Summary
酸化グラフェン窓を備えたマイクロパターンチップを新たに開発し、マイクロエレクトロメカニカルシステム技術を適用して製造し、さまざまな生体分子やナノ材料の効率的で高スループットな極低温電子顕微鏡イメージングを可能にします。
Abstract
極低温電子顕微鏡(cryo-EM)を用いた生体分子の効率的かつハイスループットな構造解析における主な制限は、ナノスケールで氷厚を制御したクライオEMサンプルを調製することの難しさです。シリコン(Si)ベースのチップは、厚さ制御された窒化シリコン(SixNy)膜上にパターン化された酸化グラフェン(GO)窓を有するマイクロホールの規則的な配列を有し、マイクロエレクトロメカニカルシステム(MEMS)技術を適用して開発された。UVフォトリソグラフィー、化学蒸着、薄膜のウェットエッチングおよびドライエッチング、および2Dナノシート材料のドロップキャスティングは、GO窓を有するマイクロパターンチップの量産に使用された。マイクロホールの深さは、クライオEM分析用の試料のサイズに応じて、必要に応じて氷の厚さを制御するために調整されます。生体分子に対するGOの良好な親和性は、クライオEMサンプル調製中に目的の生体分子をマイクロホール内に集中させます。GOウィンドウを備えたマイクロパターンチップは、さまざまな生体分子や無機ナノ材料のハイスループットクライオEMイメージングを可能にします。
Introduction
極低温電子顕微鏡(cryo-EM)は、タンパク質の3次元(3D)構造を天然状態に分解するために開発されました1、2、3、4。この技術は、ガラス質氷の薄層(10〜100nm)にタンパク質を固定し、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用してランダムに配向したタンパク質の投影画像を取得し、サンプルを液体窒素温度に維持することを含む。数千から数百万の投影画像が取得され、計算アルゴリズムによってタンパク質の3D構造を再構築するために使用される5,6。クライオEMによる分析を成功させるために、ブロッティング条件、湿度、温度を制御する装置をプランジフリーズすることにより、クライオサンプル調製が自動化されています。試料溶液を穴状の炭素膜を有するTEMグリッド上にロードし、連続的にブロットして余分な溶液を除去し、次いで液体エタンでプランジ凍結して薄いガラス質氷を生成する1,5,6。クライオEMの進歩とサンプル調製7の自動化に伴い、クライオEMは、ウイルスのエンベロープタンパク質や細胞膜のイオンチャネルタンパク質などのタンパク質の構造を解決するためにますます使用されています8、9、10。病原性ウイルス粒子のエンベロープタンパク質の構造は、ウイルス感染の病態を理解し、COVID-19パンデミックを引き起こしたSARS-CoV-2 11などの診断システムとワクチンを開発するために重要です。また、クライオEM技術は、電池12,13,14や触媒系14,15に用いられる光感応性材料のイメージングや、溶液状態の無機材料の構造解析16など、近年材料科学にも応用されている。
クライオEMおよび関連技術の著しい発展にもかかわらず、クライオサンプル調製には限界があり、ハイスループット3D構造解析の妨げとなっています。最適な厚さの硝子体氷膜を作製することは、原子分解能を有する生物材料の3D構造を得るために特に重要である。氷は、氷によって散乱された電子からのバックグラウンドノイズを最小限に抑え、電子ビーム経路1,17に沿った生体分子の重なりを禁止するのに十分なほど薄くなければならない。しかし、氷が薄すぎると、タンパク質分子が好ましい向きで整列したり、変性したりする可能性があります18、19、20。したがって、ガラス質氷の厚さは、目的の材料のサイズに応じて最適化する必要があります。さらに、サンプル調製と、調製されたTEMグリッド上の氷およびタンパク質の完全性の手動スクリーニングには、通常、広範な努力が必要です。このプロセスは非常に時間がかかり、ハイスループットな3D構造解析の効率を妨げます。したがって、クライオEMサンプル調製の信頼性と再現性の向上は、構造生物学および商業創薬、ならびに材料科学におけるクライオEMの利用を強化するであろう。
