Summary
Este protocolo describe la cromatografía de exclusión de tamaño, una técnica fácil y reproducible para enriquecer vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis a partir de sobrenadantes de cultivo.
Abstract
El papel de las vesículas extracelulares (EV) en el contexto de la infección bacteriana ha surgido como una nueva vía para comprender la fisiología microbiana. Específicamente, los EV de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) desempeñan un papel en la interacción huésped-patógeno y la respuesta al estrés ambiental. Los VEHÍCULOS eléctricos Mtb también son altamente antigénicos y muestran potencial como componentes de la vacuna. El método más común para purificar los EV Mtb es la ultracentrifugación por gradiente de densidad. Este proceso tiene varias limitaciones, incluyendo bajo rendimiento, bajo rendimiento, dependencia de equipos costosos, desafíos técnicos, y puede afectar negativamente la preparación resultante. La cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) es un método alternativo más suave que combate muchas de las limitaciones de la ultracentrifugación. Este protocolo demuestra que SEC es eficaz para el enriquecimiento de Mtb EV y produce preparaciones mtb EV de alta calidad de mayor rendimiento de una manera rápida y escalable. Además, una comparación con la ultracentrifugación del gradiente de densidad mediante procedimientos de cuantificación y calificación demuestra los beneficios de sec. Si bien la evaluación de la cantidad de EV (análisis de seguimiento de nanopartículas), el fenotipo (microscopía electrónica de transmisión) y el contenido (Western blotting) se adapta a los EV Mtb, el flujo de trabajo proporcionado se puede aplicar a otras micobacterias.
Introduction
La liberación de vesículas extracelulares (EV) por patógenos puede ser la clave para desbloquear nuevas tecnologías para controlar las enfermedades infecciosas1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es un patógeno de alta consecuencia, infectando aproximadamente un tercio de la población mundial y cobrándose la vida de millones de personas cada año2. La producción de EV por Mtb está bien documentada pero es difícil de alcanzar en la biogénesis y las funciones variadas (es decir, inmunoestimulantes, inmunosupresoras, de hierro y adquisición de nutrientes) de estos EV en el contexto de la infección 3,4,5. Los esfuerzos para comprender la composición de los EV Mtb revelaron esferas encerradas en la membrana lipídica de 50-150 nm derivadas de la membrana plasmática que contienen lípidos y proteínas de importancia inmunológica 3,6. La investigación del papel de los EV Mtb en la fisiología bacteriana ha revelado la importancia de la modulación bacteriana ev en respuesta al estrés ambiental para la supervivencia5. Los estudios de interacción huésped-patógeno han sido más complicados de interpretar, pero la evidencia indica que los EV Mtb pueden influir en la respuesta inmune del huésped y pueden servir potencialmente como un componente de vacunación efectivo 3,4,7.
La mayoría de los estudios de EV Mtb hasta ahora se han basado en la ultracentrifugación por gradiente de densidad para el enriquecimiento de vesículas8. Esto ha sido eficaz para los estudios a pequeña escala; sin embargo, esta técnica tiene varios desafíos técnicos y logísticos. Los flujos de trabajo alternativos combinan la centrifugación de varios pasos, para la eliminación de células enteras y escombros grandes, con un paso final de ultracentrifugación para granular evs. Esta metodología puede variar en eficiencia y, a menudo, da como resultado un bajo rendimiento y copurificación de biomoléculas solubles asociadas a vesículas no vesículas, al tiempo que afecta la integridad de las vesículas9. Además, este proceso requiere mucho tiempo, es intensivo manualmente y tiene un rendimiento muy limitado debido a las limitaciones del equipo.
El presente protocolo describe una técnica alternativa a la ultracentrifugación por gradiente de densidad: la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Este método ha sido demostrado para micobacterias ambientales, y en el trabajo actual, se ha extrapolado a Mtb10. Una columna disponible comercialmente y un colector automático de fracción pueden mejorar la consistencia en la preparación vesical y reducir la necesidad de equipos específicos y costosos. También es posible completar este protocolo en una fracción del tiempo en comparación con la ultracentrifugación por gradiente de densidad, lo que aumenta el rendimiento. Esta técnica es menos desafiante técnicamente, por lo que es más fácil de dominar, y puede aumentar la reproducibilidad inter / intra-laboratorio. Finalmente, SEC tiene una alta eficiencia de separación y es suave, preservando la integridad de las vesículas.
