Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Elektroporationsmedieret levering af Cas9 Ribonucleoproteiner og mRNA til frisk isolerede primære musehepatocytter

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63828
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Department of Bioengineering, Clemson University, 2Godley Snell Research Center, Clemson University
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver teknikker til isolering af primære musehepatocytter fra leveren og elektroporering af CRISPR-Cas9 som ribonukleoproteiner og mRNA for at forstyrre et terapeutisk målgen forbundet med en arvelig metabolisk sygdom i leveren. De beskrevne metoder resulterer i høj levedygtighed og høje niveauer af genmodifikation efter elektroporation.

Abstract

Denne protokol beskriver en hurtig og effektiv metode til isolering af primære musehepatocytter efterfulgt af elektroporationsmedieret levering af CRISPR-Cas9 som ribonukleoproteiner (RRP'er) og mRNA. Primære musehepatocytter blev isoleret ved hjælp af en tre-trins retrograd perfusionsmetode, hvilket resulterede i høje udbytter på op til 50 × 106 celler pr. lever og cellelevedygtighed på >85%. Denne protokol indeholder detaljerede instruktioner til plettering, farvning og dyrkning af hepatocytter. Resultaterne indikerer, at elektroporation giver en høj transfektionseffektivitet på 89%, målt ved procentdelen af grønne fluorescerende protein (GFP) positive celler og beskeden cellelevedygtighed af >35% i musehepatocytter.

For at demonstrere nytten af denne tilgang blev CRISPR-Cas9 rettet mod hydroxyphenylpyruvatdioxygenasegenet elektroporeret til primære musehepatocytter som bevis for principgenredigering for at forstyrre et terapeutisk gen relateret til en arvelig metabolisk sygdom (IMD) i leveren. En højere on-target redigering på 78% blev observeret for RRP'er sammenlignet med 47% redigeringseffektivitet med mRNA. Funktionaliteten af hepatocytter blev evalueret in vitro ved hjælp af et albuminassay, der indikerede, at levering af CRISPR-Cas9 som RRP'er og mRNA resulterer i sammenlignelig cellelevedygtighed i primære musehepatocytter. En lovende anvendelse til denne protokol er generering af musemodeller til humane genetiske sygdomme, der påvirker leveren.

Introduction

IMD'er i leveren er genetiske lidelser karakteriseret ved manglen på et afgørende leverenzym involveret i metabolisme, der fører til ophobning af giftige metabolitter. Uden behandling resulterer IMD'er i leveren i organsvigt eller for tidlig død 1,2. Den eneste helbredende mulighed for patienter med IMD'er i leveren er ortopisk levertransplantation, som er begrænset på grund af den lave tilgængelighed af donororganer og komplikationer fra immunsuppressiv terapi efter proceduren 3,4. Ifølge nylige data indsamlet af Organ Procurement and Transplantation Network modtager kun 40%-46% af de voksne patienter på ventelisten til levertransplantation et organ, mens 12,3% af disse patienter dør, mens de er på venteliste5. Desuden har kun 5% af alle de sjældne leversygdomme en FDA-godkendt behandling6. Det er klart, at der er et kritisk behov for nye behandlinger for IMD'er i leveren. Der kræves dog passende sygdomsmodeller for at udvikle nye terapeutiske muligheder.

Modellering af menneskelige sygdomme ved hjælp af in vitro- og in vivo-systemer er fortsat en hindring for at udvikle effektive terapier og studere patologien af IMD'er i leveren. Hepatocytter fra patienter med sjældne leversygdomme er udfordrende at opnå7. Dyremodeller er afgørende for at udvikle en forståelse af sygdomspatologi og for at teste terapeutiske strategier. En hindring er imidlertid at generere modeller fra embryoner, der bærer dødelige mutationer. For eksempel resulterede forsøg på at skabe musemodeller af Alagille syndrom (ALGS) med embryoner indeholdende homozygote deletioner af en 5 kb sekvens nær 5′-enden af Jag1-genet i embryoernes tidlige død8. Derudover kan generering af musemodeller ved genredigering i embryonale stamceller være tids- og ressourcekrævende9. Endelig vil mutationer forekomme uden for det målrettede væv, hvilket fører til forvirrende variabler, der kan hindre undersøgelse af sygdommen9. Somatisk genredigering ville give mulighed for lettere redigering i levervæv og omgå de udfordringer, der er forbundet med at generere modeller ved hjælp af embryonale stamceller.

Elektroporation muliggør levering af CRISPR-Cas9 direkte ind i kernen ved at anvende højspændingsstrømme til at permeabilisere cellemembranen og er kompatibel med mange celletyper, herunder dem, der er uforsonlige over for transfektionsteknikker, såsom humane embryonale stamceller, pluripotente stamceller og neuroner 10,11,12 . Lav levedygtighed er imidlertid en potentiel ulempe ved elektroporation; Optimering af proceduren kan give høje niveauer af levering, samtidig med at toksiciteten begrænses13. En nylig undersøgelse viser muligheden for at elektroporere CRISPR-Cas9-komponenter til primære muse- og humane hepatocytter som en yderst effektiv tilgang14. Ex vivo elektroporation i hepatocytter har potentiale til at blive anvendt til at generere nye musemodeller til humane IMD'er i leveren.

Denne protokol giver en detaljeret trin-for-trin procedure til isolering af musehepatocytter fra leveren og efterfølgende elektroporering af CRISPR-Cas9 som RNP-komplekser, bestående af Cas9-protein og syntetisk single-guide RNA (sgRNA) eller Cas9 mRNA kombineret med sgRNA for at opnå høje niveauer af genredigering på målet. Derudover giver protokollen metoder til kvantificering af genredigeringseffektivitet, levedygtighed og funktionalitet efter elektroporation af CRISPR-Cas9 i frisk isolerede musehepatocytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøgene blev alle udført i overensstemmelse med Institutional Animal Care and Use Committee retningslinjer og godkendte protokoller på Clemson University. Kirurgiske procedurer blev udført i bedøvede vildtype C57BL / 6J mus mellem 8 og 10 uger gamle.