ここでは、氷の厚さを制御したハイスループットクライオEM用に設計された酸化グラフェン(GO)ウィンドウを備えたマイクロパターンチップを製造するための微細加工プロセスを紹介します21。マイクロパターン化されたチップは、イメージング目的に応じてチップの構造と寸法を操作できるマイクロエレクトロメカニカルシステム(MEMS)技術を使用して製造されました。GOウィンドウを備えたマイクロパターンチップは、サンプル溶液で充填できるマイクロウェル構造を有し、マイクロウェルの深さを調整してガラス質氷の厚さを制御することができる。生体分子に対するGOの強い親和性により、可視化のための生体分子の濃度が向上し、構造解析の効率が向上します。さらに、マイクロパターン化されたチップはSiフレームで構成されており、グリッド19に高い機械的安定性を提供し、サンプル調製手順およびクライオEMイメージング中のチップの取り扱いに最適です。したがって、MEMS技術によって作製されたGOウィンドウを備えたマイクロパターンチップは、クライオEMサンプル調製の信頼性と再現性を提供し、クライオEMに基づく効率的でハイスループットな構造解析を可能にします。
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Protocol
1. GO窓付きマイクロパターンチップの作製(図1)
- 窒化ケイ素を堆積させる。
- 170 sccmのジクロロシラン(SiH2Cl2、DCS)および38 sccmアンモニア(NH3)のフロー下で、830°C、圧力150mTorrの低圧化学気相成長(LPCVD)を使用して、Siウェーハの両面(直径4インチ、厚さ100μm)に低応力窒化シリコン(SixNy)を堆積させる。
- 約30Å/minの堆積速度を使用して、堆積時間を変えることによってSixNy厚さを25〜100nm以内に制御する。
メモ:Siウェーハの取り扱いには、ウェーハが非常に薄くて壊れやすいため、細心の注意を払ってください。ウェーハの取り扱い中や機器へのロード中にウェーハを曲げないように注意してください。
- フォトレジストをパターニングする。
- SixNy蒸着Siウェーハ上にヘキサメチルジシラザン(HMDS)溶液をウェーハの表面全体を覆うのに十分な体積で塗布し、スピンコーターで3,000rpmで30秒間スピンコートし、ホットプレート上で95°Cで30秒間ベークしてウェーハ表面を疎水性にし、フォトレジスト(PR)による良好なコーティング性能を確保します。
- ウェーハの全面を覆うのに十分な体積のポジティブPR(材料表)を塗布し、3,000rpmで30秒間スピンコートし、ホットプレート上で100°Cで90秒間ベークする。スピンコートPRは、500nmの厚さを有する。
- PRコーティングされたウェーハを、アライナーを使用してクロムマスク(図2A-D)を介して紫外光(波長365nm、強度20mW/cm2)で5秒間露光します。
- 現像液(材料表)を使用してPRを1分間現像し、ウェーハを脱イオン(DI)水に2倍浸漬してリンスします。ウエハ表面にN2 ガスを吹き付けて、PRパターン化されたウェーハを完全に乾燥させます。
注:SiウェーハにN2ガスを吹き込む際には、ウェーハが非常に薄くて壊れやすいため、細心の注意を払ってください。N2ガスをウェーハに垂直な方向に高圧で吹き付けると、ウェーハが破壊する恐れがありますので、おやめください。
- Sixnyをパターン化する。
- ラボで構築された反応性イオンエッチャー(RIE)を使用して、50Wの無線周波(RF)電力で3sccmの六フッ化硫黄(SF6)ガスを使用して、PRのパターニングに続いて露出したSixNyをエッチングします。これらの設定でのエッチングレートは〜6 Å/sです。成膜するSixNy層の厚さに応じてエッチング時間を設定する。
メモ:エッチングレートは、使用するRIE機器の仕様によって異なり、ラボ内で最適化する必要があります。 - SixNyパターン化されたウェーハをアセトンに室温で30分間浸漬してPRを排除し、続いてDI水2xに浸漬してウェーハをリンスした。ウェーハ表面にN2ガスを吹き付けてウェーハを完全に乾燥させる。
メモ:溶液からウェーハを浸漬または取り出す際には、ウェーハが溶液の表面張力によって破断する可能性があるため、細心の注意を払ってください。溶液の表面に平行なウェーハを浸漬または取り出しないでください。カーボンファイバーチップを備えた精密ウェーハハンドリングピンセットを使用してください。ピンセットでウェーハを強くつかまないでください。ウェーハが斜めに傾くまでウェーハの片側を持ち上げ、溶液から取り出すことができます。ウェーハは、持ち上げ時のしっかりとしたグリップのために曲がると割れることがあります。
