Summary
이 프로토콜은 입체 세포 배양 시스템이 거의 생리적 인 상태에서 염색질 변형을 모델링, 치료 및 분석하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 설명합니다.
Abstract
포유동물 세포의 편평한 배양은 세포 생리학을 이해하기 위해 시험관내 접근법으로 널리 사용되지만, 이 시스템은 부자연스럽게 빠른 세포 복제로 인해 고체 조직을 모델링하는데 한계가 있다. 이것은 성숙한 크로마틴을 모델링 할 때 특히 도전적인데, 빠른 복제 세포는 종종 DNA 복제에 관여하고 이질적인 폴리 플로이드 집단을 가지고 있기 때문입니다. 아래는 3차원(3D) 세포 배양 시스템을 사용하여 정동작 염색질 변형을 모델링, 치료 및 분석하기 위한 워크플로우입니다. 이 프로토콜을 사용하여, 간세포 암종 세포주는 활성 영양소 확산 및 낮은 전단력을 제공하는 인큐베이터에서 재현 가능한 3D 구상체로 성장한다. 소듐 부티레이트와 소듐 숙시네이트에 의한 처리는 각각 히스톤 아세틸화 및 숙시닐화의 증가를 유도하였다. 히스톤 아세틸화 및 숙시닐화 수준의 증가는 보다 개방된 크로마틴 상태와 연관된다. 그런 다음 구상체는 세포 핵의 분리를 위해 수집되며, 히스톤 단백질은 번역 후 변형의 분석을 위해 추출됩니다. Histone 분석은 탠덤 질량 분광법과 온라인으로 결합 된 액체 크로마토그래피를 통해 수행되고 사내 계산 파이프 라인이 뒤 따릅니다. 마지막으로, 조합 히스톤 마크의 빈도 및 발생을 조사하기 위한 데이터 표현의 예가 도시된다.
Introduction
19세기 후반부터 세포 배양시스템은 인체 1,2 외부의 세포의 성장과 발달을 연구하기 위한 모델로 사용되어 왔다. 그들의 사용은 또한 조직과 기관이 건강한 상황과 병든 맥락에서 어떻게 기능하는지 연구하기 위해 확장되었습니다 1,3. 현탁액 세포 (예를 들어, 혈액 세포)는 페트리 접시 또는 플라스크에서 매끄럽고 상호 교환 가능하게 성장하며, 생체 내에서 3차원 (3D) 구조로 조립되지 않는다. 고체 기관으로부터 유래된 세포는 2차원(2D) 또는 3D 배양 시스템에서 성장할 수 있다. 2D 배양에서, 세포는 평평한 표면 2,4에 부착되는 단층에서 성장한다. 2D 세포 배양 시스템은 지수 성장 및 빠른 배가 시간, 전형적으로 24 h 내지 수일5를 특징으로 한다. 3D 시스템의 세포는 성장하여 조직과 유사한 대기업을 모델링하는 복잡한 세포 - 세포 상호 작용을 형성하며, 배가시키는 시간이 1 개월 또는 그 이상에 도달 할 수있는 동적 평형에 도달 할 수있는 능력을 특징으로합니다5.
이 논문에서 제시된 것은 감소된 중력을 시뮬레이션하는 회전 세포 배양 시스템에서 3D 구상체를 성장시키기 위한 혁신적인 방법론이다6. 이것은 NASA가 1990 년대7에 도입 한 세포 배양 시스템의 단순화 된 유도체입니다. 이 접근법은 회전 플라스크와 같은 기존 방법에서 발생하는 전단력을 최소화하고 스페로이드 재현성을 증가시킵니다6. 또한, 회전 생물반응기는 활성 영양소 확산을 증가시켜 배지 교환이 비실용적 인 매달린 방울 세포 배양과 같은 시스템에서 발생하는 괴사 형성을 최소화합니다6. 이런 식으로, 세포는 대부분 방해받지 않고 성장하여 조직에서 성장하는 세포와 관련된 구조적 및 생리적 특성의 형성을 허용합니다. 이러한 방식으로 배양된 C3A 간세포(HepG2/C3A)는 초구조적 소기관을 가졌을 뿐만 아니라 생체내1,2에서 관찰된 수준에 필적하는 양의 ATP, 아데닐레이트 키나제, 요소 및 콜레스테롤을 생성하였다. 또한, 2D 대 세포 배양 시스템에서 성장한 세포는 .3D이한 유전자 발현 패턴(8)을 나타낸다. 3D 구상체로 성장한 C3A 간세포의 유전자 발현 분석은 이들 세포가 간 기능을 조절하는 주요 경로에 관여하는 유전자뿐만 아니라 광범위한 간 특이적 단백질을 발현한다는 것을 보여주었다8. 이전의 간행물은 2D 배양물에서 기하급수적으로 성장하는 세포의 프로테옴과 3D 스페로이드 배양물에서 동적 평형을 이루는 세포 사이의 차이를 입증했다5. 이러한 차이에는 세포 신진 대사가 포함되며, 이는 차례로 세포의 구조, 기능 및 생리학에 영향을 미칩니다5. 2D 배양물에서 성장한 세포의 프로테옴은 세포 복제에 관여하는 단백질에서 더 풍부해진 반면, 3D 구상체의 프로테옴은 간 기능성에서 더욱 풍부해졌다5.
3D 구상체로 성장한 세포의 느린 복제 속도는 크로마틴 상태 및 변형과 관련된 특정 현상을보다 정확하게 모델링합니다 (예 : 히스톤 클리핑9). 히스톤 클리핑은 히스톤 N 말단 꼬리의 일부의 단백질 분해 절단을 일으키는 비가역적 히스톤 번역 후 변형 (PTM)이다. 그것의 생물학적 기능은 여전히 논의 중이다10,11,12,13, 일차 세포 및 간 조직에서의 그것의 존재는 구상체로 성장한 HepG2 / C3A 세포에 의해 모델링되지만 평평한 세포9는 아닙니다. 이것은 크로마틴 상태 및 변형이 주로 유전자에 대한 접근성을 조절함으로써 DNA 판독을 조절하고 따라서 발현14를 조절하기 때문에 중요합니다. 히스톤 PTM은 히스톤이 조립되는 뉴클레오솜의 순 전하에 영향을 미침으로써 크로마틴 상태에 직접적으로 영향을 미치거나, 크로마틴 작가, 독자 및 지우개(14)를 모집함으로써 간접적으로 영향을 미친다. 현재까지 수백 개의 히스톤 PTM이확인되어 염색질이 DNA16을 해석하기 위해 세포에 의해 사용되는 "히스톤 코드"를 호스팅한다는 가설을 강화했습니다. 그러나, 무수한 PTM 조합(15)의 확인, 및 히스톤 PTM의 조합이 종종 단리된 상태로 존재하는 PTM으로부터 상이한 생물학적 기능을 갖는다는 발견(예를 들어, Fischle, et al.17)은 "히스톤 코드"를 해독하기 위해 더 많은 작업이 필요하다는 것을 강조한다.