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Protocol
El Comité de Bioseguridad Institucional de la Universidad Estatal de Colorado aprobó el presente estudio (19-046B). El cultivo de Mycobacterium tuberculosis y la cosecha de sobrenadantes de cultivo ricos en EV fueron realizados por personal capacitado en un laboratorio de alta contención. Los materiales fueron trasladados fuera del área de alta contención después de que se realizó, confirmó y aprobó un método de inactivación válido por las políticas institucionales de bioseguridad. Al replicar el protocolo, si la inactivación validada o el método de filtración estéril no son factibles, los siguientes procedimientos deben realizarse en un laboratorio de alta contención.
1. Preparación de concentrado crudo Mtb EV
NOTA: Para procedimientos detallados sobre el cultivo de Mtb y la preparación de proteínas de filtrado de cultivo (CFP), ver Referencias11,12. Se recomienda que los medios de cultivo bacteriano estén libres de suplementos de crecimiento con componentes proteínicos o que contengan EV, como la albúmina oleica dextrosa catalasa (OADC), y detergentes como Tween. También se recomienda que la calidad del cultivo bacteriano y la CFP cosechada se examinen para garantizar una muerte celular limitada y la lisis 13,14.
- Prepare un filtro centrífugo de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa (consulte la Tabla de materiales) agregando la capacidad de volumen completo de solución salina tamponada con fosfato (1x PBS). Centrifugadora durante 5 min a 2.800 x g a 4 °C.
NOTA: Si utiliza un filtro sin volumen de parada muerta, se debe tener cuidado para garantizar que el volumen de la muestra no se reduzca por debajo del nivel del filtro, lo que resulta en un secado completo del filtro durante la centrifugación. - Deseche el flujo de flujo y cualquier PBS restante antes de llenar la cámara de muestra con Mtb CFP a su máxima capacidad. Centrifugar a 2.800 x g a 4 °C hasta que el volumen se haya reducido al volumen mínimo del dispositivo de ultrafiltración. Repetir según sea necesario, añadiendo más CFP a la unidad hasta que toda la muestra se haya reducido lo suficiente.
NOTA: Conserve una parte del material de flujo continuo de 100 kDa (100F) para la calificación aguas abajo si lo desea. Conservar a 4 °C. - Agregue 1x PBS a la unidad de filtro que contiene el concentrado hasta la capacidad total del dispositivo. Reduzca el volumen como se describe en 1.2. Repita este paso cinco veces para garantizar un lavado completo y un intercambio de tampón.
- Recupere el retentate CFP concentrado de 100 kDa (100R) de acuerdo con las especificaciones del dispositivo de ultrafiltración (consulte la Tabla de Materiales). Una vez que se recupera el 100R, lave el filtro con un volumen mínimo de 1x PBS al menos tres veces, y agrupe el lavado con el 100R para maximizar la recuperación.
- Cuantificar el material 100R con un ensayo bicinconónico (BCA) siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). Para realizar el ensayo, use varias diluciones de muestras 1:2, 1:5 y 1:10 en PBS. Pruebe la muestra por triplicado.
NOTA: Conserve una parte del material 100R para la calificación posterior si lo desea. Conservar a 4 °C.
2. Cromatografía de exclusión de tamaño para el enriquecimiento de EV Mtb a partir de CFP
NOTA: El siguiente procedimiento es específico para el uso de 3 mg de CFP de 100R Mtb con columna SEC y colector automático de fracción (AFC, ver Tabla de Materiales). Se puede adaptar para otras concentraciones iniciales y tipos de columna siguiendo las especificaciones del fabricante. Además, se recomienda a los usuarios que lean y comprendan el manual de usuario del colector automático de fracciones.
- Permita que la columna SEC se equilibre a temperatura ambiente.
