כלי עריכת גנים CRISPR לניתוח רשת אשכולות מיקרו-רנ"א
Summary
פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה של עריכת גנים של גנים חוזרים פלינדרומיים קצרים (CRISPR) בתפוקה גבוהה, המקובצים באופן קבוע, עבור ניתוח רשת של אשכולות מיקרו-רנ”א, המאפשרת ייצור מהיר של פאנל של קווי תאים מהונדסים גנטית הנושאים שילובי מחיקה ייחודיים של חברי אשכול miRNA בגודל של עד 35 קילו-בתים בתוך ניסוי יחיד.
Abstract
מיקרו-רנ”א (miRNA) התגלו כמווסתים תאיים חשובים (מדכאי גידולים, גורמים פרו-אונקוגניים) של סרטן וגרורות. רוב המחקרים שפורסמו מתמקדים ב-miRNA יחיד כאשר הם מאפיינים את תפקידם של רנ”א קטנים בסרטן. עם זאת, כ-30% מגני ה-miRNA האנושיים מאורגנים ביחידות מקובצות שלעתים קרובות מבוטאות במשותף, מה שמצביע על מערכת מורכבת ומתואמת של ויסות RNA שאינו מקודד. נדרשת הערכה ברורה יותר של האופן שבו רשתות miRNA מקובצות מתפקדות בשיתוף פעולה כדי לווסת את צמיחת הגידול, האגרסיביות של הסרטן והעמידות לתרופות לפני תרגום רנ”א קטנים שאינם מקודדים למרפאה.
השימוש בהליך עריכת גנים קצר (CRISPR) בתיווך קרינה בתפוקה גבוהה נעשה כדי לחקור את התפקיד האונקוגני של אשכול גנומי של שבעה גנים miRNA הממוקמים בתוך לוקוס המשתרע על פני כ-35,000 bp באורך של כ-35,000 bp בהקשר של סרטן הערמונית. לצורך גישה זו, קווי תאים סרטניים אנושיים היו נגועים בווקטור לנטי-וירוס עבור דוקסיציקלין (DOX) – נוקלאז Cas9 הניתן להשראה שגדל במדיום המכיל DOX במשך 48 שעות. לאחר מכן התאים עברו טרנספקטציה משותפת עם רנ”א (tracrRNA) סינתטי המפעיל טרנס-רן (tracrRNA) המורכב עם אוליגונוקלאוטידים של CRISPR RNA (crRNA) ספציפיים לאתר גנומי, כדי לאפשר יצירה מהירה של קווי תאים סרטניים הנושאים את כל מחיקת אשכול ה-miRNA ומחיקות של צבירי גנים בודדים או משולבים של miRNA בניסוי יחיד.
היתרונות של מערכת עריכת גנים בתפוקה גבוהה זו הם היכולת להימנע מתת-תקצוב וקטור DNA גוזל זמן רב, הגמישות בהעברת תאים עם שילובי RNA מנחים ייחודיים בפורמט של 24 בארות, וגנוטיפ PCR בעלות נמוכה יותר באמצעות ליזטים של תאים גולמיים. מחקרים המשתמשים בגישה יעילה זו מבטיחים לחשוף יתירות תפקודית ואינטראקציות סינרגטיות/אנטגוניסטיות בין חברי אשכול miRNA, אשר יסייעו באפיון רשתות הרנ”א הקטנות המורכבות שאינן מקודדות המעורבות במחלות אנושיות ויודיעו טוב יותר על תכנון טיפולי עתידי.
Introduction
נדרשים כלי מחקר טובים יותר כדי לחקור את התרומה של רנ”א שאינם מקודדים במחלות אנושיות. דיסרגולציה של MiRNA נצפית לעתים קרובות בהפרעות אנושיות כגון סרטן כאשר משווים את פרופילי הביטוי של רנ”א קטנים אלה שאינם מקודדים ברקמות ובנוזלי הגוף (למשל, דם, שתן) של חולי סרטן לעומת אנשים שאינם סרטניים ובריאים, שימוש במיקרו-מערכים, שימוש במיקרו-מערכים, PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR), וטכנולוגיות ריצוף עמוק מהדור הבא 1,2 . עבודות אחרונות אפיינו תת-קבוצה גדולה של miRNA אלה כגורמים מדכאי גידול, אונקוגניים וגרורות השולטים על היווצרות הגידול, התקדמות המחלה ועמידות לתרופות. ביטוי יתר ניסיוני ו/או הפחתה/אובדן של miRNAs גורמים להשלכות תפקודיות ופליוטרופיות בתא, המשקפות את המגוון הרחב של פעילויות הקשורות לסרטן ש-RNAs אלה אינם מקודדים מתאמים – גדילה, אפופטוזיס, התמיינות, שיפוץ כרומטין, אנגיוגנזה, אפיתל למזנכימלי (EMT) ומעברי MET, חילוף חומרים ותגובה חיסונית3.
