Summary
Konstruerade klaffar kräver ett integrerat funktionellt vaskulärt nätverk. I detta protokoll presenterar vi en metod för att tillverka en 3D-tryckt vävnadsflik innehållande ett hierarkiskt vaskulärt nätverk och dess direkta mikrokirurgiska anastomoser till råtta lårbensartär.
Abstract
Ingenjörs implanterbara, funktionella, tjocka vävnader kräver att man utformar ett hierarkiskt vaskulärt nätverk. 3D-bioprintning är en teknik som används för att skapa vävnader genom att lägga till lager på lager av utskrivbara biomaterial, så kallade biobläck och celler på ett ordnat och automatiskt sätt, vilket gör det möjligt att skapa mycket invecklade strukturer som traditionella vävnadstekniktekniker inte kan uppnå. Således är 3D-bioprintning ett tilltalande in vitro-tillvägagångssätt för att efterlikna den ursprungliga vaskulära komplexa strukturen, allt från millimetriska kärl till mikrovaskulära nätverk.
Framsteg inom 3D-bioprintning i granulära hydrogeler möjliggjorde högupplöst extrudering av extracellulära matrisbaserade biobläck med låg viskositet. Detta arbete presenterar en kombinerad 3D-bioprintning och offerformbaserad 3D-utskriftsmetod för tillverkning av konstruerade vaskulära vävnadsflikar. 3D-bioprintning av endotel- och stödceller med användning av rekombinant kollagen-metakrylatbiobläck i ett gelatinstödbad används för tillverkning av ett självmonterat kapillärnätverk. Denna tryckta mikrovaskulatur är monterad runt en mesoskala kärlliknande porös ställning, tillverkad med hjälp av en offer 3D-tryckt form och är sådd med endotelceller.
Denna enhet inducerar endotelet i mesoskalakärlet till anastomos med det omgivande kapillärnätet, vilket etablerar ett hierarkiskt vaskulärt nätverk inom en konstruerad vävnadsflik. Den konstruerade klaffen implanteras sedan direkt av kirurgisk anastomos till en råtta lårbensartär med hjälp av en manschettteknik. De beskrivna metoderna kan utökas för tillverkning av olika vaskulära vävnadsflikar för användning vid rekonstruktionskirurgi och vaskulariseringsstudier.
Introduction
Allvarliga vävnadsdefekter orsakas av traumatiska skador, medfödda defekter eller sjukdom, och den nuvarande guldstandarden för behandling av dessa defekter är att använda autologa transplantat, vaskulära vävnadsflikar och mikrovaskulära fria klaffar som vävnadssubstitut. Dessa alternativ har emellertid nackdelarna med begränsad vävnad på donatorstället och morbiditet på donatorstället1. Således finns det en växande efterfrågan på alternativa vävnadssubstitut som kan användas för att korrigera dessa defekter2. Tjockleken på de konstruerade vävnadskonstruktionerna begränsas av diffusionen av näringsämnen och gaser mot cellerna, och därför är ett ordentligt vaskulärt nätverk viktigt för att generera stora, tjocka och ordentligt närda byggnadsställningar.
Flera tillvägagångssätt har tillämpats för att främja vaskularisering av konstruerade implantat3, inklusive in vivo rekrytering av vaskulärt stöd från värden, leverans av tillväxtfaktorer och cytokiner i byggnadsställningarna, prevaskularisering av implantat, generering av en perfanvändbar förgreningsmikrovesselbädd med hjälp av mikropatterningstekniker4, användning av offermaterial för vaskulär kanal / nätverksbildning5 , samt skapandet av kanaler inom 3D-bioprintade konstruktioner 5,6. Vaskularisering av tjocka vävnader kräver införlivande av ett hierarkiskt vaskulärt nätverk bestående av makroskala och mikrokapillärskala kärl. De makroskaliga kärlen fördelar blod effektivt genom hela konstruktionen och möjliggör mikrokirurgiska anastomoser med värdblodkärlen, medan kärlen i mikrokapillär skala möjliggör näringsdiffusion.
Bioprinting har fått stor uppmärksamhet de senaste åren på grund av de fördelar det erbjuder jämfört med konventionella vävnadstekniska metoder. Vävnader och organ är komplexa och invecklade 3D-objekt med en specifik arkitektur. 3D-bioprintning, med dess förmåga att deponera lager av biomaterial i hög upplösning, möjliggör förmågan att skapa komplexa vävnads- och organsubstitut (t.ex. njure, lunga, lever)7. Flera trycktekniker har anpassats för bioprintning, inklusive extruderingsbaserad,bläckstråleskrivare 8, laserassisterad deposition 9,10 och stereolitografibaserad11,12 bioprinting. De extruderingsbaserade teknikerna är beroende av extrudering av materialet genom ett munstycke genom att applicera tryck på materialets bulkyta mittemot munstycket.