1. Dyrekirurgi

  1. Fremstilling af opløsninger og instrumenter
    BEMÆRK: Perfusionsopløsninger og anæstesicocktailopskrifter er vist i materialetabellen.
    1. Der fremstilles perfusionsopløsning 1 (HEPES, EGTA og EBSS), perfusionsopløsning 2 (HEPES, EGTA, EBSS,CaCl2 og MgSO4) og perfusionsopløsning 3 (opløsning 2 og liberase). Sørg for, at opløsningerne er godt blandede.
    2. Indstil vandbadet til 42 °C og forvarm perfusionsopløsning 1, 2 og 3 i mindst 30 minutter, før proceduren påbegyndes, og opbevar dem i vandbadet.
      BEMÆRK: Perfusionsopløsning 1 og 2 vil chelate calcium og skylle blodet ud i leveren. Perfusionsopløsning 3 indeholder fordøjelsesenzymet liberase til dissociere den ekstracellulære matrix.
    3. Anbring 150 ml DMEM + 10% føtalt bovint serum (FBS) i koniske rør og opbevar dem på is.
      BEMÆRK: Dette medium vil blive brugt til at frigive cellerne fra leverkapslen og vaske de isolerede hepatocytter i henholdsvis trin 2.1 og 2.2.
    4. Centrifugen indstilles til 4 °C.
    5. Steriliser pumpeslangen ved at placere begge ender af slangen i en kolbe fyldt med 70% ethanol og cykle ethanolen tre gange.
    6. Vask slangen med destilleret vand og tøm den.
    7. Fyld slangen med forvarmet 30 ml perfusionsopløsning 1 efterfulgt af 8 ml perfusionsopløsning 2. Hvis slangen stadig har plads til flere væsker, skal du fylde resten af slangen med Perfusionsopløsning 3. Stop pumpen, når du skifter til en anden perfusionsløsning for at undgå at indføre luftbobler i slangen.
    8. Anbring den overskydende slange i det 42 °C store vandbad for at holde perfusionsopløsningerne varme.
    9. Anbring enden af pumpeslangen i det koniske rør, der indeholder Perfusionsopløsning 3, mens det opbevares i vandbadet.
      BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at lade pumpen kontinuerligt fylde med perfusionsopløsning 3 under perfusion.
  2. Forberedelse af dyr
    1. Bedøv musen ved at injicere bedøvelsescocktailen intraperitonealt i en dosis på 10-11,7 μL/g legemsvægt. Bedøvelsescocktailen har en slutkoncentration på 7,5 mg/ml ketamin, 0,25 mg/ml acepromazin og 1,5 mg/ml xylazin.
    2. Overvåg musens vejrtrækning og kontroller, at musen ikke reagerer på smerte. Vent, indtil musen har en vejrtrækningshastighed på ~ 55-65 vejrtrækninger pr. Minut, reagerer ikke på at få tæerne klemt og har en slap hale. Derudover skal du kontrollere den palpebrale (blinkende) refleks ved let at røre huden på den mediale side af det lukkede øje. Hvis musen blinker eller øjenmusklerne rykker, øges dosis af hele bedøvelsescocktailen med 5-10 μL.
    3. Placer musen på ryggen i en liggende stilling, og fastgør lemmerne til overfladen ved hjælp af stifter eller tape (supplerende figur S1).
    4. Sprøjt maven med 70% ethanol og dup den tør med en vatrondel.
  3. Lever perfusion
    1. Lav et U-formet lateralt snit i mavehuden ved hjælp af en saks og udvid hullet gennem siderne.
    2. Fortsæt med at åbne huden til ribbenburet.
    3. Brug en saks til at skære gennem peritoneum for at udsætte bughulen op til ribbenburet, og pas på ikke at hakke nogen organer. Flyt tarmene til højre side ved hjælp af bagsiden af pincet eller saksens stumpe overflade. Identificer den ringere vena cava og portalvenen (supplerende figur S1).
    4. Start pumpen for at skylle forvarmlet perfusionsopløsning gennem kateteret.
    5. Stop pumpen, og fjern kateteret, når al luft er skyllet gennem systemet. Indsæt spidsen af nålen, der er forbundet med kateteret, i den ringere vena cava i en vinkel på 10 ° -20 ° i forhold til venen. Fjern nålen fra kateteret og skub forsigtigt kateteret ind i venen i en bevægelse parallelt med venen.
      BEMÆRK: Brugeren skal observere flashback af blod i kateteret for at verificere korrekt kannulation i venen.
    6. Tilslut slangen til kateteret uden at flytte kateteret længere ind i venen.
    7. Start pumpen med en strømningshastighed på 2 ml/min. Kig efter leveren, der straks bliver bleg som et tegn på, at perfusionen er vellykket.
    8. Skær portalvenen ved hjælp af en saks.
    9. Øg gradvist strømningshastigheden til 5 ml / min.
    10. Påfør tryk med jævne mellemrum på portalvenen på det omtrentlige snitsted i 3 s ved hjælp af tang eller en vatpind for at blokere dræningen og lette god perfusion.
    11. Når perfusionsopløsning 3 strømmer igennem, skal du omhyggeligt overvåge leverens elasticitet. For at afgøre, om leveren er blødgjort, skal du forsigtigt trykke på leveren med en vatpind eller tang og kontrollere, om der dannes indrykninger på leveren. Pas på ikke at overperfuse for at undgå tab af celle levedygtighed.
    12. Når leveren er blødgjort (forekommer efter 30-50 ml perfusionsopløsning 3 er strømmet igennem), skal du stoppe pumpen, fjerne kateteret og forsigtigt dissekere leveren. Læg leveren i en 100 mm petriskål indeholdende iskold DMEM + 10% FBS medium. Skær galdeblæren ud, og pas på ikke at spilde indholdet. Hvirvl petriskålen forsigtigt for at fjerne mulige blodpropper.
    13. Overfør leveren til en ny petriskål indeholdende iskold DMEM + 10% FBS-medium.