- ラボで構築された反応性イオンエッチャー(RIE)を使用して、50Wの無線周波(RF)電力で3sccmの六フッ化硫黄(SF6)ガスを使用して、PRのパターニングに続いて露出したSixNyをエッチングします。これらの設定でのエッチングレートは〜6 Å/sです。成膜するSixNy層の厚さに応じてエッチング時間を設定する。
- Siをエッチングする。
- 5 M水酸化カリウム(KOH)溶液を80°CのDI水に溶解してKOH粉末を調製した。
- パターン化されたSixNyウェーハをKOH溶液に浸漬して、露出したSiをエッチングし、パターン化されたSixNyの反対側で自立型SixNy窓が観察できるまで、ウェーハを溶液中に攪拌しながら残す。
注:ウェットエッチング時間は、Siの厚さによって異なる場合があります。厚さ100μmのウェーハの場合、ウェットエッチングには通常数時間かかります。Siエッチング中に攪拌速度を高く設定しすぎないでください、なぜなら自立型SixNy窓は非常に薄く、流体の流れによって破壊される可能性があるためです。本実験では、攪拌速度を250rpmとした。 - エッチングしたウェーハをDIウォーターバスに数回浸漬して洗浄し、エッチング残渣を除去します。ウェーハを空気中で乾燥させます。
注:自立型SixNy窓は非常に薄くて壊れやすく、溶液の表面張力によって破壊される可能性があるため、Siパターンウェーハを溶液から浸漬または取り出している間は、細心の注意を払う必要があります。ウェーハは、ウェーハの端が最初に溶液に出入りするように、斜めに浸漬または取り出す必要があります。
- KOHエッチング残渣を除去します。
- ピンセットでチップアレイの境界を軽く押して、マイクロパターン化されたチップのアレイを取得します(図1B)。
- 攪拌しながら80°Cで1.5 M KOH溶液を調製した。
- チップアレイをKOH溶液に30秒間浸漬し、DI水2xに浸してリンスします。N2ガスを吹き付けてチップを完全に乾燥させます。
注:自立型SixNy窓は非常に薄くて壊れやすいため、チップを溶液に浸し、N2ガスでブロードライする場合は、細心の注意を払ってください。チップをKOH溶液に浸漬している間、攪拌は停止すべきである。チップは、最初に溶液に垂直な方向にエッジで浸漬し、平行方向にN2ガスを吹き込む必要があります。 - チップアレイを空気中で少なくとも1時間完全に乾かします。
- PR をパターン化します。
- 固体支持体としてブランク525μmSiウェハを用意した。上記のように、SiウェーハをHMDSとポジティブPRでスピンコートしますが、PRをベークする前にSiウェーハ上にチップアレイ(自立型SixNy窓側を上向きにして)を取り付けます。PRは、ウェハとチップアレイとの間の接着剤として作用する。チップアレイで取り付けたSiウェハをホットプレート上で100°Cで90秒間ベークする。
- 上述のように、チップセットをHMDSおよびポジティブPRでスピンコートする。
- アライナーを使用して、チップセットを紫外光(波長365nm、強度20mW/cm2 )でクロムマスク(図2E、F)を通して5秒間露光します。
- 現像液で15秒間現像し、DI水2xに浸漬してチップセットをリンスし、N2 ガスを吹き付けてPRパターン化されたチップセットを十分に乾燥させます。
- マイクロパターン化されたSixNyを準備する。
- ラボで構築されたRIEを使用して、3 sccm SF6ガスで50 WのRFパワーで、PRパターニングに続いてSi xNyをエッチングします。
- PR を削除します。
- パターン化されたチップセットを60°Cの1-メチル-2-ピロリジノン(NMP)溶液に浸漬し、一晩放置することにより、PRを排除する。チップセットをDI水2xに浸漬してリンスし、N2 ガスを吹き付けてパターン化されたチップセットを完全に乾燥させます。
- ラボで構築されたRIEを使用して、150W のRFパワーで100 sccm O2ガスを使用するO2 プラズマプロセスでPR残留物を除去します。
- マイクロパターンのチップですすいでください。
- 5 M KOH溶液を80°Cで調製する。