Friforms reversibel inbäddning av suspenderade hydrogeler (FRESH) är en bioprintningsteknik13,14 som använder ett granulärt stödmaterial där det extruderade materialet deponeras och fixeras på plats av stödbadet. Stödbadet ger mekaniskt stöd för det extruderade, förkorsade biobläcket tills dess tvärbindning. Den största fördelen med denna teknik är att stödbadet möjliggör extrudering av material med låg viskositet som inte kan behålla sin form efter extrudering och före tvärbindning15. Detta utökar poolen av tillgängliga material som kan användas som biobläck.
Detta papper presenterar ett protokoll för generering av en vaskulär flik som kombinerar mikroskala och mesoskala vaskulatures. För att uppnå detta genereras bioprintade, självmonterande, mikrovaskulära nätverk i rekombinant humant kollagenmetakrylat (rhCollMA) hydrogel, som sedan ansluts till det inre av en större, implanterbar, vaskulär byggnadsställning, vilket resulterar i en helt konstruerad vävnadsflik16. För att upprätta snabb och direkt perfusion av konstruerade vävnader krävs en direkt mikrokirurgisk anastomos till värdkärl. Kärlställningen har inte tillräcklig suturhållningsstyrka för att anastomoseras med traditionell mikrokirurgisk kärlväggssuturering. Därför beskriver vi en "manschett"17,18,19 metod för att uppnå en anastomos med en råttas gemensamma lårbensartär. I denna metod är kärländarna säkrade med omkretssuturer utan att behöva perforera kärlväggen.
Även om det föreslagna protokollet har utarbetats för att studera hierarkisk vaskulatur i rhCollMA-miljön, kan detta tillvägagångssätt utökas och tillämpas på en mängd nya applikationer. Protokollet kan tillämpas på bioprintning av olika vävnadsspecifika celler i olika biobläck. Dessutom kan konstruktionens geometri och storlek enkelt modifieras för att passa specifika krav, såsom rekonstruktion av stora vävnader eller biologiska studier.
Protocol
Alla djurförsök godkändes och genomfördes under överinseende av Technion Pre-Clinical Research Authority (PCRA Technion, etikgodkännande nr 058-05-20). Manliga Sprague-Dawley råttor (275-350 g) användes för dessa studier. Se materialförteckningen för detaljer om allt material, utrustning och programvara som används i detta protokoll.
1. Tillverkning av kärlställningar
- Skapa en 3D-datormodell av önskad kärlställningsform med hjälp av CAD-programvara (Computer-Aided Design) eller ladda ner en 3D-fil med önskad vaskulär struktur från online-arkiv.
- Skapa en cylinder med en innerdiameter på 0,9 mm, en ytterdiameter på 2 mm och en höjd av 18 mm. Lägg till radiella fenestrationer med en diameter på 0,22 mm längs cylinderväggen.
- Skapa en form för ställningen med hjälp av 3D-designprogramvaran och exportera den som en . STL-fil. Lägg sedan till en tratt i designen för att underlätta fyllningen av formen senare.
- Importera . STL-fil i skivprogramvaran för 3D-skrivaren för smält deponeringsmodellering (FDM). Dela upp modellen med en lagerhöjd på 0,1 mm och exportera den som .gcode eller skicka den direkt till 3D-skrivaren.
- 3D-skriv ut formen på en FDM 3D-skrivare utrustad med ett 0,25 mm munstycke med vattenlösligt buten-diol vinylalkoholsampolymerfilament (BVOH). Förvara de tryckta formarna i en vakuumkammare tills de används.
VARNING: Undvik att hantera BVOH-filamentet med bara händer eftersom det är fuktkänsligt. Dessutom rekommenderas att glödtråden förvaras i en vakuumkammare för att undvika exponering för fukt. - Bered en polymerlösning av en 1:1-blandning av poly-L-mjölksyra (PLLA) och polylaktisk-ko-glykolsyra (PLGA) i 1,4-dioxan.
- Väg upp 350 mg PLLA och 350 mg PLGA och överför till en 20 ml injektionsflaska av glas.
- Mät 10 ml 1,4-dioxan och överför till injektionsflaskan med glas med en glaspipett. Tillsätt en liten magnetisk omrörare till glasflaskan.
