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Engineering

Fabricação de chip micro-padronizado com espessura controlada para microscopia eletrônica criogênica de alta produtividade

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63739
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3,4, 3,4,5,6
1Department of Biomedical-Chemical Engineering, The Catholic University of Korea, 2Department of Biotechnology, The Catholic University of Korea, 3School of Chemical and Biological Engineering, and Institute of Chemical Processes, Seoul National University, 4Center for Nanoparticle Research, Institute of Basic Science (IBS), 5Institute of Engineering Research, College of Engineering, Seoul National University, 6Advanced Institutes of Convergence Technology, Seoul National University

Summary

Um chip micro-padronizado recém-desenvolvido com janelas de óxido de grafeno é fabricado aplicando técnicas de sistema microeletromecânico, permitindo imagens eficientes e de microscopia criogênica de elétrons de vários biomoléculas e nanomateriais.

Abstract

Uma grande limitação para a análise eficiente e de estrutura de alto rendimento de biomoléculas usando microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) é a dificuldade de preparar amostras crio-EM com espessura de gelo controlada na nanoescala. O chip à base de silício (Si), que tem uma matriz regular de micro-buracos com janela de óxido de grafeno (GO) padronizado em um filme de nitreto de silício controlado pela espessura (SixNy), foi desenvolvido aplicando técnicas de sistema microeletrocrânico (MEMS). Fotolitografia UV, deposição de vapor químico, gravura molhada e seca do filme fino e lançamento de materiais de nanofolha 2D foram usados para a produção em massa dos chips micro-padronizados com janelas GO. A profundidade dos micro-buracos é regulada para controlar a espessura do gelo sob demanda, dependendo do tamanho do espécime para análise crio-EM. A afinidade favorável do GO em relação às biomoléculas concentra as biomoléculas de interesse dentro do microrifício durante a preparação da amostra crio-EM. O chip micro-padronizado com janelas GO permite imagens crio-EM de alto rendimento de várias moléculas biológicas, bem como nanomateriais inorgânicos.

Introduction

A microscopia eletrônica criogênica (crio-EM) foi desenvolvida para resolver a estrutura tridimensional (3D) de proteínas em seu estado natal 1,2,3,4. A técnica envolve a fixação de proteínas em uma camada fina (10-100 nm) de gelo vítreo e a aquisição de imagens de projeção de proteínas orientadas aleatoriamente usando um microscópio eletrônico de transmissão (TEM), com a amostra mantida à temperatura de nitrogênio líquido. Milhares a milhões de imagens de projeção são adquiridas e usadas para reconstruir uma estrutura 3D da proteína por algoritmos computacionais 5,6. Para uma análise bem-sucedida com crio-EM, a preparação crio-amostra foi automatizada por meio do congelamento do equipamento que controla as condições de mancha, umidade e temperatura. A solução amostral é carregada em uma grade TEM com uma membrana de carbono furada, sucessivamente borrada para remover a solução em excesso, e, em seguida, mergulha-congelada com etano líquido para produzir gelo fino e vítreo 1,5,6. Com os avanços da crio-EM e a automação da preparação da amostra7, a crio-EM tem sido cada vez mais utilizada para resolver a estrutura de proteínas, incluindo proteínas envelope para vírus e proteínas do canal de íons na membrana celular 8,9,10. A estrutura das proteínas envelope de partículas virais patogênicas é importante para a compreensão da patologia da infecção viral, bem como para o desenvolvimento do sistema de diagnóstico e vacinas, por exemplo, SARS-CoV-211, que causou a pandemia COVID-19. Além disso, técnicas crio-EM foram recentemente aplicadas às ciências materiais, como para materiais sensíveis ao feixe de imagem utilizados na bateria 12,13,14 e sistemas catalíticos 14,15 e análise da estrutura de materiais inorgânicos em estado de solução16.