현재, 히스톤 PTM 분석은 항체 (예를 들어, 웨스턴 블롯, 면역형광, 또는 크로마틴 면역침전 후 시퀀싱 [ChIP-seq]) 또는 질량 분광법 (MS)을 이용하는 기술에 기초한다. 항체 기반 기술은 높은 감도를 가지며 히스톤 마크의 게놈 전체 국소화에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있지만 조합 18,19,20에 존재하는 희귀 한 PTM 또는 PTM을 연구하는 데 종종 제한적입니다. MS는 단일 및 공존하는 단백질 변형, 특히 히스톤 단백질 18,19,20의 고처리량 및 편향되지 않은 동정 및 정량화에 더 적합하다. 이러한 이유로, 이것 및 몇몇 다른 실험실은 히스톤 펩티드 (상향식 MS), 무손상 히스톤 꼬리 (중간 다운 MS) 및 전장 히스톤 단백질 (하향식 MS)21,22,23의 분석을 위해 MS 파이프 라인을 최적화했습니다.
아래에 자세히 설명 된 것은 HepG2 / C3A 구상체를 재배하고 탠덤 질량 분광법 (nLC-MS / MS)과 온라인으로 결합 된 나노 액체 크로마토그래피를 통해 히스톤 펩티드 분석 (상향식 MS)을 준비하기위한 워크 플로입니다. 2D 세포 배양물을 성장시키고 세포를 수확하여 생물반응기로 옮겨 구상체를 형성하기 시작했습니다 (그림 1). 배양에서 18일 후, 구상체를 소듐 부티레이트 또는 소듐 숙시네이트로 처리하여 히스톤 아세틸화 및 숙시닐화의 상대적 풍부도를 증가시켰다. 특히, 3D 배양물은 유전성 화합물뿐만 아니라 평평한 배양 등가물로 처리 될 수 있습니다. 사실, 최근의 간행물은 3D 배양물에서 세포의 독성학 반응이 2D 편평한 배양24,25에서의 것보다 일차 조직과 더 유사하다는 것을 강조한다. 그런 다음 세포를 지정된 시점에서 수집하고 핵 분리를 수행했습니다. 그 후, 히스톤을 추출하고 트립신 소화 전후에 Garcia et al.26에 의해 처음 개발된 프로토콜에 따라 프로피온성 무수물로 유도체화하였다. 이 절차는 역상 크로마토그래피 (C18)로 온라인 분리 및 MS로 검출하기에 적합한 크기의 펩티드를 생성한다. 마지막으로, 히스톤 펩티드가 확인되고 정량화되었고, 생성된 데이터는 보다 완전한 생물학적 해석을 위해 여러 가지 방법으로 표현되었다.
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Protocol
1. 완충제 및 시약의 제조
- 세포 성장 배지 (HepG2 / C3A 세포 용) : Dulbecco의 변형 이글 배지 (DMEM, 4.5 g / L 포도당 포함)에 태아 소 혈청 (FBS) (10 % v / v), 비 필수 아미노산 (1 % v / v), L- 글루타민 보충제 (1 % v / v) 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (0.5 % v / v)을 첨가하십시오. 성장 배지는 최대 2주 동안 4°C에서 저장된다.
- 200 mM 소듐 부티레이트(NaBut) 용액: 10 mL를 제조하기 위해, 220.18 mg의 NaHowever를 10 mL의ddH2O에 재현탁하여 -20°C에서 1 mL 분취량을 보관한다. 세포 처리 전에, 0.45 mm 시린지 필터를 사용하여 용액을 여과하고, 여과된 용액 1 mL를 20 mM의 작동 농도에 대해 9 mL의 세포 성장 배지에 첨가한다.
- 100 mM 소듐 숙시네이트(NaSuc) 용액: 10 mL를 준비하기 위해, 10 mL의 ddH2O. 1 mL 분취량을 -20°C에서 보관하면서 162.05 mg의 NaSuc을 재현탁한다. 세포 처리 전에, 0.45 mm 시린지 필터를 사용하여 용액을 여과하고, 여과된 용액 1 mL를 10 mM의 작동 농도에 대해 9 mL의 세포 성장 배지에 첨가한다.
- 차가운 0.2 M H2SO4: 1 L를 제조하기 위해, HPLC 등급 물 990 mL에 농축된H2SO4 10 mL를 첨가한다. 4°C에서 보관한다.
- 차가운 아세톤 + 0.1 % 염산 (HCl) : 아세톤에 진한 HCl (0.1 % v / v)을 첨가하십시오. 4°C에서 보관한다.
- 100 mM NH4HCO3 용액, pH 8.0: 1 L를 제조하기 위해, HPLC 등급의 물 1 L에 7.91 g의NH4HCO3를 재현탁시켰다. 50 mL 분취량을 -20°C에서 보관하십시오.
- 0.1 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA) 용액 : HPLC 등급 물에 농축 TFA (0.1 % v / v)를 첨가하십시오. 4°C에서 보관한다.
- 60% 아세토니트릴/0.1% TFA 용액: HPLC 등급 물에 HPLC 등급 아세토니트릴(60% v/v)을 첨가합니다. 그런 다음이 솔루션에 농축 TFA (0.1 % v / v)를 첨가하십시오. 4°C에서 보관한다.
- 2% HPLC 등급 아세토니트릴 + 0.1% 포름산: HPLC 등급 물에 HPLC 등급 아세토니트릴(2% v/v)을 첨가합니다. 그런 다음이 용액에 농축 된 포름산 (0.1 % v / v)을 첨가하십시오.
- 80% HPLC 등급 아세토니트릴 + 0.1% 포름산: HPLC 등급 물에 HPLC 등급 아세토니트릴(80% v/v)을 첨가합니다. 그런 다음이 용액에 농축 된 포름산 (0.1 % v / v)을 첨가하십시오.
2. 3D 배양 시스템의 제조
참고 : 일차 또는 불멸화 된 다른 세포는 다른 배양 특성을 가지므로 구상체의 형성은 세포 유형마다 다를 수 있습니다. 이 프로토콜은 생물 반응기와 혁신적인 3D 세포 배양 시스템을 사용하여 HepG2 / C3A 스페로이드 형성을 위해 확립되었습니다.