VARNING: 1,4-dioxan är ett farligt organiskt lösningsmedel. Använd lämplig personlig säkerhetsutrustning och arbeta inuti en dragskåp. - Placera injektionsflaskan med glas i ett varmvattenbad uppvärmt till 70 °C och blanda innehållet över natten tills alla polymerer har löst sig helt. Förvara lösningen i en lufttät glasbehållare tills den används.
- Fyll BVOH-formarna med PLLA:PLGA-lösningen.
- Mät 30 μl av polymerlösningen med hjälp av en positiv förskjutningspipett och fyll i formen.
OBS: Volymen som behövs för att fylla formen kommer att ändras beroende på volymen på det designade kärlet. Fortsätt tillsätta polymerlösningen tills formens tratt är helt fylld. - Centrifugera formen vid 100 × g i 2 min. Fyll på formen med ytterligare 20 μL av polymerlösningen för att säkerställa fullständig fyllning.
- Mät 30 μl av polymerlösningen med hjälp av en positiv förskjutningspipett och fyll i formen.
- Frys de fyllda formarna vid -80 °C i minst 30 minuter för att säkerställa att all polymerlösning fryser. Ta bort lösningsmedlet från formarna genom att frystorka dem över natten.
OBS: Färgen på polymeren i formen ska vändas från klar till vit efter frystorkningsprocessen. - För att avlägsna offerformmaterialet, överför formarna efter frystorkningsprocessen till ett 5 L avjoniserat vattenbad under försiktig omrörning. Byt ut vattnet i badet när det blir grumligt. När all BVOH har lösts upp, lufttorka ställningarna och förvara dem i en vakuumkammare tills de används.
2. Beläggning av kärlställningen med fibronektin
- Desinficera PLLA:PLGA kärlställningar genom att nedsänka dem i 70% etanol i 30 min.
- Tvätta ställningarna 3x 5 min med PBS.
- Bered en spädning på 50 μg/ml humant fibronektin i PBS och täck ställningarna.
- Blanda 500 μl stamfibronektinlösning (1 mg/ml) med 9,5 ml PBS.
- Sänk ner de desinficerade kärlställningarna i denna fibronektinlösning och inkubera dem vid 37 °C i 60 minuter för att möjliggöra proteinadsorption.
- Skölj ställningarna efter inkubation med PBS för att avlägsna det obundna fibronektinet. Förvara dessa belagda ställningar vid 4 °C i upp till 1 vecka.
3. rhCollMA biobläckberedning
- Förbered en fosfatbuffert för att neutralisera det sura rhCollMA-biobläckbeståndet.
- Bered ett 10x lager fosfatbuffert genom att lösa upp 5,495 g Na2HPO4, 1,55 gNaH2PO4och 30 mg NaCl i 50 ml avjoniserat vatten.
- Förbered en 10-faldig utspädning av 10x lagerfosfatbufferten genom att kombinera 1 del 10x fosfatbuffert med 9 delar avjoniserat vatten.
- Kombinera 900 μL stam rhCollMA-lösning med 100 μL 10x fosfatbuffert för att neutralisera den sura rhCollMA-lösningen.
- Späd den neutraliserade rhCollMA-lösningen till önskad koncentration av 10 mg / ml genom att blanda den med den erforderliga mängden 1x fosfatbuffert.
OBS: Stamkoncentrationen av rhCollMA varierar mellan partierna. Därför kommer volymen av 1x fosfatbuffert som behövs för att nå den önskade koncentrationen att variera. - Förbered porogen-fotoinitiatorlösningen (PEO-LAP) som ska kombineras med den utspädda neutrala rhCollMA.
- Bered en 1,6 % (w/v) lösning av poly(etylenoxid) (PEO) i fenolrödfri DMEM genom att lösa upp 160 mg PEO i 10 ml DMEM.
- Tillsätt 20 mg litiumfenyl-2,4,6-trimetylbensoylfosfinat (LAP) till denna lösning för att erhålla 0,2 % (w/v) LAP i lösningen. Från denna punkt, täck lösningen med aluminiumfolie eller förvara den på en mörk plats för att skydda den mot ljus.
- Sterilisera PEO-LAP-lösningen genom att leda den genom ett 0,22 μm filter. Förvara denna lösning vid 4 °C i upp till 1 vecka.
- Före bioprintning, blanda den utspädda neutrala rhCollMA-lösningen med PEO-LAP-lösningen i förhållandet 1:1 för att erhålla den slutliga biobläcklösningen. Använd pipettering, snarare än en virvel, för att blanda lösningarna samtidigt som du undviker luftbubblor.
- Om många bubblor införs i lösningen, centrifugera den vid 2 000 × g i 30 s. Efter centrifugering, blanda biobläcklösningen igen för att säkerställa homogenitet.