Apesar dos desenvolvimentos perceptíveis em crio-EM e técnicas relevantes, existem limitações na preparação da criom amostra, dificultando a análise da estrutura 3D de alto rendimento. Preparar um filme de gelo vítreo com espessura ideal é especialmente importante para a obtenção da estrutura 3D de materiais biológicos com resolução atômica. O gelo deve ser fino o suficiente para minimizar o ruído de fundo de elétrons espalhados pelo gelo e proibir sobreposições de biomoléculas ao longo do caminhodo feixe de elétrons 1,17. No entanto, se o gelo é muito fino, pode fazer com que moléculas de proteínas se alinhem em orientações preferenciais ou desnaturais 18,19,20. Portanto, a espessura do gelo vítreo deve ser otimizada dependendo do tamanho do material de interesse. Além disso, um esforço extensivo é normalmente necessário para a preparação da amostra e a triagem manual da integridade do gelo e da proteína nas grades TEM preparadas. Esse processo é extremamente demorado, o que dificulta sua eficiência para análise de estrutura 3D de alto rendimento. Portanto, melhorias na confiabilidade e reprodutibilidade da preparação da amostra crio-EM aumentariam a utilização da crio-EM na biologia estrutural e na descoberta de medicamentos comerciais, bem como na ciência material.

Aqui, introduzimos processos de microfabização para a fabricação de um chip micro-padronizado com janelas de óxido de grafeno (GO) projetados para crio-EM de alta produtividade com espessura de gelo controlada21. O chip micro-padronizado foi fabricado usando técnicas de sistema microeletromecânico (MEMS), que podem manipular a estrutura e as dimensões do chip dependendo dos propósitos de imagem. O chip micro-padronizado com janelas GO tem uma estrutura de microwell que pode ser preenchida com a solução de amostra, e a profundidade da microwell pode ser regulada para controlar a espessura do gelo vítreo. A forte afinidade do GO com as biomoléculas aumenta a concentração de biomoléculas para visualização, melhorando a eficiência da análise da estrutura. Além disso, o chip micro-padronizado é composto por um quadro Si, que proporciona alta estabilidade mecânica para a grade19, tornando-o ideal para manusear o chip durante os procedimentos de preparação da amostra e imagens crio-EM. Portanto, um chip micro-padronizado com janelas GO fabricadas por técnicas MEMS fornece confiabilidade e reprodutibilidade da preparação da amostra crio-EM, que pode permitir uma análise eficiente e de estrutura de alto rendimento com base no crio-EM.

