Summary
操作されたフラップは、組み込まれた機能的な血管網を必要とする。このプロトコルでは、ラット大腿動脈への階層的血管網およびその直接顕微手術吻合を含む3D印刷組織フラップを作製する方法を提示する。
Abstract
移植可能で機能的で厚い組織を設計するには、階層的な血管ネットワークを設計する必要があります。3Dバイオプリンティングは、バイオインクと呼ばれる印刷可能な生体材料と細胞を秩序正しく自動的に層ごとに追加することによって組織を作成するために使用される技術であり、従来の組織工学技術では達成できない非常に複雑な構造を作成することができます。したがって、3Dバイオプリンティングは、ミリ波血管から微小血管ネットワークまで、天然の血管系複合体構造を模倣するための魅力的な in vitro アプローチです。
粒状ヒドロゲルにおける3Dバイオプリンティングの進歩により、低粘度の細胞外マトリックスベースのバイオインクの高解像度押出が可能になりました。この研究は、工学的血管新生組織フラップを製造するための3Dバイオプリンティングと犠牲型ベースの3Dプリンティングアプローチを組み合わせたものを提示する。ゼラチン支持浴内の組換えコラーゲン - メタクリレートバイオインクを用いた内皮および支持細胞の3Dバイオプリンティングは、自己組織化毛細管ネットワークの作製に利用される。この印刷された微小血管系は、メソスケールの容器状の多孔質足場の周りに組み立てられ、犠牲的な3D印刷された型を用いて作製され、内皮細胞を播種される。
このアセンブリは、メソスケール血管の内皮を周囲の毛細血管網と共に吻合するように誘導し、操作された組織フラップ内に階層的な血管網を確立する。操作されたフラップは、その後、袖口技術を用いてラット大腿動脈に外科的吻合によって直接移植される。記載された方法は、再建手術および血管新生研究において使用するための様々な血管新生組織フラップの作製のために拡張することができる。
Introduction
重篤な組織欠損は、外傷性傷害、先天性欠損、または疾患によって引き起こされ、これらの欠損を治療するための現在のゴールドスタンダードは、組織代替物として自家移植片、血管化組織フラップ、および微小血管フリーフラップを使用することである。しかしながら、これらの選択肢は、ドナー部位組織およびドナー部位罹患率1が限られているという欠点を有する。したがって、これらの欠陥2を矯正するために使用することができる代替組織代替物に対する需要が高まっている。操作された組織構築物の厚さは、細胞への栄養素およびガスの拡散によって制限され、したがって、適切な血管網は、大きく、厚く、適切に栄養を与えられた足場を生成するために不可欠である。
人工インプラント3の血管新生を促進するために、宿主からの血管支持体のin vivoリクルート、足場内の成長因子およびサイトカインの送達、インプラントの血管前化、マイクロパターニング技術4を用いた灌流可能な分岐微細血管床の生成、血管チャネル/ネットワーク形成のための犠牲材料の使用5を含むいくつかのアプローチが適用されている。、ならびに3Dバイオプリントされた構造内のチャネルの作成 5,6.厚い組織の血管化は、マクロスケールおよびミクロ毛細血管スケールの血管からなる階層的血管網の組み込みを必要とする。マクロスケールの血管は、構築物全体に効果的に血液を分配し、宿主血管との微小外科的吻合を可能にし、一方、微小毛細血管鱗の血管は栄養素の拡散を可能にする。
バイオプリンティングは、従来の組織工学的方法よりも利点があるため、近年大きな注目を集めています。組織と臓器は、特定のアーキテクチャを持つ複雑で複雑な3Dオブジェクトです。3Dバイオプリンティングは、生体材料の層を高解像度で堆積させる能力を備えており、複雑な組織や臓器の代替品(腎臓、肺、肝臓など)を作成する能力を可能にします7。押出ベース、インクジェット8、レーザー支援蒸着9,10、および光造形ベースの11,12バイオプリンティングを含む、いくつかの印刷技術がバイオプリンティングに適応されている。押出ベースの技術は、ノズルとは反対側の材料バルク表面に圧力を加えることによって、ノズルを通して材料を押し出すことに依存している。
懸濁ヒドロゲルの自由体可逆的包埋(FRESH)は、押し出された材料が支持浴によって所定の位置に堆積および固定される粒状支持材料を使用するバイオプリンティング技術13、14 である。支持浴は、押し出された、予め架橋されたバイオインクを、その架橋まで機械的に支持する。この技術の主な利点は、支持浴が、押出後および架橋前15の形状を維持できない低粘度材料を押し出すことを可能にすることである。これにより、バイオインクとして使用できる利用可能な材料のプールが拡大します。
この論文は、マイクロスケールとメソスケールの血管系を組み合わせた血管化フラップの生成のためのプロトコルを提示する。これを達成するために、組換えヒトコラーゲンメタクリレート(rhCollMA)ヒドロゲル中で、バイオプリントされた、自己集合性の微小血管ネットワークが生成され、次いで、これは、より大きな、移植可能な、血管足場の内部に接続され、完全に操作された組織フラップ16をもたらす。操作された組織の迅速かつ直接的な灌流を確立するには、宿主血管への直接顕微手術吻合が必要である。血管足場は、従来の顕微手術血管壁縫合を用いて吻合されるのに十分な縫合糸保持強度を有していない。したがって、我々は、ラットの共通大腿動脈で吻合を達成するための「カフ」17、18、19方法を記述する。この方法では、血管端部は、血管壁を穿孔することなく、円周縫合糸で固定される。
提案されたプロトコルは、rhCollMA環境における階層血管系を研究するために準備されているが、このアプローチは拡張され、様々な新しいアプリケーションに適用することができる。このプロトコルは、異なるバイオインク中の様々な組織特異的細胞のバイオプリンティングに適用することができる。さらに、構築物の幾何学的およびサイズは、大規模組織再構成または生物学的研究などの特定の要件に合うように容易に変更することができる。
Protocol
