Summary
Questo protocollo delinea come un sistema di coltura cellulare tridimensionale può essere utilizzato per modellare, trattare e analizzare le modifiche della cromatina in uno stato quasi fisiologico.
Abstract
Le colture piatte di cellule di mammifero sono un approccio in vitro ampiamente utilizzato per comprendere la fisiologia cellulare, ma questo sistema è limitato nella modellazione dei tessuti solidi a causa della replicazione cellulare innaturalmente rapida. Ciò è particolarmente difficile quando si modella la cromatina matura, poiché le cellule a replicazione rapida sono spesso coinvolte nella replicazione del DNA e hanno una popolazione poliploide eterogenea. Di seguito è presentato un flusso di lavoro per la modellazione, il trattamento e l'analisi delle modifiche della cromatina quiescente utilizzando un sistema di coltura cellulare tridimensionale (3D). Utilizzando questo protocollo, le linee cellulari di carcinoma epatocellulare vengono coltivate come sferoidi 3D riproducibili in un incubatore che fornisce una diffusione attiva dei nutrienti e basse forze di taglio. Il trattamento con butirrato di sodio e succinato di sodio ha indotto un aumento rispettivamente dell'acetilazione e della succinilazione degli istoni. Gli aumenti dei livelli di acetilazione e succinilazione degli istoni sono associati a uno stato di cromatina più aperto. Gli sferoidi vengono quindi raccolti per l'isolamento dei nuclei cellulari, da cui vengono estratte le proteine istoniche per l'analisi delle loro modificazioni post-traduzionali. L'analisi degli istoni viene eseguita tramite cromatografia liquida accoppiata online con spettrometria di massa tandem, seguita da una pipeline computazionale interna. Infine, vengono mostrati esempi di rappresentazione dei dati per indagare la frequenza e la presenza di segni di istoni combinatori.
Introduction
Dalla fine del 19° secolo, i sistemi di coltura cellulare sono stati utilizzati come modello per studiare la crescita e lo sviluppo delle cellule al di fuori del corpo umano 1,2. Il loro uso è stato esteso anche per studiare come funzionano i tessuti e gli organi in contesti sia sani che malati 1,3. Le cellule in sospensione (ad esempio, le cellule del sangue) crescono in piastre di Petri o fiaschi senza soluzione di continuità e in modo intercambiabile poiché non si assemblano in strutture tridimensionali (3D) in vivo. Le cellule derivate da organi solidi possono crescere in sistemi di coltura bidimensionali (2D) o 3D. Nella coltura 2D, le cellule vengono coltivate in un monostrato che aderisce a una superficiepiana 2,4. I sistemi di coltura cellulare 2D sono caratterizzati da una crescita esponenziale e da un tempo di raddoppio rapido, in genere da 24 ore a pochi giorni5. Le cellule nei sistemi 3D crescono fino a formare intricate interazioni cellula-cellula modellando più da vicino conglomerati simili a tessuti e sono caratterizzate dalla loro capacità di raggiungere un equilibrio dinamico in cui il loro tempo di raddoppio può raggiungere 1 mese o più5.
In questo articolo viene presentata una metodologia innovativa per far crescere sferoidi 3D in sistemi di coltura cellulare rotante che simulano la gravità ridotta6. Questo è un derivato semplificato di un sistema di coltura cellulare introdotto dalla NASA nel 19907. Questo approccio riduce al minimo le forze di taglio, che si verificano nei metodi esistenti come i palloni rotanti, e aumenta la riproducibilità dello sferoide6. Inoltre, il bioreattore rotante aumenta la diffusione attiva dei nutrienti, riducendo al minimo la formazione necrotica che si verifica in sistemi come la coltura cellulare a goccia sospesa in cui lo scambio di media non è pratico6. In questo modo, le cellule crescono per lo più indisturbate, consentendo la formazione di caratteristiche strutturali e fisiologiche associate alle cellule che crescono nei tessuti. Gli epatociti C3A (HepG2 / C3A) coltivati in questo modo non solo avevano organelli ultrastrutturali, ma producevano anche quantità di ATP, adenilato chinasi, urea e colesterolo paragonabili ai livelli osservati in vivo 1,2. Inoltre, le cellule cresciute in sistemi di coltura cellulare 2D vs.3D presentano diversi modelli di espressione genica8. L'analisi dell'espressione genica degli epatociti C3A cresciuti come sferoidi 3D ha mostrato che queste cellule esprimevano una vasta gamma di proteine specifiche del fegato, nonché geni coinvolti in percorsi chiave che regolano la funzionalità epatica8. Pubblicazioni precedenti hanno dimostrato le differenze tra i proteomi di cellule in crescita esponenziale in coltura 2D rispetto alle cellule in equilibrio dinamico in colture sferoidi 3D5. Queste differenze includono il metabolismo cellulare, che a sua volta influenza la struttura, la funzione e la fisiologia della cellula5. Il proteoma delle cellule cresciute in coltura 2D era più arricchito in proteine coinvolte nella replicazione cellulare, mentre il proteoma degli sferoidi 3D era più arricchito nella funzionalità epatica5.
Il tasso di replicazione più lento delle cellule cresciute come sferoidi 3D modella in modo più accurato fenomeni specifici associati allo stato e alle modifiche della cromatina (ad esempio il ritaglio dell'istone9). Il clipping istonico è una modificazione post-traduzionale irreversibile dell'istono (PTM) che causa la scissione proteolitica di parte della coda N-terminale dell'istone. Mentre la sua funzione biologica è ancora in discussione 10,11,12,13, è chiaro che la sua presenza nelle cellule primarie e nel tessuto epatico è modellata da cellule HepG2 / C3A cresciute come sferoidi, ma non come cellule piatte 9. Questo è fondamentale, poiché lo stato della cromatina e le modifiche regolano la lettura del DNA principalmente modulando l'accessibilità ai geni e quindi la loro espressione14. I PTM istonici influenzano direttamente lo stato della cromatina influenzando la carica netta dei nucleosomi in cui sono assemblati gli istoni, o indirettamente reclutando scrittori, lettori e cancellatori di cromatina14. Centinaia di PTM istonici sono stati identificati fino ad oggi15, rafforzando l'ipotesi che la cromatina ospiti un "codice istonico" utilizzato dalla cellula per interpretare il DNA16. Tuttavia, l'identificazione di una miriade di combinazioni PTM15 e la scoperta che le combinazioni di PTM istonici hanno spesso funzioni biologiche diverse dalle PTM presenti in isolamento (ad esempio Fischle, et al.17), evidenzia che è necessario più lavoro per decifrare il "codice istonico".
