Summary
Микрофлюидика является мощным инструментом для разработки диагностических тестов. Тем не менее, часто требуется дорогостоящее оборудование и материалы, а также трудоемкие методы изготовления и обработки. Здесь мы подробно описываем протокол изготовления акрилового микрофлюидного устройства для магнитных иммуноанализов на основе микро- и наночастиц в недорогих и простых в использовании условиях.
Abstract
Микрофлюидные системы значительно улучшили методы иммунологического анализа. Тем не менее, многие методы микропроизводства требуют специализированного, дорогостоящего или сложного оборудования, что делает изготовление дорогостоящим и несовместимым с массовым производством, что является одним из наиболее важных предварительных условий для проведения тестов в местах оказания медицинской помощи (POCT) в условиях ограниченных ресурсов. В данной работе описан процесс изготовления акрилового (полиметилметакрилата, ПММА) устройства для тестирования ферментативного иммунологического анализа с наночастицами с использованием метода микромоделирования с числовым программным управлением (ЧПУ). Функционирование микрофлюидного устройства показано путем выполнения иммуноанализа для обнаружения коммерческого антитела с использованием лизоцима в качестве модельного антигена, конъюгированного с магнитными наночастицами 100 нм. Это устройство интегрирует физическое ступенчатое ограничение высотой всего 5 мкм, используемое для захвата магнитных микрочастиц, которые составляют магнитную ловушку, путем размещения внешнего магнита. Таким образом, магнитной силы на иммуноподдержку конъюгированных наночастиц достаточно, чтобы захватить их и противостоять лобовому сопротивлению потока. Это микрофлюидное устройство особенно подходит для недорогого массового производства без потери точности для эффективности иммуноанализа.
Introduction
В последние годы микрофлюидика играет важную роль в методах иммунологического анализа1. Технология миниатюризации имеет много выдающихся преимуществ по сравнению с традиционными иммуноанализами, таких как снижение расхода образцов и реагентов, более короткое время инкубации, эффективный обмен решениями, а также более высокая интеграция и автоматизация2.
Кроме того, микрофлюидные системы в иммуноанализах в сочетании с магнитными наночастицами в качестве иммуноподдержки значительно сокращают время инкубации, достигая высокой чувствительности обнаружения за счет увеличения отношения поверхности к объему3. Броуновское движение частиц улучшает кинетику реакции при образовании комплекса антиген-антитело 4,5. Кроме того, магнитные свойства наночастиц обеспечивают универсальность для интеграции в различные конфигурации микрофлюидных устройств, что делает их идеальным кандидатом для передачи сигналов и захвата молекул в миниатюрных системах биозондирования на кристалле5. Однако магнитные силы значительно слабее, чем силы сопротивления в нанометровом масштабе из-за высокого отношения поверхности к объему6. Поэтому захват наночастиц для важнейших этапов иммуноанализа, таких как промывка и обнаружение, может быть сложной задачей, а обычного магнита недостаточно4.
Эффективным способом манипулирования наночастицами является использование микрофлюидной магнитной ловушки, образованной микрочастицами железа, которые упакованы в микрофлюидную структуру3. Поэтому, когда внешний магнит приближается, в намагниченной пористой среде создается сложное взаимодействие между магнитной и потоковой силами. Магнитная сила, действующая на наночастицы, достаточно сильна, чтобы захватить их и противостоять лобовому сопротивлению потока 3,4,7. Этот подход требует методов микрофабрикации, которые достигают разрешения порядка нескольких микрометров для создания микрометрических структур, которые удерживают микрочастицы.
Современные методы микропроизводства позволяют изготавливать структуры с высоким разрешением от нескольких микрон до сотен нанометров8. Однако многие из этих методов требуют специализированного, дорогого или сложного оборудования. Одной из основных трудностей является потребность в чистом помещении для изготовления пресс-форм, которая остается дорогостоящей и трудоемкой 8,9. В последнее время микрофлюидные инженеры преодолели этот недостаток, разработав множество альтернативных методов изготовления с различными преимуществами, такими как снижение затрат, более быстрое время выполнения работ, более дешевые материалы и инструменты и повышенная функциональность8. Таким образом, разработка новых методов микропроизводства принесла недорогие, нечистые методы, которые достигают разрешения до 10 мкм8. Рисунок может быть использован непосредственно на подложке без создания дорогостоящего шаблона формования, что позволяет избежать трудоемкого процесса. Методы прямого изготовления включают фрезерование с ЧПУ, лазерную абляцию и прямую литографию8. Все эти методы пригодны для получения каналов с высоким соотношением сторон в широком спектре материалов, независимо от их твердости9, что позволяет создавать новые и выгодные геометрии, физическое поведение и качества в микрофлюидных устройствах8.
Микромелирование с ЧПУ создает микромасштабные структуры с использованием режущих инструментов, которые удаляют сыпучий материал с подложки и является эффективным методом изготовления для микрофлюидных устройств10,11. Метод микромелирования может быть полезен в микрофлюидных приложениях для создания микроканалов и функций непосредственно на рабочей поверхности, предлагая ключевое преимущество: заготовка может быть изготовлена за короткое время (менее 30 минут), что значительно сокращает время обработки от проектирования до прототипа12. Кроме того, широкая доступность режущей фурнитуры из различных материалов, размеров и форм делает фрезерные станки с ЧПУ подходящим инструментом, который позволил изготавливать различные функции во многих типах недорогих одноразовых материалов13.
Среди всех материалов, обычно используемых в микромелировании, термопласты остаются ведущим выбором из-за их многочисленных благоприятных свойств и совместимости с биологическими приложениями10,14. Термопласты являются привлекательной подложкой для микрофлюидных систем благодаря своим значительным преимуществам для разработки недорогих одноразовых аналитических систем9. Кроме того, эти материалы очень поддаются крупномасштабным производственным процессам, что делает их пригодными для коммерциализации и массового производства. По этим причинам термопласты, такие как ПММА, считались надежными и прочными материалами с первых лет микрофлюидики10. Были описаны различные протоколы для изготовления закрытых каналов в термопластах, таких как связь растворителя15, тепловая связь16 и связь поверхности17 ультрафиолетовой (УФ)/озоновой обработки.
Во многих случаях разрешение позиционирования, достигаемое с помощью обычных микромельничных машин, недостаточно для некоторых микрофлюидных применений, требующих структур размером менее 10 мкм. Высококачественное микромелье имеет достаточное разрешение. К сожалению, из-за высоких цен его использование ограничено горсткой пользователей12. Ранее наша исследовательская группа сообщала о изготовлении и манипулировании недорогим инструментом, который позволяет обрабатывать конструкции менее 10 мкм, преодолевая разрешение обычных фрезерных станков12. Светильник представляет собой платформу, изготовленную методом 3D-печати с простой электроникой, содержащую три пьезоэлектрических привода. Поверхность содержит шарнирные соединения, которые позволяют поднимать ее, когда пьезоэлектрические элементы действуют одновременно. Смещение по оси Z можно контролировать с разрешением 500 нм и точностью ±1,5 мкм12.