2. Hepatocytisolering

  1. Frigør celler fra leverkapslen.
    1. Læg petriskålen på is og brug to par sterile pincet til forsigtigt at rive leverkapslen fra hinanden på alle lapperne. Hvirvl forsigtigt leveren rundt i mediet ved hjælp af en celleløfter eller en tang for at frigive hepatocytterne. Fortsæt denne bevægelse, indtil leveren bliver meget lille, og suspensionen bliver brun og uigennemsigtig.
    2. Fjern resterne af levervævet fra pladen, og overfør forsigtigt cellesuspensionen til et 50 ml konisk rør (prechilled on ice) udstyret med en 100 μm cellesi ved hjælp af en 25 ml serologisk pipette indstillet til lav hastighed.
    3. Tilsæt frisk, iskold DMEM + 10% FBS-medium til petriskålen for at vaske ud og opsamle de resterende celler fra overfladen og overføre til det 50 ml koniske rør. Gentag dette trin, indtil alle cellerne er samlet.
  2. Vask og rens hepatocytter fra ikke-parenkymale celler.
    1. Cellerne opsamlet i 50 ml konisk rør centrifugeres ved 50 × g ved 4 °C i 5 minutter ved lav deceleration eller uden bremser.
    2. Kassér supernatanten indeholdende snavs og ikke-parenkymale celler, og resuspender pelleten i den resterende supernatant ved forsigtigt at hvirvle røret. Når pelleten er resuspenderet, tilsættes 30 ml frisk, iskold DMEM + 10% FBS-medium.
    3. Centrifugeringen (trin 2.2.1) og vask (trin 2.2.3) gentages tre gange.
    4. Resuspender den endelige cellepellet i 10 ml iskold DMEM + 10% FBS-medium.
      BEMÆRK: Mængden af medium, der bruges til at resuspendere pelleten, afhænger af pelletstørrelsen. Hvis pelleten er betydeligt mindre end 15 mm, skal du bruge 1-5 ml iskold DMEM + 10% FBS-medium.
  3. Kvantificering af cellelevedygtighed
    1. I et mikrofugerør tilsættes 50 μL 0,4% Trypan Blue-opløsning til 350 μL Hepatocyt Plating Medium (PM). Derefter tilsættes 100 μL cellesuspension for at foretage en endelig fortynding på 1:5, og pipetteres op og ned flere gange for at blande.
    2. Tæl celletæthed og levedygtighed ved hjælp af et hæmocytometer. Mens du tæller, skal du placere hepatocytsuspensionen på is og derefter placere isspanden på en orbitalryster indstillet til 30 o / min for at forhindre hepatocytterne i at slå sig ned.
    3. Følg Percoll-behandlings- og centrifugeringstrinnene nedenfor, hvis cellelevedygtigheden er <70%.
      1. Percoll fortyndes med 10x fosfatbufferet saltvand (PBS) i forholdet 9:1.
      2. Bland hepatocytsuspensionen med den fortyndede Percoll i forholdet 1:1.
      3. Centrifuger ved 200 × g ved 4 °C i 10 min.
      4. Kassér supernatanten indeholdende døde celler. Resuspender pelleten i iskold DMEM + 10% FBS medium.
      5. Tæl cellerne igen.
  4. Test af hepatocytter for pladeegenskaber
    1. Plader nogle af cellerne på kollagen I-belagte 6-brøndplader med en densitet på 0,5 × 106 celler pr. Ml ved hjælp af 1,5 ml forvarm PM.
    2. Hold de resterende celler på is, mens de er på en orbitalryster, indtil de er klar til at udføre elektroporation.
    3. Anbring cellepladen i en vandkappet CO2 -inkubator ved 37 C. Flyt pladen vandret og lodret forsigtigt i en nord-til-syd og øst-til-vest bevægelse for at sikre homogen plettering. Gentag bevægelsen to gange hver 1,5 time.
    4. Kontroller cellefastgørelse 3 timer efter plettering.
      BEMÆRK: Mindst 60% af cellerne skal klæbe til pladen som en indikator for hepatocytter af god kvalitet.
    5. Skift mediet til forvarmt Hepatocyt Maintenance Medium (MM) ved 24 timer efter plettering for at opretholde cellerne i kultur.
  5. Glykogenfarvning
    1. Når cellerne har fastgjort til de 6-brønds kollagen I-belagte plader, fjernes det brugte medium fra de dyrkede celler.
    2. Fastgør cellerne i 10-15 minutter i iskold ethanol.
    3. Vask grundigt med sterilt vand.
    4. Inkuber i 1% vandig periodisk syre i 5 minutter og vask derefter med sterilt vand.
    5. Inkuberes i 100% Schiff Reagens i 30 min.
      BEMÆRK: Schiff-reagenset må ikke fortyndes, før det tilsættes til cellerne.
    6. Vask med vand tre gange i løbet af 10 min.
    7. Monter i monteringsmedium.
    8. Billede ved hjælp af et mikroskop på brightfield indstilling.

3. Design sgRNA'er til CRISPR-Cas9 genredigering

BEMÆRK: Dette afsnit beskriver designet af et sgRNA rettet mod musens hydroxyphenylpyruvatdioxygenase (Hpd) gen som bevis for principgenredigering for at forstyrre et terapeutisk målgen relateret til en IMD i leveren.

  1. Design guidesekvensen rettet mod Hpd ved hjælp af den refererede software15.
  2. Kontroller sekvensen for Hpd med Ensembl Genome Browser.
  3. Brug følgende parametre til design af gRNA: enkelt guidelængde på 20 nukleotider og en NGG (N kan være et hvilket som helst nukleotid) protospacer-tilstødende motiv (PAM) sekvens.
  4. Vælg et målområde fra exon 3 i Hpd.
  5. Generer en liste over guidesekvenser fra målområdet med On- og Off-Target Scores.
    BEMÆRK: On-Target Score angiver forudsagt redigeringseffektivitet på mål for det givne design: en højere score er korreleret med højere redigeringseffektivitet. Off-Target Score korrelerer med specificiteten af guidesekvensen: en højere score indikerer lavere sandsynlighed for redigering uden for mål. Ideelt set bør begge scorer være høje: On-Target Score >60 og Off-Target Score >50.
  6. Vælg guidesekvensen med de højeste on-target og off-target scores. Få sgRNA'et, der indeholder styresekvensen, kemisk syntetiseret.