4. Förberedelse av granulärt stödbad
- Förbered gelatin granulärt stödmaterial.
- I ett biologiskt säkerhetsskåp delar du innehållet i ett 2 g rör frystorkat stödmaterial i två sterila 50 ml koniska rör, var och en innehållande cirka 1 g.
- Tillsätt 40 ml kall (4 °C) fenolrödfri DMEM till varje rör och virvla kraftigt tills allt frystorkat stödmaterial löser sig.
- Låt den resulterande flytgödseln sitta vid 4 °C så att stödmaterialet kan rehydreras.
- Avgasa stödmaterialet i en vakuumkammare i 30 minuter för att minska bubblorna.
- Centrifugera stödmaterialet vid 2 000 × g i 5 min. Se till att materialet är längst ner på röret och att supernatanten är klar.
- Aspirera supernatanten, samtidigt som du är försiktig så att du inte aspirerar stödmaterialet längst ner.
OBS: Stödmaterialet ska inte flöda medan du lutar röret efter att supernatanten har tagits bort. Om materialet flyter, centrifugera det igen med samma inställningar men utan att lägga till ny supernatant.
- Överför cirka 4 ml av det förberedda, komprimerade stödmaterialet till varje brunn på en 12-brunnsplatta med hjälp av en positiv förskjutningspipett. Knacka på brunnsplattan på en hård yta för att tvinga stödmaterialet att sprida sig jämnt i brunnen.
OBS: Den minsta rekommenderade volymen stödmaterial är 3x volymen på konstruktionen som kommer att skrivas ut i den. - Placera brunnsplattan med stödmaterialet på ett kylt bioprintersteg, eller vid 4 °C, tills den används för att förhindra att gelatinpartiklarna smälter.
5. Införlivande av endotelceller och stödceller med biobläcket
- Förbered endotelcellmedium enligt tillverkarens instruktioner genom att blanda basalmediet med motsvarande medium kit-komponent, inklusive en antibiotikalösning, fetalt bovint serum och endotelcellstillväxttillskott.
- Förbered tandmassa stamcellsmedium genom att kombinera 500 ml DMEM med låg glukoshalt, 58 ml fetalt bovint serum, 5,8 ml icke-essentiella aminosyror (NEAA), 5,8 ml glutaminsubstitut, 5,8 ml 1 M HEPES och 5,8 ml penicillin-streptomycin-nystatinlösning.
- Bered en suspension innehållande 2 × 106 ZsGreen1-uttryckande humana fettmikrovaskulära endotelceller (HAMEC-ZsGreen1) och 6 × 106 tandmassastamceller (DPC) i 10 ml endotelcellsmedium.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 200 × g i 4 min för att erhålla en cellpellet. Aspirera det supernatanta mediet.
- Resuspendera cellpelleten i 1 ml rhCollMA-biobläck som framställts tidigare (innehållande PEO-LAP) för att erhålla ett biobläck med en total cellkoncentration på 8 × 106 celler per 1 ml biobläck.
VARNING: Efter att ha kombinerat biobläcket med cellerna, fortsätt omedelbart till nästa steg. Om celler lämnas i suspensionen under lång tid sjunker cellerna till botten av röret och deras livskraft försämras. För experiment som inte involverar celler, hoppa antingen över steg 5.1-5.5 eller införliva fluorescerande pärlor med biobläcket istället för celler för förbättrad mikroskopisk visualisering av de tryckta konstruktionerna. - Överför cell-biobläckblandningen till utskriftspatroner.
- Montera en nål med en innerdiameter på 0,22 mm på en 3 ml bärnstensfärgad bläckpatron och placera patronen i ett 50 ml koniskt rör.
- Överför 1 ml av cell-biobläckblandningen till tryckpatronen genom att fylla den uppifrån med en positiv förskjutningspipett för att minska bubblor.
- Installera skrivarkassetten i lämpligt verktyg på bioprintern.
6. Bioprintning av mikrovaskulära nätverk med rhCollMA-biobläck
- Skapa en 3D CAD-design för det bioprintade mikrovaskulära nätverket.
- Skissa ett 2D-mönster av en 4 mm kvadrat som innehåller en cirkulär kanal med en diameter på 2 mm i mitten. Extrudera skissen med 4 mm för att få en kub på 4 mm x 4 mm x 4 mm med en central kanal. Exportera det här objektet som en . STL-fil.
- Importera en 12-brunnsplatta . STL-mall i den solida modelleringsfliken i skivprogramvaran för bioprinter och placera den i det angivna området i den virtuella utskriftsbädden.