В этой статье представлены этапы производственного процесса акрилового устройства (ПММА) с помощью метода микромоделирования. Конструкция чипа состоит из основного канала шириной 200 мкм и высотой 200 мкм и бокового канала с теми же размерами для продувки потока реагентов. В центральной области канал прерывается физическим ограничением высотой всего 5 мкм, изготовленным с помощью 3D-печатной пьезоэлектрической платформы, изготовленной этой группой12, для захвата магнитных микрочастиц, которые составляют магнитную ловушку для наночастиц, путем размещения внешнего магнита. Показана работа микрофлюидного устройства путем проведения иммуноанализа для обнаружения коммерческого антитела с использованием лизоцима в качестве модельного антигена, конъюгированного с магнитными наночастицами 100 нм. Это устройство сочетает в себе различные особенности, которые делают его уникальным4: использование магнитных наночастиц в качестве иммунной поддержки сокращает общее время теста с часов до минут; использование фторогенного фермента для обнаружения позволяет установить пределы обнаружения, сопоставимые со стандартными иммуноферментными анализами (ИФА); и использование термопластика в качестве материала для изготовления делает его совместимым с массовым производством, чего не было в случае магнитных ловушек3 предыдущих микрофлюидных наночастиц, и делает его отличным кандидатом для разработки POCT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Микромельчивание
- Поверхностное шлифование
- Включите микромельничную машину и пьезоэлектрический контроллер. Запустите соответствующее программное обеспечение управления12.
- Выберите необходимые концевые фрезы (диаметры 200 мкм и 800 мкм). Поместите их в соответствующий отсек фрезерного станка (рисунок 1).
- Вырежьте прямоугольники из ПММА толщиной 9 мм x 25 мм с помощью торцевого фрезерного долота толщиной 800 мкм. Аккуратно прикрепите один из этих прямоугольников двусторонней клейкой лентой к пьезоэлектрической платформе (рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что акриловый прямоугольник всегда находится в одном и том же положении, чтобы один из углов совпадал с координатами начала координат на осях x и y для обработки. - Подключите и поместите z-сенсор на поверхность прямоугольника PMMA. Выберите контакт обнаружения и переместите его по поверхности датчика. Опустите контакт вручную, не соприкасаясь с датчиком. Активируйте режим зондирования Z0 (рисунок 3).
- Выберите концевой милл-бит длиной 200 мкм и переместите его в начало координат x, y. Извлеките z-сенсор. Осторожно опустите биту, не соприкасаясь с акриловой поверхностью.
- Вращайте концевую мельницу 200 мкм со скоростью 14 500 об/мин. Медленно опустите его до начальной координаты по оси z (z = 0). Сбросьте ось Z на 30 мкм ниже начала координат. Задайте эту координату в качестве нового z-начала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не опускайте бит, если он не вращается. В противном случае он рискует сломаться. - Нажмите кнопку «Вырезать» в программном обеспечении микромельничной машины, чтобы активировать панель «Разрезать ». Нажмите на кнопку Добавить и выберите файл .txt (Supplemental Coding File 1) с ранее созданным кодом для шлифовки акриловой поверхности. Нажмите кнопку «Вывод», чтобы начать процесс.
- Приведите концевую мельницу к координатам, где будет обрабатываться ограничение. Предотвратите отрыв концевой мельницы от поверхности земли после достижения этой координаты, нажав кнопку Пауза . В противном случае вручную переместите конечный бит мельницы в эту координату (рисунок 4A).
- Фрезерование с ограничением 5 мкм
- Установите скорость вращения торцевого фрезы на 11 000 об/мин. Поднимите платформу на 6,5 мкм с интерфейсом пьезоэлектрической платформы (Дополнительный рисунок S1). Переместите торцевой бит мельницы вдоль оси Y на 500 мкм. Верните пьезоэлектрическую платформу к ее начальному значению по оси z с интерфейсом управления.
- Фрезерование микроканалов
- Откройте ранее созданный файл проекта из программного обеспечения для проектирования (Дополнительный файл проектирования 1). Нажмите на кнопку Печать . Откройте меню «Свойства» и щелкните цветовое окно, соответствующее слою, содержащему обрабатываемый дизайн. Задайте параметры изготовления на панели инструментов , как указано на дополнительном рисунке S2.
- Деактивируйте нежелательные слои, выбрав параметр «Нет » в раскрывающемся меню «Инструменты ».
- Фрезерование отверстий
- Переключитесь на концевую биту мельницы 800 мкм. Активируйте конструктивный слой отверстий диаметром 1,2 мм, нажав на соответствующее цветовое окно.
- Повторите шаг 1.3.2., но в этом случае установите соответствующие параметры изготовления, как описано на дополнительном рисунке S3A для отверстий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина обрабатываемых отверстий составляет половину толщины акрила. - Обрабатывайте два дополнительных отверстия на контралатеральных углах прямоугольника для выравнивания акрила перевернутым способом на новой платформе (рисунок 4В). Снимите акриловый прямоугольник с пьезоэлектрической платформы. Переверните акрил и заклейте его двусторонней клейкой лентой поверх адаптера с обработанными стойками (рисунок 4C,D).
- Откройте файл с дизайном отверстий для противоположной стороны от программного обеспечения проектирования (Supplemental Design File 2). Задайте соответствующие параметры изготовления, как описано на дополнительном рисунке S3B. Отшлифуйте оставшуюся половину входных и выходных отверстий реагента диаметром 1,5 мм и глубиной 0,7 мм (дополнительный рисунок S3C).
Рисунок 1: Размещение торцевых долот. (A) Торцевые фрезы 200 мкм и 800 мкм помещаются и фиксируются с помощью винта на стальной опоре. (B) Каждый концевой фрез помещается в специальный отсек микромельничной машины для автоматического отбора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пьезоэлектрическая платформа. Платформа изготовлена методом 3D-печати и состоит из двух шестиугольных оснований, соединенных шарнирами, которые обеспечивают тонкое смещение по оси Z, управляемое тремя пьезоэлектрическими приводами. Также наблюдается акриловый адаптер, к которому прикреплен прямоугольник ПММА, и который позволяет установить угол выравнивания координат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Калибровка по оси Z. Этапы калибровки по оси Z детализированы. (A) Z-сенсор включает в себя кабель, который подключается к микромельничной машине. (B) Датчик помещается непосредственно на обрабатываемую поверхность. (C) Контакт обнаружения состоит из металлического стержня, помещенного в специальный отсек рядом с торцевыми фрезами. (D) Когда оба аксессуара вступают в контакт, микромельничная машина автоматически вычисляет начальную координату по оси Z. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Ректифицированная акриловая поверхность. (A) Торцевой фрезы диаметром 200 мкм протирает всю поверхность акрилового прямоугольника, удаляя слой высотой около 30 мкм. (B) На изображении показаны различные структуры, фрезерованные на лицевой стороне ранее выпрямленного акрила. Наблюдаются каналы и отверстия для входа и выхода реагента. Ограничение в 5 мкм нельзя увидеть невооруженным глазом. (C) Микромоленная поверхность с отверстиями для выравнивания и адаптер с выравниванием стоек на противоположных углах. (D) Акрил выровнен вверх ногами на адаптере со стойками, в которые помещаются отверстия для выравнивания. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2. Уплотнение канала
- Акриловая чистка
- Снимите акриловый прямоугольник с платформы адаптера столба. Возьмите еще один необработанный акриловый прямоугольник. Оба акриловых листа промыть изопропиловым спиртом (IPA) и промыть дистиллированной водой. Носите перчатки и избегайте контакта с IPA.