4. Elektroporation og cellekultur

  1. Fremstilling af CRISPR-Cas9 substrater, medier, celler og elektroporationsinstrumentet
    1. Tilsæt hele det medfølgende tillæg til PM og varm i 37 °C vandbadet i 10 min.
    2. Tænd for elektroporationsenheden ved at trykke på tænd / sluk-knappen , og indstil elektroporationsprogrammet ved at trykke på x-knappen og derefter pil ned-knappen, indtil programmet T-028 vises på skærmen.
    3. Forbered destinationsbrøndene til de elektroporerede hepatocytter ved at tilsætte 1,5 ml PM til seks-brønde kollagen I-belagte plader. Pladerne inkuberes i en 37 °C inkubator, indtil de er klar til brug.
    4. Tilsæt hele det medfølgende supplement til elektroporationsbufferopløsningen og inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter.
      BEMÆRK: Mærk udløbsdatoen for elektroporationsbufferen på hætteglasset (3 måneder efter datoen for tilsætning af kosttilskud).
    5. Fjern elektroporationsbeholderne fra emballagen, og mærk dem for hver prøve.
    6. I PCR-splitstrimmelrør skal du forberede Cas9 RNP-komplekserne ved at kombinere 30 μg sgRNA med 300 pmol Cas9-protein og inkubere komplekserne ved stuetemperatur i 10 minutter. Forbered Cas9 mRNA ved at kombinere 30 μg sgRNA med 4 μL Cas9 mRNA (1 μg / μL). Opbevar mRNA-sgRNA-blandingen på is indtil elektroporation. Separat forberede et rør indeholdende 1,0 μg eGFP mRNA for at verificere vellykket elektroporation ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
    7. Centrifuge 1,2 × 106 celler pr. elektroporationsreaktion ved 100 × g i 2 minutter ved 4 °C.
    8. Supernatanten fjernes fra cellepillen, og der tilsættes 100 μL elektroporationsopløsning pr. reaktion langs siden af rørvæggen. Resuspend hepatocytterne i elektroporationsopløsningen ved at vippe røret forsigtigt i hånden.
  2. Elektroporation af CRISPR-Cas9 RNA'er og mRNA til hepatocytter
    1. Når hepatocytterne forekommer jævnt dispergeret i elektroporationsopløsningen, overføres 100 μL hepatocytsuspensionen til strimmelrørene indeholdende Cas9-komplekserne.
      BEMÆRK: Brug pipettespidser med bred boring ved overførsel af hepatocytter for at bevare cellelevedygtigheden.
    2. Overfør indholdet af strimlen godt til en elektroporationsbeholder.
    3. Placer nukleovettebeholderen i spalten på elektroporationsanordningen. Elektroporate hepatocytterne ved at trykke på x-knappen . Efter elektroporation skal du vente på, at der vises en skærm på enheden, der siger OK. Tryk på x-knappen igen, og fjern beholderen.
    4. Inkuber den elektroporerede beholder på is i 15 min.
    5. Der tilsættes 500 μL forvarmt PM til elektroporationsbeholderen.
    6. Overfør 300 μL af elektroporationsreaktionen til hver destinationsbrønd på den forvarmede plade.
      BEMÆRK: Der skal være to destinationsbrønde pr. Elektroporationsreaktion. En brønd vil blive brugt til at kvantificere genredigeringseffektivitet; den anden brønd vil blive brugt til MTT- og albumin-assays.
    7. For at forhindre hepatocytter i at akkumulere i midten af brønden, disperger cellerne ved forsigtigt at flytte plader vandret og lodret i en nord-til-syd og øst-til-vest bevægelse. Sørg for, at pladen opretholder kontakt med inkubatorhylden, mens den flyttes. Gentag denne bevægelse ved 15, 30, 45, 60 og 90 minutter efter plettering af de elektroporerede hepatocytter.
    8. Pladerne inkuberes natten over ved 37 °C.
    9. Fjern mediet fra de brønde, der er udpeget til genredigeringsanalyse 24 timer efter plettering af cellerne, og udskift med 0,25 mg / ml kældermembranmatrixoverlejring.
      BEMÆRK: Hvis den opbevares i fryseren, overføres membranmatrixen til 4 °C og lade den tø op. Da kældermembranmatrixen er fast over 10 °C, er det afgørende, at kældermembranmatrixen forbliver på is eller ved 4 °C, indtil den er klar til brug.

5. Volumenet af membranmatrixen, der skal blandes med MM, beregnes for at give en slutkoncentration på 0,25 mg/ml

BEMÆRK: For en 6-brønds plade er der brug for 2 ml overlejring pr. Brønd.

6. Tilsæt det beregnede volumen af membranmatrixen til iskold MM og bland ved pipettering op og ned 10 gange

  1. Pipetter overlejringsblandingen langsomt oven på cellerne, og læg pladen tilbage i 37 °C inkubatoren.
  2. Udskift mediet med frisk vedligeholdelsesmedium hver 24. time.
  3. Ved 24 timer efter plettering overføres det konditionerede medium fra brønden, der er udpeget til MTT- og albuminassays. Opbevar det konditionerede medium i et mikrofugerør, indtil det er klar til at udføre albuminassayet. Fortsæt til trin 7.1 for MTT-analysen.
    BEMÆRK: Opbevar det konditionerede medium ved 4 °C til kortvarig opbevaring (mindre end et døgn). Ved længere opbevaring opbevares mediet ved -80 °C.