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Protocol

1. Fabricação de chip micro-padronizado com janelas GO (Figura 1)

  1. Deposite o nitreto de silício.
    1. Deposite nitreto de silício de baixo estresse (SixNy) em ambos os lados do wafer Si (4 polegadas de diâmetro e 100 μm de espessura) usando deposição de vapor químico de baixa pressão (LPCVD) a 830 °C e uma pressão de 150 mTorr, sob um fluxo de 170 sccm diclorosilane (SiH2Cl2, DCS) e amônia de 38 sccm (NH3).
    2. Usando uma taxa de deposição de ~30 Å/min, controle a espessura sixNy para estar dentro de 25-100 nm variando o tempo de deposição.
      NOTA: Deve-se tomar muito cuidado ao manusear o wafer Si porque o wafer é muito fino e frágil. Tome cuidado para não dobrar o wafer durante o manuseio ou carregamento no equipamento.
  2. Padrone o fotoresist.
    1. Aplique uma solução de hexametiethyldisilazane (HMDS) no wafer SixNy-depositado si com volume suficiente para cobrir toda a superfície do wafer, gire casaco com um revestr de spin a 3.000 rpm por 30 s, e asse a 95°C por 30 s em uma placa quente para tornar a superfície hidrofóbica da superfície do wafer e, assim, garantir um bom desempenho de revestimento com fotoistres (PR).
    2. Aplique RP (Tabela de Materiais) positiva com volume suficiente para cobrir toda a superfície do wafer, gire o casaco a 3.000 rpm por 30 s e asse a 100 °C por 90 s em uma placa quente. Pr revestido de spin tem uma espessura de 500 nm.
    3. Exponha o wafer revestido de RP com luz ultravioleta (comprimento de onda de 365 nm e intensidade de20 mW/cm 2) por 5 s através de uma máscara de cromo (Figura 2A-D) usando um alinhador.
    4. Desenvolva o PR por 1 min usando um desenvolvedor (Tabela de Materiais) e enxágue o wafer imergindo-o em água deionizada (DI) 2x. Seque totalmente o wafer com padrão pr soprando gás N2 na superfície do wafer.
      NOTA: Deve-se tomar cuidado ao soprar gás N2 no wafer Si porque o wafer é muito fino e frágil. Não sopre gás N2 com alta pressão em direção perpendicular ao wafer, pois isso pode causar a fratura do wafer.
  3. Padre o SixNy.
    1. Etch o SixNy exposto seguindo a padronização do RP usando um íon reativo construído em laboratório etc(RIE), com 3 sccm de hexafluoreto de enxofre (SF6) a um poder de radiofrequência (RF) de 50 W. A taxa de gravação com essas configurações é de ~6 Å/s. Ajuste o tempo de gravação dependendo da espessura da camada SixNy depositada.
      NOTA: A taxa de gravação pode variar e precisa de otimização em laboratório, dependendo das especificações do equipamento RIE utilizado.
    2. Elimine o RP imergindo o wafer padrão SixNy em acetona à temperatura ambiente por 30 minutos, seguido por enxaguar o wafer imergindo-o em água DI 2x. Seque totalmente o wafer soprando gás N2 na superfície do wafer.
      NOTA: Devem ser tomados extremos cuidados ao mergulhar ou retirar o wafer das soluções porque o wafer pode ser fraturado pela tensão superficial da solução. Não mergulhe ou tire o wafer paralelamente à superfície da solução. Use pinças de manuseio de wafer de precisão com pontas de fibra de carbono. Não pegue fortemente o wafer com a pinça; levantar um lado do wafer até que o wafer se incline para um ângulo, onde ele pode ser retirado da solução. O wafer pode fraturar quando se curva devido à aderência firme durante o levantamento.
  4. Etch the Si.
    1. Prepare uma solução de hidróxido de potássio de 1,5 M (KOH) dissolvendo o pó KOH em água DI a 80 °C.
    2. Mergulhe o wafer padrão SixNy na solução KOH para gravar o Si. Deixe o wafer na solução com agitação até que as janelas SixNy de pé livre possam ser observadas no lado oposto do padrão SixNy.
      NOTA: O tempo de gravação molhada pode diferir dependendo da espessura do Si; para um wafer de 100 μm de espessura, a gravura molhada normalmente leva várias horas. Não defina a velocidade de agitação muito alta durante a gravação de Si porque as janelas sixny de pé livre são muito finas e podem ser fraturadas pelo fluxo do fluido. Neste experimento, a taxa de agitação foi definida para 250 rpm.
    3. Limpe o wafer gravado mergulhando-o várias vezes em um banho d'água DI para eliminar resíduos de gravura. Seque o wafer no ar.
      NOTA: Devem ser tomados cuidados extremos ao mergulhar ou tirar o wafer padronizado Si das soluções porque as janelas sixny de pé livre são muito finas e frágeis e podem ser fraturadas pela tensão superficial da solução. O wafer deve ser imerso ou retirado em um ângulo, de tal forma que a borda do wafer entre e saia da solução primeiro.
  5. Elimine os resíduos de gravação KOH.
    1. Pressione levemente os limites da matriz de chips com uma pinça para obter uma matriz de chips que serão micro-padronizados (Figura 1B).
    2. Prepare a solução KOH de 1,5 M a 80 °C com agitação.
    3. Mergulhe a matriz de chips na solução KOH para 30 s e enxágue-a mergulhando-a em água DI 2x. Seque totalmente os chips soprando gás N2 .
      NOTA: Deve-se tomar muito cuidado ao mergulhar os chips em soluções e secá-los com gás N2 porque as janelas de sixny autônomos são muito finas e frágeis. Enquanto o chip está imerso na solução KOH, a agitação deve ser interrompida. Os chips devem ser mergulhados com suas bordas primeiro na direção perpendicular à solução e soprados com gás N2 na direção paralela.
    4. Seque totalmente a matriz do chip no ar por pelo menos 1 h.
  6. Padrone o RP.
    1. Prepare um wafer si de 525 μm em branco como suporte sólido. Gire o wafer Si com HMDS e RP positivo, como descrito acima, mas conecte a matriz de chip (com o lado da janela sixny para cima) no wafer Si antes de assar o RP. O PR age como um adesivo entre o wafer e a matriz de chips. Asse o wafer Si anexado com a matriz de chip a 100 °C por 90 s em uma placa quente.
    2. Gire o conjunto de chips com HMDS e RP positivo, conforme descrito acima.
    3. Exponha o conjunto de chip com luz ultravioleta (comprimento de onda de 365 nm; intensidade de 20 mW/cm2) para 5 s através de uma máscara de cromo (Figura 2E,F) usando um alinhador.
    4. Desenvolva o RP usando um desenvolvedor para 15 s, enxágue o conjunto de chips mergulhando-o em água DI 2x, e seque totalmente o chip padrão pr definido soprando gás N2 .
  7. Prepare o micro-padronizado SixNy.
    1. Etch SixNy seguindo a padronização de RP usando um RIE construído em laboratório, com 3 sccm de gás SF6 em potência RF de 50 W. Controle o tempo de gravação dependendo da espessura da camada SixNy .
  8. Elimine o RP.
    1. Elimine o RP imergindo o conjunto de chip padronizado na solução 1-metil-2-pyrrolidina (NMP) a 60 °C e deixando-o durante a noite. Enxágüe o conjunto de chips mergulhando-o em água DI 2x, e seque totalmente o chip padronizado, soprando gás N2 .
    2. Elimine os resíduos de RP com um processo de plasma O2 usando 100 sccm O2 gás em rf potência de 150 W por 1 min com o RIE construído em laboratório.
  9. Enxágüe o chip micro-padronizado.
    1. Prepare a solução KOH de 1,5 M a 80 °C.
    2. Mergulhe os chips micro-padronizados na solução KOH por 30 s para eliminar totalmente os resíduos de RP e enxaguar os chips imergindo-os em água DI 2x. Seque totalmente os chips soprando gás N2 .
    3. Seque totalmente as lascas no ar por pelo menos 1h.
  10. Transfira óxido de grafeno (GO) pelo método de fundição de gotas.
    1. Solução DILuir GO (2 mg/mL) a 0,2 mg/L com água DI e sonicato por 10 minutos para quebrar agregados de folhas GO. Centrifugar a solução GO diluída a 300 x g para 30 s.
    2. Descarregue o lado gravado do chip micro-padronizado para tornar a superfície do chip com carga positiva usando um descarga de brilho (Tabela de Materiais) a 15 mA por 1 min.
    3. Solte 3 μL da solução GO no lado descarado do chip micro-padronizado e deixe a gota no chip por 1 min. Depois de 1 min, limpe a solução GO em excesso no chip com papel filtro.
    4. Lave o chip transferido para GO com gotículas dI preparadas em filme de parafina e limpe a água DI no chip com papel filtro. Repita este procedimento 2x no lado transferido go e 1x no lado oposto. Seque o chip transferido por GO à temperatura ambiente durante a noite.
    5. Lave o chip micro-padronizado com janelas GO, imergindo-o na água DI e seque o chip com gás N2 .