- Погрузите акрил в ультразвуковую ванну на 10 мин (рисунок 5А,В).
- Воздействие газообразного хлороформа
- Отлично высушите оба акриловых листа. Прикрепите их к внутренней стороне стеклянной крышки чашки Петри с помощью двусторонней ленты. Обязательно поместите сторону обработанного канала открытой (рисунок 5C). Надевайте перчатки и избегайте непосредственного прикосновения к акриловой поверхности.
- Поместите основание стеклянной чашки Петри внутрь большей стеклянной чашки Петри (рисунок 5D). Влейте 1 мл хлороформа в основание чашки Петри. Быстро поместите крышку с акриловыми листами, прикрепленными к внутренней стороне.
- Немедленно добавьте дистиллированную воду к основанию большей чашки Петри до уровня крышки чашки Петри. Допускается воздействие на акрил газообразного хлороформа в течение 1 мин (рисунок 5Е).
ПРИМЕЧАНИЕ: Учтите, что более длительное время воздействия хлороформа будет атаковать акриловую поверхность, и ограничение в 5 мкм расплавится, изменив ее высоту, или исчезнет полностью. - Наклоните чашку Петри, чтобы сломать созданное водяное уплотнение. Немедленно удалите акрил из хлороформа, открыв чашку Петри. Будьте осторожны, чтобы не пролить воду.
ВНИМАНИЕ: Делайте этот процесс в вытяжном капюшоне и используйте перчатки, так как хлороформ очень токсичен.
- Склеивание прессованием и нагревом
- Снимите обе акриловые пластины с двусторонней ленты.
- Выровняйте оба акрила с боками, которые подвергались воздействию газообразного хлороформа лицом к лицу, образуя бутерброд. Поместите акрил в пресс при температуре 18 кгс/см2 и температуре 90 °C (рисунок 5F,G).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется размещать акрил продольно выровненным и менять его выравнивание через 2 мин для лучшего уплотнения. Если по истечении этого времени уплотнения недостаточно, поместите его обратно в пресс с интервалом не более 1 мин. С помощью стереоскопа проверьте состояние каналов и ограничения. Учтите, что в случае превышения времени прессования есть риск устранения ограничения.
- Крепление шланга
- Отрежьте шланг длиной 2-3 см. Сделайте полностью прямой разрез. Прикрепите каждый шланг к отверстиям устройства с помощью мгновенно высыхающего жидкого клея (рисунок 6А). Предотвратите попадание клея внутрь чипа.
Рисунок 5: Процесс герметизации устройства. (A) Каждый из акриловых листов помещается в запечатываемый пакет с дистиллированной водой и погружается в ультразвуковую ванну. (B) На изображении слева показаны каналы сразу после изготовления, а на изображении справа показано то же устройство после стирки iPA и ультразвуковой ванной, который удаляет все примеси и акриловые остатки из микроканала. Наблюдаются края ограничения, прерывающего центральный канал 200 мкм, что подтверждает успешный процесс фрезерования. Шкала брусков = 500 мкм. (C) Оба акрила сушат и приклеивают к стеклянной платформе на крышке. (D) Основание чашки Петри помещается внутрь другой чашки большего диаметра. (E) При закрытии чашки Петри водяное уплотнение предотвращает утечку газообразного хлороформа. F) Описание элементов рычага весом 5 кг. (G) Изображение открытого рычага, показывающее красным цветом область, где размещен акрил. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
3. Подготовка устройства
- Наполните каналы дистиллированной водой с помощью шприца. Убедитесь, что нет утечек или сопротивления потоку. Погрузите устройство в ультразвуковую ванну на 10 минут, чтобы удалить оставшийся акрил, клей или нежелательный материал внутри каналов.
- Опорожните воду внутри каналов устройства. Используйте шприц для введения блокирующего раствора, приготовленного из 5% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (BSA), разведенного в 1x Tris-буферном физиологическом растворе (TBS) и предварительно отфильтрованного через шприцевой фильтр 0,2 мкм полиэфирсульфона (PES).
- Готовят суспензию микрочастиц железа диаметром 7,5 мкм в 5% BSA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микрочастицы предварительно функционализированы слоем кремнезема-полиэтиленгликоля (ПЭГ), который придает устойчивость к поглощению белка4. - Инкубируют чип и суспензию микрочастиц блокирующим раствором в течение не менее 1 ч при комнатной температуре. Если возможно, разрешите блокировку на ночь при 4 °C.
4. Образование ловушки микрочастиц
- Вставьте микрочастицы в чип шприцевой иглой через выходной шланг бокового канала. Расположите чип вертикально и позвольте микрочастицам течь под действием силы тяжести через боковой канал. Поверните чип на 180° в два шага на 90° и позвольте микрочастицам нацеливаться и сжиматься при ограничении 5 мкм.
- Удалите лишние микрочастицы под действием силы тяжести, вращаясь на 45° по направлению к боковому каналу.
- Держите устройство в вертикальном положении, чтобы избежать отмены ловушки микрочастиц. См. рисунок 6B для краткого описания процесса образования ловушки микрочастиц.
5. Иммуноанализ
- Подготовка наночастиц
- Взять 2 мкл суспензии 100 нм наночастиц, предварительно конъюгированных с лизоцимом (модель антигена). Добавьте его в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл со 100 мкл блокирующего раствора. Инкубировать в течение ночи при 4 °C.
- Добавьте 150 мкл промывочного буфера (1x TBS, 0,05% Tween 20).
- Поместите микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл в магнитный сепаратор. Хранить в течение 15 мин, чтобы обеспечить разделение наночастиц (дополнительный рисунок S4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный объем магнитного сепаратора составляет 200 мкл. Избегайте использования меньшего объема. - Извлеките жидкость из трубки с помощью микропипетки. Избегайте контакта со стенкой трубки, где образовалась гранула наночастиц.
- Добавьте 250 мкл свежего промывочного буфера. Держите трубку под перемешиванием в течение 15 мин.