MiRNAs מקודדים כגנים בודדים או חיים באשכולות גנומיים, אשר מתועתקים בגרעין ומעובדים באופן נרחב לפני שהם יוצרים את מיני ה-miRNA הבוגרים מבחינה ביולוגית, חד-גדיליים ~ 22 נוקלאוטידים (nt) הממוקמים בציטופלסמה4. הרנ”א הקטנים האלה מפעילים את השפעתם לאחר שעתוק ופועלים כרגולטורים של גנים שליליים הנקשרים למטרות רנ”א שליח (mRNA) באופן ספציפי לרצף כדי להביא את קומפלקס ההשתקה הקטליטי המושרה על ידי RNA (RISC) לאתר ה-mRNA, וכתוצאה מכך פירוק mRNA ו/או חסימה בתרגום חלבונים. MiRNAs הם קבוצה נפוצה ביותר של רנ”א שאינם מקודדים במערכות של בעלי חיים, ו-2,654 miRNAs בוגרים קיימים בגנום האנושי (miRBase release 22.1)5. MiRNAs בדרך כלל מקשרים עם השלמה לא שלמה למטרות ה-mRNA שלהם4. לכן, miRNA יחיד יכול לווסת עשרות למאות מטרות mRNA נפרדות ולהשפיע באופן פונקציונלי על מגוון רחב של מסלולים ביולוגיים. כדי להוסיף למורכבות של מנגנונים מבוססי miRNA, mRNA יחיד יכול להיות מווסת על ידי miRNA מרובים ומובחנים. לפיכך, קשה לחקור כיצד חוסר ויסות miRNA משבש את האיזון ההומאוסטטי של הגוף ומוביל לממאירות אנושית.
רוב המחקרים שפורסמו התמקדו ב-miRNA יחיד כאשר הם מאפיינים את תפקידם באירועי מחלה. עם זאת, כ-30% מגני ה-miRNA האנושיים מאורגנים ביחידות מקובצות באשכולות (בדרך כלל כ-10 קילו-בייסים [kb]) שלעתים קרובות מתועתקות באותו כיוון ומבוטאות במשותף, מה שמצביע על מערכת מתואמת ומורכבת של תקנת RNAלא מקודדת 6. צביר ה-miRNA האנושי הפוליציסטרוני הגדול ביותר הוא צביר 14q32 הכולל מבשרי miRNA של 54 miRNA. אחת מיחידות ה-miRNA המקובציות הנחקרות ביותר הקשורות לסרטן אנושי היא הצביר הפוליציסטרוני miR-17-92 המורכב מ-miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 ו-miR-92-1 השוכנים בתוך אינטרון 3 של ה-RNA הלא מקודד, c13orf25. אשכול miR-17-92 מוגבר לעתים קרובות בממאירות המטופויאטית ומתבטא יתר בגידולים מוצקים וביסס תפקידים אונקוגניים בקידום התקדמות מחזור התא, אפופטוזיס ואנגיוגנזה7. בנוסף, אשכול miR-15a ו-miR-16-1 הנמצא בתוך האינטרון של הגן הלא מקודד Leu2 נמחק לעתים קרובות בלוקמיה ומופחת בוויסות במגוון רחב של סוגי סרטן, ומתפקד כדי לחסום את צמיחת הגידול על ידי התמקדות בגן האנטי-אפופטוטי BCL2 ובגנים נוספים של התקדמות מחזור התא8. אשכול miR-888 מוגבר בחולים עם סרטן ערמונית בדרגה גבוהה ומורכב משבעה גנים miRNA (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b ו–891a) הממוקמים על כרומוזום אנושי Xq27.3 9,10.