- Importera . STL-fil med kubformen till den solida modelleringsfliken i skivprogramvaran för bioprinter. Klicka på kryssrutan Använd extern skivare | konfigurera utsnitt under avsnittet objektegenskaper . I popup-fönstret väljer du ett rätlinjigt mönster för fyllningsmönstret och skriver 30% i fyllningstätheten. Klicka på acceptera.
- Placera en kopia av kubformen i varje önskad virtuell brunn genom att klicka på kuben och flytta den med musen.
- Skapa nya materialinställningar för rhCollMA-biobläcket på materialfliken i skivprogramvaran för bioprinter genom att klicka på knappen Lägg till material . Välj materialets inställningar för utskrift. För tryck, skriv 2 psi i motsvarande ruta. För hastighet, skriv 20 mm/s i motsvarande ruta.
OBS: Varje biobläckmaterial har sina egna olika utskriftsinställningar som kan sparas i materiallistan i applikationen. - Tilldela värdena för linjebredd och linjehöjd till 0,24 mm och accelerationsvärdet till 400 mm/s2 genom att skriva dessa värden i motsvarande rutor.
- På den solida modelleringsfliken klickar du på kubobjektet och klickar sedan på rhCollMA-materialet från materialavsnittet för att tilldela det till kubformen. På fliken biomontering klickar du på knappen Skicka utskriftsjobb för att skicka utskriftsjobbet till bioprintern.
- Ladda utskriftspatronen laddad med det cellulära biobläcket i 3 ml omgivande pneumatiska dispenseringsverktyget i den 3D-extruderingsbaserade bioprintern.
- Ställ in utskriftsbäddens temperatur på 4 °C genom att klicka på kylknappen under fliken Kontroll-Uppvärmning/kylning på bioprinter-gränssnittsskärmen. Ladda plattan med stödbadet på skrivarbädden.
OBS: Materialets inställningar för trycktryck och hastighet kan ändras på grund av skillnader i omgivningstemperatur eller biobläcksatsvariation. Till exempel, på kallare dagar, behövs ett högre tryck eller lägre hastighet för att extrudera samma mängd material. - På utskriftsfliken på bioprintergränssnittsskärmen klickar du på utskriftsjobbet som skickades i steg 6.7. och klicka på start | gå för att starta utskriftsjobbet.
- Efter utskrift, utsätt brunnsplattan för en 405 nm ljuskälla med en intensitet på 3 mW / cm2 i 30 s för att initiera tvärbindningen av rhCollMA-biobläcket.
- Efter tvärbindning, inkubera brunnsplattan vid 37 °C och 5% CO2 i minst 20 minuter tills allt stödbad smälter.
- Aspirera försiktigt det flytande stödbadet och ersätt det med endotelcellmedium. Inkubera konstruktionerna vid 37 °C och 5 %CO2 tills de används i ytterligare steg.
OBS: På grund av sammandragningen av konstruktionen efter utskrift rekommenderas att utföra monteringen Steg 7 samma dag som steg 6.
7. Montering av det bioprintade mikrovaskulära nätverket med kärlställningen för att erhålla den konstruerade vaskulära klaffen
- Omedelbart efter avlägsnande av stödmaterial av det bioprintade mikrovaskulära nätverket, placera en fibronektinbelagd PLLA: PLGA vaskulär byggnadsställning i huvudkanalen för den bioprintade strukturen.
- Inkubera de monterade konstruktionerna vid 37 °C och 5 %CO2 i 2 dagar.
- Linje lumen i kärlställningen med endotelceller.
- Förbered en cellsuspension av tdTomato-uttryckande humana fettmikrovaskulära endotelceller (HAMEC-tdTomato) i en koncentration av 1 × 107 celler/ml.
- Placera en 20 μL droppe av denna cellsuspension på en hydrofob yta (dvs. en icke-vävnadskultur [nonTC] 10 cm skål).
- Placera försiktigt kärlställningarna ovanpå droppen, så att ställningens lumen i ena änden kommer i kontakt med celldroppen.
- Aspirera droppen från den motsatta änden av ställningen (dvs den ände som inte kommer i kontakt med droppen) och fyller dess lumen med cellsuspensionen.
- Placera den sådda ställningen i ett mikrocentrifugrör och lägg den i en rotator inuti i en fuktad inkubator i 60 minuter. Överför sedan ställningen till en 12-brunnsplatta och tillsätt 2 ml endotelcellmedium.
- Odla de konstruerade flikarna i 7 dagar, samtidigt som du ersätter mediet var 2: e dag med färskt endotelcellmedium.