すべての動物処置は、テクニオン前臨床研究局(PCRAテクニオン、倫理承認番号058-05-20)の監督下で承認され、実施された。雄のSprague-Dawleyラット(275〜350g)をこれらの研究に使用した。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、およびソフトウェアの詳細については、 材料表 を参照してください。
1. 血管足場製作
- コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して、所望の血管足場形状の3Dコンピュータモデルを作成するか、オンラインリポジトリから所望の血管構造の3Dファイルをダウンロードする。
- 内径0.9mm、外径2mm、高さ18mmの円柱を作成します。シリンダー壁の横に直径 0.22 mm の放射状の窓ガラスを追加します。
- 3D 設計ソフトウェアを使用して足場の金型を作成し、 としてエクスポートします。STL ファイルです。次に、後で金型の充填を容易にするために、設計に漏斗を追加します。
- をインポートします。溶融蒸着モデリング(FDM)3Dプリンタ用のスライスソフトウェアにSTLファイル。レイヤーの高さが 0.1 mm のモデルをスライスし、.gcode として書き出すか、3D プリンターに直接送信します。
- 水溶性ブテン - ジオールビニルアルコール共重合体(BVOH)フィラメントを使用して、0.25mmノズルを備えたFDM 3Dプリンタで金型を3D印刷します。印刷された金型は、使用時まで真空チャンバーに保管してください。
警告: BVOH フィラメントは湿気に敏感であるため、素手での取り扱いは避けてください。さらに、湿気にさらされないようにフィラメントを真空チャンバに保管することをお勧めします。 - 1,4-ジオキサン中のポリ-L-乳酸(PLLA)とポリ乳酸-コ-グリコール酸(PLGA)の1:1混合物のポリマー溶液を調製する。
- 350 mg の PLLA および 350 mg の PLGA の重量を量り、20 mL のガラスバイアルに移します。
- 10 mLの1,4-ジオキサンを測定し、ガラスピペットを使用してガラスバイアルに移す。ガラスバイアルに小さな磁気攪拌子を加える。
警告: 1,4-ジオキサンは危険な有機溶媒です。適切な個人用安全装置を使用し、ヒュームフード内で作業してください。 - ガラスバイアルを70°Cに加熱した温水浴の中に置き、すべてのポリマーが完全に溶解するまで内容物を一晩混合する。使用時まで、溶液を気密ガラス容器に保管してください。
- BVOH金型にPLLA:PLGAソリューションを充填します。
- 容積ピペットを使用して、30 μLのポリマー溶液を測定し、金型に充填します。
注:金型を充填するために必要な体積は、設計された容器の体積に応じて変化します。金型の漏斗が完全に充填されるまでポリマー溶液を加え続けます。 - 金型を100 × g で2分間遠心分離する。さらに20μLのポリマー溶液を金型に補充して、完全な充填を確保します。
- 容積ピペットを使用して、30 μLのポリマー溶液を測定し、金型に充填します。
- 充填された金型を-80°Cで少なくとも30分間凍結して、すべてのポリマー溶液が凍結することを確認します。金型から溶媒を一晩凍結乾燥することによって除去する。
注:金型内のポリマーの色は、凍結乾燥プロセス後に透明から白に変わるはずです。 - 犠牲型材料を除去するために、凍結乾燥処理後の型を穏やかに攪拌しながら5L脱イオン水浴に移す。お風呂の水が曇ったら交換してください。すべてのBVOHが溶解したら、足場を風乾し、使用時まで真空チャンバーに保管してください。
2.血管足場をフィブロネクチンでコーティングする
- PLLA:PLGA血管足場を70%エタノールに30分間浸漬して消毒します。
- 足場をPBSで3x 5分間洗う。
- PBS中の50μg/mLヒトフィブロネクチンの希釈液を調製し、足場をコーティングする。
- 500 μL のストックフィブロネクチン溶液 (1 mg/mL) を 9.5 mL の PBS と混合します。
- 消毒した血管足場をこのフィブロネクチン溶液に浸し、タンパク質吸着を可能にするために37°Cで60分間インキュベートする。
- インキュベーション後、足場をPBSですすぎ、未結合のフィブロネクチンを除去した。これらのコーティングされた足場を4°Cで最大1週間保管してください。
3. rhCollMAバイオインク調製
- 酸性rhCollMAバイオインクストックを中和するためのリン酸緩衝液を調製する。
- 5.495 gのNa2 HPO 4、1.55 gのNaH2 PO4、および30 mgのNaClを50 mLの脱イオン水に溶解して、リン酸緩衝液の10倍ストックを調製する。
- 10倍リン酸緩衝液の1部と9部の脱イオン水を組み合わせて、10倍原液リン酸緩衝液の10倍希釈液を調製する。
- 900 μL のストック rhCollMA 溶液と 100 μL の 10x リン酸緩衝液を組み合わせて、酸性 rhCollMA 溶液を中和します。
- 中和したrhCollMA溶液を、必要量の1xリン酸緩衝液と混合して、所望の濃度の10mg/mLに希釈する。
注:rhCollMAのストック濃度はロットによって異なります。したがって、所望の濃度に達するのに必要な1xリン酸緩衝液の容量は変化するであろう。 - 希釈した中性rhCollMAと組み合わせるためにポロゲン - 光開始剤溶液(PEO-LAP)を調製する。
- 160mgのPEOを10mLのDMEMに溶解して、フェノールレッドを含まないDMEM中のポリ(エチレンオキシド)(PEO)の1.6%(w / v)溶液を調製する。
- この溶液に20mgのフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム(LAP)を加え、溶液中に0.2%(w/v)LAPを得た。この時点から、溶液をアルミホイルで覆うか、暗い場所に保管して光から保護してください。
- PEO-LAP 溶液を 0.22 μm フィルターに通して滅菌します。この溶液を4°Cで最大1週間保存する。