Attualmente, l'analisi PTM degli istoni si basa su tecniche che utilizzano anticorpi (ad esempio, western blots, immunofluorescenza o immunoprecipitazione della cromatina seguita da sequenziamento [ChIP-seq]) o spettrometria di massa (MS). Le tecniche basate su anticorpi hanno un'elevata sensibilità e possono fornire informazioni dettagliate sulla localizzazione a livello di genoma dei segni istonici, ma sono spesso limitate nello studio di PTM o PTM rari presenti in combinazioni 18,19,20. La SM è più adatta per l'identificazione e la quantificazione imparziali e ad alto rendimento di modificazioni proteiche singole e coesistenti, in particolare proteine istoniche 18,19,20. Per questi motivi, questo e molti altri laboratori hanno ottimizzato la pipeline MS per l'analisi di peptidi istonici (MS bottom-up), code istoniche intatte (MS middle-down) e proteine istoniche a lunghezza intera (MS top-down)21,22,23.
Di seguito è riportato un flusso di lavoro per la coltivazione di sferoidi HepG2 / C3A e la loro preparazione per l'analisi dei peptidi istonici (MS bottom-up) tramite cromatografia nano-liquida, accoppiata online con spettrometria di massa tandem (nLC-MS / MS). È stata coltivata una coltura cellulare 2D e le cellule sono state raccolte e trasferite in un bioreattore dove avrebbero iniziato a formare sferoidi (Figura 1). Dopo 18 giorni in coltura, gli sferoidi sono stati trattati con butirrato di sodio o succinato di sodio per aumentare l'abbondanza relativa di acetilazione e succinilazione degli istoni. In particolare, le colture 3D possono essere trattate con composti genotossici altrettanto bene dei loro equivalenti di coltura piatta; infatti, recenti pubblicazioni evidenziano che la risposta tossicologica delle cellule in coltura 3D è più simile ai tessuti primari rispetto a quelli in coltura piatta 2D 24,25. Le cellule sono state quindi raccolte in punti temporali specificati ed è stato eseguito l'isolamento nucleare. Quindi, gli istoni sono stati estratti e derivatizzati con anidride propionica prima e dopo la digestione della tripsina secondo un protocollo sviluppato per la prima volta da Garcia et al.26. Questa procedura genera peptidi di dimensioni appropriate per la separazione online con cromatografia a fase inversa (C18) e il rilevamento con SM. Infine, i peptidi istonici sono stati identificati e quantificati e i dati generati sono stati rappresentati in più modi per un'interpretazione biologica più completa.
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Protocol
1. Preparazione di tamponi e reagenti
- Mezzi di crescita cellulare (per le cellule HepG2/C3A): aggiungere siero bovino fetale (FBS) (10% v/v), aminoacidi non essenziali (1% v/v), integratore di L-glutammina (1% v/v) e penicillina/streptomicina (0,5% v/v) al Modified Eagle's Medium di Dulbecco (DMEM, contenente 4,5 g/L di glucosio). I substrati di crescita vengono conservati a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- 200 mM di soluzione di butirrato di sodio (NaBut): per preparare 10 mL, sospendere 220,18 mg di NaBut in 10 mL di ddH2O. Conservare 1 mL aliquote a -20 °C. Prima del trattamento cellulare, filtrare la soluzione utilizzando un filtro a siringa da 0,45 mm e aggiungere 1 mL della soluzione filtrata a 9 mL di mezzo di crescita cellulare per una concentrazione di lavoro di 20 mM.
- 100 mM di soluzione di succinato di sodio (NaSuc): per preparare 10 mL, sospendere 162,05 mg di NaSuc in 10 mL di ddH2O. Conservare 1 mL aliquote a -20 °C. Prima del trattamento cellulare, filtrare la soluzione utilizzando un filtro a siringa da 0,45 mm e aggiungere 1 mL della soluzione filtrata a 9 mL di mezzo di crescita cellulare per una concentrazione di lavoro di 10 mM.
- Freddo 0,2 M H2SO4: Per preparare 1 L, aggiungere 10 ml di H2SO4 concentrato a 990 ml di acqua di grado HPLC. Conservare a 4 °C.
- Acetone freddo + 0,1% acido cloridrico (HCl): aggiungere HCl concentrato (0,1% v/v) all'acetone. Conservare a 4 °C.
- Soluzione nh4HCO3 da 100 mM, pH 8,0: per preparare 1 L, sospendere 7,91 g di NH4HCO3 in 1 L di acqua di grado HPLC. Conservare aliquote da 50 ml a -20 °C.
- Soluzione di acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,1%: aggiungere TFA concentrato (0,1% v/v) all'acqua di grado HPLC. Conservare a 4 °C.
- Soluzione di acetonitrile al 60%/ TFA allo 0,1%: aggiungere acetonitrile di grado HPLC (60% v/v) all'acqua di grado HPLC. Quindi, aggiungere TFA concentrato (0,1% v / v) a questa soluzione. Conservare a 4 °C.
- 2% acetonitrile di grado HPLC + 0,1% di acido formico: aggiungere acetonitrile di grado HPLC (2% v / v) all'acqua di grado HPLC. Quindi, aggiungere acido formico concentrato (0,1% v/v) a questa soluzione.
- 80% acetonitrile di grado HPLC + 0,1% di acido formico: aggiungere acetonitrile di grado HPLC (80% v / v) all'acqua di grado HPLC. Quindi, aggiungere acido formico concentrato (0,1% v/v) a questa soluzione.
