Summary
Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten menschlichen Mikroglia (iPSMG) in das Gehirn über einen transnasalen Weg bei immunkompetenten Mäusen. Die Methode zur Herstellung und transnasalen Transplantation von Zellen und die Verabreichung von Zytokinmischung zur Aufrechterhaltung von iPSMG wird gezeigt.
Abstract
Mikroglia sind die spezialisierte Population von makrophagenähnlichen Zellen des Gehirns. Sie spielen eine wesentliche Rolle sowohl bei physiologischen als auch bei pathologischen Gehirnfunktionen. Der größte Teil unseres derzeitigen Verständnisses von Mikroglia basiert auf Experimenten, die mit der Maus durchgeführt wurden. Menschliche Mikroglia unterscheiden sich von Maus-Mikroglia, und daher entsprechen die Reaktion und Eigenschaften von Maus-Mikroglia möglicherweise nicht immer denen von menschlichen Mikroglia. Darüber hinaus ist die Forschung an menschlichen Mikroglia aufgrund ethischer und technischer Schwierigkeiten auf das In-vitro-Kultursystem beschränkt, das die In-vivo-Eigenschaften von Mikroglia nicht kapituliert. Um diese Probleme zu überwinden, wird eine vereinfachte Methode zur nicht-invasiven Transplantation induzierter pluripotenter Stammzell-abgeleiteter menschlicher Mikroglia (iPSMG) in das immunkompetente Mäusegehirn über einen transnasalen Weg in Kombination mit der pharmakologischen Erschöpfung endogener Mikroglia unter Verwendung eines koloniestimulierenden Faktor-1-Rezeptor-Antagonisten (CSF1R) entwickelt. Dieses Protokoll bietet eine Möglichkeit, Zellen nicht-invasiv in das Gehirn der Maus zu transplantieren und kann daher für die Bewertung der In-vivo-Rolle menschlicher Mikroglia in physiologischen und pathologischen Gehirnfunktionen wertvoll sein.
Introduction
Mikroglia sind eine spezialisierte Population von makrophagenähnlichen Zellen im zentralen Nervensystem (ZNS) und spielen eine wesentliche Rolle bei der Steuerung verschiedener Gehirnfunktionen wie der Entwicklung neuronaler Schaltkreise, der Modulation der Neurotransmission und der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns 1,2,3. Obwohl murine Mikroglia viele Funktionen mit denen des Menschen teilen, zeigen sie artspezifische Unterschiede. Daher entspricht die Reaktion von Mausmikroglia auf verschiedene Reize möglicherweise nicht immer der menschlichen Mikroglia 4,5,6. Obwohl viele Studien menschliche Mikroglia analysiert haben, beschränken sich diese Experimente auf In-vitro-Studien. In vitro kultivierte menschliche Mikroglia zeigen morphologische Merkmale und Genexpression, die sich stark von denen in vivo unterscheiden. Daher kapitulieren In-vitro-Experimente möglicherweise nicht immer die In-vivo-Eigenschaften menschlicher Mikroglia. Daher wird ein experimentelles System zur Untersuchung menschlicher Mikroglia in vivo benötigt.
Um die In-vivo-Eigenschaften menschlicher Mikroglia zu untersuchen, werden kürzlich in vitro erzeugte induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) oder embryonale Stammzellen-abgeleitete menschliche Mikroglia chirurgisch in das Gehirn von Mäusentransplantiert 7,8,9,10,11,12,13,14. Mit diesem Ansatz wurden verschiedene In-vivo-Merkmale menschlicher Mikroglia charakterisiert. Die weit verbreitete Anwendung dieser Methode ist jedoch aus zwei Gründen begrenzt. Erstens ist die Anforderung von immundefizienten Mäusen. Um die Rolle menschlicher Mikroglia bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen zu untersuchen, müssen krankheitsmutationsübertragende Mäuse in immundefiziente Mäuse überführt werden, was viel Zeit und Mühe erfordert. Darüber hinaus können bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen periphere Immunzellen, wie T-Zellen, Mikrogliafunktionenmodulieren 15,16,17. Daher stellen Experimente, die an immundefizienten Mäusen durchgeführt wurden, möglicherweise keine echten Eigenschaften der menschlichen Mikroglia in vivo dar. Zweitens erfordern invasive Operationen zur Transplantation von Mikroglia zusätzliche Ausrüstung und Ausbildung. Darüber hinaus kann eine Hirnverletzung während der invasiven Transplantation den Mikroglia-Phänotyp verändern.