- 표준 성장 배지를 사용하여 세포가 80% 합류할 때까지 단층으로 성장시킨다.
- 세포를 HBSS (75cm2 플라스크의 경우 5 mL)로 세척하고, 세포를 5% CO2로 37oC에서 5분 동안 HBSS (1:2 희석액)에 희석된 0.05% 트립신-EDTA 5 mL로 인큐베이션한다.
- 현미경으로 세포 분리를 확인하고 3 mL의 태아 소 혈청 (FBS) 또는 성장 배지 (5 % -10 % FBS 함유)를 첨가하여 트립신을 중화시킵니다.
- 세포 수를 계수하고 세포 현탁액을 희석하여 1 x 106 세포를 최대 부피 1.5 mL로 얻었다.
- 웰을 0.5 mL의 성장 매질로 세척함으로써 초저 부착 24-웰 둥근 바닥 플레이트 (웰 당 다중 마이크로웰 포함)를 평형화시킨다. 플레이트를 3,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 웰 표면으로부터 기포를 제거하였다.
- 세포 현탁액을 플레이트 내로 옮기고 120 x g에서 3분 동안 원심분리한다 .
- 플레이트를 스페로이드 형성을 위해 5% CO2와 함께 37oC에서24 시간 동안 인큐베이션한다. 한편, 습도 챔버를 25 mL의 멸균수로 채우고 세포 챔버를 9 mL의 성장 배지로 채워 생물반응기를 평형화시킨다.
- 클리노스타트 인큐베이터에서 회전하는 생물반응기를 5% CO2로 37oC에서24시간 동안 인큐베이션한다.
3. 생물반응기에서 구상체의 성장
참고: 구상체의 구조를 보존하기 위해 3D 구조물을 취급하는 데 넓은 보어 팁이 사용됩니다.
- 1mL 너비의 보어 팁으로 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 초저 부착 플레이트에서 구상체를 분리하고 조직 배양 처리 접시로 옮깁니다.
- 0.5 mL의 미리 가온된 성장 배지로 플레이트를 세척하고 동일한 접시로 옮긴다.
- 현미경으로 구상체의 품질을 평가하고 충분히 형성된 구상체를 선택하십시오. 좋은 품질의 구상체는 균일 한 크기, 컴팩트 함 및 원형도를 가지고 있습니다.
- 구상체를 5mL의 신선한 성장 배지로 채워진 평형화된 생물반응기로 옮깁니다. 구상체를 옮긴 후 생물 반응기를 신선한 성장 배지로 완전히 채 웁니다.
- 생물반응기를 클리노스타트 인큐베이터에 넣고 회전 속도를 10-11 rpm으로 조절한다.
- 2-3 일마다 10 mL의 오래된 배지를 제거하고 10 mL의 신선한 배지로 교체하여 성장 배지를 교환하십시오.
- 스페로이드 성장에 따라 회전 속도를 조정하여 구상체의 크기와 수가 증가함에 따라 증가합니다.
- 배양에서 18 일 후, 구상체는 치료 및 / 또는 수집 할 준비가되었습니다.
4. 스페로이드 처리 및 수집
참고: 이 프로토콜에서 HepG2/C3A 구상체는 아세틸화 및 숙시닐화를 각각 포함하는 히스톤 마크의 수준을 평가하기 위해 소듐 부티레이트(NaBut) 및 소듐 숙시네이트(NaSuc)로 처리됩니다.
- 화합물의 적절한 작동 농도 (예를 들어, 20 mM의 NaBut 또는 10 mM NaSuc)로 성장 배지를 준비한다. 생물반응기의 배지를 처리된 배지와 교환한다.
참고 : 제어 조건을 수립하려면 치료를 추가하기 전에 실험을 위해 충분한 구상체를 수집하거나 처리되지 않은 구상체에 대한 생물 반응기를 지정하십시오. - 충분한 치료 시간 (예를 들어, NaSuc 치료의 경우 48 h 내지 1 주일 또는 NaBut 치료의 경우 48-72 h) 후에 프로테오믹 분석을 위해 구상체를 수집한다.
참고: 이 프로토콜을 사용한 히스톤 추출을 위해, 대략 1 x 10 6개의 세포를 함유하는6 내지 여덟 개의 구상체가 수집되었다.- 상단 포트를 통해 생물반응기에서 3-5 mL의 배지를 제거하십시오.
- 전면 포트를 열고 1mL 너비의 보어 팁을 사용하여 구상체를 제거하고 마이크로 원심분리 튜브에 넣으십시오.
- 구상체를 100 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 매체를 폐기한다.
참고: 생물반응기의 배지는 변경될 수 있으며 생물반응기는 추가적인 치료 시간 또는 회수를 위해 인큐베이터로 복귀될 수 있습니다. - 구상체를 200 μL의 HBSS로 세척하여 FBS를 제거하였다. 100 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다.
참고 : 구상체는 처리 될 때까지 -80 oC에서 저장할 수 있습니다.
5. 히스톤 추출
참고 : 히스톤에 존재하는 많은 염기성 아미노산 잔기는 인산 골격을 가진 DNA와 밀접하게 상호 작용할 수있게합니다. 히스톤은 핵에서 가장 기본적인 단백질 중 일부이기 때문에 얼음처럼 차가운 황산 (0.2 MH2SO4)으로 추출하면 오염이 최소화됩니다. 비 히스톤 단백질은 강산에서 침전됩니다. 최종 농도 33%로 희석된 고농축 트리클로로아세트산(TCA)은 황산으로부터 히스톤을 침전시키기 위해 이후에 사용된다. 전체 히스톤 추출을 위해 모든 샘플, 튜브 및 시약을 얼음 위에 보관하십시오.
- 세포 펠릿 (∼10-20 μL)에 차가운0.2 M H2SO4의 다섯 부피 (∼100 μL)를 첨가하고, 피펫을 위아래로 피펫하여 펠릿을 파괴하고 히스톤을 방출한다.
- 튜브를 일정한 회전으로 최대 4시간 동안 인큐베이션하거나 4oC에서 진탕한다.
참고: 부피가 500μL를 초과하는 재현탁 샘플의 경우, 2시간 인큐베이션으로 히스톤을 추출하기에 충분합니다(더 긴 인큐베이션은 다른 기본 핵 단백질의 추출을 초래할 수 있음). 부피가 200 μL 미만인 재현탁 샘플의 경우, 더 나은 수율을 위해 4시간 인큐베이션이 필요합니다. - 4°C에서 5분 동안 3,400 x g 에서 원심분리한다. 새로운 튜브에 상층액을 수집하고 나중에 펠렛을 버리십시오.