אשכול miR-888 ממפה בתוך לוקוס HPCX1 (סרטן ערמונית תורשתי, X-linked 1) המשתרע על Xq27-2, אשר זוהה על ידי ניתוח הצמדה של אילן יוחסין משפחתי תורשתי של סרטן הערמונית 11,12,13,14,15,29. אפיון פונקציונלי של חברים בודדים באשכולות miR-888 באמצעות כלי ביטוי שגוי קונבנציונליים של miRNA – חיקויים של miRNA ומעכבי אנטיסנס – הצביע על כך ש-miRNA אלה ממלאים תפקידים חופפים בוויסות צמיחת גידול הערמונית ופלישהל-9,10. עם זאת, שיטות ניסיוניות אלה אינן מתאימות בקלות לחקר האופן שבו חברים מקובצים מרובים של miR-888 פועלים בסינרגיה או באופן אנטגוניסטי ברשת RNA שאינה מקודדת כדי לשלוט בהומאוסטזיס של רקמות ובהתקדמות הסרטן. פרוטוקול יעיל זה המתואר באמצעות טכנולוגיית עריכת גנים CRISPR בתפוקה גבוהה משתנה כדי לנתח מולקולרית אשכולות miRNA הקשורים לסוגי סרטן אנושיים (למשל, אשכול miR-888) כדי לגשר על פער הידע הזה.
גנים של קריספר חיידקי וקריספר (cas) מתווכים חסינות אדפטיבית נגד בקטריופאג’ים16. הגילוי של מערכת מעקב פרוקריוטית עתיקה זו הותאם במהירות ככלי מדעי יעיל כדי למקד בקלות כל לוקוס גנומי רצוי ולבצע שינויים ברצף הדנ”א במגוון רחב של מערכות בעלי חיים וסוגי תאים הן במבחנה והן ב- in vivo16,17. טכניקה זו טומנת בחובה הבטחה גדולה כשיטה יעילה לחקור רשתות miRNA בהקשר של מחלות אנושיות. לשם כך, פרוטוקול עריכת גנים זה של CRISPR בתפוקה גבוהה לחקר אשכול miR-888 המשתרע על פני כ-35 קילו-בייט על כרומוזום X אנושי בקווי תאים אנושיים מונצחים של סרטן הערמונית (LNCaP, PC3-ML) בנוי כדי לחקור כיצד חברי אשכול מתאמים את מסלולי התקדמות הסרטן. ניתן ליישם גישה זו לאפיון כל צביר miRNA ומאפשרת לחוקרים ליצור במהירות קווי תאים אנושיים הנושאים את כל מחיקת אשכול ה-miRNA ואת המחיקות של צבירי גנים בודדים ומשולבים של miRNA בניסוי יחיד.
בהליך זה, קווי תאים יציבים נוצרים הנושאים מערכת ביטוי לנטי-ויראלית בלתי ניתנת להשראה של דוקסיציקלין (DOX) המאפשרת לחוקר לשלוט בסטרפטוקוקוס פיוגנס קריספר הקשור לאנדונוקלאז Cas9 (csn1) באמצעות מקדם הגנים המכונן DOX-inducible TRE3G. מערכת Tet-On 3G bipartite כוללת גורם התארכות אנושי מכונן 1 אלפא (hEF1alpha) כדי להניע את השעתוק הן של הגן Tet-On 3G והן של הגן העמידות לבלצימידין (BlastR) כתעתיק דו-קריסטלוני. חלבון הטרנסאקטיבטור Tet-On 3G נקשר רק למקדם TRE3G בנוכחות DOX, וכתוצאה מכך נוצר שעתוק Cas9 חזק. בהיעדר DOX, אין ביטוי Cas9 בסיסי או מינימלי מאוד. לכן, החוקר יכול לגרום לייצור גבוה של חלבון Cas9 בתאים הגדלים במדיה בתוספת DOX במהלך שלבי עריכת הגנים של CRISPR ובקרה לפינוי מהיר של חלבוני CAS9 עם נסיגת DOX.
פרוטוקול זה מתאר גם את התכנון של אוליגונוקלאוטידים סינתטיים של CRISPR RNA (crRNA) המכוונים לאזורים המכוונים לאזורים המקיפים את כל צביר ה-miRNA, אזורי סיכת שיער (premiRNA) בודדים של miRNA ו/או תת-קבוצות של גנים של miRNA בתוך הצביר. כל crRNA מתוכנן מכיל רצף מדריך ייחודי של 5′-terminal 20 nt (משלים לרצף הגנומי של עניין שיש להתמקד בו), ואחריו רצף חוזר אינווריאנטי של 22 nt S. pyogenes (5′-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3′) המאפשר זיווג בסיסים עם האוליגונוקלאוטידים האוניברסליים של CRISPR RNA (tracrRNA) המפעילים טרנס-אקטיב18. יחד, ה-crRNA וה-tracrRNA המחושלים (יחס מעורב של 1:1) מתפקדים כרנ”א המנחה לפרוטוקול זה (איור 1A). בכל ניסוי, שני רנ”א מנחים סינתטיים מועברים לתאים המושרים על-ידי DOX כדי לקשר וללוות את חלבון ה-Cas9 החיידקי לאתרי הדנ”א הגנומיים (5′ ו-3′) המקיפים את אזור צביר ה-miRNA המיועד להסרה (איור 1B).