- Повторите шаги 5.1.3.-5.1.5. В 2 раза больше, встряхивая только в течение 5 мин.
- Добавьте желаемую концентрацию первичного антилизоцимного антитела (см. Таблицу материалов). Приспособить к конечному объему 100 мкл в разбавителе антител (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
- Инкубировать в течение 15 мин при 37 °C. Держите встряхивание в течение дополнительных 15 минут при комнатной температуре.
- Повторите шаги стирки 5.1.2.-5.1.6.
- Добавьте 100 мкл разбавителя антител. Добавьте вторичное антитело, связанное с пероксидазой хрена (HRP-AbII) (см. Таблицу материалов) в разведении 1:500.
- Повторите шаги стирки 5.1.2.-5.1.6.
- Держите наночастицы в конечном объеме 50 мкл разбавителя антител.
6. Экспериментальный монтаж
- Наполните два стеклянных шприца объемом 100 мкл водой, подключите шланг длиной 6,5 см к каждому шприцу, вставьте металлический штифт в конец шланга и поместите оба шприца на управляемый компьютером шприцевой насос.
- Запечатайте все шланги акрилового устройства теплом.
- Отрежьте входной шланг и держите всего несколько миллиметров. Наполните дозирующую иглу буфером для промывки и вставьте ее в разрезанный шланг. Дайте раствору капать перед подключением иглы к устройству, чтобы предотвратить доступ воздуха к устройству.
- Отрежьте выходной шланг от бокового канала. Подключите к шприцевому насосу. Затем проделайте ту же процедуру для выходного шланга основного канала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выполнить шаги 6.3.-6.4. в этом порядке, чтобы избежать распаковки ловушки микрочастиц. Если возможно, проверьте состояние ловушки на этих этапах с помощью увеличительного стекла. - Поместите стеклянный слайд на ступень микроскопа. Прикрепите магнит к слайду с помощью двусторонней ленты и поместите небольшой кусочек ленты с каждой стороны, чтобы закрепить края чипа на стекле.
- Установите скорость потока 50 мкл/ч через вкладки «Расход» и «Агрегаты» в контроллере шприцевого насоса. Выберите режим вывода и нажмите кнопку Пуск , чтобы активировать поток буфера стирки.
- Осторожно подойдите к устройству к слайду с магнитом в горизонтальном порядке, чтобы область чипа, содержащая ловушку, контактировала с магнитом.
- Приклейте края устройства к стеклу с помощью двусторонней ленты, чтобы предотвратить движение. Избегайте затруднения оптического пути для микроскопии (рисунок 6C).
Рисунок 6: Окончательная конфигурация устройства. (A) Акриловое устройство со шлангами, прикрепленными к соответствующим входам и выходам. Шкала показывает размеры устройства в сантиметрах. (B) Протокол формирования ловушки микрочастиц. Микрочастицы протекают по каналу под действием силы тяжести, когда устройство помещается в вертикальное положение. Микрочастицы концентрируются при ограничении 5 мкм. Лишние микрочастицы легко удаляются путем вращения чипа по боковому каналу. Чип держится вертикально, чтобы сохранить ловушку перед иммуноанализом. (C) Микрофлюидное устройство, установленное на стеклянном предметном стекле, содержащем магнит, на ступени перевернутого флуоресцентного микроскопа. Наблюдается дозирующая игла, через которую добавляются реагенты, а также выпускные шланги, которые соединяются со шприцевым насосом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
7. Иммунодетекция
- Держите буфер промывки в течение 10 мин со скоростью 50 мкл/ч, чтобы удалить избыток BSA.
- Извлеките оставшийся буфер для стирки из дозирующей иглы с помощью микропипетки. Добавьте 50 мкл суспензии наночастиц.
- Проточите суспензию наночастиц в течение 7 мин со скоростью потока 100 мкл/ч. Впоследствии изменяют расход до 50 мкл/ч и расходят еще 15 мин.
- Замените дозирующую иглу. Проточите промывочный буфер в течение 10 мин со скоростью 50 мкл/ч. Подготовьте фторогенный субстрат в соответствии со спецификациями производителя на этапе промывки.
- Извлеките оставшийся буфер для стирки из дозирующей иглы с помощью микропипетки. Добавьте 100 мкл фторогенного субстрата (см. Таблицу материалов). Проточите фторгенный субстрат в течение 6 мин при 50 мкл/ч.
- Установите параметры измерения расхода (1 мкл/ч, 3 мкл/ч, 5 мкл/ч и 10 мкл/ч) и времени (6 мин) в соответствующих вкладках «Скорость потока» и «Установить таймер» интерфейса, управляющего шприцевым насосом. Обязательно выберите Режим вывода для каждого из выполняемых измерений.
- Установите дополнительную вкладку «Скорость потока» на уровне 50 мкл/ч и установите таймер на 3 минуты для этапа промывки.
- Включите флуоресценцию микроскопа за 15 с до того, как подложка на скорости 50 мкл/ч остановится. Начните захват изображения с помощью программного обеспечения камеры микроскопа за 10 секунд до остановки подложки со временем экспозиции 1000 миллисекунд. Выполняйте визуализацию в течение 6 минут со скоростью 1 кадр/с (FPS).
- Нажмите на кнопку Пуск нужного параметра расхода сразу после остановки расхода промывки подложки при остановке 50 мкл/ч. Нажмите кнопку Пуск потока промывки (50 мкл/ч) сразу после остановки выбранного измерительного потока.
- Остановите захват изображения и выключите флуоресценцию микроскопа, чтобы избежать фотоотбеливания подложки.
- Повторите шаги 7.8.-7.10. для каждого используемого расхода измерения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Удалось создать высоковоспроизводимый протокол изготовления, который улучшает разрешение обычной техники микромосячения. Используя этот протокол, достигается изготовление канала высотой до 5 мкм, который работает как поэтапное ограничение в канале высотой 200 мкм. Простая конструкция ступенчатого ограничения захватывает микрочастицы железа диаметром 7,5 мкм, которые при уплотнении в микроканале позволяют создавать магнитную ловушку при приближении внешнего магнита к устройству. Это устройство позволяет проводить иммуноанализы с использованием наночастиц, конъюгированных с интересующим анализируемым веществом в качестве иммунологической поддержки. В этой работе были выполнены неконкурентные косвенные иммунологические анализы с обнаружением на основе фермент-меченых антител. Модельный антиген (Ag) представлял собой лизоцимный белок, конъюгированный с наночастицами (NP) диаметром 100 нм. Антилизоцим кролика IgG использовался в качестве первичного антитела (AbI), а обнаружение проводилось с использованием пероксидазы-конъюгированного вторичного антитела из хрена кролика (HRP-AbII).