7. Analyse af leveringseffektivitet, levedygtighed og on-target redigering i elektroporerede musehepatocytter

  1. Levedygtighedsmåling ved hjælp af MTT-assay
    1. Der fremstilles 12 mM MTT-stamopløsning ved tilsætning af 1 ml PBS til et hætteglas med 5 mg MTT.
    2. Der tilsættes 150 μL MTT-stamopløsning til brøndene og inkuberes i 24 timer.
    3. Efter inkubation tilsættes 1,5 ml natriumdodecylsulfathydrochloridopløsning (SDS-HCI) til hver brønd og pipetteres derefter for at blande.
    4. Inkuber pladen i 4 timer ved 37 ° C og se efter en ændring i mediets farve fra klar til lilla for at indikere levedygtige celler.
    5. Hver prøve blandes igen med en pipette, og absorbansen aflæses ved 570 nm ved hjælp af en mikropladelæser.
    6. Den normaliserede levedygtighed for Cas9-behandlede prøver beregnes ved hjælp af Eq (1):
      Equation 1 (1)
  2. Albuminassay for at evaluere hepatocytfunktionalitet
    1. Overfør 50 μL af det konditionerede medium til brøndene i pladen, der leveres af albuminsættet. Dæk brøndene og inkuber i 2 timer ved stuetemperatur.
    2. Brøndene vaskes 5x med 200 μL vaskebuffer.
    3. Vend pladen om for at tømme hver brønd på silkepapir, og tryk et par gange.
    4. Efter vask tilsættes 50 μL af det biotinylerede antistof, der er tilvejebragt i albuminassaysættet, til hver brønd og inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
    5. Trin 5.2.2-5.2.3 gentages for at vaske brøndene.
    6. Der tilsættes 50 μL streptavidinperoxidase, der er tilvejebragt i albuminassaysættet, til hver brønd og inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter.
    7. Trin 5.2.2 gentages.
    8. Der tilsættes 50 μL af det kromogenerubstrat, der er tilvejebragt i albuminassaysættet pr. brønd, og der inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur. Bank forsigtigt på pladen for at sikre jævn blanding. Fjern eventuelle luftbobler med en pipettespids.
    9. Til sidst tilsættes 50 μL stopopløsning til hver brønd og ser efter en farveændring fra gul til blå for at indikere funktionelle celler.
    10. Fortsæt straks med at læse absorbansen ved 450 nm ved hjælp af en mikropladelæser.
  3. Anestimer leveringseffektiviteten i brønde, der er elektroporeret med eGFP mRNA.
    1. Optag fasekontrast og grønne fluorescensbilleder af hepatocytter 24 timer efter elektroporation. Tag tre billeder forskellige steder i brønden.
    2. Upload billeder af cellerne til ImageJ. Under fanen Billede skal du vælge Type | 16-bit for at konvertere billede til gråtoner.
    3. Hvis du vil fremhæve cellestrukturer i billedet, skal du vælge Juster | Tærskel. Juster skyderen for at fremhæve celler.
    4. Under fanen Proces skal du vælge Subtraher baggrund for at fjerne baggrundsstøj.
    5. Tæl cellerne ved at klikke på fanen Analysér og derefter vælge Analysér partikler. Klik på Ok for at generere en liste over tællede partikler.
    6. Beregn procentdelen af GFP-positive celler ved at dividere antallet af tællede partikler i de grønne fluorescensbilleder med antallet af tællede partikler i det tilsvarende fasekontrastbillede.
  4. Analyse af Cas9-aktivitet på mål
    1. Ekstrakt genomisk DNA fra elektroporerede celler.
      1. Fjern medium fra pladen 3 dage efter elektroporation, og tilsæt 500 μL 0,25% trypsin. Inkuberes ved 37 °C i 5 min. Pipetter flere gange efter inkubation for at sikre, at hepatocytter har løsnet sig fra pladen.
      2. Den trypsiniserede cellesuspension overføres til mikrocentrifugerør, og centrifugeres i en bordpladecentrifuge ved 800 × g i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter spinding undersøges rørene for pellets.
      3. Fjern supernatanten indeholdende trypsin ved pipettering. Sørg for ikke at forstyrre pelleten. Resuspender pelleten i 80 μL DNA-ekstraktionsopløsning. Hvis pelleten er vanskelig at se, resuspenderes indholdet af røret i 50 μL DNA-ekstraktionsopløsning.
      4. Vortex i 30 s for at sikre, at pelleten genoplives. Overfør suspensionen til PCR split-strip rør og placer dem i den termiske cyklist. Kør i 15 min ved 95 °C og 8 min ved 68 °C.
    2. PCR-forstærker stedet på målet.
    3. Følg proceduren beskrevet nedenfor for forstærkning af Hpd on-target-regionen ved hjælp af DNA-polymerase.
      1. Der fremstilles en reaktion indeholdende 0,5 μL 10 mM dNTP'er, 0,5 μL 10 μM Forward primer, 0,5 μL 10 μM Reverse primer, 0,125 μL Taq polymerase, 5 μL genomisk DNA ekstraheret fra hepatocytterne og 18,375 μL nukleasefrit vand. Se supplerende tabel S1 for primersekvenser.
      2. Kort hvirvel og centrifuger hurtigt PCR-blandingen for at sikre, at opløsningen er i bunden af røret.
      3. PCR-blandingen anbringes i en termisk cyklist, og der forstærkes under disse betingelser: 94 °C i 30 s til denaturering, 30 cyklusser på 94 °C i 30 s, 57 °C til 45 s til udglødning, 68 °C til 1 min og en endelig forlængelse på 68 °C i 5 min.
        BEMÆRK: Udglødningstemperaturen for PCR-reaktionen varierer afhængigt af primernes sammensætning. Overvej at bruge en smeltetemperaturberegner, før du udfører PCR.
      4. For at bekræfte den korrekte produktstørrelse blandes 3 μL AF PCR-produkterne med 2 μL vand og 1 μL 6x farvestof. Kør på en 1,5% agarosegel og bekræft den korrekte produktstørrelse.
    4. Rens DNA'et ved hjælp af magnetiske perler.
      BEMÆRK: Spinkolonner kan også bruges til PCR-oprydning. Nedenfor er procedurer til rensning af PCR-produkter ved hjælp af magnetiske perler.
      1. Fjern magnetiske perler fra 4 °C, og lad dem nå stuetemperatur.
      2. Kort hvirvel og centrifuger hurtigt PCR-blandingen.
      3. Tilsæt et volumen perler svarende til 1,8× volumenet af PCR-blandingen. Pipetter PCR-perleblandingen 10x for at sikre, at opløsningen blandes ligeligt.
      4. Inkuberes ved stuetemperatur i 10 min.
      5. Overfør PCR-perleblandingen til en PCR-plade og læg den på en magnetplade.
      6. Inkuber pladen på magneten i 5 min. Efter de 5 minutter skal du kontrollere, at opløsningen er klar, og perlerne er bundet til magneten, inden du går videre til næste trin.
      7. Kassér supernatanten.
      8. Der tilsættes 200 μL 70% ethanol til brønden og inkuberes i 30 s.
        BEMÆRK: 70% ethanol skal fremstilles kort før oprydningen udføres for at forhindre DNA-tab.
      9. Supernatanten kasseres, og trin 7.4.4.8 gentages.
      10. Fjern supernatanten, og lad den tørre i 3 minutter ved stuetemperatur for at fjerne spor af ethanol.
      11. Pladen fjernes fra magneten, og der tilsættes 22 μL vand til prøven. Pipetter op og ned 10x for at blande vand og perler.
      12. Prøverne inkuberes i 3 minutter ved stuetemperatur.
      13. Overfør pladen tilbage til magneten og inkuber i 3 minutter, eller indtil opløsningen er klar.
      14. 20 μL af prøven overføres til et PCR-rør. Pas på, at ingen perler overføres.
    5. Sekvens oprenset DNA-amplicon ved Sanger-sekventering.
    6. Upload .ab1-sekvensfiler til behandlede og kontrollerede (ubehandlede) prøver til Sporing af indels ved nedbrydning (TIDE)16 for at kvantificere indels på målstedet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering af belagte primære hepatocytter fra leveren
Den samlede proces med leverperfusion og hepatocytisolering er illustreret i figur 1. I dette forsøg blev der anvendt vildtvoksende, 8-10 uger gamle C57BL6/6J mus. Proceduren forventes at give 20-50 × 106 celler pr. mus med en levedygtighed mellem 85% og 95%. Hvis levedygtigheden er <70%, skal percoll-behandling følges for at fjerne døde celler. Frisk isolerede hepatocytter skal belagt på kollagen I-belagte eller nitrogenholdige vævskulturplader. Inden for 3-12 timer efter plettering forventes hepatocytterne at klæbe til pladen, og cellemorfologien antager et typisk polygonalt eller sekskantet udseende inden for 24 timer (figur 2). Hepatocytter er de eneste celler i leveren, der opbevarer glukose i form af glykogen. For at verificere renheden af de isolerede celler udføres glykogenfarvning ved anvendelse af periodisk syre-Schiff-reagens ved 24 timer efter plettering. Cytoplasmaet af de farvede hepatocytter forekommer magenta (figur 3).