- 최종 25 % -33 % v / v (예 : 차가운 TCA 40-60 μL : 상청액 120 μL)를 구성하도록 냉간 농축 TCA를 추가하고 튜브를 몇 번 뒤집어 혼합하십시오.
- 튜브를 일정한 회전에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하거나 4oC에서 진탕시킨다.
참고 : 더 작은 시작 펠렛 크기의 경우 하룻밤 동안 배양하는 것이 좋습니다. - 3,400 x g 에서 4oC에서 5분 동안 원심분리하여 피펫팅하여 상층액을 버린다. 상청액을 조심스럽게 흡인하십시오. 튜브 또는 펠릿의 측면을 만지지 마십시오.
참고 : 히스톤은 튜브의 측면과 하단 양쪽에 침착됩니다. 튜브의 맨 아래에 형성된 백색 불용성 펠릿은 대부분 비 히스톤 단백질 및 기타 생체 분자를 포함합니다. - 유리 파스퇴르 피펫 (~ 500 μL / 튜브)을 사용하여 차가운 아세톤 + 0.1 % HCl로 튜브 (벽 및 펠렛)를 씻으십시오.
- 3,400 x g 에서 4oC에서 5분 동안 원심분리하여 튜브를 뒤집어 상층액을 버린다.
- 유리 파스퇴르 피펫 (~ 500 μL / 튜브)을 사용하여 튜브 (벽 및 펠렛)를 100 % 차가운 아세톤으로 씻으십시오. 4oC에서 5분 동안 3,400 x g에서 원심분리한다.
- 튜브를 뒤집어 상층액을 버리고 나머지 아세톤을 피펫으로 꺼냅니다. 뚜껑을 열고 샘플을 벤치에서 ~ 20 분 동안 공기 건조시킵니다.
- 프로피오닐화를 진행하거나 사용 전까지 샘플을 - 80oC에저장한다.
6. 파생화의 첫 번째 라운드
참고: 히스톤 단백질을 소화하기 위해 트립신을 사용하면 기존의 프로테오믹스 설정을 사용하여 식별하기 어려운 지나치게 작은 펩티드가 생깁니다. 이러한 이유로, 프로피온성 무수물은 변형되지 않은 모노메틸리신 잔기의 ɛ-아미노기를 화학적으로 유도체화하는데 사용된다. 이것은 트립신 단백질 분해를 C 말단 아르기닌 잔기로 제한합니다. 96웰 플레이트의 샘플의 경우 시약 픽업을 위해 다중 채널 피펫 및 저장소를 사용하는 것이 좋습니다(그림 2A). 유도체화는 또한 펩티드의 유리 N-테르미니를 표지하기 위해 소화 후에 수행되어 펩티드 소수성을 증가시키고, 따라서 역상 크로마토그래피 보유를 증가시킨다.
- 샘플을 100 mM 중탄산암모늄 (pH 8.0) 중의 15%-20% 아세토니트릴의 20 μL에 재현탁시킨다. 15 초 동안 소용돌이 치고, 30 초 동안 1,000 x g 로 회전합니다.
- 여덟 개 이상의 샘플이 있는 경우, 재현탁된 각 샘플을 96웰 플레이트로 옮깁니다.
참고: 샘플이 96웰 플레이트로 전송되지 않은 경우 6.3-6.7, 7.1-7.5 및 8.1-8.5단계에서 단일 채널 파이펫을 사용할 수 있습니다. - 후드 아래에 다채널 피펫을 사용하여 2 μL의 프로피온성 무수물을 첨가한다. 5x 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오.
- 다채널 피펫을 사용하여 수산화암모늄 10μL를 빠르게 첨가한다. 5x 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오.
참고: 프로피온산은 펩타이드로부터 프로피온산 무수물과 유리 아민 사이의 반응의 산물이며 샘플 pH를 감소시킬 수 있습니다. pH 8은 수산화암모늄을 1:5(v/v)의 비율로 샘플에 첨가하여 재확립할 수 있다. - pH 시험지를 사용하여 pH가 8인지 확인하십시오. pH가 8< 경우, 수산화암모늄 1 μL를 첨가하여 조정한다. pH가 8> 경우, 1 μL 포름산 또는 아세트산을 첨가하여 조정한다. pH > 10일 때, 더 높은 pKa를 갖는 다른 아미노산 잔기의 표지가 가능하다.
- 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.
- 6.3-6.6단계를 반복합니다. 히스톤 프로피오닐화의 이중 라운드는 거의 완전한 반응 효율을 보장합니다.
- 모든 웰이 완전히 건조 될 때까지 속도 진공에서 플레이트를 건조시킵니다 (~ 9 시간).
- 트립신 소화를 진행하거나 사용 전까지 샘플을 - 80oC에서저장한다.
7. 히스톤 소화
참고: 히스톤은 트립신을 사용하여 펩타이드로 소화되며, 이는 아르기닌과 리신 잔기의 카르복실 쪽에서 절단됩니다. 그러나, 프로피오닐화는 리신 잔기를 변형시키기 때문에, 아르기닌 잔기만이 절단된다(도 2B).
- 트립신 용액 (50 mMNH4HCO3, pH 8.0 중 25 ng/μL)을 준비한다. 20 μL의 트립신 (500 ng)을 각 샘플에 첨가하십시오.
- 50 mMNH4HCO3 용액을 준비하기 위해, HPLC 등급의 물로 100 mMNH4HCO3용액을 1:1 v/v로 희석한다.
- pH 시험지를 사용하여 pH가 8인지 확인하십시오. pH가 8< 경우, 수산화암모늄 1 μL를 첨가하여 조정한다. pH가 8>면, 1 μL의 포름산 또는 아세트산을 첨가하여 조정한다.
- 실온에서 밤새 소화하거나 37oC에서 6-8시간 동안 배양한다.
- 가능하다면 소화 후 ~ 3 시간 후에 pH가 감소했을 수 있으므로 pH를 확인하십시오. pH가 8< 경우, 수산화암모늄 1 μL를 첨가하여 조정한다.
- 50 ng/μL 트립신 용액 (250 ng)의 추가 5 μL를 첨가하고 소화를 계속하십시오.
- 프로피오닐화의 두 번째 라운드를 진행하거나 사용 전까지 샘플을 - 80oC에서저장한다.