2. Preparazione del sistema di coltura 3D
NOTA: Cellule diverse, primarie o immortalizzate, hanno proprietà di coltura diverse, quindi la formazione di sferoidi può differire tra i tipi di cellule. Questo protocollo è stato stabilito per la formazione di sferoidi HepG2/C3A utilizzando bioreattori e un innovativo sistema di coltura cellulare 3D.
- Utilizzando mezzi di crescita standard, far crescere le cellule come un monostrato fino a quando non sono confluenti all'80%.
- Lavare le cellule con HBSS (5 mL per un pallone da 75 cm2 ) e incubare le cellule con 5 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% diluita in HBSS (diluizione 1:2) per 5 min a 37 oC con il 5% di CO2.
- Controllare il distacco cellulare al microscopio e neutralizzare la tripsina aggiungendo 3 ml di siero bovino fetale (FBS) o mezzo di crescita (contenente il 5%-10% di FBS).
- Contare il numero di cellule e diluire la sospensione cellulare per ottenere 1 x 106 celle in un volume massimo di 1,5 ml.
- Equilibrare una piastra inferiore rotonda a 24 pozzetti con attacco ultra-basso (contenente più micro-pozzetti per pozzetto) lavando i pozzetti con 0,5 ml di terreno di crescita. Centrifugare la piastra per 5 minuti a 3.000 x g per rimuovere le bolle d'aria dalla superficie del pozzo.
- Trasferire la sospensione cellulare nella piastra e centrifugare per 3 minuti a 120 x g.
- Incubare la piastra per 24 ore a 37 oC con il 5% di CO2 per la formazione di sferoidi. Nel frattempo, equilibrare il bioreattore riempiendo la camera di umidità con 25 ml di acqua sterile e la camera cellulare con 9 ml di mezzi di crescita.
- Incubare il bioreattore, ruotando nell'incubatore clinostat, per 24 ore a 37 oC con il 5% di CO2.
3. Crescita degli sferoidi nei bioreattori
NOTA: per preservare la struttura degli sferoidi, per la gestione delle strutture 3D vengono utilizzate punte di foro largo.
- Staccare gli sferoidi dalla piastra di attacco ultra-bassa tubando delicatamente su e giù con punte di foro larghe 1 mL e trasferirli in un piatto trattato con coltura tissutale.
- Lavare il piatto con 0,5 ml di terreno di crescita preriscaldato e trasferirlo nello stesso piatto.
- Valutare la qualità degli sferoidi al microscopio e selezionare sferoidi sufficientemente formati. Gli sferoidi di buona qualità hanno dimensioni, compattezza e rotondità uniformi.
- Trasferire gli sferoidi in bioreattori equilibrati riempiti con 5 ml di terreni di crescita freschi. Dopo aver trasferito gli sferoidi, riempire completamente il bioreattore con mezzi di crescita freschi.
- Posizionare il bioreattore nell'incubatore clinostat e regolare la velocità di rotazione a 10-11 giri / min.
- Scambia i supporti di crescita ogni 2-3 giorni rimuovendo 10 ml di vecchi supporti e sostituendoli con 10 ml di supporti freschi.
- Regola la velocità di rotazione in base alla crescita sferoidale, aumentando man mano che gli sferoidi crescono in dimensioni e numero.
- Dopo 18 giorni in coltura, gli sferoidi sono pronti per il trattamento e/o la raccolta
4. Trattamento e raccolta degli sferoidi
NOTA: In questo protocollo, gli sferoidi HepG2/C3A sono trattati con butirrato di sodio (NaBut) e succinato di sodio (NaSuc) per valutare i livelli di segni istonici contenenti acetilazione e succinilazione, rispettivamente.
- Preparare i substrati di crescita con l'appropriata concentrazione di lavoro del composto (ad esempio, 20 mM di NaBut o 10 mM NaSuc). Scambiare i media nel bioreattore con i media trattati.
NOTA: per stabilire una condizione di controllo, raccogliere abbastanza sferoidi per gli esperimenti prima di aggiungere il trattamento o designare un bioreattore per gli sferoidi non trattati. - Raccogliere gli sferoidi per l'analisi proteomica dopo un tempo di trattamento sufficiente (ad esempio, da 48 ore a 1 settimana per il trattamento con NaSuc o 48-72 ore per il trattamento con NaBut).
NOTA: Per l'estrazione degli istoni utilizzando questo protocollo, sono stati raccolti da sei a otto sferoidi contenenti circa 1 x 106 cellule.- Rimuovere 3-5 ml di media dal bioreattore attraverso la porta superiore.
- Aprire la porta anteriore e utilizzare una punta del foro larga 1 mL per rimuovere gli sferoidi e posizionarli in tubi microcentrifuga.
- Centrifugare gli sferoidi a 100 x g per 5 minuti e scartare i mezzi.
NOTA: il supporto nel bioreattore può essere cambiato e il bioreattore può essere restituito all'incubatore per ulteriori tempi di trattamento o recupero. - Lavare gli sferoidi con 200 μL di HBSS per rimuovere l'FBS. Centrifugare a 100 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
NOTA: gli sferoidi possono essere conservati a -80 oC fino all'elaborazione.
5. Estrazione degli istoni
NOTA: I numerosi residui di aminoacidi basici presenti negli istoni permettono loro di interagire strettamente con il DNA, che ha una spina dorsale di acido fosforico. Poiché gli istoni sono alcune delle proteine più basiche nel nucleo, quando vengono estratti con acido solforico ghiacciato (0,2 M H2SO4) c'è una contaminazione minima. Le proteine non istoniche precipiteranno in acido forte. L'acido tricloroacetico altamente concentrato (TCA) diluito ad una concentrazione finale del 33% viene successivamente utilizzato per precipitare gli istoni dall'acido solforico. Conservare tutti i campioni, le provette e i reagenti sul ghiaccio per l'intera estrazione degli istoni.
- Aggiungere cinque volumi (~ 100 μL) di freddo 0,2 M H2SO4 al pellet della cella (~ 10-20 μL) e pipettare su e giù per interrompere il pellet e rilasciare istoni.