- バイオプリンティングの前に、希釈した中性rhCollMA溶液とPEO-LAP溶液を1:1の比率で混合し、最終的なバイオインク溶液を得た。渦ではなくピペッティングを使用して、気泡を避けながら溶液を混合します。
- 溶液に多くの気泡が導入された場合は、2,000 × g で30秒間遠心分離します。遠心分離後、均一性を確保するためにバイオインク溶液を再び混合する。
4.粒状サポート入浴剤
- ゼラチン粒状担体材料を調製する。
- 生物学的安全キャビネット内で、凍結乾燥担体材料の1つの2gチューブの内容物を、それぞれ約1gを含む2つの滅菌50mL円錐形チューブに分割する。
- 40mLの冷(4°C)フェノールレッドフリーDMEMを各チューブに加え、凍結乾燥担体材料がすべて溶解するまで激しく渦巻き込んだ。
- 得られたスラリーを4°Cに座らせて、担体材料が再水和できるようにします。
- 真空チャンバ内の支持材料を30分間減圧して気泡を低減させる。
- サポート材料を2,000 × g で5分間遠心分離する。材料がチューブの底にあり、上清が透明であることを確認します。
- 上部の支持材を吸引しないように注意しながら、上清を吸引する。
注:サポート材料は、上清を除去した後にチューブを傾けている間は流れてはなりません。材料が流れた場合は、新しい上清を追加せずに、同じ設定を使用して再度遠心分離します。
- 調製し、圧縮した担体材料の約4mLを、容積ピペットを用いて12ウェルプレートの各ウェルに移す。硬い表面のウェルプレートをタップして、サポート材料がウェル内に均等に広がるように強制します。
メモ: サポート資料の最小推奨容量は、印刷されるコンストラクトの体積の 3 倍です。 - ゼラチン粒子が融解するのを防ぐために、担体材料を含むウェルプレートを冷却されたバイオプリンターステージ上、または4°Cで、その使用まで置く。
5. バイオインクによる内皮細胞および支持細胞の組み込み
- 抗生物質溶液、ウシ胎児血清、および内皮細胞増殖サプリメントを含む、基礎培地を対応する培地キットコンポーネントと混合することによって、製造業者の指示に従って内皮細胞培地を調製する。
- 500 mL の低グルコース DMEM、58 mL のウシ胎児血清、5.8 mL の非必須アミノ酸 (NEAA)、5.8 mL のグルタミン代替物、5.8 mL の 1 M HEPES、および 5.8 mL のペニシリン - ストレプトマイシン - ナイスタチン溶液を組み合わせて歯髄幹細胞培地を調製する。
- 2×106個の ZsGreen1発現ヒト脂肪微小血管内皮細胞(HAMEC-ZsGreen1)および6個×106個の 歯髄幹細胞(DPSC)を含む懸濁液を10mLの内皮細胞培地に調製する。
- 細胞懸濁液を200× g で4分間遠心分離し、細胞ペレットを得た。上清培地を吸引する。
- 細胞ペレットを、以前に調製した1mLのrhCollMAバイオインク(PEO−LAPを含む)に再懸濁し、バイオインク1mL当たり8×106 個の総細胞濃度を有するバイオインクを得た。
警告: バイオインクを細胞と組み合わせたら、すぐに次のステップに進んでください。細胞が懸濁液中に長時間放置されると、細胞はチューブの底に沈み、その生存率は悪化する。細胞を含まない実験の場合は、ステップ5.1〜5.5をスキップするか、細胞の代わりにバイオインクに蛍光ビーズを組み込んで、印刷された構築物の顕微鏡的視覚化を強化します。 - 細胞 - バイオインク混合物を印刷カートリッジに移す。
- 内径 0.22 mm の針を 3 mL の琥珀色の印刷カートリッジに合わせ、カートリッジを 50 mL の円錐形のチューブに入れます。
- 1mLの細胞 - バイオインク混合物を上から充填することによって印刷カートリッジに移し、正の置換ピペットを使用して気泡を減少させる。
- 印刷カートリッジをバイオプリンターの適切なツールに取り付けます。
6. rhCollMAバイオインクを用いたマイクロ血管ネットワークのバイオプリンティング
- バイオプリントされた微小血管ネットワーク用の3D CAD設計を作成します。
- 中央に直径 2 mm の円形チャンネルを含む 4 mm 角の 2D パターンをスケッチします。スケッチを 4 mm 押し出して、中央チャンネルのある 4 mm x 4 mm x 4 mm の立方体を取得します。このオブジェクトを としてエクスポートします。STL ファイルです。
- 12 ウェルプレートをインポートします。STLテンプレートをバイオプリンタスライスソフトウェアの ソリッドモデリング タブに入れ、仮想プリントベッドの指定された領域に配置します。
- をインポートします。立方体形状のSTLファイルをバイオプリンタスライスソフトウェアのソリッドモデリングタブに入れる。[外部スライサーを使用]チェックボックスをクリック|オブジェクトのプロパティセクションでスライサーを構成します。ポップアップウィンドウで、塗りつぶしパターンの直線パターンを選択し、塗りつぶし密度に「30%」と入力します。[同意する] をクリックします。
- 立方体図形のコピーを目的の各仮想井戸に配置するには、立方体をクリックし、マウスを使用して移動します。
- バイオプリンタースライスソフトウェアの「材料」タブで「 材料 の追加」ボタンをクリックして、rhCollMAバイオインクの新しい 材料 設定を作成します。印刷するマテリアルの設定を選択します。 圧力の場合は、対応するボックスに 「2 psi」 と入力します。 速度の場合は、対応するボックスに 「20 mm/s」 と入力します。
注:各バイオインク材料には、アプリケーションの材料リストに保存できる独自の異なる印刷設定があります。 - 線幅と線の高さの値を 0.24 mm、加速度の値を 400 mm/秒2 に割り当てます。これらの値を対応するボックスに入力します。
- ソリッド モデリング タブで、立方体オブジェクトをクリックし、材料セクションから rhCollMA マテリアルをクリックして立方体形状に割り当てます。バイオアセンブリタブで、印刷ジョブの送信ボタンをクリックして、印刷ジョブをバイオプリンターに送信します。
- セルラーバイオインクを装填した印刷カートリッジを、3D押出ベースのバイオプリンタの3mL周囲空気圧ディスペンスツールにロードします。