8. 펩티드 N-테르미니의 유도체화
참고: 그들의 N 말단에서 히스톤 펩티드의 프로피오닐화는 프로피오닐 그룹이 펩티드 소수성을 증가시킴에 따라 역상 액체 크로마토그래피 (예를 들어, 히스톤 H3의 아미노산 3-8)에 의해 가장 짧은 펩티드의 보유를 향상시킨다.
- 후드 아래에 다채널 피펫을 사용하여 2 μL의 프로피온성 무수물을 첨가한다. 5x 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오.
- 다채널 피펫을 사용하여 수산화암모늄 10μL를 빠르게 첨가한다. 5x 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오.
참고: 프로피온산은 펩티드로부터 프로피온산 무수물과 유리 아민 사이의 반응의 산물이며, 샘플 pH를 감소시킬 수 있다. pH 8은 수산화암모늄을 1:5(v/v)의 비율로 샘플에 첨가하여 재확립할 수 있다. - pH 시험지를 사용하여 pH가 8인지 확인하십시오. pH가 8< 경우, 수산화암모늄 1 μL를 첨가하여 조정한다. pH가 8> 경우, 1 μL 포름산 또는 아세트산을 첨가하여 조정한다. pH > 10일 때, 더 높은 pKa를 갖는 다른 아미노산 잔기의 표지가 가능하다.
- 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.
- 8.1-8.4단계를 반복합니다. 히스톤 프로피오닐화의 이중 라운드는 거의 완전한 반응 효율을 보장합니다.
- 모든 웰이 완전히 건조 될 때까지 속도 진공에서 플레이트를 건조시킵니다 (~ 9 시간).
- 탈염 단계를 진행하거나 사용 전까지 샘플을 - 80oC에서저장한다.
9. 탈염 및 샘플 정리
참고: 샘플에 존재하는 염은 질량 분광법 분석을 방해합니다. 염은 또한 전기 분무 중에 이온화되며 펩티드로부터의 신호를 억제 할 수 있습니다. 염은 펩티드 상에 이온성 부가물을 형성할 수 있으며, 이는 부가된 펩티드가 상이한 질량을 갖도록 한다. 이것은 펩티드의 신호 강도를 감소시키고 적절한 식별 및 정량화를 방해한다. 탈염에 대한 설정은 그림 2C에 설명되어 있습니다.
- HLB 수지 (100 % 아세토니트릴 중 50 mg / mL)를 자기 교반 플레이트에 혼합하기 시작하십시오.
- 유동을 수집하기 위해 96웰 폴리프로필렌 필터 플레이트 아래에 96웰 수집 플레이트가 놓여 있는지 확인하십시오.
- 웰 당 70 μL의 HLB 현탁액을 필터 플레이트에 첨가한다. 튀는 것을 방지하기 위해 진공을 부드럽게 켭니다. 흐름 통과를 버립니다.
- 수지를 0.1% TFA의 100 μL로 세척한다. 튀는 것을 방지하기 위해 진공을 부드럽게 켭니다. 흐름 통과를 버립니다.
- 각 샘플을 0.1% TFA의 100 μL에 재현탁시킨다. pH를 확인; ~ 2-3이어야합니다.
- 각 샘플을 각 웰에 로드합니다. 튀지 않도록 진공을 부드럽게 켭니다. 흐름 통과를 버립니다.
- 100 μL 0.1% TFA로 세척한다. 튀지 않도록 진공을 부드럽게 켭니다. 흐름 통과를 버립니다.
- 수집 플레이트를 새로운 96웰 수집 플레이트로 교체합니다.
- 웰 당 60% 아세토니트릴/0.1% TFA의 60 μL를 첨가한다. 튀지 않도록 진공을 부드럽게 켭니다. 유동 스루를 수집하고 속도 진공에서 건조하십시오.
- LC-MS/MS로 진행하거나 사용 전까지 샘플을 -80 o C 에보관하십시오.
10. 질량 분광법과 결합 된 액체 크로마토그래피를 통한 히스톤 펩티드 분석
- 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에서 실행되도록 이동상을 준비한다. 이동상 A (MPA): 2% HPLC 등급 아세토니트릴 + 0.1% 포름산. 이동상 B (MPB): 80% HPLC 등급 아세토니트릴 + 0.1% 포름산.
- HPLC 방법을 다음과 같이 프로그램한다: (1) 30분에 걸쳐 4%-34% MPB; (2) 5 분 이상 34 % -90 % MPB; 및 (3) 5분 동안 등용매 90% MPB를 포함한다. C18 3 μm 패킹 재료, 75 μm 내부 직경, 20-25 cm 길이의 권장 컬럼 특성을 사용하십시오. 내부 직경이 75μm인 나노 컬럼의 경우 유량을 250-300nL/min으로 설정합니다.
- HPLC가 샘플 로딩 전에 컬럼 평형화를 자동화하도록 프로그래밍되지 않은 경우에, 1분에 걸쳐 (4) 90%-4% MPB 및 (5) 10분에 걸쳐 등용매 4% MPB를 포함한다.
- MS 획득 방법을 프로그래밍한다.
- 계측기가 각 듀티 사이클의 시작 부분에서 하나의 전체 MS 스캔을 수행하는지 확인하십시오. 고분해능 계측(예: orbitrap 또는 비행 시간 분석기)이 권장되는데, 이는 신호 추출 중에 활용될 수 있는 질량 정확도 때문입니다. 그러나, 저분해능 계측기는 또한 앞서 설명된 바와 같이 활용될 수 있다(27,28).
- 전체 MS 스캔 다음에 16개의 MS/MS 스캔 이벤트가 발생하는지, 각 이벤트에는 300-1100의 m/z 범위에 걸쳐 50m/z의 분리 폭이 있는지 확인하십시오. 예를 들어, 첫 번째 스캔은 300-350 m/z, 두 번째 스캔은 350-400 m/z 등에서 신호를 분리해야 합니다. 가능하다면 고해상도로 MS/MS 스캔을 획득하지만, 전체 MS 스캔에 비해 낮은 분해능으로 충분하다(손상되지 않은 이온에 비해 단편 이온의 질량이 작기 때문에).
- HPLC 방법은 ∼3-40 s의 피크 폭을 갖는 크로마토그래피 신호를 생성할 것이다; 적절한 신호 정량화를 보장하기 위해, 질량 분석기가 크로마토그래피 피크당 적어도 10개의 듀티 사이클(즉, 3초 이상의 듀티 사이클)을 수행하는지 확인하십시오.