- Incubare tubi per un massimo di 4 ore a rotazione costante o agitazione a 4 oC.
NOTA: Per i campioni risospesi che hanno un volume superiore a 500 μL, è sufficiente un'incubazione di 2 ore per estrarre gli istoni (un'incubazione più lunga può comportare l'estrazione di altre proteine nucleari di base). Per i campioni risospesi con un volume inferiore a 200 μL, è necessaria un'incubazione di 4 ore per una migliore resa. - Centrifugare a 3.400 x g per 5 min a 4 °C. Raccogliere il surnatante in un nuovo tubo e scartare il pellet in un secondo momento.
- Aggiungere TCA concentrato a freddo in modo tale che costituisca un finale 25%-33% v/v (ad esempio, 40-60 μL di TCA freddo: 120 μL di surnatante) e mescolare invertendo il tubo alcune volte.
- Incubare tubi per almeno 1 ora a rotazione costante o agitazione a 4 oC.
NOTA: per i pellet di partenza di dimensioni più piccole, si consiglia un'incubazione notturna. - Centrifugare a 3.400 x g per 5 min a 4 oC. Scartare il surnatante mediante pipettaggio. Aspirare attentamente il surnatante; non toccare i lati del tubo o del pellet.
NOTA: gli istoni si depositano su entrambi i lati e sul fondo del tubo. Il pellet bianco insolubile formato nella parte inferiore del tubo contiene principalmente proteine non istoniche e altre biomolecole. - Lavare il tubo (pareti e pellet) con acetone freddo + 0,1% HCl utilizzando una pipetta Pasteur in vetro (~ 500 μL / tubo).
- Centrifugare a 3.400 x g per 5 minuti a 4 oC. Scartare il surnatante capovolgendo il tubo.
- Lavare il tubo (pareti e pellet) con acetone freddo al 100% utilizzando una pipetta Pasteur in vetro (~ 500 μL / tubo). Centrifuga a 3.400 x g per 5 min a 4 oC.
- Scartare il surnatante capovolgendo il tubo e la pipetta fuori dall'acetone rimanente. Aprire il coperchio e asciugare all'aria il campione sul banco per ~ 20 minuti.
- Procedere alla propionilazione o conservare i campioni in -80 oC fino all'uso.
6. Primo ciclo di derivatizzazione
NOTA: L'uso della tripsina per digerire le proteine istoniche porta a peptidi eccessivamente piccoli che sono difficili da identificare utilizzando configurazioni proteomiche tradizionali. Per questo motivo, l'anidride propionica viene utilizzata per derivare chimicamente i gruppi ɛ-amminici dei residui di lisina non modificati e monometilici. Questo limita la proteolisi della tripsina ai residui di arginina C-terminale. Per i campioni in piastre a 96 pozzetti, si raccomanda l'uso di pipette e serbatoi multicanale per il prelievo dei reagenti (Figura 2A). La derivatizzazione viene eseguita anche dopo la digestione per etichettare gli N-termini liberi dei peptidi aumentando l'idrofobicità peptidica e quindi la ritenzione cromatografica in fase inversa.
- Sospendere i campioni in 20 μL di acetonitrile al 15%-20% in bicarbonato di ammonio da 100 mM (pH 8,0). Vortice per 15 s, e poi spin down a 1.000 x g per 30 s.
- Se ci sono otto o più campioni, trasferire ogni campione risospeso in una piastra a 96 pozzetti.
NOTA: se i campioni non sono stati trasferiti su una piastra a 96 pozzetti, è possibile utilizzare una pipetta a canale singolo nei passaggi 6.3-6.7, 7.1-7.5 e 8.1-8.5. - Sotto il cofano, aggiungere 2 μL di anidride propionica usando una pipetta multicanale. Mescolare pipettando su e giù 5x.
- Aggiungere rapidamente 10 μL di idrossido di ammonio utilizzando una pipetta multicanale. Mescolare pipettando su e giù 5x.
NOTA: L'acido propionico è un prodotto della reazione tra anidride propionica e ammine libere da peptidi e può ridurre il pH del campione. Il pH 8 può essere ristabilito aggiungendo idrossido di ammonio al campione con un rapporto di 1:5 (v/v). - Assicurarsi che il pH sia 8 utilizzando la carta di prova del pH. Se il pH < 8, regolare aggiungendo 1 μL di idrossido di ammonio. Se il pH > 8, regolare aggiungendo 1 μL di acido formico o acetico. Quando il pH > 10, è possibile l'etichettatura di altri residui di aminoacidi con pKa più elevato.
- Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Ripetere i passaggi 6.3-6.6. Un doppio ciclo di propionilazione degli istoni garantisce un'efficienza di reazione quasi completa.
- Piastra asciutta in velocità sottovuoto fino a quando tutti i pozzetti sono completamente asciutti (~ 9 h).
- Procedere alla digestione della tripsina o conservare i campioni a -80 oC fino all'uso.
7. Digestione degli istoni
NOTA: gli istoni vengono digeriti in peptidi usando la tripsina, che taglia sul lato carbossilico dei residui di arginina e lisina. Tuttavia, poiché la propionilazione modifica i residui di lisina, solo i residui di arginina vengono scissi (Figura 2B).
- Preparare la soluzione di tripsina (25 ng/μL in 50 mM NH4HCO3, pH 8,0). Aggiungere 20 μL di tripsina (500 ng) a ciascun campione.
- Per preparare la soluzione NH4HCO3 da 50 mM, diluire la soluzione 100 mM NH4HCO3 1:1 v/v con acqua di grado HPLC.
- Assicurarsi che il pH sia 8 utilizzando la carta di prova del pH. Se il pH < 8, regolare aggiungendo 1 μL di idrossido di ammonio. Se il pH > 8, regolare aggiungendo 1 μL di acido formico o acetico.
- Digerire a temperatura ambiente durante la notte o incubare a 37 oC per 6-8 ore.