In diesem Protokoll wird die nicht-invasive transnasale Transplantation (Tsn) von iPSMG in immunkompetente Wildtyp-Mäuse beschrieben18. Durch die Kombination eines pharmakologischen ON/OFF eines CSF1R-Antagonisten PLX5622, der die endogenen Mausmikroglia19 und Tsn erschöpft, kann iPSMG nicht-invasiv in das Gehirn der Maus transplantiert werden. Darüber hinaus bleibt das transplantierte iPSMG mit der Anwendung von exogenem menschlichem Zytokin für 60 Tage regionsspezifisch ohne Immunsuppressiva lebensfähig.
Protocol
Alle in dieser Studie verwendeten Tiere wurden in Übereinstimmung mit den von der Physiologic Society of Japan20 veröffentlichten "Guiding Principles in the Care and Use of Animals in the Field of Physiologic Sciences" und mit vorheriger Genehmigung des Animal Care Committee der Universität Yamanashi (Yamanashi, Japan).
1. Herstellung von Zellmedium, Transplantationsmedium und Anästhesiegemisch
- Bereiten Sie das Zellmedium vor, indem Sie 10% fetales Rinderserum und 0,1% Penicillin / Streptomycin bei DMEM hinzufügen.
- Bereiten Sie das Transplantationsmedium vor, indem Sie hCSF1 (250 ng/ml) und hTGF-β1 (100 ng/ml) in das Zellmedium geben.
- Bereiten Sie die Anästhesiemischung für die intraperitoneale Injektion vor, indem Sie 0,45 ml Medetomidinhydrochlorid, 1,2 ml Midazolam und 1,5 ml Butorphanoltartrat in 11,8 ml normaler Kochsalzlösung mischen.
2. Herstellung von iPSMG
HINWEIS: Gefrorene iPSMG (Table of Materials) wurden bis zum Gebrauch bei -80 °C aufbewahrt.
- Tauen Sie die gefrorenen Zellen schnell in einem 37 °C warmen Wasserbad auf. Schwenken Sie die Proben, bis alles sichtbare Eis geschmolzen ist.
- Das aufgetaute iPSMG in das auf 37 °C erwärmte Nährmedium geben. Fügen Sie 1 ml aufgetaute Zellen mit Medium (1 × 106 Zellen) zu 10 ml der Kulturmedien hinzu.
- Zentrifen Sie die Zellen bei 300 x g für 5 Minuten, um ein Zellpellet zu erhalten.
- Entfernen Sie nach der Zentrifugation alle Überstände, ohne das Zellpellet zu stören. Eine vollständige Entfernung des Überstands ist wünschenswert, um die Verdünnung der Zytokinkonzentration im Transplantationsmedium zu reduzieren.
- Fügen Sie das Transplantationsmedium hinzu, um eine Zellkonzentration von 1 x 105 Zellen/μL zu erhalten.
- Legen Sie das iPSMG auf Eis und fahren Sie sofort mit der Transplantation fort.
HINWEIS: Die Vorbereitung von iPSMG für die Transplantation erfolgt auf einer sauberen Bank, um eine Kontamination zu vermeiden.
3. Vorbereitung der Maus für die transnasale Transplantation (Tsn)
- Füttern Sie die männlichen Wildtyp-Mäuse (C57BL/6J, 8 Wochen alt) 7 Tage lang mit PLX5622, die Nahrung enthalten.
- Beenden Sie am Ende des 7. Tages die PLX-Diät und füttern Sie die Mäuse mit einer normalen Diät bis zum Ende der Studie.
HINWEIS: PLX5622 enthaltende Diät wird durch Zugabe von 1,2 g PLX5622 in 1 kg AIN-93G (Tabelle der Materialien) hergestellt.