Детектирование проводили путем корреляции изменения интенсивности флуоресцентного сигнала, полученного после взаимодействия HRP-AbII с фторогенной субстратом при прохождении через ловушку с захваченными наночастицами. Для выполнения измерений определяли область до и область после ловушки. На рисунке 7A-D показано увеличение интенсивности флуоресценции для различных концентраций антилизоцима AbI: 0 нг/мл, 10 нг/мл, 100 нг/мл и 1000 нг/мл для данной скорости потока фторогенного субстрата (3 мкл/ч). Это показывает, что изменение флуоресценции субстрата прямо пропорционально концентрации используемого AbI.
Рисунок 7: Области измерения флуоресценции. Измерения флуоресценции показаны для различных концентраций используемых первичных антилизоцимных антител: (A) 0 нг/мл, (B) 10 нг/мл, (C) 100 нг/мл и (D) 1000 нг/мл. Синие круги показывают область измерения флуоресценции до и после ловушки, образованной ограничением высоты 5 мкм, где субстрат реагирует с HRP-конъюгированным вторичным антителом. Все изображения соответствуют потоку 3 мкл/ч. Аббревиатура: HRP = пероксидаза хрена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Однако для данной концентрации AbI полученный уровень флуоресценции является функцией скорости потока, используемой для флуорогенного субстрата. Таким образом, конверсионная способность этого субстрата ферментом HRP обратно пропорциональна скорости потока. Оценивались различные скорости потока субстрата 1 мкл/ч, 3 мкл/ч, 5 мкл/ч и 10 мкл/ч. Для каждого эксперимента были получены кривые, соответствующие разности флуоресценции, заданной подложкой до и после прохождения через магнитную ловушку. На рисунке 8А-С показаны кривые, полученные для концентрации 100 нг/мл для трех различных скоростей потока: (А) 10 мкл/ч, (В) 3 мкл/ч и (С) 1 мкл/ч. В зависимости от используемой скорости потока конверсионная способность субстрата HRP-конъюгированным вторичным антителом, помещенным в магнитную ловушку, варьируется. Зеленая кривая представляет интенсивность флуоресценции субстрата после преобразования HRP, расположенной в ловушке. Видно, что при более высоких потоках максимальный уровень полученной флуоресценции распадается. Красная кривая представляет собой базальную флуоресценцию до того, как субстрат достигнет ловушки. Измерение флуоресценции подложки в этой области ловушки остается постоянным, а его величина зависит от степени неспецифических взаимодействий, если отсутствует эффективное блокирование поверхности канала. Мы рассчитали разницу между обеими кривыми, представленную синей кривой.
Рисунок 8: Флуоресцентные кривые. Графики получены при концентрации 100 нг/мл первичного антитела и скорости потока (А) 10 мкл/ч, (В) 3 мкл/ч и (С) 1 мкл/ч. Три цветные кривые представляют флуоресценцию, измеренную до ловушки (красная кривая) и после ловушки (зеленая кривая), и разницу между ними (синяя кривая) с течением времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
На рисунке 9А-С интегрированы кривые разности флуоресценций, измеренные до и после иммунореакции для различных потоков для концентраций AbI (A) 0 нг/мл, (B) 10 нг/мл и (C) 1000 нг/мл. Измерение скорости потока 0 мкл/ч указывает на измерение иммунореакции в статических условиях, где управляет диффузия. При концентрации 1000 нг/мл флуоресценция насыщается для всех оцениваемых потоков. Однако ступенчатая картина флуоресценции при различных потоках обусловлена диффузией субстрата, которая реагирует с такой высокой скоростью преобразования, что преодолевает меньшие потоки. Таким образом, происходит возвращение этой флуоресценции в верхнюю по течению зону ловушки.
Рисунок 9: Коэффициенты разности флуоресценций. Обобщены кривые разности флуоресценций (после-до) для различных потоков, используемых при (А) 0 нг/мл, (В) 10 нг/мл и (С) 1000 нг/мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Измерения, полученные с помощью этого прибора, позволяют сгенерировать стандартную калибровочную кривую для иммунологических анализов, выполненных с лизоцимом в качестве модельного антигена. На фиг.10 показана калибровочная кривая, полученная из максимальных значений различий между флуоресценцией до и после иммунореакции, выполненной в магнитной ловушке. Этот протокол позволяет обнаруживать первичные антилизоцимные антитела с концентрациями порядка нанограммов на миллилитр с использованием потоков от 1 мкл/ч до 10 мкл/ч. Высокая изменчивость и высокие уровни флуоресценции при 1 мкл/ч позволяют предположить, что реактивность иммунокомплекса такова, что эта скорость не благоприятствует потоку реагирующего субстрата и имеет тенденцию накапливаться сразу после ловушки, в дополнение к тому, что сопротивление устройства снижает разрешение устройства для этой скорости потока.
Рисунок 10: Калибровочная кривая. На графике показано максимальное значение различий в интенсивности флуоресценции кривых, полученных относительно концентрации используемого первичного антитела (АВ1) для каждой скорости потока. I/Isat соответствует соотношению значения флуоресценции, полученного для каждого измерения флуоресценции (I), нормализованному относительно максимального значения флуоресценции, достигнутого при насыщении (Isat). Полосы погрешностей представляют стандартное отклонение трех экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Интерфейс контроллера пьезоэлектрической платформы. На левом изображении показан интерфейс, который управляет смещением по оси z пьезоэлектрической платформы. Ограничение создается путем поднятия платформы за счет приложения напряжения к трем пьезоэлектрическим приводам. На правом изображении показан интерфейс программного обеспечения, которое управляет микромельничной машиной, где можно наблюдать точные координаты в осях x и y, где ограничение обрабатывается со скоростью 11 000 об/мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Конструкция устройства. Дизайн устройства, созданного с использованием программного обеспечения для проектирования, виден слева. Конструкция состоит из двух каналов, один из которых является основным каналом, который содержит ограничение высоты 5 мкм, а другой - боковым каналом для выхода отходов. Каналы имеют микромолоту с помощью концевой мельницы 200 мкм. На панели справа показаны параметры изготовления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S3: Микроизмельчающие параметры входных и выпускных отверстий. (A) Отверстия диаметром 1,2 мм и глубиной 0,65 мм (половина толщины акрила) микрофрезерированы на обрабатываемой поверхности. Панель справа показывает скорость перемещения, параметры вращения и глубины торцевого фрезерного долота. (B) Отверстия диаметром 1,5 мм и глубиной 0,7 мм микрофрезерированы на противоположной стороне, соединяющей отверстия. На панели справа показаны параметры изготовления. Оба корпуса имеют микромолоту с 800 мкм концевой мельницей. (C) Входное отверстие реагента (справа) и выходное отверстие (слева) показаны после обработки обеих сторон. Размеры половины большего диаметра позволяют соединить шланг, в то время как барьер, создаваемый половиной меньшего диаметра, не позволяет шлангу блокировать входные отверстия. Шкала стержней = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S4: Разделение наночастиц. Используя коммерческий магнитный сепаратор, наночастицы 100 нм могут быть легко сконцентрированы для выполнения этапов промывки во время иммуноанализа. Гранула, образовавшаяся через 15 мин, наблюдается в красном круге. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный кодовый файл 1: Код для шлифования акриловой поверхности. Сгенерированный код приведен с инструкциями по шлифовке акриловой поверхности размером 25 мм x 9 мм по осям x и y. Последняя строка кода позиционирует сверло прямо в координатах, где будет обрабатываться ограничение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный проектный файл 1: Проектирование входных и выходных отверстий микроканала и реагента. Конструкция содержит два слоя разноцветных структур (черные каналы и красные отверстия), которые обрабатываются на ранее отшлифованной акриловой грани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный проектный файл 2: Проектирование отверстий на противоположной стороне. Конструкция состоит из отверстий большего диаметра для противоположной грани, которые сообщаются с предыдущими и служат для фиксации шлангов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Акриловое микрофлюидное устройство для иммуноанализа с использованием наночастиц в качестве иммуноподдержки было изготовлено с использованием метода микромельчивания. Метод прямого изготовления на подложке имеет то преимущество, что позволяет избежать использования мастер-формы, а также времени и затрат, которые это подразумевает. Тем не менее, он ограничен быстрым прототипированием и крупномасштабным производством устройств.