- 트래핑 스타일 질량 분석기(orbitrap, ion trap)를 사용하는 경우 이온 주입 시간 제한이 <200ms로 설정되어 있는지 확인하십시오. 다른 분석기 (사중극자, 비행 시간)의 경우 스캔 시간이 빠르기 때문에 문제가되지 않습니다. 예비 테스트가 필요할 수 있습니다.
참고: 히스톤 펩티드 분석을 위한 MS 방법에 대한 더 자세한 내용은 하기 참고문헌27,28,29에서 찾을 수 있다.
- 소화된 히스톤 샘플의 ~1μg/μL에 해당하는 10μL의 MPA에 샘플을 재현탁합니다. 배치의 모든 샘플이 유사한 희석 및 부피를 사용하여로드되는 경우 정확한 로딩량은 중요하지 않습니다 (평가하기가 쉽지 않음).
- 1 μL의 샘플을 HPLC 컬럼 상에 로딩한다.
- 10.1-10.3단계에서 프로그래밍된 LC-MS/MS 메서드를 실행합니다.
11. 데이터 분석
- MS 원시 데이터 파일을 피크 영역 통합을 수행하도록 설계된 소프트웨어로 가져옵니다.
참고: EpiProfile30,31은 현재 연구에서 사용되며 알려진 히스톤 펩티드의 신뢰할 수 있는 피크 면적 추출에 최적화되어 있으므로 일반적으로 권장됩니다. 그러나, 스카이라인32,33과 같은 추출된 이온 크로마토그래피를 위해 자유롭게 이용가능한 다른 소프트웨어가 적합하다. - 주어진 (un) 변형된 펩티드의 상대적 풍부도를 그의 모든 변형된 형태에서 펩티드의 전체 영역으로 나눈 단일 펩티드의 면적으로서 계산한다. EpiProfile30,31과 같은 소프트웨어에는 이미 신호 추출을 위한 펩타이드 라이브러리가 포함되어 있습니다. 그렇지 않으면, 수동으로 또는 일상적인 프로테오믹스 파이프라인을 사용하는 펩티드 식별을 통해 관심있는 펩티드의 라이브러리를 생성한다.
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Representative Results
이 프로토콜에서, HepG2/C3A 구상체는 20 mM NaBut 및 10 mM NaSuc로 처리되었으며, 둘 다 히스톤 PTM의 글로벌 수준에 영향을 미쳤다 (도 3A). 그런 다음 히스톤 PTM을 MS/MS 수집을 통해 단일 잔기 수준에서 확인하고 정량화하였다(도 3B).
샘플이 반복실험에서 실행될 때, 통계적 분석을 수행하여 샘플 간의 PTM의 폴드 변화 농축과 관찰의 재현성을 평가할 수 있습니다. 표시된 데이터는 아세틸화로 변형된 펩티드가 NaBut 대 대조군으로 처리된 구상체에서 풍부하다는 것을 입증하는 반면(도 3C), NaSuc으로 처리된 샘플은 라이신 숙시닐화로 변형된 히스톤 펩티드의 상대적 풍부도가 더 높다는 것을 입증한다(도 3D). 이러한 계산은 별도의 간행물(34)에 상술된 바와 같이 스프레드시트 프로그램에서 수행되었다. 주어진 히스톤 수정의 전반적인 증가는 레이더 플롯에서 더 잘 표현 될 수 있으며, 분석 된 수정 사이트에 대한 자세한 정보를 유지하면서 특정 변형의 더 높은 글로벌 풍부도를 관찰하는 것이 더 직관적이됩니다 (그림 3E, F).
이 프로토콜은 히스톤 H3 아미노산 잔기 9-17로부터 펩티드를 생성하며, 이는 빈번하게 변형된 잔기 K9, S10, 및 K14를 포함한다. 표시된 데이터는 NaBut 사용한 치료가 H3K14ac의 수준을 증가시키지만, H3K9me3이 아닌 H3K9me2와 공동 변형된 히스톤에서만 증가한다는 것을 나타낸다(도 4A). 두 수정 간의 공존 주파수는 링 그래프로 보다 직관적으로 나타낼 수 있으며, 여기서 노드는 개별 수정을 나타내고 커넥터 라인의 두께는 두 PTM 간의 공존 주파수를 나타냅니다(그림 4B). 때로는 공존 빈도가 영향을받지 않지만 막대 플롯으로 표현 된 데이터는 오해의 소지가 있습니다. 예를 들어, 도 4A 에 표현된 데이터는 H3K9me2K14ac 조합이 대조군보다 NaBut 처리에서 더 풍부하다는 것을 나타낸다. 이것은 정확하지만,이 주어진 조합은 치료에 관계없이 가장 빈번합니다. 그림 4B 는 H3K9me2K14ac 및 H3K9me3K14ac가 처리 (선 두께)에 관계없이 가장 빈번한 조합 패턴이지만 H3K14ac (노드)의 글로벌 수준이 실험에서 진정으로 변화하고 있음을 분명히 보여줍니다.
이 프로토콜은 히스톤 H4 잔기 4-17로부터 펩티드를 생성하며, 이는 위치 K5, K8, K12, 및 K16 (주로 아세틸화에 의해)에서 변형가능한 잔기를 포함한다. 대조군과 NaBut 처리를 비교할 때, 데이터를 예를 들어 워드 클라우드로 표현함으로써 아세틸화 조합의 증가를 관찰할 수 있다(도 4C). 이 표현은 히스톤 H4의 변형되지 않은 버전이 대조군 샘플에서 가장 풍부하다는 것을 분명히 강조하는 반면, NaAnd로 처리 된 구상체는 두 배, 삼중 및 4 배로 아세틸화 된 히스톤 H4 프로테오형으로 풍부합니다. 그러나 단어 구름은 정확한 값을 표시하는 데 제한이 있습니다. 히스톤 코드의 상대적 풍부도는 부정확하게 추정 될 수있는 텍스트의 크기에 의해 비 복잡해야합니다. 따라서, Venn 다이어그램 또는 UpSetR 표현(35 )과 같은 보다 현대적인 등가물들은 공존하는 히스톤 PTM들의 정확한 정량화를 보여주기 위해 사용될 수 있다(도 4D, E). 표시된 데이터는 히스톤 H4에 대한 아세틸화의 선택된 조합이 대조군에 비해 NaBut 치료에서 상대적으로 더 풍부하다는 것을 다시 한번 강조합니다.