Elektroporation af CRISPR-Cas9 RRP'er og mRNA i isolerede musehepatocytter
Frisk isolerede musehepatocytter blev elektroporeret med eGFP mRNA, Cas9 mRNA sammen med Hpd-målrettet sgRNA eller Cas9-protein kompleksbundet med Hpd-sgRNA (RNP). Hpd-sgRNA blev kemisk modificeret med 2′-O-methylphosphorthioatbindinger til de første og sidste tre på hinanden følgende nukleotider på 5′ og 3′ enderne14. Streptococcus pyogenes Cas9 blev brugt til eksperimenter. Hepatocytterne blev afbildet 24 timer efter elektroporation ved hjælp af et fluorescensmikroskop, og procentdelen af GFP-positive celler blev talt i billederne (figur 4A). I gennemsnit var 89,8% [interval 87,1% -92,4%] af hepatocytterne GFP-positive. 3 dage efter elektroporation blev Cas9-inducerede indsættelser og deletioner (indels) i Hpd-locus analyseret ved hjælp af TIDE16. Resultaterne viser on-target indels på 47,4% i hepatocytter elektroporeret med CRISPR-Cas9 mRNA og 78,4% indels for Cas9 RNP (figur 4B). MTT- og albuminassays blev udført for at evaluere hepatocytlevedygtighed og funktionalitet efter elektroporering af CRISPR-Cas9. MTT-resultaterne viser en levedygtighed på 35,4% og 45,9% i hepatocytter behandlet med henholdsvis CRISPR-Cas9 mRNA og RNP (figur 4C). I overensstemmelse med MTT-resultaterne var de normaliserede albuminniveauer 31,8% i hepatocytter behandlet med Cas9 mRNA og 34,5% for Cas9 RNP (figur 4D).

Figure 1
Figur 1: Skematisk af hepatocytperfusions- og isolationsprotokollen. Efter kannulering af den ringere vena cava skæres portalvenen, og Perfusionsopløsninger 1, 2 og 3 pumpes gennem leveren. Leverkapslen brister, og celler frigives ved hjælp af en celleløfter. Frigivne celler er anstrengt og centrifugeret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Frisk isolerede primære hepatocytter. Hepatocytter isoleret fra C57BL / 6J mus blev belagt på kollagen I-belagte 6-brønds plader med Hepatocyt Plating Media. Billeder taget kl. 24 efter plettering. Skalabjælke = 400 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Glykogenfarvning. Frisk isolerede primære musehepatocytter blev farvet for glykogen for at bekræfte renhed. Farvning blev udført ved hjælp af Schiff Reagens ved 24 timer efter plettering. Cytoplasma af de farvede hepatocytter forekommer magenta. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Elektroporation af HPD-målrettet CRISPR-Cas9 til frisk isolerede primære musehepatocytter. (A) Fasekontrast og grøn fluorescensmikroskopibilleder af frisk isolerede musehepatocytter 24 timer efter elektroporation. Billeder i øverste række er hepatocytter transficeret med eGFP mRNA, og billederne i nederste række er utransficerede kontrolhepatocytter. Skalastænger = 400 μm. (B) On-target indels for musehepatocytter elektroporeret med Cas9 mRNA kombineret med sgRNA eller RNP. (C) Levedygtighed normaliseret til utransficerede kontrolhepatocytter i MTT-assay ved 24 timer efter elektroporation. (D) Albuminniveauer i konditioneret medium normaliseret til utransficerede kontrolhepatocytter målt ved 24 timer efter elektroporation (n = 3) med to tekniske replikater. Statistisk analyse blev udført ved uparrede t-tests. Dette tal blev ændret fra 14. Forkortelser: Hpd = 4-hydroxyphenylpyruvat dioxygenase; CRISPR = grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser; Cas9 = CRISPR-associeret protein 9; sgRNA = enkelt guide RNA; RNP = ribonukleoprotein; INDEL = indsættelse-sletning; MTT = 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyltetrazoliumbromid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Fejlfinding for leverperfusions- og hepatocytisoleringsprotokollen. Denne tabel fremhæver almindelige problemer, der opstår under protokollen, og foreslår mulige løsninger. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende figur S1: Musens bughule under operationen. Kateter indsættes i den ringere vena cava (blå prik) før nyregrenene (ikke set). Forkortelser: L = Lever; K = Nyre; I = Tyndtarmen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S1: Cas9-guide og PCR-primersekvenser. Guidesekvensen og PAM til sgRNA-målretning mod Hpd og PCR-primersekvenser til forstærkning af Hpd. Forkortelser: Hpd = 4-hydroxyphenylpyruvat dioxygenase; CRISPR = grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser; Cas9 = CRISPR-associeret protein 9; sgRNA = enkelt guide RNA; PAM = protospacer-tilstødende motiv. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De trin, der er skitseret i protokollen for hepatocytisolering, er udfordrende og kræver praksis for færdigheder. Der er flere vigtige trin for den vellykkede hepatocytisolering fra leveren. For det første er korrekt kannulering af den ringere vena cava afgørende for fuldstændig leverperfusion. Fraværet af blanchering i leveren efter perfusion indikerer forskydning af kateteret (tabel 1). Den ringere vena cava (retrograd perfusion) blev kannuleret i proceduren, fordi den er enklere og mere tilgængelig end portalvenen (antegrad perfusion)17,18. Nogle protokoller bruger suturer til at sikre kateteret19; suturer komplicerer dog processen. Suturering af kateteret kan resultere i uønskede resultater, såsom forkert placering af kateteret og gør det umuligt at justere dets position. Derudover er det muligt at udføre kannulationen i leveren uden at fjerne nålen, hvilket yderligere kan forenkle leverperfusionen. Tilslutning af pumpen til kateteret er unødvendig med nålen i venen. Derudover er der en reduceret mulighed for ved et uheld at trække kateteret ud og danne blodpropper. Indsættelse af kun spidsen af kateteret med en flad vinkel i forhold til venen forbedrede canulationen. Den ringere vena cava har flere grene, så indsættelse af kateteret på det forkerte sted vil forårsage perfusion i en anden del af kroppen og ikke leveren (tabel 1). Det er således vigtigt at placere kateteret på et sted, der undgår grenene. Den vaskulære struktur vil variere lidt mellem forskellige mus; Det er derfor vigtigt at undersøge venerne, før de kannuleres for at bestemme det bedste sted til injektion af kateteret. Tilbagestrømningen af blod inde i kateteret efter fjernelse af nålen er en glimrende indikation af korrekt kannulation. Korrekt kannulation kan også kontrolleres ved at kigge efter lever hævelse, når trykket et øjeblik påføres portalvenen (trin 1.3.13).