Здесь мы использовали ранее сообщенную дополнительную пьезоэлектрическую платформу для фрезерного станка12. Платформа была изготовлена методом 3D-печати для создания каналов переменной глубины с вертикальным разрешением, лучшим, чем разрешение 10 мкм обычных микромельничных машин. Мы добились фрезерования каналов высотой до 5 мкм, которые образуют ступенчатое ограничение в микрофлюидном канале 200 мкм.
Для изготовления микрофлюидного устройства требуется только два торцевых фрезерных бита диаметром 200 мкм и диаметром 800 мкм без необходимости ручной замены битов. Используемая модель фрезерного станка выполняет обмен битами автоматически, что помогает в оптимизации времени. Кроме того, режим «Z0 sensing» позволяет автоматически определять происхождение по оси Z с высокой точностью, контактируя с датчиком и штифтом, включенным в фрезерный станок.
Конструкция этого устройства проста, состоящая только из основного канала, прерываемого 5-мкм в шахматном порядке, и вспомогательного канала, который служит продувкой и входом для микрочастиц. Однако высокая точность таких структур требуется для ограничения улавливания микрочастиц железа диаметром 7,5 мкм. Большее ограничение позволяет микрочастицам проходить без удержания, что препятствует их захвату и образованию ловушки микрочастиц. И наоборот, меньшее ограничение значительно увеличивает сопротивление потока канала и заставляет реагенты выходить через боковой канал вместо того, чтобы проходить через пористую среду микрочастиц. Использование микрочастиц большего диаметра для формирования магнитной ловушки позволило бы сделать большее ограничение. Например, частицы диаметром 40 мкм нуждаются в ступенчатом ограничении ~30 мкм. В этом случае нет необходимости использовать пьезоэлектрическую платформу, а протокол изготовления упрощается. Однако пористая среда, состоящая из более крупных микрочастиц, будет по-разному захватывать наночастицы и будет влиять на производительность иммуноанализа; однако неясно, будет ли это к лучшему или к худшему. Ведутся работы по изучению этих особенностей для оптимизации устройства7.
Для достижения требуемой точности было выполнено шлифование поверхности для удаления слоя акриловой поверхности размером 30 мкм путем перемещения 200 мкм торцевого фрезерного бита через всю акриловую поверхность со скоростью 14 500 об/мин. Этот процесс позволяет получить новое начало на оси Z вдоль всей поверхности для большей точности в высоте. Очень важно всегда выравнивать акрил в одном и том же положении, чтобы исходные координаты по осям x и y (предварительно заданные) совпадали с одним из углов акрила. Точно так же следует убедиться, что акрил идеально сидит на основании; в противном случае поверхность может не изнашиваться должным образом, что приводит к проблемам на следующих этапах сборки.
Как только программа завершает процесс поверхностного шлифования, она автоматически приводит конечный долот мельницы к определенной координате, где ограничение 5 мкм, образующее ловушку, будет обработано. Крайне важно предотвратить взлет концевой мельницы с поверхности, как только она достигнет этой координаты. Рекомендуется определить, есть ли у микромельного станка опция, которая предотвращает отсоединение торцевого фреза от поверхности после завершения процесса шлифования. В противном случае потребуется вручную переместить резак в эту координату, что может привести к ошибкам точности местоположения.
Чтобы обработать шахматное ограничение в акриле, необходимо оверсайз на 1,5 мкм. Для высоты 5 мкм пьезоэлектрическая платформа была поднята до 6,5 мкм, потому что микроканал имеет тенденцию немного сплющиваться в процессе герметизации каналов. Кроме того, конечная длина ограничения в устройстве составляет всего 50 мкм; тем не менее, он обрабатывается дольше, чтобы гарантировать, что он взаимодействует с обоими концами основного канала, когда он обрабатывается после этого. За один шаг каналы глубиной 200 мкм изготавливаются с использованием торцевого фрезерного долота диаметром 200 мкм и скоростью вращения 11 000 об/мин. Таким образом, обработка каналов шириной 200 мкм в акриле занимает всего несколько секунд.
Следующим шагом в изготовлении устройства является обработка отверстий, которые соединяют каналы с внешней стороной. Эти отверстия используются для размещения шлангов, которые позволяют легко подключить устройство к шприцевому насосу, который его запускает. Одной из проблем, с которыми здесь сталкиваются, является размещение шлангов. Оптимальное расстояние имеет решающее значение, чтобы обеспечить поток реагентов и избежать создания уплотнения с поверхностью необработанного акрила. Чтобы преодолеть этот недостаток, отверстия обрабатываются в два этапа, чтобы создать границу, где шланги не превышают нужной глубины.
С концевым фрезерным битом 800 мкм рисунок отверстий был отточен на той же ранее микромолотной грани. Отверстия проделываются в конце каждого канала диаметром 1,2 мм и глубиной 0,65 мм, что составляет половину толщины акрила. Кроме того, в контралатеральных углах прямоугольника обрабатываются два отверстия, которые позволяют выровнять акрил лицевой стороной вниз на платформе со столбами. Важно использовать скребок или резак, чтобы удалить акрил с пьезоэлектрической платформы, чтобы не сломать его. На противоположной стороне акрила диаметр отверстий составляет 1,5 мм (больше предыдущей половины), что равно диаметру фиксируемого шланга. Глубина составляет 0,7 мм и должна быть немного больше половины переднего лицевого отверстия, чтобы гарантировать, что оба обработанных отверстия взаимодействуют друг с другом. Барьер, образованный отверстием меньшего диаметра, предотвращает попадание шланга в дно и блокирует входное отверстие. Такая реализация в протоколе значительно улучшает размещение входных и выходных шлангов жидкости к чипу.