4. Transnasale Transplantation von Zellen
- 24 h nach Beendigung der PLX-Fütterung wiegen Sie die Mäuse und betäuben Sie sie mit einer intraperitonealen Injektion der Anästhesiemischung (0,2 ml/20 g).
- Nachdem die Mäuse vollständig betäubt wurden, wie durch Nichtansprechbarkeit auf den Pedalentzugsreflex (feste Zehenklemme) beurteilt, verabreichen Sie 2,5 μL Hyaluronidase in PBS (100 U / ml) bei 1 h vor Tsn von iPSMG zweimal mit einer 10 μL Pipettenspitze, um die Permeabilität der Nasenschleimhaut zu erhöhen.
- Nach der Anwendung von Hyaluronidase die Mäuse in Rückenlage bringen.
- Wiederholen Sie Schritt 4.2 10 Minuten vor der transnasalen Transplantation von iPSMG.
- Tragen Sie 2,5 μL Zellsuspension mit einer 10 μL Pipettenspitze in ein Nasenloch der Maus auf.
- Legen Sie die Maus für 5 Minuten in Rückenlage, bevor Sie die Zellsuspension in das andere Nasenloch verabreichen.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.5 und 4.6 viermal, wobei ein Gesamtvolumen von 20 μl pro Tier angewendet wird.
- Stellen Sie die Maus in Rückenlage auf ein 37 °C heißes Pad, bis sie sich von der Narkose erholt hat.
- Wiederholen Sie um 48 Uhr nach Beendigung der PLX-Fütterung die Schritte 4.1-4.7 an denselben Mäusen erneut.
HINWEIS: Es sollte beachtet werden, dass iPSMG während der Transplantation auf Eis gelegt werden.
5. Anwendung von Zytokinen
- Anästhesien der Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion einer Anästhesiemischung (0,2 ml/20 g).
- 2,5 μL des Transplantationsmediums werden mit einer 10 μL Pipettenspitze in ein Nasenloch der Maus aufgetragen.
- Legen Sie die Maus für 5 Minuten in Rückenlage, bevor Sie das Transplantationsmedium in das andere Nasenloch verabreichen.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.2 und 5.3 viermal, wobei ein Gesamtvolumen von 20 μl pro Tier angewendet wird.
HINWEIS: Es sollte beachtet werden, dass die transnasale Verabreichung von Transplantationsmedium (humane Zytokine) alle 12 Stunden für die Lebensfähigkeit von transplantiertem iPSMG bis zum Ende der Studie erforderlich ist.
Representative Results
Diese Technik ermöglicht es dem Prüfarzt, iPSMG nicht-invasiv in den Hippocampus und das Kleinhirn zu transplantieren, aber nicht in den Kortex des Mausgehirns. Nach Abschluss der Studie wurden anästhesierte Mäuse einer transkardialen Perfusion von eiskaltem PBS (−) unterzogen, gefolgt von eiskaltem Paraformaldehyd mit 4% (w/v) in PBS. Die Gehirne wurden isoliert, über Nacht in 4% (w/v) Paraformaldehyd postfixiert und in einem PBS, das 30% (w/v) Saccharose enthielt, kryogeschützt. Weiterhin wurden die Gehirne in einer Einbettungsmasse eingefroren und (20 μm dicke koronale Schnitte) auf einem Kryostaten geschnitten. Die Abschnitte wurden dreimal in PBS(−) (je 10 min) gewaschen und mit 0,5% (v/v) Triton X-100 in 10% normalem Ziegenserum für 1 h permeabilisiert und blockiert. Die Abschnitte wurden dann 5 Tage lang mit dem antihumanspezifischen Zytoplasmamarker STEM121 (1:100) und dem Anti-Iba1 (1:1000) inkubiert. Als nächstes wurden die Abschnitte dreimal mit PBS(−) für jeweils 10 min gewaschen und mit sekundären Antikörpern inkubiert: Alexa Fluor 488- oder 546-konjugierte Maus oder Kaninchen-IgGs (1:1000) für 2 h bei Raumtemperatur. Nach dem dreimaligen Waschen mit PBS(-) wurden Abschnitte mit einem Antifade-Montagemedium auf Dias montiert. Für die Aufnahme von Fluoreszenzbildern wurde ein konfokales Mikroskop verwendet, das mit einer 40-fachen Objektivlinse ausgestattet war. Die Lebensfähigkeit von iPSMG 2 Monate nach der Transplantation im Hippocampus und im Kortex ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Anzahl der transplantierten Zellen kann durch Zählen von Zellen bestimmt werden, die sowohl für humanspezifische Antikörper als auch für panmikrogliale / Monozytenmarker positiv sind, während endogene Mausmikroglia nur wie zuvor beschrieben positiv für Pan-Mikroglia / Monozytenmarker sind18. Die transplantierten iPSMGs ersetzen Mausmikroglia, zeigen verzweigte Morphologien im Hippocampus und werden im Kortex18 nicht nachgewiesen.