2. Imagem Cryo-EM

  1. Prepare a crio-amostra.
    1. Prepare a crio-amostra usando uma máquina mecânica de mergulho crio-mergulhador (Tabela de Materiais), que controla a temperatura, a umidade, o tempo de mancha e a força. Depois de carregar a almofada de manchas nas manchas, certifique-se de que a umidade e a temperatura na câmara sejam mantidas a 100% e 15 °C, respectivamente.
    2. Pegue o chip micro-padronizado com uma pinça crio-doce típica e carregue a pinça para a máquina de mergulho crio-. Pipet 3 μL de solução de amostra para o chip micro-padronizado no lado padrão do orifício, com janelas GO na parte inferior. Controle o tempo e a força de manchas dependendo da solução amostral.
      NOTA: Aqui, foram utilizados espécimes biológicos, ou seja, vírus da imunodeficiência humana (HIV-1), ferritina, proteasome 26S, groEL, partículas de proteína de apoferritina e proteínas de filamento foram usadas para imagens crio-EM. Além disso, diversos tipos de materiais inorgânicos, como nanopartículas Fe2O3 (NP), nanopartículas Au, nanorods Au e nanopartículas de sílica, foram utilizados para imagens crio-EM. O tempo e a força desejados foram colocados no êmbolo criogeno para diferentes tipos de amostras.
    3. Após o processo de desinchar, congele o chip carregado com amostras imediatamente em etano líquido. Transfira o chip para a caixa de grade em nitrogênio líquido (LN2) e armazene-o na LN2 antes da imagem crio-EM.
  2. Realize imagens crio-EM.
    1. Carregue a crio-amostra em um suporte crio-EM com a temperatura mantida a -180 °C.
    2. Carregue o suporte crio-EM em um TEM e observe as amostras com o modo de sistema de dose mínima (MDS).