- マイクロパターン化されたチップをKOH溶液に30秒間浸漬してPR残留物を完全に除去し、DI水2xに浸漬してチップをリンスします。N2ガスを吹き付けてチップを完全に乾燥させます。
- 少なくとも1時間、空気中のチップを完全に乾かします。
- 酸化グラフェン(GO)をドロップキャスト法により転写する。
- GO溶液(2 mg / mL)をDI水で0.2 mg / Lに希釈し、GOシートの凝集体を分解するために10分間超音波処理します。希釈したGO溶液を300 x g で30秒間遠心分離する。
- マイクロパターンチップのSiエッチング側をグロー放電し、グローディスチャージャ(材料表)を使用してチップ表面を15mAで1分間正電荷でレンダリングします。
- GO溶液3μLをマイクロパターンチップのグロー放電側に滴下し、チップ上に1分間放置する。1分後、チップ上の余分なGO溶液をろ紙で拭き取ります。
- GO転写チップをパラフィン膜上に調製したDI水滴で洗浄し、チップ上のDI水をろ紙で拭き取ります。この手順を GO 転送側で 2 倍、反対側で 1 倍繰り返します。GO転写チップを室温で一晩乾燥させます。
- マイクロパターンのチップをDI水に浸してGOウィンドウで洗浄し、チップをN2 ガスでブロードライします。
2. クライオEMイメージング
- クライオサンプルを調製する。
- 温度、湿度、吸い取り時間、および力を制御する機械式クライオプランジマシン(材料表)を使用してクライオサンプルを調製します。ブロッターにブロッティングパッドをロードした後、チャンバー内の湿度と温度がそれぞれ100%と15°Cに維持されていることを確認してください。
- 一般的なクライオピンセットでマイクロパターンチップを拾い上げ、ピンセットをクライオプランジマシンにロードします。ピペット3 μLのサンプル溶液を、穴パターン側のマイクロパターンチップ上に、底部にGOウィンドウを取り付けます。試料溶液に応じてブロッティング時間と力を制御します。
注:ここでは、生物標本、すなわちヒト免疫不全ウイルス(HIV-1)、フェリチン、プロテアソーム26S、groEL、アポフェリチンタンパク質粒子、およびタウフィラメントタンパク質をクライオEMイメージングに使用した。さらに、クライオEMイメージングには、Fe2O3ナノ粒子(NP)、Auナノ粒子、Auナノロッド、シリカナノ粒子などの多様な種類の無機材料が使用されました。所望のブロッティング時間と力を、異なるタイプのサンプルについてクライオプランジャーに設定した。 - ブロッティングプロセスの後、サンプルをロードしたチップを直ちに液体エタンにプランジフリーズします。チップを液体窒素(LN 2)のグリッドボックスに移し、クライオEMイメージングの前にLN2に保管します。
- クライオEMイメージングを実行します。
- クライオサンプルをクライオEMホルダーにセットし、温度を-180°Cに保ちます。
- クライオEMホルダーをTEMにロードし、最小線量システム(MDS)モードでサンプルを観察します。
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Representative Results
GOウィンドウを備えたマイクロパターンチップは、MEMS製造と2D GOナノシート転写によって製造されました。マイクロパターニング用のチップを量産し、ウェーハ内の4個から約500個のチップを作製した(図1Bおよび図2A,B)。マイクロパターンチップの設計は、フォトリソグラフィー手順中に異なる設計のクロムマスク(図2)を使用して操作することができます。作製されたマイクロパターンチップは、自立型SixNy膜の数と寸法を制御していた。自立型Si xNy膜の数は、48(6 x 8)から50(5 x 10)まで、寸法は50 x 40 μm 2から250 x40 μm2に制御されました(図3A、B、F、G)。各自立型SixNy膜は、異なる穴間隔で2〜3μmの範囲のカスタマイズ可能な直径を有する数十〜数百のマイクロホールを有することができる。作製されたマイクロパターンチップには最大25,000個のGO懸架穴があり、穴の数も制御可能です(図3B-Dおよび図3G-I)。正孔を横切る薄いGO層の存在は、ラマン分光法および電子回折によって確認された。GOウィンドウでのラマンスペクトルは、GOの代表的なピーク、すなわち1360cm-1および1590cm-1のDバンドおよびGバンドをそれぞれ22個示した(図3E)。多重配向六角形回折パターンは、ウィンドウが多層GOで構成されていることを示しています(図3J)。