- Se possibile, controllare il pH dopo ~ 3 ore di digestione, in quanto potrebbe essere diminuito. Se il pH < 8, regolare aggiungendo 1 μL di idrossido di ammonio.
- Aggiungere altri 5 μL di 50 ng/μL di soluzione di tripsina (250 ng) e continuare la digestione.
- Procedere al secondo ciclo di propionilazione o conservare i campioni a -80 oC fino all'uso.
8. Derivatizzazione del peptide N-termini
NOTA: La propionilazione dei peptidi istonici al loro N-terminus migliora la ritenzione dei peptidi più corti mediante cromatografia liquida in fase inversa (ad esempio, amminoacidi 3-8 dell'istone H3), poiché il gruppo propionilico aumenta l'idrofobicità peptidica.
- Sotto il cofano, aggiungere 2 μL di anidride propionica usando la pipetta multicanale. Mescolare pipettando su e giù 5x.
- Aggiungere rapidamente 10 μL di idrossido di ammonio utilizzando la pipetta multicanale. Mescolare pipettando su e giù 5x.
NOTA: L'acido propionico è un prodotto della reazione tra anidride propionica e ammine libere da peptidi e può ridurre il pH del campione. Il pH 8 può essere ristabilito aggiungendo idrossido di ammonio al campione con un rapporto di 1:5 (v/v). - Assicurarsi che il pH sia 8 utilizzando la carta di prova del pH. Se il pH < 8, regolare aggiungendo 1 μL di idrossido di ammonio. Se il pH > 8, regolare aggiungendo 1 μL di acido formico o acetico. Quando il pH > 10, è possibile l'etichettatura di altri residui di aminoacidi con pKa più elevato.
- Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Ripetere i passaggi da 8.1 a 8.4. Un doppio ciclo di propionilazione degli istoni garantisce un'efficienza di reazione quasi completa.
- Piastra asciutta in velocità sottovuoto fino a quando tutti i pozzetti sono completamente asciutti (~ 9 h).
- Procedere alla fase di desalinizzazione o conservare i campioni a -80 oC fino all'uso.
9. Dissalazione e pulizia del campione
NOTA: i sali presenti nel campione interferiscono con l'analisi della spettrometria di massa. I sali sono anche ionizzati durante l'elettrospray e possono sopprimere i segnali dai peptidi. I sali possono formare addotti ionici sui peptidi, che fanno sì che il peptide addotto abbia una massa diversa. Ciò riduce l'intensità del segnale del peptide e impedisce una corretta identificazione e quantificazione. La configurazione per la desalinizzazione è illustrata nella Figura 2C.
- Iniziare a miscelare la resina HLB (50 mg/mL in acetonitrile al 100%) su una piastra magnetica.
- Assicurarsi che ci sia una piastra di raccolta a 96 pozzetti posizionata sotto la piastra filtrante in polipropilene a 96 pozzetti per raccogliere il flusso attraverso.
- Aggiungere 70 μL di sospensione HLB per pozzetto alla piastra filtrante. Accendere delicatamente il vuoto per evitare schizzi. Scartare il flusso attraverso.
- Lavare la resina con 100 μL di 0,1% TFA. Accendere delicatamente il vuoto per evitare schizzi. Scartare il flusso attraverso.
- Sospendere ogni campione in 100 μL di TFA allo 0,1%. Controllare il pH; dovrebbe essere ~ 2-3.
- Caricare ogni campione in ogni pozzetto. Accendere delicatamente l'aspirapolvere per evitare schizzi. Scartare il flusso attraverso.
- Lavare con 100 μL 0,1% TFA. Accendere delicatamente l'aspirapolvere per evitare schizzi. Scartare il flusso attraverso.
- Sostituire la piastra di raccolta con una nuova piastra di raccolta a 96 pozzetti.
- Aggiungere 60 μL di acetonitrile al 60% / TFA allo 0,1% per pozzetto. Accendere delicatamente l'aspirapolvere per evitare schizzi. Raccogliere il flusso attraverso e asciugare in un vuoto di velocità.
- Procedere a LC-MS/MS o conservare i campioni a -80 oC fino all'uso.
10. Analisi del peptide istonico mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa
- Preparare le fasi mobili per l'esecuzione sulla cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Fase mobile A (MPA): 2% acetonitrile di grado HPLC + 0,1% di acido formico. Fase B mobile (MPB): 80% acetonitrile di grado HPLC + 0,1% di acido formico.
- Programmare il metodo HPLC come segue: (1) 4%-34% MPB oltre 30 min; (2) 34%-90% MPB oltre 5 min; e (3) isocratico 90% MPB per 5 min. Utilizzare le seguenti proprietà consigliate della colonna: materiale di imballaggio C18 3 μm, diametro interno 75 μm, lunghezza 20-25 cm. Impostare la portata a 250-300 nL/min per nanocolonne con diametro interno di 75 μm.
- Nel caso in cui l'HPLC non sia programmato per automatizzare l'equilibratura della colonna prima del caricamento del campione, includere (4) 90%-4% MPB su 1 min e (5) isocratico 4% MPB su 10 min.
- Programmare il metodo di acquisizione MS.
- Assicurarsi che lo strumento esegua una scansione MS completa all'inizio di ogni ciclo di lavoro. Si raccomanda una strumentazione ad alta risoluzione (ad esempio, orbitrap o analizzatori di tempo di volo), grazie alla precisione di massa che può essere utilizzata durante l'estrazione del segnale. Tuttavia, la strumentazione a bassa risoluzione può anche essere utilizzata come descritto in precedenza27,28.
- Assicurarsi che la scansione MS completa sia seguita da 16 eventi di scansione MS/MS, ciascuno con una larghezza di isolamento di 50 m/z, che coprono l'intervallo m/z compreso tra 300 e 1100. Ad esempio, la prima scansione dovrebbe isolare i segnali a 300-350 m/z, la seconda a 350-400 m/z, ecc. Se possibile, acquisire scansioni MS / MS anche in alta risoluzione, ma è sufficiente una risoluzione inferiore rispetto alla scansione MS completa (a causa delle masse più piccole di ioni frammento rispetto agli ioni intatti).
