., Burkhardt, J. E., Germann, P. G. Is Science the only driver in species selection? An internal study to evaluate compound requirements in the minipig compared to the dog in preclinical studies. Toxicologic Pathology. 44 (3), 474-479 (2016).
- MacArthur Clark, J. The 3Rs in research: A contemporary approach to replacement, reduction and refinement. British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).
- Schneider, B., et al. Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: The one health initiative. CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).
- Lehmann, R., et al. Human organoids: A new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. S. Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936 (2018).
- Truskey, G. A. Human microphysiological systems and organoids as in vitro models for toxicological studies. Frontiers in Public Health. 6, 185 (2018).
- Caipa Garcia, A. L., Arlt, V. M., Phillips, D. H. Organoids for toxicology and genetic toxicology: applications with drugs and prospects for environmental carcinogenesis. Mutagenesis. , (2021).
- Augustyniak, J., et al. Organoids are promising tools for species-specific in vitro toxicological studies. Journal of Applied Toxicology. 39 (12), 1610-1622 (2019).
- Zietek, T., et al. Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - Update to the human model and expansion of applications. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).
- Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion. Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).
- Kar, S. K., et al. Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research. Veterinary Research. 52 (1), 1-17 (2021).
- Borcherding, D. C., et al. Sa1976 polyphenols reverse the pathologic effects of palmitic acid and high fat diet in canine enteroids. Gastroenterology. 158 (6), 486 (2020).
- Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).
- Zdyrski, C., et al. Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation. Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Kurr, L. A., Allenspach, K., Jergens, A., Mochel, J. P. Harnessing the biology of intestinal organoids to accelerate drug discovery in inflammatory bowel disease: A one health approach. The FASEB Journal. 34, 1 (2020).
- Nantasanti, S., et al. Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids. Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).
- Favier, R. P., et al. COMMD1-Deficient dogs accumulate copper in hepatocytes and provide a good model for chronic hepatitis and fibrosis. PLoS ONE. 7 (8), 42158 (2012).
- Kruitwagen, H. S., et al. Long-term survival of transplanted autologous canine liver organoids in a COMMD1-deficient dog model of metabolic liver disease. Cells. 9 (2), 410 (2020).
- Vilgelm, A. E., et al. Fine-needle aspiration-based patient-derived cancer organoids. iScience. 23 (8), 101408 (2020).
- Saxena, K., et al. Human intestinal enteroids: A new model to study human rotavirus infection, host restriction, and pathophysiology. Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).
- VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
- Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
- Mackenzie, J. S., Jeggo, M. The one health approach-why is it so important. Tropical Medicine and Infectious Disease. 4 (2), 88 (2019).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