GO窓付きマイクロパターンチップを、LPCVDプロセス中にSiウェハ上のSixNyの堆積厚さを制御することにより、3つの代表的なターゲット深さ(25nm、50nm、および100nm)で作製し、マイクロホールの深さを規制する実現可能性を確認した。GO窓を有するマイクロホールの構造および厚さを評価するために、GO窓を有するマイクロパターンチップの40°傾斜および断面走査型電子顕微鏡(SEM)画像および原子間力顕微鏡(AFM)画像を得た。GO窓を有するマイクロホールのウェル型構造が明瞭に観察され、マイクロホールの深さは目標深さに対応する(図4)。この結果は、GOウィンドウによるマイクロパターンチップの数と設計の制御が可能であることを裏付けています。
クライオEMイメージングのためのマイクロパターンチップの使用を実証するために、マイクロパターンチップを使用して生体分子および無機NPの様々なクライオサンプルを調製した。生物標本について、HIV-1、フェリチン、プロテアソーム26S、groEL、アポフェリチンタンパク質粒子、およびタウフィラメントタンパク質を、GOウィンドウを備えたマイクロパターンチップを用いてクライオEMでイメージングした(図5A-F)。生体分子の他に、Fe2O3NP、AuNP、Auナノロッド、シリカNPなどの無機材料も、マイクロパターンチップを用いたクライオEMによって観察された(図5G-J)。
図1:クライオEM用GOウィンドウを備えた新開発のマイクロパターンチップの製造手順の回路図と画像。 (A)製造プロセスの回路図と、製造プロセス中のGOウィンドウを備えたマイクロパターンチップの断面図。(B)各製造工程における製造製品の画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:フォトリソグラフィープロセスに使用されるクロムマスクの簡単な説明図(A,B)4インチSiウェハ用チップの量産用マスク設計(24 x 24アレイのチップ)、(C,D)2 x 2アレイのチップ設計、および(E,F)マイクロホールパターンの設計。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:GOウィンドウを有するマイクロパターンチップの構造、(A,F)マイクロパターンチップ全体の光学顕微鏡像、(B,G)単一マイクロパターンSixNy膜のSEM画像、(C,H)マイクロパターンのSEM画像、および(D,I)GO窓を有する単一マイクロホールのSEM画像。(E,J)GO窓の(E)ラマンスペクトルおよび(J)選択された領域電子回折(SAED)パターンを通るマイクロホールにおけるGOの確認。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:GO窓を有するマイクロホールのウェル構造および深さ、(A-C)GO窓を有する単一のマイクロホールの40°傾斜SEM画像、および(D-F)異なる深さ(25nm、50nm、および100nm)のGO窓を有するマイクロパターンチップの断面SEM画像。(G)原子間力顕微鏡(AFM)3Dレンダリング画像、(H)AFM偏向画像、および(I)100nmのSixNy膜で作製されたGOウィンドウを有するマイクロパターンチップの深さを示す(H)の赤い線に沿った線状プロファイル。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:(A)HIV-1ウイルス粒子、(B)フェリチン、(C)プロテアソーム26S、(D)groEL、(E)アポフェリチン、(F)タウタンパク質(フィブリル化タウタンパク質を示す矢印)、(G)Fe2O3NP、(H)AuNP、(I)Auナノロッド、および(J)シリカNP。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、GOウィンドウを備えたマイクロパターンチップを製造するための微細加工プロセスを紹介します。作製されたマイクロパターンチップは、分析する材料のサイズに応じてGO窓を有するマイクロホールの深さを制御することによって、硝子体氷層の厚さを調節するように設計されています。GOウィンドウを備えたマイクロパターンチップは、一連のMEMS技術と2Dナノシート転写法を使用して製造されました(図1)。