Ключевым шагом в производстве устройств является уплотнение. Необходимо герметизировать лицо, содержащее обработанные каналы, необработанной акриловой крышкой с теми же размерами. Герметизация листов методом, не приближающимся к температуре стеклования акрила, позволяет получить каналы без деформации. С помощью используемого метода склеивания тонкая пленка растворителя между двумя листами ПММА растворяет тонкую пленку с поверхности листа ПММА, затем испаряется и, наконец, повторно соединяет мономеры листов ПММА при определенной рабочей температуре.
Широко описанный способ воздействия паров хлороформа был использован для герметизации этого акрилового устройства. Как сообщалось ранее в литературе, хлороформ обеспечивает высокую прочность связи; однако, поскольку хлороформ атакует акрил очень агрессивно, акрил никогда не должен вступать в прямой контакт с жидким хлороформом, только с газообразным хлороформом. Важно поддерживать оптимальное расстояние между испаряющимся хлороформом и акрилом. Мы создали простую систему с помощью стеклянной чашки Петри, в которой акрил приклеивался к крышке. Использовалась платформа, состоящая из девяти горок, соединенных и прикрепленных к крышке чашки Петри, на которой акрил приклеивался двусторонней лентой для регулирования расстояния. Хотя газообразный хлороформный процесс очень чувствителен к изменениям температуры окружающей среды, температуру чашек Петри можно контролировать, помещая их в полистирольную коробку. Водяное уплотнение предотвращает слишком быстрое испарение хлороформа.
Напротив, есть и другие методы соединения, которые являются более быстрыми и не требуют специального оборудования; однако некоторые из них подходят только для соединения двух акриловых листов без механической обработки. Аналогичным образом, трудно контролировать силу склеивания, поскольку растворитель должен быть налит непосредственно между обоими акриловыми листами18, с высоким риском плавления структур небольших размеров, таких как микромолотное ограничение 5 мкм.
Используя протокол, описанный здесь, однородные уплотнения были достигнуты с помощью самодельного пресса, с помощью которого контролировалось давление и температура уплотнения. Для конструкции этого пресса как каркас из алюминия, так и шарнир создают рычаг, усиливающий механическую силу, исходящую от веса 5 кг до коэффициента 9:1. Нагревательные элементы передают свое тепло алюминиевым пластинам толщиной 2 см, которые находятся в контакте с акриловыми деталями.
После того, как акриловые слои герметизированы, последним шагом в процессе изготовления является подключение внешних шлангов к соответствующим входным и выходным отверстиям устройства. Жидкий клей наносится наружно, как только шланги находятся внутри отверстий. Если диаметр шланга меньше отверстий, жидкий клей может попасть в устройство, забив каналы.
Методы прямого изготовления на подложке, такие как микромельчивание, имеют некоторые недостатки, такие как шероховатость обрабатываемой поверхности и конструкции с плохо разграниченными краями9. Несмотря на шероховатость обрабатываемой поверхности каналов, никакой дополнительной обработки для этого устройства не требуется. Важным моментом, который следует отметить в этом протоколе связывания, является то, что хлороформ позволяет уменьшить шероховатость измельченных микроканалов путем полировки поверхностей, подвергающихся воздействию растворителя. Полировка поверхности настолько хороша, что даже оптическое качество улучшено19.
Когда устройство было изготовлено, оно должно быть подготовлено к использованию в иммунологическом анализе. Ультразвуковая промывка устройства имеет большое значение для удаления любого нежелательного акрилового мусора, который может закупорить каналы и помешать иммунологическому анализу.
Кроме того, особое внимание необходимо уделить правильной блокировке каналов, чтобы избежать неспецифических взаимодействий и высоких фоновых шумовых сигналов. Было показано, что блокировка с 5% BSA снижает шум неспецифического связывания антител в каналах, и достаточно 1 ч инкубации. Микрочастицы железа покрыты слоем кремнезема-ПЭГ для предотвращения неспецифического связывания в них. Кроме того, микрочастицы блокируются BSA (одновременно с каналами) перед формированием ловушки в устройстве. Ночная инкубация при 4 °C лучше, а это означает, что для изготовления и инкубации устройства перед иммуноанализом требуется 1 день. Было показано, что уменьшение шероховатости хлороформом и закупорки поверхностей для уменьшения неспецифических взаимодействий работает исключительно хорошо, что позволяет этой платформе достичь предела обнаружения, сопоставимого со стандартным ИФА в модельном иммуноанализе4.
Формирование ловушки микрочастиц в микроканальном ограничении является ручным процессом. Хотя нет точного контроля количества поступающих микрочастиц, мы полагаемся на оценку длины уплотненных частиц. Можно сделать ловушку больше или легко удалить излишки. Выброшенные частицы накапливаются в боковом канале и их не нужно удалять из чипа. Крайне важно предотвратить поступление микрочастиц в основной канал, поскольку они могут взаимодействовать с наночастицами перед ловушкой и изменять измерения иммуноанализа.
В качестве доказательства концепции мы реализовали иммунодетекцию комплекса, образованного лизоцимным белком, конъюгированным с наночастицами диаметра 100 нм путем инкубации специфического первичного антитела и соответствующего HRP-меченого вторичного антитела. Иммунокомплекс образуется вне аппарата. Тем не менее, можно выполнить весь иммуноанализ внутри устройства. Магнитные свойства наночастиц позволяют легко манипулировать с помощью высокоэффективного неодимового сепаратора постоянных магнитов. Необходимо просто удерживать реакционную микротрубку в течение 15 минут, чтобы позволить наночастицам притягиваться магнитом к стенке микротрубки, что облегчает этапы промывки иммунологического анализа за пределами устройства.