그림 1: 3D 구상체의 히스톤 펩티드 분석을 위한 워크플로우. HepG2/C3A 세포는 80% 컨플루언시에 도달할 때까지 2D 배양물에서 먼저 성장한다. 그런 다음 세포를 평형화 된 생물 반응기로 옮기고 clinostat 인큐베이터 내에 배치하여 10-11 rpm으로 회전하여 구상체를 형성합니다. 18일 후, 구상체는 20 mM NaBut 또는 10 mM NaSuc로 처리되고 그들의 상응하는 시점 후에 수확된다. 핵은 세포로부터 분리되고 히스톤 추출은 0.2 MH2SO4로 수행된다. 히스톤 유도체화는 트립신 소화 전후에 프로피온산 무수물로 수행되어 액체 크로마토그래피에 의해 생성된 짧은 펩티드의 보유를 보장한다. 샘플은 탈염된 후 단계 10에서 언급된 LC-MS/MS 방법을 사용하여 실행되고, 결과 데이터는 단계 11에 설명된 대로 분석된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 프로피오닐화 및 탈염 단계를 위한 설정. (A) 프로피오닐화는 흄 후드에서 수행되며 모든 구성 요소는 단계를 신속하게 연속적으로 수행할 수 있도록 배치됩니다. (B) 히스톤 H3.1 꼬리에 프로피오닐화, 트립신 소화, 및 프로피오닐화의 첫 번째 라운드의 개략도. (C) 탈염은 96-웰 진공 매니폴드 및 96-웰 폴리프로필렌 필터 플레이트를 사용하여 벤치에서 수행된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 개별 히스톤 변형의 표현. (A) 대조군 및 처리된 (20 mM NaBut 또는 10 mM NaSuc) HepG2/C3A 구상체에서의 일반적인 글로벌 히스톤 변형의 상대적 풍부도를 보여주는 막대 그래프. (b) 대조군 (20 mM NaBut 또는 10 mM NaSuc)에서 히스톤 H3 펩티드 (KSTGGKAPR)의 잔기 9-17에서 발생하는 단일 히스톤 PTMs의 풍부함을 보여주는 막대 그래프 HepG2/C3A 구상체. (C,D) 화산은 20 mM NaBut (C) 또는 10 mM NaSuc (D)로 처리한 후 히스톤 펩티드 PTMs의 위상 변화 및 차등 발현의 유의성을 나타내는 플롯이다. 강조 표시된 청색 및 녹색 점은 각각 아세틸화 및 숙시닐화 잔기를 나타낸다. (E, F) 대조군과 비교하여 각각 20 mM NaBut 또는 10 mM NaSuc로 처리한 후 단일 히스톤 펩티드 아세틸화 (E) 또는 숙시닐화 (F)의 풍부함을 보여주는 레이더 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 공존하는 히스톤 변형의 표현. (A) 대조군 및 처리된 히스톤 H3(KSTGGKAPR)의 잔기 9-17에서 발생하는 조합 히스톤 PTM의 풍부함을 보여주는 막대 그래프(20 mM NaBut 또는 10 mM NaSuc) HepG2/C3A 구상체. (b) 대조군 및 처리된 (20 mM NaBut) HepG2/C3A 구상체에서 히스톤 H3 (KSTGGKAPR)의 잔기 9-17 상의 조합 히스톤 PTM 사이의 관계를 보여주는 고리 그래프. 노드 색상의 강도는 처리 그룹 내에서 단일 PTM의 풍부함에 해당하지만 선 두께는 PTM 동시 발생 빈도에 해당합니다. (c) 대조군 및 처리된 (20 mM NaBut) HepG2/C3A 구상체에서 히스톤 H4 잔기에 대한 조합 히스톤 PTMs의 빈도를 보여주는 워드 클라우드. 텍스트의 크기는 지정된 조합 PTM의 풍부함과 일치합니다. (D,E) 대조군 및 20 mM NaBut 처리된 샘플에서 히스톤 H4 펩티드 잔기 4-17에 대한 공존 변형의 빈도를 나타내는 벤도이다. 데이터는 ShinyApp UpSetR35를 사용하여 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 이 프로토콜을 사용하여 검출된 펩티드의 목록. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
히스톤 PTM의 분석은 일반적인 프로테오믹스 분석 파이프라인과 근본적으로 다릅니다. 대부분의 히스톤 PTM은 여전히 수수께끼 같은 생물학적 기능을 가지고 있습니다. 결과적으로 Gene Ontology 또는 pathway 데이터베이스와 같은 주석을 사용할 수 없습니다. 히스톤 변형을 그들의 촉매작용을 담당하는 효소 또는 이들 PTM에 결합하는 도메인을 함유하는 단백질과 연관시키는 몇몇 자원이 존재한다(예를 들어, HISTome36). 뿐만 아니라, 히스톤 PTM의 글로벌 수준이 조절될 때 크로마틴의 전반적인 상태를 추측할 수 있다. 예를 들어, 히스톤 아세틸화 또는 숙시닐화와 같은 다른 아실화의 전반적인 증가는 일반적으로 크로마틴 탈축합37,38과 연관된다.
MS 분석은 아미노산 서열에 대한 이들의 정확한 국소화와 같은 이러한 변형에 대한 보다 상세한 정보를 제공한다. 이 프로토콜에서 MS/MS 수집은 생물학적 해석에 중요할 수 있는 히스톤 PTM을 식별하고 정량화하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 히스톤 H3 (H3K4me3)의 리신 4 상의 트리메틸화는 활발하게 전사된 유전자39의 프로모터 상에서 농축되는 반면, 리신 9 (H3K9me3) 벤치마크에 대한 동일한 변형은 구성적 헤테로크로마틴40을 구성한다. 히스톤 변형은 현재 특정 질환에서 바이오마커로서 사용되고 있다; 이와 같이, 히스톤 분석은 치료에 대한 반응 이외에 질병 병리학을 연구하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 후성유전학적 약물로)41,42.
단일 PTM이 아닌 여러 PTM 간의 상호 작용을 시각적으로 표현하는 것이 더 어렵습니다. 링 그래프와 같은 기존 차트는 두 PTM의 공존 주파수를 보여줄 수 있지만, 네트워크의 입체 표현이 필요하기 때문에 한 번에 두 개 이상의 PTM 간의 공존 주파수를 나타낼 수는 없습니다. 이러한 이유로, 다른 표현들은 세 개 이상의 PTM들이 고려될 때 히스톤 코드의 변화를 강조하는데 더 적합할 수 있다. 일반적으로 데이터 표현을 다양화하면 샘플 간의 중요한 변화를 관찰할 가능성이 높아집니다. 이 프로토콜은 히스톤 PTM 및 공존하는 PTM의 규정을 표시하기 위한 다양한 그림의 예를 제공합니다.