MEMS製造技術を使用する主な利点は、大量生産の能力と、フォトリソグラフィー中に異なる設計のクロムマスクを使用してマイクロチップの構造と寸法を操作することの実現可能性です(図2)。低応力のLPCVD堆積Si xNy層は、数十ナノメートルの厚さの自立型SixNy23,24,25,26の安定性を保証します。しかしながら、ナノメートルスケールの自立型SixNy層は、依然として垂直方向27の力に対して脆弱である。そのため、マイクロパターンチップを取り扱う際は、溶液に浸漬する場合やブロードライする場合など、細心の注意が必要です。さらに、マイクロパターンチップの製造プロセスでは、100μmのSiウェーハを使用しており、ほとんどのクライオEM試料ホルダおよびオートローダとの互換性を保証します。ただし、製造プロセス中には、壊れやすいウェーハが破砕するのを防ぐために注意が必要です。
GO窓を有するウェル型構造のミクロンスケールの規則的な配列を、光学顕微鏡およびSEMで確認した(図3および図4)。また、GOを転写するドロップキャスティング法は、高い平坦度で目立ったしわのないGO成膜を可能にします(図3D,E,I,J)。マイクロパターンチップはクライオEMオートローダへのロードに適しており、通常のアレイ内の数ミクロンスケールの穴により、単一粒子分析のための大きな画像データの自動収集が可能です。また、SixNy膜やGO支持マイクロホールの数や形態は、MEMS製造プロセスで容易に操作できるため、研究目的に応じてハイスループットな単粒子解析などのクライオEMイメージング実験が可能です。さらに、厚さが制御されたマイクロパターンチップの拡張された用途は、ナノメートルスケールでパターニングされた穴を有するチップの製造によって促進され得る。半導体業界で開発されたナノパターニング技術は、それらのチップ28、29、30の製造に採用することができる。
マイクロホールの深さを調整する能力は、25nm、50nm、および100nmの3つの代表的なターゲット深さでGOウィンドウを備えたマイクロパターンチップを製造することによってここで実証されています。マイクロウェル構造の異なる深さは、Siウェーハ上のSixNy層の堆積時間を制御することによって達成された(図4)。GO窓を有するマイクロパターンチップの形態および厚さを評価するために、集束イオンビーム(FIB)断面から得られたデバイスの断面をSEMで観察し、深さプロファイルをAFMで測定した(図4)。GO窓を有するマイクロホールのウェル型構造はSEMおよびAFM画像に明確に示され、SixNyマイクロホールの深さの制御およびGO窓の転写の成功が確認された。GOウィンドウを備えたカスタマイズ可能なマイクロパターンチップを使用することで、クライオEMイメージングに最適な氷厚の領域で高い成功率が保証される可能性があります。
クライオEMで観察する材料のサイズが異なるため、適切な厚さのガラス質氷を製造すると、コントラスト分解能の向上、広い配向カバレッジ、およびクライオEMイメージング中の構造の変性の低減を確保できます。生物学的応用のためのクライオEMイメージングプロセスの使用を実証するために、HIV-1、フェリチン、プロテアソーム26S、groEL、アポフェリチン、タウタンパク質を含む異なるサイズの様々な生物学的サンプルを、GOウィンドウを備えたマイクロパターンチップを用いて画像化した。生体分子は、GOウィンドウを備えたマイクロパターンチップを使用して明確に観察された(図5A-F)。生体分子以外にも、Fe2O3NP、AuNP、Auナノロッド、シリカNPなどの多様な種類の無機ナノ材料も、GO窓を有するマイクロパターンチップを用いて観察された(図5G-J)。マイクロパターン化されたチップおよび作製方法は、様々な材料のクライオイメージングに対する適合性を示す。したがって、GOウィンドウを備えた新しく開発されたマイクロパターンチップは、クライオEMによる効率的でハイスループットな構造分析のための信頼性が高く再現性のあるサンプル調製戦略を提供します。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