- Il metodo HPLC genererà segnali cromatografici con larghezze di picco di ~3-40 s; per garantire una corretta quantificazione del segnale, assicurarsi che lo spettrometro di massa esegua almeno 10 cicli di lavoro per picco cromatografico (cioè un ciclo di lavoro di 3 s o più veloce).
- Se si utilizza un analizzatore di massa in stile trapping (orbitrap, trappola ionica), assicurarsi che il limite di tempo di iniezione ionica sia impostato su <200 ms; per altri analizzatori (quadrupolo, tempo di volo), questo non è un problema a causa del loro tempo di scansione più veloce. Potrebbe essere necessario un test preliminare.
NOTA: Maggiori dettagli sui metodi ms per l'analisi dei peptidi istonici sono disponibili nei seguenti riferimenti 27,28,29.
- Campione risospeso in 10 μL di MPA, che corrisponde a ~1 μg/μL di campione di istone digerito. L'esatta quantità di carico non è critica (anche non banale da valutare) se tutti i campioni del lotto vengono caricati utilizzando diluizioni e volumi simili.
- Caricare 1 μL di campione sulla colonna HPLC.
- Eseguire il metodo LC-MS/MS programmato nei passaggi 10.1-10.3.
11. Analisi dei dati
- Importare i file di dati grezzi MS in un software progettato per eseguire l'integrazione dell'area di picco.
NOTA: EpiProfile 30,31 è utilizzato nello studio attuale ed è generalmente raccomandato, in quanto è ottimizzato per l'estrazione affidabile dell'area di picco di peptidi istonici noti. Tuttavia, altri software liberamente disponibili per la cromatografia ionica estratta come Skyline32,33 sono adatti. - Calcola l'abbondanza relativa di un dato peptide (non) modificato come l'area di un singolo peptide divisa per l'area totale del peptide in tutte le sue forme modificate. Software come EpiProfile30,31 contengono già librerie di peptidi per l'estrazione del segnale. Altrimenti, genera una libreria di peptidi di interesse manualmente o tramite l'identificazione peptidica utilizzando pipeline proteomiche di routine.
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Representative Results
In questo protocollo, gli sferoidi HepG2/C3A sono stati trattati con 20 mM NaBut e 10 mM NaSuc, entrambi i quali hanno influenzato i livelli globali di PTM istonici (Figura 3A). I PTM istonici sono stati quindi identificati e quantificati a livello di singolo residuo tramite acquisizione ms/MS (Figura 3B).
Quando i campioni vengono eseguiti in repliche, è possibile eseguire analisi statistiche per valutare l'arricchimento del cambiamento di piega di un PTM tra i campioni, nonché la riproducibilità dell'osservazione. I dati mostrati dimostrano che i peptidi modificati con acetilazioni sono arricchiti in sferoidi trattati con NaBut vs. controllo (Figura 3C), mentre i campioni trattati con NaSuc hanno una maggiore abbondanza relativa di peptidi istonici modificati con succinilazione di lisina (Figura 3D). Questi calcoli sono stati eseguiti in un programma di fogli di calcolo come dettagliato in una pubblicazione separata34. Un aumento complessivo di una data modifica istonica può essere meglio rappresentato nei grafici radar, dove osservare una maggiore abbondanza globale di una certa modifica diventa più intuitivo, pur mantenendo informazioni dettagliate sui siti di modifica analizzati (Figura 3E,F).
Questo protocollo genera un peptide dai residui di amminoacidi H3 istonici 9-17, che includono i residui frequentemente modificati K9, S10 e K14. I dati mostrati indicano che il trattamento con NaBut aumenta i livelli di H3K14ac, ma solo su istoni co-modificati con H3K9me2 e non H3K9me3 (Figura 4A). La frequenza di coesistenza tra due modifiche può essere rappresentata in modo più intuitivo come un grafico ad anello, dove i nodi rappresentano le singole modifiche mentre lo spessore delle linee del connettore rappresenta la frequenza di coesistenza tra i due PTM (Figura 4B). A volte, la frequenza di coesistenza non è influenzata, ma i dati rappresentati come grafici a barre potrebbero essere fuorvianti. Ad esempio, i dati rappresentati nella Figura 4A indicano che la combinazione H3K9me2K14ac è più abbondante nel trattamento naBut che nel controllo. Questo è corretto, ma questa data combinazione è la più frequente indipendentemente dal trattamento. La Figura 4B mostra chiaramente che H3K9me2K14ac e H3K9me3K14ac sono i modelli combinatori più frequenti indipendentemente dal trattamento (spessore della linea), ma che i livelli globali di H3K14ac (nodo) sono ciò che sta veramente cambiando nell'esperimento.
Questo protocollo genera un peptide dai residui di istone H4 4-17, che include residui modificabili nelle posizioni K5, K8, K12 e K16 (principalmente mediante acetilazione). Quando si confrontano il controllo e il trattamento NaBut, è possibile osservare un aumento delle combinazioni di acetilazioni rappresentando i dati come, ad esempio, le nuvole di parole (Figura 4C). Questa rappresentazione evidenzia chiaramente che la versione non modificata dell'istone H4 è più abbondante nel campione di controllo, mentre gli sferoidi trattati con NaBut sono arricchiti in proteoforme H4 acetilate doppiamente, triplicate e quadruplicate. Tuttavia, le nuvole di parole sono limitate nella visualizzazione dei valori esatti; l'abbondanza relativa di un codice istonico dovrebbe essere de-contorta dalla dimensione del testo, che può essere stimata in modo impreciso. Pertanto, i diagrammi di Venn o equivalenti più moderni come la rappresentazione UpSetR35 possono essere utilizzati per mostrare l'esatta quantificazione dei PTM istonici coesistenti (Figura 4D,E). I dati mostrati evidenziano ancora una volta che combinazioni selezionate di acetilazioni sull'istone H4 sono relativamente più abbondanti nel trattamento con NaBut rispetto al controllo.