- バイオプリンターインターフェイス画面の[制御 - 加熱/冷却]タブの下にある冷却ボタンをクリックして、プリントベッドの温度を4°Cに設定します。サポートバスの入ったプレートをプリンタベッドに積み込みます。
注:印刷圧力と印刷速度に関する材料の設定は、周囲温度の違いやバイオインクバッチの変動により変更される場合があります。たとえば、寒い日には、同じ量の材料を押し出すためにより高い圧力またはより遅い速度が必要です。 - バイオプリンターインターフェース画面の印刷タブで、ステップ 6.7 で送信された 印刷 ジョブをクリックします。をクリックし、[ 開始] |クリック して印刷ジョブを開始します。
- 印刷後、ウェルプレートを3mW/cm2 の強度を有する405nmの光源に30秒間露光し、rhCollMAバイオインクの架橋を開始した。
- 架橋後、ウェルプレートを37°Cおよび5%CO2 で、すべての支持浴が溶けるまで少なくとも20分間インキュベートする。
- 液化した支持浴を穏やかに吸引し、内皮細胞培地と交換する。さらなるステップで使用するまで、構築物を37°Cおよび5%CO2 でインキュベートする。
メモ: 印刷後に構造が収縮するため、ステップ 6 と同じ日にアセンブリステップ 7 を実行することをお勧めします。
7.バイオプリントされた微小血管網を血管足場で組み立てて、操作された血管化フラップを得る
- バイオプリントされた微小血管網の担体材料除去の直後に、バイオプリント構造のメインチャネルにフィブロネクチンコーティングされたPLLA:PLGA血管足場を置く。
- 組み立てた構築物を37°Cおよび5%CO2で2 日間インキュベートする。
- 血管足場の内腔を内皮細胞で整列させる。
- tdトマト発現ヒト脂肪微小血管内皮細胞(HAMEC−tdトマト)の細胞懸濁液を1×107 細胞/mLの濃度で調製する。
- この細胞懸濁液の20μLの液滴を疎水性表面(すなわち、非組織培養物[nonTC]10cmディッシュ)に置く。
- 一端の足場の内腔が細胞液滴と接触するように、血管足場を液滴の上に静かに置く。
- 足場の対向する端(すなわち、液滴に接触していない端部)から液滴を吸引し、その内腔を細胞懸濁液で満たす。
- 播種した足場を微量遠心チューブに入れ、加湿インキュベーター内の回転子に60分間入れます。次に、足場を12穴プレートに移し、2mLの内皮細胞培地を加える。
- 操作したフラップを7日間培養し、2日ごとに培地を新鮮な内皮細胞培地に交換しながら培養する。
8. 人工フラップの共焦点顕微鏡および免疫蛍光染色
- 培養の4日後および7日後、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて組み立てた足場の生細胞イメージングを行う。
- ZsGreen1およびtdTomato蛍光タンパク質の蛍光チャネルを顕微鏡画像取得ソフトウェアで定義します。
- ズーム 0.5 倍 (ピクセル サイズ 5 μm) の 5 倍/0.16 対物レンズを選択し、それぞれ厚さ 41 μm のスライスを 22 枚含む Z スタックを定義します。
- 3 x 2 タイル スキャンを定義して、構成体全体をイメージし、キャプチャします。
- レーザー強度とゲイン値を調整して、彩度がなく背景が最小限に抑えられたクリアな蛍光シグナルを取得し、画像を取得します。
- 取得したZスタックの最大強度投影を行い、顕微鏡画像取得ソフトウェアまたは類似の画像解析ソフトウェアを用いて単一の2D画像を取得する。
- 関心領域の高倍率イメージングを実行します。
- 0.5ズーム(ピクセルサイズ1.25μm)の10x/0.3対物レンズに切り替え、厚さ41μmの9スライスのZスタックを定義します。
- 手順 8.2.-8.3 を実行します。
- 7日間の培養後、操作されたフラップを4%パラホルムアルデヒドに20分間沈めて固定します。
- コンストラクトをPBSで3x 5分間洗浄する。
- PBS中の0.3%(v/v)Triton-Xを構築物に加え、室温で15分間インキュベートして細胞を透過処理する。
- コンストラクトをPBSで3x 5分間洗浄する。
- PBSに5%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)を溶解してブロッキング溶液を調製する。ブロッキング溶液を操作されたフラップに加え、室温で1時間インキュベートする。
- マウス抗平滑筋アクチン(抗SMA)抗体を予め調製した5%BSA溶液で1:50に希釈して一次抗体溶液を調製し、SMA発現支持細胞を染色した。
- 足場を一次抗体溶液中で4°Cで一晩インキュベートする。
- PBSで3x 5分洗う。
- Cy3結合ヤギ抗マウスIgG 1:400抗体および4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、2.5μg/mL)をPBSで希釈して二次抗体溶液を調製する。
- 二次抗体溶液を足場に塗布し、室温で3時間インキュベートする。
- PBSで3x 5分洗う。
- コンストラクトをPBS中の4°Cで最大1ヶ月間保存する。
- 染色された足場を共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて画像化する。
- 顕微鏡画像取得ソフトウェアで3つの蛍光チャンネル(DAPI、ZsGreen、およびCy3)を定義します。
- 断面厚さ 2 μm で、総厚さ 50 μm の Z スタックを定義します。次に、タイル スキャンを定義して、構成体のより大きな領域をイメージします。
- 集録パラメータを調整して、飽和がなくバックグラウンドを最小限に抑えた明確な蛍光シグナルを取得します。
- 1.0倍ズーム(ピクセルサイズ0.31μm)で20x/0.8対物レンズを使用して画像を取得します。
- 取得したZスタックの最大強度投影を行い、顕微鏡画像取得ソフトウェアまたは類似の画像解析ソフトウェアを用いて単一の2D画像を取得する。
9.袖口技術を使用して、操作されたフラップをラットの大腿動脈に直接吻合する