רצף מוטיב סמוך פרוטוספייסר (PAM) (5′-NGG-3′ עבור סוג פראי S. pyogenes Cas9) חייב להיות נוכח בגנום התא וממוקם מיד בסמוך לרצף הדנ”א של 20 nt המיועד על ידי ה-RNA המנחה17. רצף ה-PAM משמש כאות מקשר וממקם את האזור הקטליטי של האנזים אנדונוקלאז Cas9 באתר הדנ”א הגנומי הממוקד, מה שמוביל לאחר מכן לביקוע דנ”א מכוון ודו-גדילי (ds) הממוקם כ-3 nt במעלה הזרם של ה-PAM. מנגנון תיקון הדנ”א של התא מתקן את קצוות הדנ”א המנוקבים, מה שעלול לגרום לקשירת קשר מושלמת, אך לעתים קרובות מתרחשת הצטרפות סוף לא הומולוגית (NHEJ), מה שגורם להכנסות קטנות או מחיקות (אינדלים) באתר התיקון. מאחר ש-miRNAs הם גנים שאינם מקודדים הממוקמים לעתים קרובות באזורים אינטרגניים ואינטרוניים, האינדלים האלה נושאים סיכון נמוך ליצירת מוטציות לא רצויות של שטויות/מיסנס.
על ידי שימוש בקידוד RNA OLIgonucleotides סינתטיים (crRNA ו-tracrRNA מחושלים, יחס טוחן של 1:1) עבור קומפלקס הרנ”א המנחה בניסויים אלה, אסטרטגיית נוקאאוט גנים זו נמנעת מתת-תקצוב וקטור DNA גוזל זמן רב ומאפשרת גמישות עצומה בהעברת שילובי RNA מנחים ייחודיים לתאים בפורמט של 24 בארות. הכנת ליזטים של תאים גולמיים לסינון גנוטיפ PCR גם נמנעת משיטות טיהור דנ”א יקרות וגוזלות זמן רב, תוך שהיא מאפשרת יצירת קו יעיל של תאי מושבה בודדים וניתוח פנוטיפי יעיל. ואכן, פרוטוקול עריכת גנים זה של CRISPR בתפוקה גבוהה שימש בהצלחה כדי לבצע טרנספקטציה של קווי תאי סרטן ערמונית בתרבית (LNCaP, PC3-ML) עם 32 שילובי RNA מנחים ייחודיים בניסוי יחיד וליצור קווי נוקאאוט הנושאים מחיקות עבור כל אזור האשכול miR-888 של ~35 kb; צירופי מחיקה קטנים יותר עבור חברי אשכול miR-888 השייכים למשפחות miR-743 ו-miR-891a; כמו גם מחיקות עבור חברי miRNA בודדים בתוך אשכול miR-888. מחקרים כאלה יספקו הדגשה ברורה יותר של האופן שבו miRNA מקובצים מתפקדים בשיתוף פעולה כדי לווסת את צמיחת הגידול, האגרסיביות והעמידות לתרופות לפני תרגום miRNA למרפאה ככלים טיפוליים ואבחוןיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הליך עריכת גנים זה של קריספר מאפשר לחוקר ליצור במהירות פאנל שלם של קווי תאים הנושאים שילובים ייחודיים של מחיקת אשכולות miRNA. הטרנספקציה של רנ”א מנחים סינתטיים המורכבים מ-crRNA גנומיים ספציפיים לאתר 5′ ו-3′ המחושלים ב-tracrRNA סינתטי (יחס טוחנות של 1:1) בפרוטוקול זה מונעת תת-קלונינג של וקטור פלסמיד הגו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
קווי תאים PC3-ML סופקו בחביבות על ידי מארק סטרן (בית הספר לרפואה של אוניברסיטת דרקסל). ג’סטין טוקסי סייע בגנוטיפ PCR. עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן ברידן אדמס, קרן מחקר תרגומית של ריאן, ומענק של מועצת המחקר לבריאות של חבר העמים הבריטי (CHRB-274-11-20) ל- AE-K.