- Encienda el AFC con el interruptor de encendido en la parte posterior de la unidad de torre y ajuste la configuración de la célula de carga, si es necesario, presionando SETUP en la pantalla táctil del menú principal. La célula de carga solo debe calibrarse en el primer uso, después de cada actualización de software y si se observa inconsistencia en los volúmenes de recolección de fracciones.
- En la pantalla SETUP , alinee el carrusel seleccionando CARRUSEL > CALIBRAR. Inserte el carrusel con los 13 pequeños orificios orientados hacia arriba en la torre AFC y ajuste el carrusel para que la boquilla de fluido esté directamente sobre la posición de descarga presionando los botones - y / o + .
- Retire las tapas de la columna SEC equilibrada. Deslice la columna SEC en el soporte de columna apropiado e instálela cuidadosamente en la torre AFC. Asegúrese de que la etiqueta de identificación por radiofrecuencia (RFID) en la columna esté orientada hacia el AFC y verifique que la conexión entre la columna y la válvula sea segura. Coloque el tubo de salida de residuos en un contenedor de recogida.
- En la pantalla SETUP , seleccione Programación de recolección y establezca el recuento en 13 y el tamaño en 0,5 ml pulsando los botones - y/o + . Deje la configuración "Volumen de búfer" como predeterminada de 2.7 ml y luego cierre la ventana "Programación de recopilación" presionando X.
- Seleccione INICIAR COLECCIÓN en la pantalla de inicio y confirme los parámetros de la colección seleccionando SÍ. Cargue 13 tubos de microcentrífuga etiquetados de 1,7 ml con las tapas abiertas y apuntando hacia el centro del carrusel.
- Avance el AFC seleccionando OK, luego monte el depósito de columna y avance nuevamente presionando OK. Seleccione la opción para vaciar la columna presionando SÍ y agregue un volumen de columna de PBS filtrado de 0,2 μm para eliminar cualquier búfer de almacenamiento. Una vez que se complete el lavado, avance el AFC presionando OK.
- Coloque la cubierta del carrusel sobre el AFC y pulse OK. Prepare un volumen de columna de PBS filtrado de 0,2 μm. Utilice una pipeta para eliminar cualquier exceso de búfer de la columna.
- Traiga 3 mg de muestra de 100R según lo cuantificado en el paso 1.5 a 500 μL con 1x PBS. Agregue la muestra de 3 mg a la parte superior de la columna. Avance el AFC y permita que la muestra se tope con la frita. Una vez que la muestra haya entrado completamente en la columna, agregue el PBS preparado en el paso 2.6 al depósito.
- Supervise el funcionamiento del AFC mientras recoge primero el volumen vacío y luego las fracciones especificadas. Una vez que se complete la carrera y el carrusel vuelva a la posición de desperdicio, retire la cubierta y retire los tubos de fracción del carrusel. Almacene las fracciones a 4 °C antes de la cuantificación (paso 3) y la calificación (paso 4).
- Si la columna se va a reutilizar, seleccione la opción para limpiar la columna pulsando SÍ; de lo contrario, presione NO. Siga las instrucciones de la AFC.
NOTA: Una vez que la columna se lava y el búfer de almacenamiento se ha ejecutado, se puede quitar, tapar y almacenar a 4 °C.
3. Cuantificación de los vehículos eléctricos Mtb
- Mida la concentración de proteínas para cada fracción usando BCA y micro BCA12.
- Para fracciones de 0,5 ml recogidas de 3 mg de CFP de 100R Mtb, utilice el micro BCA con una dilución de 1:3 para las fracciones numeradas del 1 al 7 de cada muestra por triplicado.
- Para fracciones de 0,5 ml numeradas 5-13, utilice el BCA sin dilución para cada muestra por triplicado.
NOTA: La superposición de los ensayos para las fracciones 5-7 ayudará a garantizar que todas las fracciones tengan una salida legible.
- Cuantificar la concentración de partículas para cada fracción mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA).
- Diluya las muestras en 1 ml de 1x PBS utilizando las siguientes proporciones iniciales sugeridas; para las fracciones 1-3, use 1:100, y luego para las fracciones restantes, use una dilución 1:10.