M.-H.K.、S.K.、M.L.、J.P.は、基礎科学研究所からの財政的支援を認める(Grant No.IBS-R006-D1)。S.K.、M.L.、J.P.は、ソウル大学校(2021年)を通じたクリエイティブ・パイオニア研究者プログラムからの財政的支援と、韓国政府(MSIT;グラント番号NRF-2020R1A2C2101871、およびNRF-2021M3A9I4022936)。M.L.とJ.P.は、ポスコTJパーク財団のポスコ科学フェローシップと韓国政府(MSIT;付与番号NRF-2017R1A5A1015365)。JPは、韓国政府(MSIT;付与番号NRF-2020R1A6C101A183)、ソウル大学校工学部・医学部による学際的研究イニシアティブプログラム(2021年)。M.-H.K.は、韓国政府(MSIT;付与番号NRF-2020R1I1A1A0107416612)。著者らは、ソウル大学高分子・細胞イメージングセンター(SNU CMCI)のスタッフとクルーに、クライオEM実験に対するたゆまぬ努力と忍耐力に感謝している。著者らは、FIB-SEM実験の支援をしてくれた国立大学共同利用研究センターのS. J. Kim氏に感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma Aldrich, USA | 443778 | |
| Acetone | |||
| AFM | Park Systems, South Korea | NX-10 | |
| Aligner | Midas System, South Korea | MDA-600S | |
| AZ 300 MIF developer | AZ Electronic Materials USA Corp., USA | 184411 | |
| Cryo-EM holder | Gatan, USA | 626 single tilt cryo-EM holder | |
| Cryo-plunging machine | Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA | Vitrobot Mark IV | |
| Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) | FEI Company, USA | Helios NanoLab 650 | |
| Glow discharger | Ted Pella Inc., USA | PELCO easiGlow | |
| Graphene oxide (GO) solution | Sigma Aldrich, USA | 763705 | |
| Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% | Alfa Aesar, USA | 10226590 | |
| Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) | Centrotherm, Germany | LPCVD E1200 | |
| maP1205 positive PR | Micro resist technology, Germany | A15139 | |
| Potassium hydroxide (KOH), flake | DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea | 6597-4400 | |
| Raman Spectrometer | NOST, South Korea | Confocal Micro Raman System HEDA | |
| Reactive ion etcher (RIE) | Scientific Engineering, South Korea | Lab-built | |
| SEM | Carl Zeiss, Germany | SUPRA 55VP | |
| Si wafer | JP COMMERCE, South Korea | 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um | |
| Spin coater | Dong Ah Trade Corp., South Korea | ACE-200 | |
| TEM | JEOL, Japan | JEM-2100F |
References
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