Materials
| 0.2 mL PCR tubes, flat cap | Fisher | 14-230-225 | Plasticware |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Plasticware |
| 24-well tissue culture plate | Corning Costar | 09761146 | Plasticware |
| 5x Phusion HF Buffer | Thermo Scientific | F-518L | PCR reagent, genotyping |
| 6-well tissue culture plate | Fisher | FB012927 | Plasticware |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 08-772-2C | Plasticware |
| Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal | AbCam | ab191468 | Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200 |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | Tisuue culture reagent |
| BLAST nucleotide search engine | National Center for Biotechnology Information | NA | Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov |
| Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes | Calbiochem | CAS 589205 | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | A50298 | Equipment; Cell counter |
| Cryogenic tubes | Thermo Scientific | 50001012 | Plasticware |
| Dharmacon CRISPR Design Tool | Horizon Discovery Ltd. | NA | Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer |
| DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 | Dharmacon, Inc. | T-2002-02 | Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231100 | Tisuue culture reagent |
| DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10013CV | Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells |
| Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution | Sigma-Aldrich | D3072-1ML | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | Tisuue culture reagent |
| Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed | Dharmacon, Inc. | U-002005-20 | CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides |
| Edit-R Modified Synthetic crRNA, desalted/deprotected, 2 nmol |
Dharmacon, Inc. | crRNA-460XXX | CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides |
| EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL | Dharmacon, Inc. | VCAS11227 | CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system |
| Ensembl genomic viewer | Ensembl | NA | Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences. |
| GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc25778 | Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500 |
| Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit | IBI Scientific | IB47010 | Nucleic acid gel electrophoresis reagent |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000044 | Tisuue culture reagent |
| Hexadimethrine bromide | MilliporeSigma | H9268 | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | MilliporeSigma | IPFL10100 | Western blot reagent; nitrocellulose |
| Intercept (TBS) Blocking Buffer | LI-COR | 927-60001 | Western blot reagent |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | Western blot reagent |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | Western blot reagent |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5425 R | Plasticware |
| miRBase microRNA viewer | miRBase | NA | Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb. |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well | Invitrogen | NP0321BOX | Western blot reagent |
| Odyssey CLx Imaging System | LI-COR | CLx | Equipment; Western blot imaging |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Transfection reagent |
| Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System | Owl | D2-BP | Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system |
| PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides) | Integrated DNA Technology | NA | PCR reagent, genotyping |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Scientific | F530S | PCR reagent, genotyping |
| RIPA Lysis Buffer 10x | MilliporeSigma | 20-188 | Western blot reagent |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Invitrogen | 25530049 | PCR reagent, genotyping |
| RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Scientific | EN0531 | PCR reagent, genotyping |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | MT10041CV | Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells |
| SnapGene Viewer | Snap Gene | NA | Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features |
| TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red | Gibco | 12563029 | Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | Nucleic acid gel electrophoresis reagent |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | 4375305 | Equipment |
| XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | Equipment; Protein gel electrophoresis system |
References
- Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Laurence, J. . Translating MicroRNAs to the Clinic. , 329-369 (2017).
- Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Thiagalingam, S. . Systems Biology of Cancer. , 134-153 (2015).
- Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs – microRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
- Breving, K., Esquela-Kerscher, A. The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2008).
- Kabekkodu, S. P., et al. Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases. Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).
- Xiang, J., Wu, J. Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis. Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).
- Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives. Cell Death & Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).
- Hasegawa, T., et al. Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate. Molecular Cancer Research. , (2018).
- Lewis, H., et al. miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration. Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).
- Xu, J., et al. Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome. Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).
- Schleutker, J., et al. A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease. Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).
- Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees. Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).
- Brown, W. M., et al. Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci. British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).
- Bochum, S., et al. Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families. Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- . SnapGene® software (from Insightful Science; available at snapgene.com) Available from: https://www.snapgene.com (2022)
- . Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI) Available from: https://www.ensembl.org (2022)
- Howe, K. L., et al. Ensembl 2021. Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).
- . miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory) Available from: https://www.mirbase.org (2022)
- . Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon) Available from: https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer (2022)
- . Off-Spotter (Venetia Pliatsika & Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center) Available from: https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/ (2022)
- Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).
- . Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents Available from: https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf (2022)
- Baffoe-Bonnie, A. B., et al. A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region. Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).
- Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates. Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).
- Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines. Recherche en cancérologie. 40 (3), 524-534 (1980).
- Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping. Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).