- Vórtice las soluciones diluidas y luego extraiga la muestra en una jeringa desechable de 1 ml. Coloque la jeringa en una bomba de jeringa automática si está disponible.
- Ajuste la bomba de jeringa a 30 μL/min y utilice la configuración de captura de vídeo con una ganancia de pantalla de 10-12 y un nivel de cámara de 10-12. Ajuste el enfoque para cada muestra.
- Recopile un mínimo de tres videos a 30 s cada uno utilizando un flujo constante.
- Realice el análisis con el umbral de detección de software establecido en cinco.
NOTA: Es posible que no sea posible obtener datos de NTA para las últimas fracciones (>7) sin sacrificar un volumen de muestra significativo.
4. Calificación de los vehículos eléctricos Mtb
- Visualice el perfil general de proteínas de cada fracción utilizando un gel de proteína teñido de plata.
NOTA: Los procedimientos detallados para SDS-PAGE y tinción de plata se pueden encontrar en la Referencia15.- Agregue el tampón de muestra SDS a 10 μL de cada fracción y 5 μg de CFP, 100R y 100F. Hervir durante 5 min a 100 °C, luego cargar en un gel Bis-Tris al 4%-12% con una escalera de peso molecular para electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) (ver Tabla de materiales).
- Ejecute el gel utilizando 1 tampón de 2-[N-morfolino]ácido etanosulfónico (MES) (consulte la Tabla de materiales) y una corriente de 200 V durante 35 min.
- Retire el gel del cassette y proceda con la tinción de plata15.
- Evaluar la presencia o ausencia de marcadores EV en cada fracción por Western blot.
NOTA: Los procedimientos detallados para Western blotting se pueden encontrar en la Referencia15.- Ejecute un gel SDS-PAGE como se describe en los pasos 4.1.1-4.1.2.
- Retire el gel del cassette y transfiera las proteínas resueltas a una membrana de nitrocelulosa de 0,2 μm (ver Tabla de Materiales) aplicando una corriente de 50 V durante un mínimo de 1 h.
- Realizar análisis de Western blot para evaluar proteínas de interés. Se recomiendan anticuerpos primarios contra LpqH, lipoarabinomanano (LAM) y GroES (ver Tabla de Materiales).
- Fracciones de agrupación basadas en la presencia o ausencia de marcadores, según corresponda para la aplicación posterior.
- Confirmar la presencia de vesículas intactas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).
- Fije 15 μL de la muestra de vesícula agregando 15 μL de paraformaldehído de grado EM al 4% y guárdelo a 4 ° C durante la noche.
- Prepare una rejilla TEM de cobre recubierta de carbono formvar de 200 mallas limpiando la superficie y haciendo un sustrato hidrófilo.
NOTA: Se recomienda la limpieza con plasma con 95% de argón, 5% de oxígeno y 30% de potencia plasmática durante 1 minuto. - Deje caer 10 μL de la muestra fija en la rejilla y deje que la muestra se adhiera durante 10 minutos, luego borre el exceso de líquido con papel de filtro.
- Flote la rejilla en una gota de agua ultrapura durante 30 s, luego elimine el exceso de líquido.
- Flote la rejilla en una gota de acetato de uranilo de grado EM al% durante 2 minutos, luego borre el exceso de líquido.
- Deje que la rejilla se seque completamente al aire.
- Imagen utilizando un TEM (ver Tabla de Materiales) a 100 kV o similar.
NOTA: Se deben utilizar otros métodos de cuantificación y caracterización de vehículos eléctricos en función de las aplicaciones posteriores. La Información Mínima para Estudios de Vesículas Extracelulares18 debe ser consultada para obtener pautas que aseguren el rigor y la reproducibilidad de todos los estudios de EV.