Abbildung 1: Lebensfähigkeit von iPSMG im Kortex und im Hippocampus 2 Monate nach Tsn. Das linke Feld zeigt eine Immunfärbung mit einem Pan-Mikroglia/Monozytenmarker, Iba1 (grün). Das mittlere Feld zeigt die Immunfärbung mit dem humanspezifischen Zytoplasmamarker STEM121 (rot). Das rechte Feld zeigt ein zusammengeführtes Bild der Immunfärbung von Iba1 und STEM121. (A) Bei Kontrollmäusen wurden sowohl im Kortex als auch im Hippocampus nur Mausmikroglia (Iba1+/STEM121-) nachgewiesen. (B) Bei iPSMG-transplantierten Mäusen wurden im Kortex nur Mausmikroglia (Iba1+/STEM121-) nachgewiesen, während im Hippocampus iPSMG (Iba1+/STEM121+) nachgewiesen wurden. Die Pfeile im Bild zeigen Maus-Mikroglia, während Pfeilspitzen iPSMG zeigen. Für die Fluoreszenzbildaufnahme wurde ein konfokales Mikroskop verwendet, das mit einem 40-fachen Objektiv ausgestattet war. Maximale Bildgröße: 1024 x 1024 Pixel. Zoomfaktor: 2. Maßstabsbalken = 50 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Das Protokoll beschreibt hier die nicht-invasive Transplantation von iPSMG in das Gehirn der Maus. Die Einzigartigkeit des aktuellen Protokolls besteht darin, dass iPSMG durch die Kombination pharmakologischer PLX ON / OFF-Methoden und intranasales Transplantation nicht-invasiv in das immunkompetente Mäusegehirn transplantiert werden kann. Transplantierte iPSMG bildeten die Mehrheit der Mikroglia im Hippocampus und Kleinhirn, indem sie die freie Nische für bis zu 60 Tage, aber nicht im Kortex besetzten.
Die kritischen Punkte für das effiziente Tsn von iPSMG sind (i) die Erschöpfungseffizienz endogener Mausmikroglia (ii) die Verabreichung menschlicher Zytokine alle 12 h. Mikroglia pflegen ihr eigenes Territorium im Gehirn. Eine effiziente Erschöpfung der Mausmikroglia ist erforderlich, um eine Nische für die Transplantation von transplantiertem iPSMG zu schaffen. Wenn die Erschöpfung der endogenen Mausmikroglia unzureichend ist, wird keine Besiedlung des Hippocampus und des Kleinhirns der Maus durch iPSMG beobachtet. Die Lebensfähigkeit von Mikroglia hängt von der CSF1R- und TGFBR-Signalgebung 19,21,22 ab. Es wird berichtet, dass hCSF1 selektiv die Lebensfähigkeit menschlicher Mikroglia erhöht, und hTGF-β1 wird für die Lebensfähigkeit von Mikroglia benötigt und dämpft Entzündungen, wenn es alle 12 h21,23,24 verabreicht wird. In Abwesenheit von exogenen menschlichen Zytokinen werden iPSMG im Gehirn der Maus nicht beobachtet. Darüber hinaus muss darauf geachtet werden, dass iPSMG vor Tsn nicht mechanisch durch übermäßiges Pipettieren oder auf andere Weise aktiviert wird, da dies die iPSMG-Eigenschaften sowie die Transplantationseffizienz unwiderruflich verändert. Wenn der zufriedenstellende Tsn von iPSMG nicht gesehen wird, muss die Lebensfähigkeit von iPSMG vor der Transplantation sowie der Abbau endogener Mikroglia bestimmt werden. Wenn die Erschöpfung der endogenen Mausmikroglia nicht mehr als 90% beträgt, kann die Fütterungszeit des PLX5622 geändert werden, um die Erschöpfung zu erhöhen.