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Representative Results

Um chip micro-padronizado com janelas GO foi fabricado pela fabricação mems e transferência de nanofolha 2D GO. Os chips para micro-padronização foram produzidos em massa, com cerca de 500 chips produzidos a partir de um wafer de 4 polegadas (Figura 1B e Figura 2A,B). Os desenhos dos chips micro-padronizados podem ser manipulados usando diferentes desenhos da máscara de cromo (Figura 2) durante o procedimento de fotolitografia. Os chips micro-padronizados fabricados tinham números controlados e dimensões de membranas SixNy de pé livre. Os números das membranas SixNy autônomos foram controlados de 48 (6 x 8) a 50 (5 x 10) e as dimensões de 50 x 40 μm2 a 250 x 40 μm2 (Figura 3A, B,F,G). Cada membrana sixny autônomo pode ter dezenas a centenas de micro-orifícios com diâmetros personalizáveis que variam de 2-3 μm com espaçamento de orifício diferente. Chips micro-padronizados fabricados têm até ~25.000 furos suspensos por GO, enquanto o número de furos também é controlável (Figura 3B-D e Figura 3G-I). A existência da fina camada GO através do buraco foi confirmada pela espectroscopia de Raman e difração eletrônica. O espectro Raman na janela GO mostrou picos representativos de GO, ou seja, bandas D e G em 1360 cm-1 e 1590 cm-1, respectivamente22 (Figura 3E). Os padrões de difração hexagonal orientados a multiplicação indicam que as janelas consistem em multicamadas GO (Figura 3J).

O chip micro-padronizado com janelas GO foi fabricado em três profundidades de alvo representativas (25 nm, 50 nm e 100 nm) controlando a espessura da deposição do SixNy no wafer Si durante o processo LPCVD para confirmar a viabilidade de regular a profundidade dos micro-buracos. Para avaliar a estrutura e a espessura dos micro-buracos com janelas GO, foram obtidas imagens de microscópio eletrônico de varredura transversal (SEM) de 40°, 40°tilted e transversal e imagens de microscopia de força atômica (AFM) do chip micro-padronizado com janelas GO. A estrutura bem-tipo do microrifício com uma janela GO foi claramente observada, com a profundidade do microrifício correspondente à profundidade alvo (Figura 4). Os resultados confirmam que o controle do número e o design do chip micro-padronizado com janelas GO é possível.

Para demonstrar o uso do chip micro-padronizado para imagem crio-EM, várias amostras crioléculas de biomoléculas e NPs inorgânicos foram preparadas usando o chip micro-padronizado. Para espécimes biológicos, HIV-1, ferritina, proteasome 26S, groEL, partículas de proteína de apoferritina e proteínas de filamento tau foram imagens com crio-EM usando o chip micro-padronizado com janelas GO (Figura 5A-F). Além das biomoléculas, materiais inorgânicos como Fe2O3 NPs, Au NPs, Au nanorods e NPs de sílica também foram observados por crio-EM usando chips micro-padronizados (Figura 5G-J).