Изюминкой этого прибора является то, что он простой, быстрый (общее время анализа 40 мин4 по сравнению с 4-6 ч для ИФА) и дешевый (сопоставимый с ценой теста бокового потока). Все эти особенности делают данный профиль устройства хорошим кандидатом для разработки POCT. Кроме того, устройство может количественно обнаруживать концентрации анализируемого вещества, аналогичные золотому стандарту ELISA4, что чрезвычайно ценно для эпидемиологических исследований и принятия решений в области общественного здравоохранения. Обычно микрофлюидные системы для иммуноанализа имеют хорошие пределы обнаружения, но длительное время анализа, или они имеют короткое время анализа, но неоптимальные пределы обнаружения4. Комбинируя магнитные наночастицы в качестве иммунной поддержки и фторогенных ферментов для обнаружения, эта платформа имеет короткое время анализа и хороший предел обнаружения (в предыдущей работе мы обнаружили предел обнаружения 8 пг/мл с использованием биотина в качестве антигена, что сопоставимо со стандартной ИФА4). Наконец, данная технология имеет важное преимущество перед испытаниями бокового потока: возможность дать количественные, а не только качественные результаты («да» или «нет»). В отличие от большинства других микрофлюидных систем, разработанных в лабораториях, в которых используются редкие материалы, эта система изготовлена из акрила (ПММА), недорогого термопластика, который очень совместим с массовым производством медицинских диагностических устройств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана компанией Conacyt, Мексика, в рамках гранта, 312231 "Programa de Apoyos para Actividades Científicas, Tecnológicas y de Innovación", а также AMEXCID и Министерством иностранных дел Мексики (SRE) в рамках гранта "Prueba serológica rápida, barata y de alta sensibilidad para SARS-CoV-2". JAHO благодарит Conacyt Mexico за стипендию PhD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.008 Endmill | KYOCERA SGS | 2204 | 2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12 |
| 0.032 Endmill | KYOCERA SGS | 2228 | 2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12 |
| Carbonyl-iron microparticles | Sigma-Aldrich | 44890 | 7 μm |
| Chloroform | Fermont | 6201 | Health Hazard: Moderate Flammability: None Reactivity: None Contact Hazard: Moderate |
| CMOS camera Moment | Teledyne Photometrics | Sensor Technology: CMOS Quantum Efficiency: 73% Pixel Size: 4.5 µm x 4.5 µm Supported Interfaces: USB 3.2 Gen 2 |
|
| Dr Engrave Software | Roland DGA Corporation | Engraving software to design and create the engraving path on the surface | |
| Extraction hood | Unknown | Unknown | |
| Flexible Plastic Tubing | Tygon | AAD04103 | ID = 0.020, OD = 0.060 |
| Fluorescence microsope | ZEISS | Axio Vert.A1 | |
| High Precision Dispense Needle | Loctite | 98612 | |
| Homemade piezoelectric controller application | LabView | See reference 12 for more details. | |
| Loctite 495 instant adhesive | Henkel | 49503 | Apply with micropipette tip or dispensing needle |
| MagJET Separation Rack | thermoscientific | 12 x 1.5 mL | |
| Mechanic press | Home-made | ||
| Milling Machine | Roland | MDX-50 | |
| Piezoelectric platform | Home-made | See reference 12 | |
| Polymethylmethacrylate - Sheet - PMMA, Acrylic | Goodfellow | ME303018/1 | Thickness: 1.3 mm, Transparency: Clear/Transparent |
| PVCamTest software | Teledyne Photometrics | Version 3.10.107 | Image acquisition software |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ 7457 | |
| SuperMag Carboxyl Beads | Ocean NanoTech | KSC0100 | 100 nm |
| Syringe pump | kd Scientific | KDS200 | Can hold up to two syringes |
| Utrasonic bath | Branson | 2800 | |
| VPanel software | Windows OS | Version 1.0.3.0 | Software for controlling the micromilling machine |
References
- Ng, A. H. C., Uddayasankar, U., Wheeler, A. R.
- Berlanda, S. F., Breitfeld, M., Dietsche, C. L., Dittrich, P. S. Recent advances in microfluidic technology for bioanalysis and diagnostics. Analytical Chemistry. 93 (1), 311-331 (2021).
- Teste, B., et al. Microchip integrating magnetic nanoparticles for allergy diagnosis. Lab on a Chip. 11 (24), 4207-4213 (2011).
- Guevara-Pantoja, P. E., Sánchez-Domínguez, M., Caballero-Robledo, G. A. Micro-nanoparticles magnetic trap: Toward high sensitivity and rapid microfluidic continuous flow enzyme immunoassay. Biomicrofluidics. 14 (1), 014111 (2020).
- Khizar, S., et al. Magnetic nanoparticles in microfluidic and sensing: From transport to detection. Electrophoresis. 41 (13-14), 1206-1224 (2020).
- Podaru, G., Chikan, V. CHAPTER 1: Magnetism in nanomaterials: Heat and force from colloidal magnetic particles. Magnetic Nanomaterials: Applications in Catalysis and Life Sciences. , Royal Society of Chemistry. Cambridge, UK. 1-24 (2017).
- Reynoso-Hernández, K. B., Guevara-Pantoja, P. E., Caballero-Robledo, G. A. Capture efficiency of magnetic nanoparticles through the compaction effect of a microparticles column. Physical Review E. 104 (2), 024603 (2021).
- Gale, B. K., et al. A review of current methods in microfluidic device fabrication and future commercialization prospects. Inventions. 3 (3), 60 (2018).
- Liu, K., Fan, Z. H. Thermoplastic microfluidic devices and their applications in protein and DNA analysis. Analyst. 136 (7), 1288-1297 (2011).
- Guckenberger, D. J., de Groot, T. E., Wan, A. M. D., Beebe, D. J., Young, E. W. K. Micromilling: A method for ultra-rapid prototyping of plastic microfluidic devices. Lab on a Chip. 15 (11), 2364-2378 (2015).
- Guevara-Pantoja, P. E., Jiménez-Valdés, R. J., García-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. Pressure-actuated monolithic acrylic microfluidic valves and pumps. Lab on a Chip. 18 (4), 662-669 (2018).
- Guevara-Pantoja, P. E., Chavez-Pineda, O. G., Solis-Serrano, A. M., Garcia-Cordero, J. L., Caballero-Robledo, G. A. An affordable 3D-printed positioner fixture improves the resolution of conventional milling for easy prototyping of acrylic microfluidic devices. Lab on a Chip. 20 (17), 3179-3186 (2020).
- Friedrich, C. R., Vasile, M. J. Development of the micromilling process for high-aspect-ratio microstructures. Journal of Microelectromechanical Systems. 5 (1), 33-38 (1996).
- Malayath, G., Sidpara, A. M., Deb, S. Study of different materials response in micro milling using four edged micro end mill tools. Journal of Manufacturing Processes. 56, 169-179 (2020).
- Jiang, J., et al. A single low-cost microfabrication approach for polymethylmethacrylate, polystyrene, polycarbonate and polysulfone based microdevices. RSC Advances. 5 (45), 36036-36043 (2015).
- Sun, Y., Kwok, Y. C., Nguyen, N. T. Low-pressure, high-temperature thermal bonding of polymeric microfluidic devices and their applications for electrophoretic separation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (8), 1681-1688 (2006).
- Tsao, C. W., Hromada, L., Liu, J., Kumar, P., DeVoe, D. L. Low temperature bonding of PMMA and COC microfluidic substrates using UV/ozone surface treatment. Lab on a Chip. 7 (4), 499-505 (2007).
- Bamshad, A., Nikfarjam, A., Khaleghi, H. A new simple and fast thermally-solvent assisted method to bond PMMA-PMMA in micro-fluidics devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 26 (6), 065017 (2016).
- Ogilvie, I. R. G., et al. Reduction of surface roughness for optical quality microfluidic devices in PMMA and COC. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (6), 065016 (2010).