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Representative Results
La proteína de filtrado de cultivo (CFP) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) se concentró, cuantificó y luego se aplicaron 3 mg de material a una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Las concentraciones de proteínas y partículas fueron enumeradas por BCA y NTA, respectivamente. Los rangos esperados para la recuperación de proteínas y partículas más los valores exactos obtenidos para estos resultados se informan en la Tabla 1. Valores mucho más altos que estos rangos pueden indicar contaminación o problemas de integridad de la columna. Los valores significativamente más bajos apuntan a problemas en las etapas de ultrafiltración y, por lo tanto, el flujo debe compararse con el CFP inicial y el 100R para determinar si se produjo una concentración exitosa. Una tinción de plata de proteína no específica muestra que las fracciones posteriores contienen más proteína y se asemejan al material 100R (Figura 1).
Las manchas occidentales de las fracciones demuestran que el lipoarabinomanano (LAM) está presente en todas las fracciones, con fracciones posteriores que muestran bandas de menor intensidad (Figura 2A, Figura suplementaria 1). La lipoproteína lpqH de 19 kDa, conocida por estar presente en los EVmtb 3,19, está enriquecida en las primeras fracciones de la SEC (Figura 2B, Figura suplementaria 1). La proteína chaperonina de 10 kDa GroES está ausente en las primeras fracciones de la SEC (Figura 2C, Figura suplementaria 1); este hallazgo se alinea con estudios publicados anteriormente sobre GroES como contaminante durante el enriquecimiento de Mtb EV12 y sirve como un control negativo para la presencia de Mtb EV. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) confirma la presencia de vesículas cerradas unidas a la membrana (Figura 3A). En la Tabla 2 se informa una comparación de los EV Mtb separados por ultrafiltración por gradiente de densidad y este método SEC. SEC proporciona una mayor recuperación de proteínas y partículas para tres réplicas técnicas de la misma CFP. Estos resultados han sido consistentes en múltiples lotes de CFP (datos no mostrados). Ambos métodos dan como resultado vesículas cerradas unidas a la membrana en el rango de tamaño esperado, como lo demuestran TEM (Figura 3) y NTA (Figura 4).
En conjunto, estos datos demuestran el enriquecimiento de los vehículos eléctricos Mtb en las primeras fracciones SEC. Los valores más altos de NTA ocurren en las fracciones 1-3, y el contenido de proteínas aumenta a medida que aumenta el número de fracciones, lo que indica la separación de las proteínas solubles de los EV (Tabla 1). Debido a que la fracción 4 contiene evidencia de GroES (Figura 2C, Figura suplementaria 1), esta fracción no se incluyó en el material agrupado para TEM. Dependiendo de la aplicación posterior, se debe considerar la inclusión o exclusión de fracciones específicas para la estrategia de agrupación.
Figura 1: Tinción de plata por fracción. Un gel SDS-PAGE teñido con plata demuestra el perfil proteico general para cada fracción. CFP = 5 μg de Mtb CFP, 100R = 5 μg de 100R, 100F = 5 μg de 100F, 1-11 = 10 μL de fracciones SEC 1-11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Western blots por fracción. Western blots detectando (A) LAM, (B) LpqH y (C) GroES, demostrando cambios en los marcadores de proteínas en las fracciones. CFP = 5 μg de Mtb CFP, 100R = 5 μg de 100R, 100F = 5 μg de 100F, 1-11 = 10 μL de fracciones SEC 1-11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM). (A) Fracciones SEC 1-3 agrupadas antes de la fijación. (B) La ultracentrifugación del gradiente de densidad de los EV Mtb se tiñó negativamente para las imágenes TEM. Barras de escala = 200 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Distribución del análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). (A) Fracciones SEC 1-3. (B) Los EV de ultracentrifugación Mtb de gradiente de densidad se analizaron con análisis de seguimiento de nanopartículas. Se muestra la distribución de tamaño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Fracción | Rango de recuperación de proteínas (μg/μL) | Rango de recuperación de partículas (por μL) | Resultado recuperación de proteínas (μg/μL) | Resultado Recuperación de partículas (por μL) |
| 1 | 0.01-0.03 | 1E8 - 3E8 | 0.013 | 1.60E+08 |
| 2 | 0.02-0.04 | 2E8 - 4E8 | 0.026 | 2.10E+08 |
| 3 | 0.02-0.04 | 2E7 - 6E7 | 0.024 | 5.20E+07 |
| 4 | 0.03-0.05 | 7E6 - 2E7 | 0.032 | 1.30E+07 |
| 5 | 0.05-0.09 | 1E6 - 5E6 | 0.053 | 4.20E+06 |
| 6 | 0.09-0.2 | 1E6 - 5E6 | 0.099 | 5.20E+06 |
| 7 | 0.1-0.3 | 1E6 - 3E6 | 0.234 | 2.70E+06 |
| 8 | 0.3-0.5 | 1E6 - 4E6 | 0.398 | 4.20E+06 |
| 9 | 0.4-0.6 | 1E6 - 3E6 | 0.543 | 4.10E+06 |
| 10 | 0.5-0.7 | 1E6 - 3E6 | 0.661 | 1.70E+06 |
| 11 | 0.6-0.8 | 1E6 - 3E6 | 0.736 | 1.40E+06 |
Tabla 1: Recuperación de proteínas y partículas por fracción. Rango esperado de recuperación de proteínas y partículas por fracción basado en 3 mg de material de partida. Los valores exactos para la obtención del material utilizado en este estudio se incluyen en las dos columnas más a la derecha.