8. Konfokalmikroskopi och immunofluorescensfärgning av de konstruerade flikarna
- Efter 4 dagar och 7 dagars odling, utför levande cellavbildning av de monterade ställningarna med hjälp av ett konfokalt laserscanningsmikroskop.
- Definiera fluorescenskanalerna för ZsGreen1 och tdTomato fluorescerande proteiner på programvaran för insamling av mikroskopbilder.
- Välj ett objektiv på 5x/0,16 med 0,5x zoom (pixelstorlek 5 μm) och definiera en Z-stack med 22 skivor med en tjocklek på 41 μm vardera.
- Definiera en 3 x 2 panelsökning för att avbilda och fånga hela konstruktionen.
- Justera laserintensiteten och förstärkningsvärdena för att få en tydlig fluorescerande signal utan mättnad och minimal bakgrund och få bilderna.
- Utför en maximal intensitetsprojektion av den förvärvade Z-stacken för att få en enda 2D-bild med hjälp av mikroskopets bildförvärvsprogramvara eller liknande bildanalysprogramvara.
- Utför högre förstoringsavbildning av ett område av intresse.
- Byt till ett objektiv på 10x/0,3 med 0,5 zoom (pixelstorlek 1,25 μm) och definiera en Z-stack med 9 skivor tjocklekar på 41 μm.
- Utför steg 8.2.-8.3.
- Efter 7 dagars kultur fixar du de konstruerade flikarna genom att sänka dem i 4% paraformaldehyd i 20 minuter.
- Tvätta konstruktionerna 3x 5 min med PBS.
- Tillsätt 0,3% (v / v) Triton-X i PBS till konstruktionerna och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur för att permeabibera cellerna.
- Tvätta konstruktionerna 3x 5 min med PBS.
- Bered en blockerande lösning genom att lösa upp 5 % (w/v) bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Tillsätt blockeringslösningen till de konstruerade flikarna och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
- Förbered den primära antikroppslösningen genom att späda ut mus-anti-glattmuskelaktin (anti-SMA) 1:50-antikropp i den 5% BSA-lösning som tidigare framställts för att fläcka de SMA-uttryckande stödcellerna.
- Inkubera ställningarna i den primära antikroppslösningen över natten vid 4 °C.
- Tvätta 3x 5 min med PBS.
- Förbered den sekundära antikroppslösningen genom att späda ut Cy3-konjugerad get-antimus IgG 1:400-antikropp och 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 2,5 μg/ml) i PBS.
- Applicera den sekundära antikroppslösningen på ställningarna och inkubera i 3 timmar vid rumstemperatur.
- Tvätta 3x 5 min med PBS.
- Förvara konstruktionerna vid 4 °C i PBS i upp till 1 månad.
- Avbilda de färgade ställningarna med hjälp av ett konfokalt laserscanningsmikroskop.
- Definiera de tre fluorescenskanalerna (DAPI, ZsGreen och Cy3) på programvaran för insamling av mikroskopbilder.
- Definiera en Z-stack med en sektionstjocklek på 2 μm som spänner över en total tjocklek på 50 μm. Definiera sedan en panelsökning för att avbilda större delar av konstruktionen.
- Justera förvärvsparametrarna för att få en tydlig fluorescerande signal utan mättnad och minimal bakgrund.
- Hämta bilderna med 20x / 0,8-mål med 1,0x zoom (pixelstorlek 0,31 μm).
- Utför en maximal intensitetsprojektion av den förvärvade Z-stacken för att få en enda 2D-bild med hjälp av mikroskopets bildförvärvsprogramvara eller liknande bildanalysprogramvara.
9. Anastomosering av den konstruerade klaffen direkt till en råttas lårbensartär med hjälp av en manschettteknik
- Förbered och sterilisera (autoklav) följande kirurgiska verktyg: Nr 15 skalpell, ett par fintandade pincett och ett litet par ringhanterade saxar. Förbered och sterilisera dessutom följande mikrokirurgiska verktyg: en rak finspetsad juvelerartång nr 3, en vinklad juvelerartång, en rundhanterad nålhållare med böjda käkar, ett par kärldilatatorer, dissekerande sax, adventitia sax samt kärlklämmor med applikatorn.
- Bered en lösning av 100 IE / ml hepariniserad saltlösning genom att späda ut 5 ml lagerheparinlösning med 195 ml saltlösning.
- Skär och sterilisera polyimidmanschetter.
- Skär 2,5 mm sektioner av ett polyimidrör under ett dissekerande mikroskop.
- I ena änden av varje sektion gör du ett 1,25 mm längs snitt i rörets vägg för att få ett manschetthandtag. Gör ett vinklat snitt i den andra änden av röret för att underlätta kärlets eversion.