Figura 1: Flusso di lavoro per l'analisi dei peptidi istonici degli sferoidi 3D. Le cellule HepG2 / C3A vengono prima coltivate in coltura 2D fino a raggiungere l'80% di confluenza. Le cellule vengono quindi trasferite in un bioreattore equilibrato e poste all'interno dell'incubatore clinostat dove ruoteranno a 10-11 giri / min per formare sferoidi. Dopo 18 giorni, gli sferoidi vengono trattati con NaBut da 20 mM o 10 mM NaSuc e vengono raccolti dopo i punti temporali corrispondenti. I nuclei sono isolati dalle cellule e l'estrazione degli istoni viene eseguita con 0,2 M H2SO4. La derivatizzazione degli istoni viene quindi eseguita con anidride propionica prima e dopo la digestione della tripsina per garantire la ritenzione dei peptidi corti risultanti mediante cromatografia liquida. I campioni vengono desaltati e quindi eseguiti utilizzando il metodo LC-MS/MS menzionato nel passaggio 10 e i dati risultanti vengono analizzati come descritto nel passaggio 11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Configurazione per le fasi di propionilazione e dissalazione. (A) La propionilazione viene eseguita in una cappa aspirante e tutti i componenti sono disposti in modo che i passaggi possano essere eseguiti in rapida successione. (B) Schema del primo ciclo di propionilazione, digestione della tripsina e secondo ciclo di propionilazione sulla coda dell'istone H3.1. (C) La desalinizzazione viene eseguita sul banco utilizzando un collettore per vuoto a 96 pozzetti e una piastra filtrante in polipropilene a 96 pozzetti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rappresentazione delle singole modificazioni istoniche. (A) Grafico a barre che mostra l'abbondanza relativa di modificazioni globali comuni degli istoni negli sferoidi di controllo e trattati (20 mM NaBut o 10 mM NaSuc) HepG2/C3A. (B) Grafico a barre che mostra l'abbondanza di PTM a singolo istone presenti sui residui 9-17 del peptide istone H3 (KSTGGKAPR) negli sferoidi HepG2/C3A di controllo e trattati (20 mM NaBut o 10 mM NaSuc). (C,D) Grafici vulcanici che mostrano il cambiamento di piega e il significato dell'espressione differenziale dei PTM peptidici istonici dopo il trattamento con 20 mM NaBut (C) o 10 mM NaSuc (D). I punti blu e verde evidenziati rappresentano rispettivamente residui acetilati e succinilati. (E,F) Grafici radar che mostrano l'abbondanza di acetilazione (E) o succinilazione (F) di un singolo peptido istone dopo il trattamento con 20 mM NaBut o 10 mM NaSuc rispettivamente rispetto al controllo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rappresentazione delle modificazioni istoniche coesistenti. (A) Grafico a barre che mostra l'abbondanza di PTM di istono combinatorio presenti sui residui 9-17 dell'istone H3 (KSTGGKAPR) in controllo e trattati (20 mM NaBut o 10 mM NaSuc) sferoidi HepG2/C3A. (B) Grafici ad anello che mostrano la relazione tra PTM di istono combinatorio sui residui 9-17 dell'istone H3 (KSTGGKAPR) in controllo e sferoidi HepG2/C3A trattati (20 mM NaBut). L'intensità del colore del nodo corrisponde all'abbondanza di un singolo PTM all'interno del suo gruppo di trattamento, mentre lo spessore della linea corrisponde alla frequenza di co-occorrenza ptm. (C) Nuvole di parole che mostrano la frequenza dei PTM di istono combinatorio sui residui di istone H4 in controllo e sferoidi HepG2/C3A trattati (20 mM NaBut). La dimensione del testo corrisponde all'abbondanza del PTM combinatorio specificato. (D,E) Diagramma di Venn che rappresenta la frequenza delle modifiche coesistenti sui residui peptidici H4 istonici 4-17 nei campioni di controllo e 20 mM NaBut trattati. I dati vengono visualizzati utilizzando ShinyApp UpSetR35. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella complementare 1: Elenco dei peptidi rilevati utilizzando questo protocollo. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
L'analisi dei PTM istonici è fondamentalmente diversa dalla tipica pipeline di analisi proteomica. La maggior parte dei PTM istonici hanno ancora funzioni biologiche enigmatiche; di conseguenza, annotazioni come Gene Ontology o database di pathway non sono disponibili. Esistono diverse risorse che associano le modificazioni istoniche all'enzima responsabile della loro catalisi o proteine contenenti domini che legano questi PTM (ad esempio, HISTome36). Inoltre, è possibile speculare sullo stato generale della cromatina quando i livelli globali di PTM istonici sono regolati. Ad esempio, un aumento complessivo dell'acetilazione degli istoni o di altre acilazioni come la succinilazione è normalmente associato alla decon condensazione della cromatina37,38.
L'analisi della SM fornisce informazioni più dettagliate su queste modifiche, come la loro esatta localizzazione sulla sequenza di amminoacidi. In questo protocollo, l'acquisizione di MS/MS viene utilizzata per identificare e quantificare i PTM istonici, che possono essere fondamentali per l'interpretazione biologica. Ad esempio, la trimetilazione sulla lisina 4 dell'istone H3 (H3K4me3) è arricchita sui promotori dei geni39 trascritti attivamente, mentre la stessa modificazione sulla lisina 9 (H3K9me3) parametri di riferimento costitutivi dell'eterocromatina40. Le modificazioni istoniche sono attualmente utilizzate come biomarcatori in malattie specifiche; in quanto tale, l'analisi degli istoni può essere utilizzata per studiare la patologia della malattia oltre alla risposta al trattamento (ad esempio, con farmaci epigenetici)41,42.
È più difficile rappresentare visivamente le interazioni tra più PTM rispetto a singoli PTM. Mentre i grafici esistenti come i grafici ad anello possono mostrare la frequenza di coesistenza di due PTM, non possono rappresentare la frequenza di coesistenza tra più di due PTM alla volta, poiché ciò richiederebbe una rappresentazione tridimensionale della rete. Per questo motivo, altre rappresentazioni potrebbero essere più appropriate per evidenziare i cambiamenti nei codici istonici quando vengono considerati tre o più PTM. In generale, diversificare la rappresentazione dei dati offre maggiori possibilità di osservare cambiamenti significativi tra i campioni. Questo protocollo presenta esempi di diverse illustrazioni per la visualizzazione di regolamenti di PTM istonici e PTM coesistenti.