| Método de enriquecimiento | Proteína total recuperada (μg) | Total de partículas recuperadas |
| Ultracentrifugación por gradiente de densidad | 3.14 | 1.82E+10 |
| 3.88 | 1.93E+10 | |
| 3.20 | 1.65E+10 | |
| Cromatografía de exclusión de tamaño F1-3 | 12.96 | 4.05E+10 |
| 14.14 | 4.15E+10 | |
| 14.74 | 4.35E+10 |
Tabla 2: Comparación de métodos de recuperación de proteínas y partículas. Rendimiento proteico medido con BCA y recuento total de partículas medido por NTA para EV Mtb originados a partir de 3 mg del mismo material de partida 100R, enriquecidos utilizando el método de ultracentrifugación de gradiente de densidad referenciado8 o este método SEC (triplicado).
Figura suplementaria 1: Manchas occidentales originales (sin recortar) de la Figura 2. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Las vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis son reservorios altamente antigénicos, que las presentan como una vía atractiva para el desarrollo de herramientas diagnósticas y futuras vacunas 4,19,20. Históricamente, la ultracentrifugación por gradiente de densidad se ha utilizado para separar los EV Mtb de otros materiales solubles y secretados8. Si bien este proceso es efectivo, también requiere mucho tiempo, es técnicamente desafiante y puede afectar la integridad de las preparaciones EV resultantes 9,10. El protocolo presentado ofrece un método alternativo para las preparaciones de Mtb EV a través de la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC).
Hay varios puntos críticos para el éxito en este método. La preparación inicial de Mtb CFP influirá en la calidad y el rendimiento de las vesículas después de SEC. Se recomienda que la CFP se recolecte en o antes de la fase media del crecimiento para limitar el nivel de lisis celular en el momento de la cosecha. Los cultivos en fase de crecimiento estacionario y lo lomo tardío pueden contener niveles más altos de lisis celular y pueden dar lugar a la identificación de proteínas intracelulares y estructuras artificiosas similares a EV, generadas espontáneamente a partir de los fragmentos de membrana de las células lisadas, como un contribuyente significativo a la CFP recolectada 12,13,14 . Esto debe evaluarse antes de comenzar este protocolo, ya que las vesículas de membrana de las células lisadas se copurificarán con los EV Mtb secretados y los posibles análisis sesgados aguas abajo. Se debe tener cuidado durante la ultrafiltración para garantizar que la membrana del filtro permanezca intacta y húmeda. El daño al filtro puede hacer que el material deseado fluya a través de él. Incluir la PPC original, 100R y 100F en las evaluaciones de calidad posteriores ayudará en la evaluación de la integridad de la ultrafiltración.