Ved isolering af hepatocytter er det andet kritiske trin at genkende, hvornår fuldstændig leverfordøjelse har fundet sted. Enzymets kvalitet og koncentration er afgørende for korrekt fordøjelse. I modsætning til protokollerne, der findes i 20,21, foreslår denne protokol at anvende Liberase, der består af to collagenaseisoformer, fordi det giver bedre konsistens i enzymaktivitet og reduceret batch-til-batch-variation end almindelig collagenase22. Variationer i fordøjelsesenzymkvalitet og aktivitet kan forårsage uoverensstemmelser i isolationen. Det er vigtigt at overvåge leveren under fordøjelsen og stoppe fordøjelsen umiddelbart efter, at leveren er blødgjort. En fordøjet lever vil være fleksibel og vise et tab i elasticitet verificeret ved at trykke leveren ved hjælp af tang eller vatpinde for at bekræfte, at fordybninger dannes uden at vævet hopper tilbage. I denne protokol er den maksimale mængde Liberase-opløsning, der anbefales pr. Lever, 50 ml; et højere volumen ville resultere i fordøjelsesbesvær. Hvis kannulationen udføres perfekt, er 30 ml Liberase-opløsningen tilstrækkelig til at opnå korrekt fordøjelse. De sidste kritiske trin i proceduren er isolerings- og vasketrinnene. Efter dissekering af leveren og overførsel til en steril petriskål indeholdende iskold DMEM med FBS, er det afgørende at undgå at skære leveren i stykker. På dette stadium skal du bruge en celleløfter til at frigive cellerne forsigtigt og maksimere cellelevedygtigheden. Vippe skålen for at nedsænke leveren i DMEM letter frigivelsen af celler fra kapslen i suspension og skal ske langsomt og på is. Det skal være let at forstyrre Glissons kapsel under frigivelsestrinnet, og mediet skal blive overskyet og brunt. Vanskeligheder ved afbrydelse af kapslen er en indikator for dårlig fordøjelse (tabel 1).

Denne protokol er velegnet til at generere høje niveauer af CRISPR-Cas9-redigeringer i frisk isolerede musehepatocytter. Indels genereret af Cas9 RNP og mRNA blev sammenlignet i undersøgelsen. Højere niveauer af genredigering blev observeret i hepatocytter elektroporeret med Cas9 RNP end mRNA, hvilket er i overensstemmelse med resultater fra andre undersøgelser 14,23,24. Fordelen ved Cas9 RNP i forhold til mRNA er, at det giver lavere off-target redigering, da Cas9-proteinet findes i cellen i kortere perioder end mRNA23,24. Da effektiviteten af sgRNA'er varierer afhængigt af design og målsted, bør flere sgRNA'er designes og testes for redigeringseffektivitet ved genet af interesse. Vælg det højere specificitetsscoredesign, når du vælger mellem sgRNA med høj geneffektivitet. Hvis genredigering er konsekvent lav, kan du overveje at levere en reporter, såsom eGFP mRNA, for at bekræfte leveringen. Lave niveauer af eGFP-positive celler efter elektroporation kan indikere udløbet elektroporationsbuffer, problemer med elektroporationsudstyr eller luftbobler i reaktionen. Hvis der er et stort antal eGFP-positive celler, men lav redigeringseffektivitet, skal du teste sgRNA-designet i en cellelinje for at bekræfte redigeringsaktivitet og justere mængderne af Cas9 og sgRNA elektroporeret i celler. Til sidst skal du overveje den metode, der bruges til at evaluere redigeringsaktivitet. Gelbaserede assays, såsom T7 Endonuclease I, kan underrapportere genredigering på grund af lav følsomhed for 1 bp mismatches på cutstedet. Dyb sekventering er den mest nøjagtige metode til kvantificering af Cas9-genredigering, især til lavredigeringshændelser på off-target-websteder.

Et andet udfordrende aspekt af protokollen er dyrkning af frisk isolerede hepatocytter efter elektroporation. Brugere skal håndtere celler forsigtigt under hvert trin i protokollen for at opnå levedygtige, pladebare hepatocytter efter elektroporation. Undgå at sprede hepatocytter med hvirvel; i stedet skal du klippe hætteglasset indeholdende celler forsigtigt, indtil cellerne bliver resuspended. Når du overfører hepatocytter, skal du bruge bredborede pipettespidser for at opretholde levedygtigheden. Inkubering af kuvetterne på is i 15 minutter efter elektroporation gør det muligt for cellemembranen at genlukke og forbedre levedygtigheden. Efter plettering skal du placere pladen i inkubatoren og forsigtigt flytte pladen vandret og lodret i en nord-til-syd og øst-til-vest bevægelse for at sikre, at hepatocytterne spredes jævnt og opretholder cellelevedygtighed. Hvis hepatocytterne ikke binder sig til pladen, skal du overveje at øge antallet af celler til 1,3 × 106 i elektroporationsreaktionen.

En lovende anvendelse til protokollen er generering af musemodeller af humane IMD'er i leveren. Musehepatocytter, der er positive for genet, der koder for fumarylacetoacetathydrolase (Fah), har vist sig effektivt at engraftere og genbefolke leveren efter transplantation i Fah-mangelfulde (Fah-/-) mus25. En ny tilgang til udvikling af musemodeller af IMD'er i leveren er ved at elektroporere CRISPR-Cas9 til vildtype musehepatocytter for at introducere redigeringer forbundet med en sygdom efterfulgt af transplantation af de genredigerede hepatocytter i Fah-/- mus. De Cas9-redigerede hepatocytter ville have en naturlig selektiv fordel efter transplantation sammenlignet med de indfødte Fah-mangelfulde celler til genbefolkelse af leveren.

Afslutningsvis udstyrer denne protokol brugerne med kapacitet til at isolere primære hepatocytter fra museleveren efterfulgt af genredigering ved hjælp af CRISPR-Cas9 mRNA og RRP'er. Protokollen kan ændres til brug i forskellige stammer af mus til at studere forskellige typer genetiske sygdomme, der påvirker leveren in vitro og in vivo og teste terapeutiske tilgange.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at afsløre.