Sebbene questo protocollo generi peptidi istonici relativamente piccoli a causa della digestione della tripsina (circa 4-20 amminoacidi), peptidi selezionati contengono più residui modificabili. L'analisi di questi peptidi consente la quantificazione delle frequenze di coesistenza dei PTM, che potrebbero rivelare informazioni importanti su quali segni di istoni combinatori sono regolati in un determinato set di dati. In particolare, non ci sono passaggi durante la preparazione del campione in cui viene eseguita la quantificazione degli istoni. Ci sono quattro ragioni per questo: (1) la tripsina ha una vasta gamma di attività e può essere utilizzata in una vasta gamma di rapporti enzima-campione (1: 10-1: 200). Anche quando la resa sperimentale degli istoni estratti differisce da quella prevista, non sono stati riscontrati problemi di digestione utilizzando questo protocollo. (2) Questo protocollo è destinato a piccole quantità di materiale, in cui la quantificazione degli istoni potrebbe essere difficile da eseguire a causa della mancanza di sensibilità. (3) Utilizzando una concentrazione costante di tripsina indipendentemente dalla quantità di materiale istonico, possiamo usare peptidi trittici (come la tripsina autolizza) per confrontare le prestazioni cromatografiche. Lievi variazioni nella resa del campione saranno normalizzate dal software di analisi dei dati (fase 11), che utilizza tutti i segnali (non) modificati per un dato peptide come denominatore durante il processo di normalizzazione. (4) Infine, una drammatica sottostima della quantità di materiale di partenza potrebbe creare problemi di sovraccarico della colonna cromatografica nanoLC. Tuttavia, l'esecuzione del passaggio di desalinizzazione come indicato in questo protocollo impedisce che si verifichi questo problema. In caso di quantità eccessive di materiale di partenza (ad esempio >100 μg), il limite della capacità della resina dissalazione sarà superato e qualsiasi campione in eccesso verrà lavato via durante la fase di carico.
È importante notare che non tutti i peptidi rilevati da questa analisi sono stati evidenziati in Figura 3 e Figura 4. Inoltre, non tutte le modifiche degli istoni sono rilevabili utilizzando questi specifici metodi di preparazione e acquisizione del campione. Viene fornita una tabella supplementare 1 per elencare tutti i segnali peptidici che vengono estratti utilizzando la pipeline descritta. Alcune modifiche ben note non sono elencate nella tabella, poiché la preparazione del campione descritta non è adatta per il loro rilevamento. Esempi notevoli sono i peptidi ubiquitinilati degli istoni H2A e H2B e la fosforilazione dell'istone H2A. X (un marcatore generale di danno al DNA). Questo perché la propionilazione dei peptidi associati a questi PTM porta a peptidi eccessivamente lunghi, che non sono adatti per la cromatografia C18 e il metodo di rilevamento della SM descritto. Altre modificazioni che sono presenti in letteratura ma non presenti nella Tabella Supplementare 1 sono modifiche a bassissima abbondanza (attualmente rilevabili solo utilizzando la SM dopo strategie di arricchimento come l'immunoprecipitazione o il trattamento cellulare specifico), come la lattilazione43 o la sierotonilazione44. Anche le modificazioni istoniche con spostamenti di massa imprevedibili causati dalla polimerizzazione o dal legame covalente eterogeneo alla sequenza istonica non sono considerate (ad esempio, poli-ADP-ribosilazione45 e glicazione46). Inoltre, questo protocollo utilizza NaSuc e NaBut per trattare gli sferoidi HepG2 / C3A, ma può essere modificato per l'uso con altri farmaci / modificatori epigenetici e tipi di colture cellulari 2D / 3D.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Il laboratorio Sidoli riconosce con gratitudine la Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck e l'NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA solution | Gibco | 25300054 | |
| 0.5-20 µL pipet tips | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 µL multi-channel pipette | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
| 10 mL syringe | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
| 10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
| 1000 µL pipet tips | Rainin | 30389164 | |
| 18 G syringe needle | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | 3" length, 0.05" diameter |
| 200 µL multi-channel pipette | Corning | 4082 | |
| 2-200 µL pipet tips | BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
| 24-well ultra-low attachment microplate | Corning | 07-200-602 | |
| 75 cm2 U-shaped cell culture flask | Corning | 461464U | Untreated, with vent cap |
| 96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | Acetone should be used cold |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
| Ammonium hydroxide solution | Fisher Scientific | AC423300250 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioreactor for 3D cell culture |
| ClinoStar | CelVivo | N/A | Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture |
| Control unit | CelVivo | N/A | Tablet for ClinoStar settings |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Fume hood | Mott | N/A | Model 7121000 |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile |
| Glutagro supplement | Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananyl-L-glutamine |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-CI | 100X solution |
| Oasis HLB resin | Waters | 186007549 | Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
| Oro-Flex I polypropylene filter plate | Orochem | OF1100 | 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | 100X solution |
| pH paper | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | 0-13 pH test paper |
| Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
| Polymicro capillary | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD |
| Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile | Fisher Scientific | 1367549 | |
| Propionic anhydride | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.0003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size |
| Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Nutator Mixer 1105 |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium butyrate | Thermo Scientific | A11079 | |
| Sodium succinate dibasic | Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
| SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
| SpeedVac vacuum concentrator (96-well) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterile hood | Thermo Scientific | 1375 | Class II, Type A2 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker Analyzed ACS reagent |
| Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | Resuspend 100% w/v in HPLC grade water |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | Sequencing grade |
| Vacuum manifold 96-well | Millipore | MAVM0960R | |
| Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| Wide bore pipet tips 1000 µL | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
| Wide bore pipet tips 200 µL | Axygen | 14-222-730 (Fisher Scientific) |
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