- Sänk ner manschetterna i 70% etanol följt av två tvättar med hepariniserad saltlösning.
- Förbered en manlig Sprague-Dawley råtta (275-350 g) för operation.
- Sju dagar före operationen, börja administrera en subkutan daglig dos av ciklosporin (10 mg kg-1) för att uppnå immunsuppression.
- Före operationen, bedöva djuret med 3% isofluran inhalation enligt institutionell SOP med hjälp av en induktionskammare. Verifiera djupbedövning genom att klämma båda fötterna och kontrollera om det finns reflexer.
- Administrera en subkutan dos av smärtstillande buprenorfin (0,03 mg kg-1) och antikoagulerande heparin (200 IE kg-1).
- Applicera en smörjande ögonsalva på djurets ögon för att förhindra uttorkning.
- Raka råttans kirurgiska område och desinficera platsen med jod och sedan 70% etanol. Säkra djurets lemmar till bordet med tejp.
- Exponera och isolera den gemensamma lårbensartären.
- Gör ett 2 cm långt, snett snitt genom huden, längs konkaviteten mellan benet och buken.
- Använd pincett och trubbig sax och släpp huden från den underliggande vävnaden för att visualisera den inguinala fettkudden.
- Skär rakt igenom fettkudden runt de övre, mediala och nedre marginalerna med sax och pincett. Var uppmärksam på att inte skära stora kärl under fettkudden.
- Reflektera fettkudden i sidled och lämna de epigastriska kärlen intakta. Placera en våt gasbind på den reflekterade fettkudden för att förhindra torkning och fixa den på plats. Se till att de vanliga lårbenskärlen är synliga.
OBS: Fettkudden kommer senare att användas för att applicera mjukt tryck på anastomoserna. - Exponera lårbensartären från inguinalbandet proximalt till den epigastriska artärförgreningspunkten distalt genom att extrahera den från dess mantel.
VARNING: Det finns vanligtvis en gren av lårbensartären som löper under den, vanligtvis kallad Murphys gren. Var uppmärksam på att inte skada denna svåra att se gren. - Dela Murphys gren genom att ligatera den och ligate sedan lårbensartären med två ligaturer i mitten av artären åtskilda 1 mm från varandra. Håll ena änden av ligaturen lång för att använda senare för att dra kärländen genom manschetten.
- Skär artären mellan de två ligaturerna med hjälp av adventitia sax.
VARNING: Det bör inte förekomma någon blödning när du utför detta snitt. Om artäränden blöder, kläm fast artären och applicera en ligatur igen. - Använd den långa änden av ligatursuturen och sätt in varje kärlände i en polyimidmanschett, som bereddes i föregående steg, så att de två manschetternas handtag pekar bort från varandra.
- Efter insättning, applicera en klämma samtidigt på manschetthandtaget och kärlet och säkra manschetten på plats.
- Förbered en hepariniserad saltlösning i en spruta utrustad med en 27 G nål.
- Dra i den ligerade kärländen och skär den nära ligaturen. Tvätta omedelbart kärländen noggrant med den hepariniserade saltlösningen tills inget blod är synligt i lumen.
VARNING: Se till att kärländen tvättas väl eftersom allt blod som finns kvar inuti kommer att bilda en blodpropp som kommer att införas i blodomloppet när proceduren är klar. Detta kan leda till ocklusion av kärlet och förlust av perfusion till benet. - Expandera kärlets lumen genom att hålla det i sin mantel med ena handen och utvidga dess lumen med kärldilatatorn med den andra handen.
- Placera en lös 6-0 polypropenomkrets sutur runt manschettkroppen. Evert kärländen med två kärldilatatorer över manschettkroppen och säkra den på plats genom att dra åt omkretssuturen.
OBS: Om något blod läcker genom det fastklämda kärlet under manipulationerna, tvätta lumen noggrant med hepariniserad saltlösning. - Skölj den konstruerade klaffen med hepariniserad saltlösning och sätt sedan in den kärlfodrade manschetten i kärlställningens lumen. Fäst ställningen på plats genom att placera en omkrets 6-0 polypropen sutur runt ställningen och manschettkroppen. Gör detta steg för båda sidor av kärlställningen.
- Vik ett 0,2 μm polystyrenmembranfilter runt anastomosstället för att isolera den konstruerade klaffen från den omgivande vävnaden.
- Släpp den distala klämman först; släpp sedan den proximala klämman för att återupprätta blodflödet genom kärlet.
- För att stoppa blödning genom anastomoserna, reflektera fettkudden tillbaka över lårbenskärlen och applicera försiktigt tryck med en steril gasväv i 3 minuter.