이 프로토콜은 트립신 소화 (약 4-20 아미노산)로 인해 상대적으로 작은 히스톤 펩티드를 생성하지만, 선택된 펩티드는 여러 개의 변형 가능한 잔기를 함유한다. 이러한 펩타이드의 분석은 PTM의 공존 주파수의 정량화를 허용하며, 이는 주어진 데이터 세트에서 어떤 조합 히스톤 마크가 조절되는지에 대한 중요한 정보를 나타낼 수 있습니다. 특히, 히스톤의 정량화가 수행되는 샘플 준비 중에는 단계가 없습니다. 여기에는 네 가지 이유가 있습니다 : (1) 트립신은 광범위한 활성을 가지고 있으며 광범위한 효소 대 샘플 비율 (1 : 10-1 : 200)에서 사용할 수 있습니다. 추출 된 히스톤의 실험 수율이 예상 된 것과 다른 경우에도이 프로토콜을 사용하여 소화 문제가 발생하지 않았습니다. (2) 이 프로토콜은 민감도 부족으로 인해 히스톤 정량화가 수행되기 어려울 수 있는 미량의 물질을 위한 것입니다. (3) 히스톤 물질의 양에 관계없이 일정한 트립신 농도를 사용함으로써 트립틱 펩타이드 (트립신 자동 분해제)를 사용하여 크로마토그래피 성능을 벤치마킹 할 수 있습니다. 샘플 수율의 약간의 변동은 데이터 분석 소프트웨어에 의해 정규화될 것이며(단계 11), 이는 정규화 프로세스 동안 분모로서 주어진 펩티드에 대한 모든 (un) 변형된 신호를 사용한다. (4) 마지막으로, 출발 물질의 양을 극적으로 과소 평가하면 nanoLC 크로마토그래피 컬럼에 과부하가 걸리는 문제가 발생할 수 있습니다. 그러나 이 프로토콜에 표시된 대로 탈염 단계를 수행하면 이 문제가 발생하지 않습니다. 과도한 양의 출발 물질 (예 : >100 μg)의 경우, 탈염 수지의 용량 한계가 초과되고 과량의 샘플이 로딩 단계 동안 씻겨 나갈 것입니다.
이 분석에 의해 검출된 모든 펩티드가 도 3 및 도 4에서 강조된 것은 아니라는 점에 유의하는 것이 중요하다. 뿐만 아니라, 모든 히스톤 변형이 이러한 특정 샘플 준비 및 수집 방법을 사용하여 검출 가능한 것은 아니다. 보충 표 1 은 기술된 파이프라인을 사용하여 추출되는 모든 펩티드 신호를 나열하기 위해 제공된다. 몇 가지 잘 알려진 변형은 설명 된 샘플 준비가 검출에 적합하지 않기 때문에 표에 나열되지 않습니다. 주목할만한 예는 히스톤 H2A 및 H2B로부터의 유비퀴티닐화 펩티드, 및 히스톤 H2A의 인산화이다. X (DNA 손상의 일반적인 마커). 이는 이들 PTMs와 관련된 펩티드의 프로피오닐화가 지나치게 긴 펩티드로 이어지기 때문이며, 이는 C18 크로마토그래피 및 기술된 MS 검출 방법에 적합하지 않다. 문헌에 존재하지만 보충 표 1 에 존재하지 않는 다른 변형은 락틸화 43 또는 세로토닐화44 와 같은 매우 낮은 풍부 변형 (현재 면역침전 또는 특정 세포 치료와 같은 농축 전략 후에 MS를 사용하여 검출가능함)이다. 히스톤 서열에 대한 중합 또는 불균질 공유 결합에 의해 야기되는 예측할 수 없는 질량 이동을 갖는 히스톤 변형도 고려되지 않는다(예를 들어, 폴리-ADP-리보실화45 및 당화46). 또한이 프로토콜은 HepG2 / C3A 구상체를 치료하기 위해 NaSuc 및 NaBut를 사용하지만 다른 약물 / 후성 유전 학적 변형제 및 2D / 3D 세포 배양 유형과 함께 사용하도록 수정할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없습니다.
Acknowledgments
Sidoli 연구소는 백혈병 연구 재단 (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck 및 NIH Office of Director (1S10OD030286-01)를 감사하게 생각합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA solution | Gibco | 25300054 | |
| 0.5-20 µL pipet tips | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 µL multi-channel pipette | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
| 10 mL syringe | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
| 10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
| 1000 µL pipet tips | Rainin | 30389164 | |
| 18 G syringe needle | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | 3" length, 0.05" diameter |
| 200 µL multi-channel pipette | Corning | 4082 | |
| 2-200 µL pipet tips | BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
| 24-well ultra-low attachment microplate | Corning | 07-200-602 | |
| 75 cm2 U-shaped cell culture flask | Corning | 461464U | Untreated, with vent cap |
| 96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | Acetone should be used cold |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
| Ammonium hydroxide solution | Fisher Scientific | AC423300250 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioreactor for 3D cell culture |
| ClinoStar | CelVivo | N/A | Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture |
| Control unit | CelVivo | N/A | Tablet for ClinoStar settings |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Fume hood | Mott | N/A | Model 7121000 |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile |
| Glutagro supplement | Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananyl-L-glutamine |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-CI | 100X solution |
| Oasis HLB resin | Waters | 186007549 | Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
| Oro-Flex I polypropylene filter plate | Orochem | OF1100 | 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | 100X solution |
| pH paper | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | 0-13 pH test paper |
| Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
| Polymicro capillary | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD |
| Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile | Fisher Scientific | 1367549 | |
| Propionic anhydride | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.0003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size |
| Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Nutator Mixer 1105 |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium butyrate | Thermo Scientific | A11079 | |
| Sodium succinate dibasic | Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
| SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
| SpeedVac vacuum concentrator (96-well) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterile hood | Thermo Scientific | 1375 | Class II, Type A2 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker Analyzed ACS reagent |
| Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | Resuspend 100% w/v in HPLC grade water |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | Sequencing grade |
| Vacuum manifold 96-well | Millipore | MAVM0960R | |
| Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| Wide bore pipet tips 1000 µL | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
| Wide bore pipet tips 200 µL | Axygen | 14-222-730 (Fisher Scientific) |
References
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- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
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- Wrzesinski, K., et al. The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments. PLoS One. 9 (9), 106973 (2014).
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