Im Vergleich zu einer herkömmlichen chirurgischen Transplantationsmethode, die invasiv ist und zusätzliche Ausrüstung und Schulung erfordert, ermöglicht Tsn die Transplantation auf nicht-invasive, einfache, stabile und einfache Weise. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die Transplantation von iPSMG in immunkompetente Mäusegehirne; So können immunokompetente Krankheitsmodellmäuse verwendet werden, um die Reaktion von iPSMG zu untersuchen.
Der größte Nachteil der aktuellen Methode ist die regionale Heterogenität bei der Transplantation von iPSMG. Wenn die hirnregionenspezifische iPSMG-Transplantation erforderlich ist, ist das aktuelle Protokoll nicht geeignet, da das transplantierte iPSMG nur im Hippocampus und im Kleinhirn, aber nicht im Kortex 60 Tage lang verpfropft bleibt. Darüber hinaus ist die Notwendigkeit, exogene menschliche Zytokine alle 12 h intranasal zu verabreichen, auch eine Einschränkung des derzeitigen Protokolls, da es umfangreiche Arbeit erfordert und teuer ist.
Zusammenfassend wird ein detailliertes Protokoll für Tsn von iPSMG in die Gehirne immunkompetenter Mäuse bereitgestellt. In Kombination mit pharmakologischen ON/OFF von Mausmikroglia durch PLX5622 ermöglicht dieses Protokoll eine erfolgreiche Transplantation von iPSMG. Da transplantierte Zellen im Hippocampus und Kleinhirn über einen längeren Zeitraum beobachtet werden können, wenn exogene Zytokine angewendet werden, kann die derzeitige Methode für die Bewertung der Rolle menschlicher Mikroglia sowohl in physiologischen als auch in pathologischen Zuständen in diesen Regionen wertvoll sein.
Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Fördergeber: Diese Studie wurde unterstützt von JSPS KAKENHI 17K14961 (PB), 20K15899 (PB), JP18K06481 (YS), JP20KK0366 (YS), 20H05902 (SK), 20H05060 (SK), 19H04746 (SK), 21H04786 (SK), 21K19309 (SK), AMED-CREST (SK), CREST (SK), der Mitsubishi Science Foundation (SK), der Takeda Science Foundation (SK) und einem Frontier Brain Science Grant der University of Yamanashi (SK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 10566 | |
| AIN 93G | Oriental Yeast Co | ||
| Anti-Iba1 antibody | FUJIFILM | 019–19741 | |
| Anti-STEM121 antibody | Takara Bioscience | Y40410 | |
| Butorphanol tartrate | Kyoritsu Seiyaku | 8019 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Fetal bovine serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30070.03 | |
| Frozen iPSMG | Shionogi & Co., Ltd | Laboratory for Drug Discovery and Disease Research | |
| Human colony stimulating factor 1 (hCSF1) | PeproTech | 300-25 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 | |
| Medetomidine hydrochloride | Meiji Seika | VETLI5 | |
| Midazolam | Astellas | 18005A2 | |
| Paraformaldehyde | Wako Pure Chemical Industries | 162-16065 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Pipette | Eppendorf | 3120000011 | |
| Pipette tip | Eppendorf | 30076028 | |
| PLX5622 | Amadis Chemical | A930097 | |
| Transforming growth factor-β1 (Tgf-b1) | PeproTech | 100-21 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| VECTA SHIELD Hard Set Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400-10 | antifade mounting medium |
References
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