- 次の手術器具を準備して滅菌します:15番メス、一対の細かい歯の鉗子、および小さな一対のリングハンドルハサミ。さらに、次の顕微手術用具を準備して滅菌します:まっすぐに細い尖ったNo.3宝石商の鉗子、角度の付いた宝石商の鉗子、湾曲した顎を持つ丸いハンドルの針ホルダー、一対の血管拡張器、解剖はさみ、アドベンティアはさみ、およびアプリケーター付きの血管クランプ。
- 5 mLのストックヘパリン溶液を195 mLの生理食塩水で希釈することによって、100 IU/mLのヘパリン化生理食塩水の溶液を調製する。
- ポリイミドの袖口を切断して滅菌します。
- ポリイミドチューブの2.5mm切片を解剖顕微鏡下で切断する。
- 各セクションの一端で、チューブの壁に縦方向に1.25mmの切開を行い、カフハンドルを得る。チューブのもう一方の端に角度の付いた切断を行い、血管の反転を容易にします。
- 袖口を70%エタノールに浸し、続いてヘパリン化生理食塩水で2回洗浄する。
- 手術のために雄のスプレイグ・ドーリーラット(275〜350g)を準備する。
- 手術の7日前に、免疫抑制を達成するためにシクロスポリン(10mgkg-1)の皮下1日用量の投与を開始する。
- 手術前に、誘導チャンバーを用いた施設SOPによる3%イソフルラン吸入を用いて動物を麻酔する。両足をつまんで反射神経を確かめて深い麻酔を確かめます。
- 鎮痛薬ブプレノルフィン(0.03mg kg-1)および抗凝固ヘパリン(200IU kg-1)の皮下用量を投与する。
- 脱水を防ぐために動物の目に潤滑眼軟膏を塗布する。
- ラットの外科領域を剃り、ヨウ素と70%エタノールで部位を消毒する。粘着テープを使用して動物の手足をテーブルに固定します。
- 一般的な大腿動脈を露出させ、隔離する。
- 脚と腹部の間の凹みに沿って、皮膚を通して2cmの長さの斜めの切開を行う。
- 鉗子と鈍い端のはさみを使用して、下層組織から皮膚を解放し、鼠径部脂肪パッドを視覚化します。
- はさみと鉗子を使用して、上、内側、および下の余白の周りの脂肪パッドを右に切ります。脂肪パッドの下で大きな容器を切らないように注意してください。
- 脂肪パッドを横方向に反射し、上腹部血管をそのまま残す。濡れたガーゼを反射脂肪パッドの上に置き、乾燥を防ぎ、所定の位置に固定します。一般的な大腿骨血管が見えるようにする。
注:脂肪パッドは、後で吻合部に柔らかい圧力をかけるために使用されます。 - 鼠径靭帯から上腹部動脈分岐点に近接した大腿動脈を鞘から抜いて遠位に露出させる。
注意:通常、大腿動脈の枝がその下に走っており、一般にマーフィーの枝と呼ばれています。この見にくい枝を傷つけないように注意してください。 - マーフィーの枝を結紮して分割し、動脈の中央に1mm間隔をあけて2つの結紮で大腿動脈を結紮する。結紮縫合糸の一端を長く保ち、後で袖口を通して血管端を引っ張るために使用する。
- 2つの結紮状の間の動脈を外気性はさみを使用して切断する。
警告:このカットを行う際に出血があってはなりません。動脈端が出血した場合は、動脈をクランプし、結紮を再適用する。 - 合字縫合糸の長い端を使用して、前のステップで準備したように、各容器の端部をポリイミドカフに挿入し、2つのカフのハンドルが互いに離れるようにします。
- 挿入後、カフハンドルと容器に同時にクランプを取り付け、カフを所定の位置に固定します。
- 27G針を備えたシリンジにヘパリン処理生理食塩水を調製する。
- 結紮した血管の端を引っ張り、結紮の近くで切断する。血管端部をヘパリン処理した生理食塩水で直ちに十分に洗浄し、内腔に血液が見えなくなるまで洗浄する。
警告: 内部に残った血液は血栓を形成し、手順を完了すると血流に導入されるため、血管端がよく洗われていることを確認してください。これは、血管の閉塞および脚への灌流の喪失につながる可能性がある。 - 片手で鞘で保持し、もう片方の手で血管拡張器で内腔を拡張することによって、血管の内腔を広げる。
- ゆるい6-0ポリプロピレンの円周縫合糸を袖口本体の周囲に置きます。袖口本体の上に2つの血管拡張器を使用して血管端をエバートし、円周縫合糸を締め付けることによって所定の位置に固定する。
注:操作中にクランプされた血管から血液が漏れた場合は、ヘパリン処理した生理食塩水で内腔を徹底的に洗ってください。 - 操作されたフラップをヘパリン処理した生理食塩水ですすぎ、血管裏打ちされた袖口を血管足場の内腔に挿入する。足場と袖口本体の周りに円周状の6-0ポリプロピレン縫合糸を配置して、足場を所定の位置に固定します。血管足場の両側に対してこのステップを行う。
- 0.2 μmのポリスチレンメンブレンフィルターを吻合部位に巻き付けて、操作されたフラップを周囲の組織から分離します。
- 最初に遠位クランプを解除します。次に、近位クランプを解除して、血管を通る血流を再確立する。
- 吻合部を通る出血を止めるには、脂肪パッドを大腿骨血管に反射させ、滅菌ガーゼを使用して3分間穏やかな圧力をかけます。
- 6-0ポリプロピレンを使用して脂肪パッドを所定の位置に縫合する。次いで、5〜0個のPGA吸収性縫合糸を用いて皮膚を縫合する。
- 創傷領域を生理食塩水できれいにし、ヨウ素溶液を塗布する。
- 術後の疼痛および動物管理のために、飲料水中に0.1%(v / v)のトラマドールを調製する。さらに、ヘパリン(200IUKG-1)およびシクロスポリン(10mg kg-1)の1日用量を投与する。
- 動物を加熱ランプの下に置いた清潔なケージに単身で置きます。動物が胸骨の臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を監視し続けます。
Representative Results
このプロトコルは、血管足場(図1Ai)とバイオプリントされた微小血管系(図1Aii)からなる工学的フラップの製造を記述しており、これらはメソスケールおよびマイクロスケールの血管系を達成するために組み立てられた(図1Aiii)。プロトコールに従って、血管足場のBVOH型を設計し、3Dプリントした(図1B、C)。得られた印刷構造を目視で検査し、金型の空の空間に見られる可能性のあるBVOHの小さなストランドについて調べました(図1D)。これらのストランドは、通常、誤った材料設定またはBVOHが水分を吸収したことを示します。これらのストランドは、鋳型の不完全な充填および結果として生じる血管足場の構造的欠陥につながる可能性があるため、除去されるべきである。次に、金型にPLLA:PLGA溶液を充填し、続いてプロトコルに記載されているように凍結乾燥プロセスと洗浄ステップを行った。得られたPLLA:PLGA血管足場を目視検査し、血管壁の完全性および内腔開存性を検証した(図1E)。