La configuración y el lavado adecuados de la columna SEC son necesarios para la preparación de EV de la más alta calidad. Siempre siga los manuales de usuario para la configuración y la eliminación. Mientras se recolectan las fracciones, asegúrese de que el AFC no se golpee ni se mueva, ya que esto puede interrumpir el proceso y provocar fracciones omitidas o inconsistentes. Los anticuerpos utilizados para la calificación dependerán de la aplicación posterior de las vesículas enriquecidas, y deben incluir un marcador que se espera que esté en los EV Mtb (LpqH) y un marcador encontrado en CFP pero no enriquecido en Mtb EV (GroES). Una limitación de los métodos presentados aquí es la variación potencial en los controles de proteínas apropiados. Este protocolo ha sido desarrollado utilizando métodos de cultivo estándar. El trabajo realizado con Mycobacterium avium sugirió que los niveles de chaperoninas como GroES cambian en CFP y EV en función del medio utilizado para el crecimiento21. A medida que surja más información sobre la composición de ev micobacterianos, puede ser necesario ajustar el marcador de control negativo específico.
Por último, todos los procedimientos de cuantificación y calificación y las aplicaciones posteriores deben realizarse rápidamente. Si se requiere almacenamiento de material, se recomienda 4 °C durante la congelación para evitar la interrupción de la integridad de las vesículas durante el proceso de congelación-descongelación. Si se realiza la congelación, alícuel el material para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación. Los vehículos eléctricos enriquecidos deben reevaluarse cuantitativa y cualitativamente si pasa una cantidad significativa de tiempo entre la evaluación inicial y el uso.
Este método enriquece eficazmente los EV Mtb, y hay flexibilidad para la adaptación a otras micobacterias. Al adaptar este procedimiento para otros organismos, asegúrese de que el cultivo inicial tenga una lisis celular limitada. La cantidad de material cargado en la columna debe ajustarse, ya que la cinética de la liberación de EV variará. No exceda una concentración máxima de proteína de 7 g por 100 ml según las especificaciones del fabricante. También es necesario evaluar cada fracción individualmente para detectar la presencia de marcadores y contaminantes asociados a EV. La concentración de proteínas y los datos de NTA pueden ser engañosos en la optimización del método: una concentración muy baja de proteínas no significa la ausencia de vesículas en esas fracciones. Además, el cambio de las columnas SEC y los parámetros de recopilación de fracciones permite al usuario escalar el protocolo en función de las aplicaciones de entrada y posteriores. Las limitaciones de este método incluyen el costo del AFC y los consumibles, la producción diluida y, como se mencionó anteriormente, el desarrollo y la optimización del esquema de agrupación de facciones. Si bien la ultracentrifugación por gradiente de densidad tiene sus ventajas y tal vez más aplicable para ciertos experimentos, el enriquecimiento de los vehículos eléctricos Mtb por parte de la SEC es comparable en calidad y superior en acceso y facilidad de uso, como se presenta aquí.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer el apoyo de la Facultad de Medicina Veterinaria y Ciencias Biomédicas Premio Experiencial y el Programa de Investigación Compartida del Consejo de Investigación Universitaria a NKG y la financiación de ATCC (premio # 2016-0550-0002) a KMD. También nos gustaría agradecer a Anne Simpson por su apoyo técnico y a BEI Resources, NIAID, NIH por los siguientes reactivos: Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (producido in vitro), NR-13792, Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (producido in vitro), NR-49223, y Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clon CS-35 (producido in vitro), NR-13811.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x MES SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Automatic Fraction Collector | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Pre-stained Protein Ladder | Invitrogen | 10748010 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC710008 | Ultrafiltration device used in step 1.1 |
| Electroblotting System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL | AbCam | ab6790 | Secondary antibody |
| JEM-1400 Transmission Electron Microscope | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primary antibody |
| Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primary antibody |
| Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primary antibody |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | For plasma cleaning of the TEM grid | |
| Nanosight equipped with syringe pump and computer with NanoSight NTA software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 μm | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC column |
| SDS sample buffer | Boster | AR1112 | In-house recipe used in this procedure, however this product is equivalent |
| SDS-PAGE gel chamber | ThermoFisher Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silver Stain Plus Kit | BioRad | 1610449 | In-house protocol used in this procedure, however this kit is equivalent |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 |
References
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