Figure 1
Figura 1: Esquemas e imagens do procedimento de fabricação do recém-desenvolvido chip micro-padronizado com janelas GO para crio-EM. (A) Esquemas do processo de fabricação e seções transversais do chip micro-padronizado com janelas GO durante o processo de fabricação. (B) Imagens dos produtos de fabricação em cada etapa de fabricação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Breve ilustração das máscaras de cromo usadas para o processo de fotolitografia. (A,B) Design de máscara para produção em massa de chips para um wafer 4 em Si (24 x 24 matriz de chips), (C,D) desenhos de 2 x 2 matriz de chips, e (E,F) desenhos de padrões de micro-furos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Estrutura dos chips micro-padronizados com janelas GO. (A,F) Imagens de microscopia óptica de chips micro-padronizados inteiros, (B,G) SEM imagens de membranas SixNy monoescaradas únicas, (C,H) SEM imagens de micro-padrões e (D,I) SEM imagens de micro-buracos únicos com janelas GO. (E,J) Confirmação de GO no microrifício através (E) do espectro Raman e (J) o padrão de difração eletrônica de área selecionada (SAED) da janela GO. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Bem estrutura e profundidade do micro-buraco com janelas GO. (A-C) 40° imagens SEM inclinadas de um único micro-furo com uma janela GO, e (D-F) imagem SEM transversal do chip micro-padronizado com janelas GO em diferentes profundidades (25 nm, 50 nm e 100 nm). (G) Microscopia de força atômica (AFM) imagem de renderização 3D, (H) imagem de deflexão AFM e (I) perfil de linha ao longo da linha vermelha em (H) mostrando a profundidade do chip micro-padronizado com janelas GO fabricadas com 100 nm SixNy membrana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Imagens crio-EM de vários biomateriais de tamanho e nanomateriais inorgânicos usando o chip micro-padronizado com janelas GO. (A) partícula do vírus HIV-1, (B) ferritina, (C) proteasome 26S, (D) groEL, (E) apoferritina, (F) proteína tau (setas indicando proteína tau fibrilada), (G) Fe2O3 NP, (H) Au NP, (I) Au nanorod, e (J) silica NP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Os processos de microfabização para a produção de chips micro-padronizados com janelas GO são introduzidos aqui. O chip micro-padronizado fabricado foi projetado para regular a espessura da camada de gelo vítreo, controlando a profundidade do micro-buraco com janelas GO, dependendo do tamanho do material a ser analisado. Um chip micro-padronizado com janelas GO foi fabricado usando uma série de técnicas MEMS e um método de transferência de nanofolha 2D (Figura 1). A maior vantagem do uso da técnica de fabricação mems é sua capacidade de produção em massa e a viabilidade de manipular a estrutura e as dimensões do microchip utilizando diferentes desenhos da máscara de cromo durante a fotolitografia (Figura 2). A camada SixNy depositada pelo LPCVD com baixo estresse garante a estabilidade das dezenas de nanômetros de espessura de sixnyy 23,24,25,26. No entanto, a camada sixny em escala de nanômetros ainda é vulnerável a forças na direção perpendicular27. Portanto, é necessário extrema cautela ao manusear o chip micro-padronizado, como ao mergulhar em solução ou secagem. Além disso, o processo de fabricação do chip micro-padronizado usa o wafer Si de 100 μm, o que garante compatibilidade com a maioria dos porta-amostras crio-EM e carregadores automáticos. No entanto, é necessário cautela durante os processos de fabricação para evitar que o wafer frágil se frature.

O conjunto regular em escala de micron de estruturas bem-tipo com janelas GO foi confirmado com um microscópio óptico e um SEM (Figura 3 e Figura 4). Além disso, o método de fundição de gota para transferência de GO permite a deposição go com alto achatamento e sem rugas perceptíveis (Figura 3D,E,I,J). O chip micro-padronizado é adequado para o carregamento no carregador automático crio-EM, e dezenas de milhares de furos em escala de micron em uma matriz regular permitem a coleta automatizada de dados de imagem grandes para análise de partículas únicas. Além disso, o número e a morfologia das membranas SixNy e micro-buracos suportados por GO podem ser manipulados facilmente no processo de fabricação do MEMS, permitindo uma análise de partículas simples de alto rendimento e outros experimentos de imagem crio-EM, dependendo dos propósitos da pesquisa. Além disso, aplicações estendidas de chips micro-padronizados com espessura controlada podem ser facilitadas pela fabricação de chips que possuem furos padronizados na escala de nanômetros. Técnicas de nano-padronização desenvolvidas na indústria de semicondutores podem ser adotadas na fabricação desses chips 28,29,30.

A capacidade de regular a profundidade dos micro-buracos foi demonstrada aqui pela fabricação de chips micro-padronizados com janelas GO em três profundidades de alvo representativas: 25 nm, 50 nm e 100 nm. Diferentes profundidades da estrutura de microwell foram alcançadas controlando o tempo de deposição da camada SixNy no wafer Si (Figura 4). Para avaliar a morfologia e a espessura do chip micro-padronizado com janelas GO, foram observadas seções transversais dos dispositivos obtidos a partir da secção de feixe de íons focal (FIB) com SEM, e o perfil de profundidade foi medido com AFM (Figura 4). A estrutura bem-tipo do micro-buraco com janela GO foi claramente mostrada nas imagens SEM e AFM, confirmando o controle bem sucedido da profundidade do micro-furo SixNy e transferência da janela GO. O uso do chip micro-padronizado personalizável com janelas GO provavelmente garantirá uma alta taxa de sucesso nas regiões produtoras de espessura de gelo ideal para imagens crio-EM.

Uma vez que os materiais a serem observados com crio-EM têm tamanhos diferentes, produzir gelo vítreo com espessura adequada pode garantir maior resolução de contraste, uma ampla cobertura de orientação e redução da desnaturação da estrutura durante a imagem crio-EM. Para demonstrar o uso do processo de imagem crio-EM para aplicações biológicas, várias amostras biológicas de diferentes tamanhos, incluindo HIV-1, ferritina, proteasome 26S, groEL, apoferritina e proteína tau, foram imagens usando o chip micro-padronizado com janelas GO. As biomoléculas foram claramente observadas usando o chip micro-padronizado com janelas GO (Figura 5A-F). Além das biomoléculas, diversos tipos de nanomateriais inorgânicos, como Fe2O3 NPs, Au NPs, Au nanorods e NPs de sílica, também foram observados usando o chip micro-padronizado com janelas GO (Figura 5G-J). O chip micro-padronizado e o método de fabricação mostram compatibilidade para a criobito de vários materiais. Assim, o recém-desenvolvido chip micro-padronizado com janelas GO fornece uma estratégia de preparação de amostra confiável e reprodutível para análise eficiente e de estrutura de alto rendimento com crio-EM.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

M.-H.K., S.K., M.L., e J.P. reconhecem o apoio financeiro do Instituto de Ciência Básica (Grant No. IBS-R006-D1). S.K., M.L., e J.P. reconhecem o apoio financeiro do Programa de Pesquisadores Pioneiros criativos através da Universidade Nacional de Seul (2021) e da bolsa NRF financiada pelo governo coreano (MSIT; Grant Nos. NRF-2020R1A2C2101871 e NRF-2021M3A9I4022936). M.L. e J.P. reconhecem o apoio financeiro da Posco Science Fellowship da POSCO TJ Park Foundation e da bolsa NRF financiada pelo governo coreano (MSIT; Grant No. NRF-2017R1A5A1015365). J.P. reconhece o apoio financeiro da subvenção da NRF financiada pelo governo coreano (MSIT; Grant No. NRF-2020R1A6C10183), e os Programas de Iniciativas Interdisciplinares de Pesquisa pela Faculdade de Engenharia e Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Seul (2021). M.-H.K. reconhece o apoio financeiro da subvenção da NRF financiada pelo governo coreano (MSIT; Grant No. NRF-2020R1I1A0107416612). Os autores agradecem à equipe e à equipe do Centro Nacional universitário de Seul para Imagens Macromoleculares e Celulares (SNU CMCI) por seus esforços incansáveis e perseverança com os experimentos crio-EM. Os autores agradecem a S. J. Kim, do Centro Nacional de Instalações inter universitárias de Pesquisa, pela assistência aos experimentos fib-SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) Sigma Aldrich, USA 443778
Acetone
AFM Park Systems, South Korea NX-10
Aligner Midas System, South Korea MDA-600S
AZ 300 MIF developer AZ Electronic Materials USA Corp., USA 184411
Cryo-EM holder Gatan, USA 626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) FEI Company, USA Helios NanoLab 650
Glow discharger Ted Pella Inc., USA PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution Sigma Aldrich, USA 763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% Alfa Aesar, USA 10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) Centrotherm, Germany LPCVD E1200
maP1205 positive PR Micro resist technology, Germany A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea 6597-4400
Raman Spectrometer NOST, South Korea Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE) Scientific Engineering, South Korea Lab-built
SEM Carl Zeiss, Germany SUPRA 55VP
Si wafer JP COMMERCE, South Korea 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater Dong Ah Trade Corp., South Korea ACE-200
TEM JEOL, Japan JEM-2100F

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References

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Fabricação de chip micro-padronizado com espessura controlada para microscopia eletrônica criogênica de alta produtividade
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Kang, M. H., Lee, M., Kang, S., Park, J. Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (182), e63739, doi:10.3791/63739 (2022).

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