10mg/mLの濃度で中和されたrhCollMAバイオインクを調製し、PEO:LAP溶液と1:1の比率で組み合わせた。Zs-Green1で標識したヒト脂肪微小血管内皮細胞および歯髄幹細胞をrhCollMAバイオインクで再懸濁し、溶液を印刷カートリッジおよびプリンタにロードした。直進パターンを有する中央チャネルを有する箱形状(図1D)を、ゼラチン支持浴の内部でバイオプリントした。印刷後、構築物を架橋し、支持浴を溶解して洗浄した。培養の4日後、構築物をライブ画像化し、微小血管網自己組織化について確認した。 図1D は、バイオプリント構築物における高度に発達したHAMEC−ZsGreen1微小血管ネットワークの例を示す。
次に、フィブロネクチン被覆血管足場を、印刷された構築物の中央チャネルに挿入した(図2A)。組み立てられた構築物を2日間培養し、その間に細胞はゲルを収縮させ、血管足場にしっかりと付着させた。次いで、血管足場を、プロトコールに従って、tdTomatoを発現するHAMECsで裏打ちした。培養の7日後、構築物を固定し、画像化した。図 2B は、バイオプリントされた微小血管系における内皮細胞が緑色で描かれ、一方、血管足場の内皮内皮ライニングが赤色で描かれている組み立てられた構築物の側面図を示す。画像は、バイオプリントゲル中の緑色の微小血管自己集合体を示し、血管足場は赤色の内皮細胞で裏打ちされている。より高い倍率では、赤色の内皮内層に由来する芽が、バイオプリントされた微小血管網と共に発芽および吻合が見られる(図2C)。次に、構築物を、歯髄幹細胞のマーカーとしてα平滑筋アクチン(SMA)について染色した。免疫染色に続いて、構築物をレーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて画像化した(図2D)。
最後に、培養の7日後、操作されたフラップを、プロトコルに記載されているように、ラットの大腿動脈に微小外科的に吻合した。代表的な手順のビデオは、 補足ビデオS1で見ることができます。 図2E は、クランプ除去前の完了した吻合部位の代表画像を示し、 図2F は、クランプ除去および止血後の吻合部位の代表画像を示す。創傷閉鎖前に目に見える出血があってはならない。
図1:作製されたメソスケールおよびマイクロスケール容器の代表的な画像。 (A) プロトコルのステップの概略概要。許可を得て転載16.(b)血管足場材の犠牲型に対するCAD設計。(C)代表的な3Dプリントされた犠牲金型の側面図(スケールバー=0.5mm)。(D)犠牲型の上面図(スケールバー=0.5mm)(E)記載プロトコールを用いて作製された代表的な血管足場(スケールバー=5mm)。(F)3DバイオプリントされたrhCollMA微小血管ネットワークのためのCAD設計。(G)緑色でHAMEC−ZsGreen1を示す高度に発達したバイオプリント血管網の代表画像。スケールバー = 200 μm。略語: CAD = コンピュータ支援設計;rhCollMA = 組換えヒトコラーゲンメタクリレート;HAMEC = ヒト脂肪微小血管内皮細胞;PLLA = ポリ-L-乳酸;PLGA = ポリ乳酸 - コグリコール酸。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:組み立てられた血管化フラップの代表的な画像 (A)バイオプリントされた微小血管系および血管足場の代表的な集合体の写真。(B)血管足場の内皮内皮ライニングの4日後に画像化された代表的な操作されたフラップの側面図。バイオプリントされた微小血管系は緑色(HAMEC-ZsGreen1)で示され、内皮内層は赤色(HAMEC-tdTomato)で示されている。(C)緑色でバイオプリントされた血管系と赤色の内皮内層との間の吻合の代表的な画像。(D)インキュベーションの7日後の平滑筋アクチン(赤)、核(青)、および内皮細胞(緑)についての免疫染色の代表的な画像。(E)クランプ除去前のラットの大腿動脈を有する操作されたフラップの完了した吻合の代表的な画像、および(F)クランプ除去後の。略語:HAMEC = ヒト脂肪微小血管内皮細胞;SMA = 平滑筋アクチン;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ビデオS1:ラットの大腿動脈に血管足場を吻合するための代表的な顕微手術手順。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
血管新生組織のエンジニアリングは、組織工学20の主な課題の1つです。人工血管組織を作成するための現在の方法は、自己組織化微小血管系21,22,23の作成またはメソスケール血管足場24,25の作製に焦点を当てており、移植時に即時かつ直接灌流され得る階層的血管系のシステムを再現することに焦点を合わせていない26.この研究では、2つの3D印刷モダリティを使用して、マイクロスケールとメソスケールの血管系で構成される階層的な血管ネットワークを構築するプロトコルについて説明します。このプロトコルは、3Dバイオプリントされた自己組織化マイクロ血管ネットワークとメソスケールの血管足場を組み合わせて、移植可能な血管化フラップを達成します。さらに、このフラップをラットの大腿動脈に直接吻合するためのプロトコルを提示する。