Acknowledgments

RNC modtog finansiering fra South Carolina Bioengineering Center of Regeneration and Formation of Tissues Pilot tilskud støttet af National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) fra National Institutes of Health, American Association for the Study of Liver Diseases Foundation og American Society of Gene &Cell Therapy under tilskudsnumre P30 GM131959, 2021000920, og 2022000099. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra American Society of Gene &Cell Therapy eller American Association for the Study of Liver Diseases Foundation. Skemaet for figur 1 blev oprettet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural USA Scientific 1402-4700
6-well Collagen Plates Advanced Biomatrix 5073
accuSpin Micro 17R Fisher Scientific 13-100-675
All-in-one Fluorescent Microscope Keyence BZ-X810
Analog Vortex Mixer VWR 97043-562
ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL ThermoFisher Scientific 2079GPK
Automated Cell Counter Bio-Rad Laboratories TC20
Blue Wax Dissection Tray Braintree Scientific Inc. DTW1 9" x 6.5" x 1/2"+F21
Cell scraper/lifter Argos Technologies UX-04396-53 Non-pyrogenic, sterile
Conical tubes (15 mL) Fisher Scientific 339650
Conical tubes (50 mL) Fisher Scientific 14-432-22
Cotton applicators Fisher Scientific 22-363-170
Curved scissors Cooper Surgical 62131
Disposable Petri Dishes Falcon 351029 100mm,sterile
Disposable Petri Dishes VWR 25373-100 35mm, sterile
Epoch Microplate Spectrophotometer BioTek Instruments 250082
Falcon Cell strainer (70 µm) Fisher Scientific 08-771-2
Forceps Cooper Surgical 61864 Euro-Med Adson Tissue Forceps
IV catheters  BD 382612 24 G x 0.75 in
IV infusion set Baxter 2C6401
MyFuge 12 Mini Centrifuge Benchmark Scientific 1220P38
Needles Fisher Scientific 05-561-20 25 G
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001 Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes
Peristaltic Pump Masterflex  HV-77120-42 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC
Precision pump tubing Masterflex HV-96410-14 25 ft, silicone
Primaria Culture Plates Corning Life Sciences 353846 Nitrogen-containing tissue culture plates
Serological Pipets (25 mL) Fisher Scientific 12-567-604
Syringes BD 329464 1 mL, sterile
T100 Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories 1861096
Water bath ALT 27577 Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 IDT 1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL Fisher Scientific NC9959336
CleanCap Cas9 mRNA Trilink Biotechnologies L-7606-100
CleanCap EGFP mRNA Trilink Biotechnologies L-7201-100
Corning Matrigel Matrix Corning Life Sciences 356234
DMEM ThermoFisher Scientific 11885076 Low glucose, pyruvate
Ethanol 70% VWR 71001-652
Fetal bovine serum Thermoscientific 26140-079
Hepatocyte Maintenance Medium (MM) Lonza MM250
Hepatocyte Plating Medium (PM) Lonza MP100
Mouse Albumin ELISA Kit Fisher Scientific NC0010653
Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit Lonza VPL-1004
OneTaq HotStart DNA Polymerase New England Biolabs M0481L
PBS 10x pH 7.4  Thermoscientific 70011-044 No calcium or magnesium chloride
Percoll (PVP solution) Santa Cruz Biotechnology sc-500790A
Periodic acid Sigma-Aldrich P7875-25G
Permount Mounting Medium VWR 100496-550
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen Corporation QE05090
Schiff’s fuchsin-sulfite reagent Sigma-Aldrich S5133
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher Scientific 25200056 Phenol red
Vybrant MTT Cell Viability Assay ThermoFisher Scientific V13154
Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized)  Stable at 4 °C for 2 months
EBSS Fisher Scientific 14155063 Complete to 200 mL
EGTA (0.5 M) Bioworld 40520008-1 200 µL
HEPES (pH 7.3, 1 M) ThermoFisher Scientific AAJ16924AE 2 mL 
Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized)  Stable at 4 °C for 2 months
CaCl2·2H20 (1.8 mM) Sigma C7902-500G 360 µL of 1 M stock 
EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) Fisher Scientific 14-155-063 Complete to 200 mL
HEPES (1 M) ThermoFisher Scientific AAJ16924AE 2 mL 
MgSO4·7H20 (0.8 mM) Sigma 30391-25G 160 µL of 1 M stock
Perfusion Solution 3  Prepared fresh prior to use
Solution 2 50 mL
Liberase Roche 5401127001 0.094 Wunsch units/mL
Mouse Anesthetic Cocktail 
Acepromzine 0.25 mg/mL final concentration
Ketamine 7.5 mg/mL final concentration
Xylazine 1.5 mg/mL final concentration
Software URL
Benchling https://www.benchling.com/
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Tracking of Indels by Decomposition https://tide.nki.nl/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pampols, T. Inherited metabolic rare disease. Advances in Experimental Medicine and Biology. 686, 397-431 (2010).
  2. Saudubray, J. M., Sedel, F., Walter, J. H. Clinical approach to treatable inborn metabolic diseases: an introduction. Journal of Inherited Metabolic Disease. 29 (2-3), 261-274 (2006).
  3. Arnon, R., et al. Liver transplantation in children with metabolic diseases: the studies of pediatric liver transplantation experience. Pediatric Transplantation. 14 (6), 796-805 (2010).
  4. Maiorana, A., et al. Preemptive liver transplantation in a child with familial hypercholesterolemia. Pediatric Transplantation. 15 (2), 25-29 (2011).
  5. OPTN/SRTR 2019 Annual Data Report: Liver. , Available from: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2019/Liver.aspx (2019).
  6. Fabris, L., Strazzabosco, M. Rare and undiagnosed liver diseases: challenges and opportunities. Translational Gastroenterology and Hepatology. 6, (2020).
  7. Haugabook, S. J., Ferrer, M., Ottinger, E. A. In vitro and in vivo translational models for rare liver diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1865 (5), 1003-1018 (2019).
  8. Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
  9. Lima, A., Maddalo, D. SEMMs: Somatically engineered mouse models. a new tool for in vivo disease modeling for basic and translational research. Frontiers in Oncology. 11, 1117 (2021).
  10. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  11. Ye, L., et al. Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32 mutation confers resistance to HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9591-9596 (2014).
  12. Straub, C., Granger, A. J., Saulnier, J. L., Sabatini, B. L. CRISPR/Cas9-mediated gene knock-down in post-mitotic neurons. PLoS One. 9 (8), 105584 (2014).
  13. Hoban, M. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated correction of the sickle mutation in human CD34+ cells. Molecular Therapy. 24 (9), 1561-1569 (2016).
  14. Rathbone, T., et al. Electroporation-mediated delivery of Cas9 ribonucleoproteins results in high levels of gene editing in primary hepatocytes. The CRISPR Journal. , (2022).
  15. Benchling [Biology Software]. , Available from: https://benchling.com (2022).
  16. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
  17. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
  18. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475 (7356), 386-389 (2011).
  19. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  20. Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
  21. Kim, Y., et al. Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure. Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).
  22. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  23. Lattanzi, A., et al. Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements. Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).
  24. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
  25. Grompe, M. Hereditary Tyrosinemia: Pathogenesis, Screening and Management. Tanguay, R. M. , Springer International Publishing. 215-230 (2017).

Tags

Bioengineering udgave 184
Elektroporationsmedieret levering af Cas9 Ribonucleoproteiner og mRNA til frisk isolerede primære musehepatocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rathbone, T., Ates, I., Stuart, C.,… More

Rathbone, T., Ates, I., Stuart, C., Parker, T., Cottle, R. N. Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes. J. Vis. Exp. (184), e63828, doi:10.3791/63828 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter