Administration médiée par électroporation de ribonucléoprotéines cas9 et d’ARNm dans des hépatocytes primaires de souris fraîchement isolés

Tanner Rathbone; Ilayda Ates; Callie Stuart; Tina Parker; Renee N. Cottle

doi:10.3791/63828

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Article de méthode

Administration médiée par électroporation de ribonucléoprotéines cas9 et d’ARNm dans des hépatocytes primaires de souris fraîchement isolés

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DOI :

10.3791/63828

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2 juin 2022

Tanner Rathbone^*¹ , Ilayda Ates^*¹ , Callie Stuart¹ , Tina Parker² , Renee N. Cottle¹

¹Department of Bioengineering, Clemson University, ²Godley Snell Research Center, Clemson University

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit des techniques pour isoler les hépatocytes primaires de souris du foie et électroporer CRISPR-Cas9 sous forme de ribonucléoprotéines et d’ARNm afin de perturber un gène cible thérapeutique associé à une maladie métabolique héréditaire du foie. Les méthodes décrites se traduisent par une viabilité élevée et des niveaux élevés de modification des gènes après électroporation.

Résumé

Ce protocole décrit une méthode rapide et efficace pour isoler les hépatocytes primaires de souris, suivie d’une administration de CRISPR-Cas9 médiée par électroporation sous forme de ribonucléoprotéines (RNP) et d’ARNm. Les hépatocytes primaires de souris ont été isolés à l’aide d’une méthode de perfusion rétrograde en trois étapes, ce qui a donné des rendements élevés allant jusqu’à 50 × 10⁶ cellules par foie et une viabilité cellulaire de >85%. Ce protocole fournit des instructions détaillées pour le placage, la coloration et la culture des hépatocytes. Les résultats indiquent que l’électroporation offre une efficacité de transfection élevée de 89%, mesurée par le pourcentage de cellules positives aux protéines fluorescentes vertes (GFP) et une viabilité cellulaire modeste de >35% dans les hépatocytes de souris.

Pour démontrer l’utilité de cette approche, CRISPR-Cas9 ciblant le gène de l’hydroxyphénylpyruvate dioxygénase a été électroporé dans des hépatocytes primaires de souris en tant que preuve de principe de l’édition de gènes pour perturber un gène thérapeutique lié à une maladie métabolique héréditaire (MI) du foie. Une édition sur cible plus élevée de 78 % a été observée pour les RNI par rapport à une efficacité d’édition de 47 % avec l’ARNm. La fonctionnalité des hépatocytes a été évaluée in vitro à l’aide d’un test à l’albumine qui a indiqué que l’administration de CRISPR-Cas9 sous forme d’ARN et d’ARNm entraînait une viabilité cellulaire comparable dans les hépatocytes primaires de souris. Une application prometteuse de ce protocole est la génération de modèles murins pour les maladies génétiques humaines affectant le foie.

Introduction

Les MI du foie sont des troubles génétiques caractérisés par la carence d’une enzyme hépatique cruciale impliquée dans le métabolisme qui conduit à l’accumulation de métabolites toxiques. Sans traitement, les MI du foie entraînent une défaillance d’organe ou une mort prématurée ^1,2. La seule option curative pour les patients atteints de MI du foie est la transplantation hépatique orthotopique, qui est limitée en raison de la faible disponibilité des organes de donneurs et des complications du traitement immunosuppresseur après la procédure ^3,4. Selon d....