3Dバイオプリンティングは、従来の組織工学技術に対する汎用性のために、近年関心を集めています。このプロトコールはrhCollMAバイオインクにおける微小血管ネットワークの生成を記載しているが、使用される方法は、研究された新規バイオインクおよび支持浴の茄多から他の多くのバイオインクにほとんど変更を加えずに適用することができる27、28。rhCollMAをバイオインクとして使用することを選んだのは、ヒトECMにI型コラーゲンが豊富に存在するため、細胞付着に適した環境が提供されていたためです。さらに、それは植物中で組換え的に生産され、メタクリレート基でさらに修飾され、光重合および安定な3Dヒドロゲル29,30の形成を可能にする。光架橋は、無毒であることが示されており、405nmの青色光への曝露によって活性化され、UV光の可能性のある光毒性を低減する光開始剤LAPの添加によって達成された。しかしながら、感光性バイオインクの使用は、バイオインクおよび担体材料の調製のためにフェノールレッド非含有培養培地の使用を必要とする。さらに、このプロトコルは、rhCollMAなどのバイオインクの高忠実度押出を可能にするゼラチン担体材料の使用を記載している。したがって、その準備およびプリンタベッドの冷却中に冷媒の使用を確実にすることが重要です。過度の加熱は、架橋に使用される光源または周囲温度の上昇によって発生する可能性があります。
押出ベースのバイオプリンタは、バイオプリントされた微小血管ネットワークを作成するためにここで使用されており、現在、同様の構築物を生成できる多くの市販のバイオプリンタがある。さらに、提案された方法は、異なる形状、サイズ、およびインフィルパターンを研究するために容易に修正および適用され得る。本研究では、直線状のインフィルパターンを選択して相互接続された細孔を作成し、これを比較的迅速に高い忠実度で印刷することができる。
気泡は、押出バイオプリンティング、特にサポート材料の内部に大きな課題をもたらします。したがって、担体材料の移送、バイオインク細胞懸濁液の調製、および印刷カートリッジへのそれらの移送のために正の変位ピペットを使用することによって、これらの気泡の存在および形成を最小限に抑えることが極めて重要である。
本研究では、ヒト脂肪由来内皮細胞や歯髄幹細胞は、患者からの単離が比較的容易であることから、支持細胞として用いた。さらに、この濃度が最も発達した血管網を確立することが示されているため、8 x 106細胞/ mLの総細胞濃度が選択された16。このプロトコルは、異なる細胞タイプおよび供給源、ならびに異なるバイオインクを使用して微小血管系を生成するために使用することができるが、微小血管網の発達のための最良の条件を確立するために細胞濃度の較正を行わなければならない。さらに、組織特異的細胞(すなわち、筋芽細胞または骨芽細胞)をバイオインク内に組み込んで、組織特異的血管化フラップを達成することができる。
多孔性血管足場用のモールドは、市販の押出3Dプリンタ上に水溶性材料を3D印刷して作製した。これにより、ラピッドプロトタイピングプラットフォームに基づく費用対効果の高い技術が得られ、その結果、血管足場の多くの異なる形状およびサイズを迅速に研究およびスクリーニングすることができる31。それにもかかわらず、この方法の制限は、ほとんどの3Dプリンタ32の解像度制限である。しかし、アディティブマニュファクチャリングを取り巻く急速に進化する業界により、これらの制限は時間の経過とともに改善されると予想されます。ほとんどの有機溶媒は細胞に有毒であり、バイオプリンティング手順を血管足場製造プロセスと組み合わせる能力を妨げるため、製造プロセスのための有機溶媒の使用は、プロトコルの別の制限である。
細胞懸濁液を押し出すのとは対照的に吸引を用いて足場の内腔に播種する記載された方法は、播種された細胞の局在化に大きな影響を与える。負圧を使用することで、足場の壁16上の穿孔を通る細胞懸濁液の流出を最小限に抑えながら、足場の内側内腔の内皮化を可能にする。
顕微手術吻合のための記載された「カフ」方法は、容易に修正され、異なる血管足場材料またはサイズ、ならびに広範囲の動物モデルにおける異なる動脈および静脈に適合させることができる。プロトコルへの適応には、異なるポリイミドチューブサイズおよび縫合糸サイズが含まれるであろう。この方法は足場壁の穿孔を必要とせず、欠陥の発生につながる可能性がある。この作業は、多くのアプリケーションに拡張できるプロトコルを提示します。メソスケールおよびマイクロスケールの血管系の作製およびそれらの組み立ておよび移植を含むこのプロトコルの重要な側面は、再建的用途ならびに血管および他の組織工学研究の両方のための工学的フラップの重要な側面を表す。
Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、欧州連合のHorizon 2020 Research and Innovation Programme(助成金契約番号818808)に基づき、欧州研究評議会(ERC)から資金提供を受けました。rhCollMAはCollPlant(イスラエル、Rehovot)から寛大に提供された。著者らは、動物ケアの支援についてテクニオンの前臨床研究機関、ならびにジャネット・ザビン、ガリア・ベン・デイビッド、アイダン・レデンスキーに感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dioxane | Biosolve Chemical | 42405 | |
| 27 G x 0.5" blunt tip dispensing needles | CML supply | 901-27-050 | |
| 3cc amber syringe barrel & piston set | Nordson EFD | 7012085 | Amber syringes used to block light and prevent premature crosslinking |
| 5-0 AssuCryl PGA absorbale suture | Assut Sutures | Absorbable sutures used for skin wound closure | |
| 6-0 polypropelene sutures | Assut Sutures | 9351 | |
| Acland clamps | S&T | B-1V | |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-15 | |
| Angled no.3 jeweler's forceps | S&T | JFAL-3-18 | |
| BioAssemblyBot 400 3D Bioprinter | Advanced Solutions | a 6-axis 3D bioprinter | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Buprenorphine | vetmarket | B15100 | |
| BVOH filament | Verbatim | 55903 | a water-soluble 1.75 mm diameter filament |
| Clamp applying forceps | S&T | CAF-4 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| Dietrich bulldog clamps | Fine Science Tools (FST) | 18039-45 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carlo Erba Reagents | 480141 | |
| Dissection scissors | S&T | 18039-45 | |
| DMEM, High Glucose, No Phenol Red | Sartorius | 01-053-1A | |
| Duratears | Alcon | DJ03 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | glutamine substitute |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Heparin Sodium 5,000 I.U./mL | Panpharma | - | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | A stock concentration of 1 mg/mL |
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal Critical Care | NDC 66794-011-25 | |
| LifeSupport | Advanced Biomatrix | 5244 | a gelatin support slurry for FRESH 3D bioprinting |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| MICROMAN E M1000E, 100-1,000 µL | Gilson | FD10006 | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Poly(ethylene oxide), M.W. 250,000 to 400,000 | Acros Organics | 178602500 | |
| Poly(L-lactic acid), IV 5.0 dl/g (PLLA) | Polysciencse, Inc. | 18582-10 | |
| Polyimide tubing, ID: 0.0249", OD: 0.0273" | Cole-Parmer | 95820-05 | A thin-walled tube used to fabricate cuffs for microsurgical anastomoses |
| Prusa I3 MK2.5 3D Printer | Prusa Research | http://www.prusa3d.com/ | a popular commercial 3D printer |
| Resomer RG 503 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Evonik Industries | 719870 | |
| rhCollMA | CollPlant | https://collplant.com/ | generously provided by CollPlant (Rehovot, Israel) |
| round-handled needle holder | S&T | B-15-8 | |
| Scalpel handle - #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
| Sodium Chloride | Biosolve Chemical | 19030591 | |
| Sodium Phosphate dibasic (NaH2PO4) | Riedel-de Haen | 4276 | |
| Solidworks | Dassault Systems | CAD software | |
| Straight no.3 jeweler's forceps | S&T | JF-3-18 | |
| Straight serrated forceps | Fine Science Tools (FST) | 11050-10 | |
| Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton Limited | 305 | |
| Triton-X 100 | BioLab LTD | 57836 | |
| TSIM | Advanced Solutions | 3D slicing and design software for the BioAssembly Bot | |
| Vessel dilator | S&T | D-5a.1 | |
| Zeiss Tivato 700 surgical microscope | Zeiss |
References
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