- Suturera fettkudden tillbaka på plats med 6-0 polypropen; suturera sedan huden med 5-0 PGA absorberbara suturer.
- Rengör sårområdet med saltlösning och applicera jodlösning.
- För postoperativ smärta och djurhantering, förbered en 0,1% (v / v) tramadol i dricksvatten. Dessutom administrera en daglig dos av heparin (200 IE kg-1) och cyklosporin (10 mg kg-1).
- Placera djuret i en ren bur av sig själv placerad under en värmelampa. Fortsätt att övervaka djuret tills det återfår tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternal recumbency.
Representative Results
Detta protokoll beskriver tillverkningen av en konstruerad flik bestående av en kärlställning (figur 1Ai) och en bioprintad mikrovaskulatur (figur 1Aii), som monterades för att uppnå mesoskala och mikroskala vaskulatur (figur 1Aiii). Efter protokollet designades och 3D-printades BVOH-formar av kärlställningen (figur 1B,C). De erhållna tryckta strukturerna inspekterades visuellt för små strängar av BVOH, som kan hittas i formarnas tomma utrymmen (figur 1D). Dessa strängar indikerar vanligtvis felaktiga materialinställningar eller att BVOH har absorberat fukt. Dessa trådar bör tas bort eftersom de kan leda till ofullständig fyllning av formen och strukturella defekter i den resulterande kärlställningen. Därefter fylldes formarna med PLLA: PLGA-lösning, följt av frystorkningsprocessen och tvättstegen, som beskrivs i protokollet. Den erhållna PLLA: PLGA kärlställningen inspekterades visuellt för att verifiera kärlväggens integritet och lumenpatency (figur 1E).
Ett neutraliserat rhCollMA-biobläck i en koncentration av 10 mg/ml framställdes och kombinerades i förhållandet 1:1 med PEO:LAP-lösningen. Humana fettmikrovaskulära endotelceller märkta med Zs-Green1 och tandmassastamceller återsuspenderades med rhCollMA-biobläcket, och lösningen laddades i en tryckpatron och på skrivaren. Lådformer med en central kanal med ett rätlinjigt mönster (figur 1D) bioprintades inuti gelatinstödbadet. Efter tryckning tvärbinddes konstruktionerna och stödbadet löstes upp och tvättades. Efter 4 dagars kultur avbildades konstruktionerna live för att kontrollera om mikrovaskulärt nätverk självmontering. Figur 1D visar ett exempel på ett högt utvecklat HAMEC-ZsGreen1 mikrovaskulärt nätverk i den bioprintade konstruktionen.
Därefter sattes en fibronektinbelagd kärlställning in i den centrala kanalen för den tryckta konstruktionen (figur 2A). De monterade konstruktionerna odlades i 2 dagar, under vilka cellerna kontraherar gelén och fäster den ordentligt på kärlställningen. Därefter fodrades kärlställningen med HAMECs som uttrycker tdTomato, enligt protokollet. Efter 7 dagars kultur fixades och avbildades konstruktionerna. Figur 2B visar en sidovy av de sammansatta konstruktionerna där endotelcellerna i den bioprintade mikrovaskulaturen är avbildade i grönt, medan kärlställningens endotelfoder är avbildat i rött. Bilden visar en grön mikrovaskulär självmontering i den bioprintade gelén, medan kärlställningen är fodrad med röda endotelceller. Med högre förstoring ses groddar som härrör från det röda endotelfodret spira och anastomosera med det bioprintade mikrovaskulära nätverket (figur 2C). Därefter färgades konstruktionerna för α glattmuskelaktin (SMA) som en markör för tandmassastamcellerna. Efter immunfärgningen avbildades konstruktionerna med hjälp av ett laserscannande konfokalmikroskop (figur 2D).
Slutligen, efter 7 dagars kultur, anasterades de konstruerade flikarna mikrokirurgiskt till en råttas lårbensartär, som beskrivs i protokollet. En video av ett representativt förfarande kan ses i Kompletterande video S1. Figur 2E visar en representativ bild av en färdig anastomos före klämborttagning, och figur 2F visar en representativ bild av anastomosstället efter klämborttagning och hemostas. Det bör inte finnas någon blödning synlig före sårstängning.
Figur 1: Representativa bilder av de tillverkade meso- och mikroskalekärlen. (A) Schematisk översikt över protokollets steg. Återges med tillstånd16. (B) CAD-design för kärlställningens offerform. (C) Sidovy av en representativ 3D-tryckt offerform (skalstreck = 0,5 mm). (D) Ovanifrån av offerformen (skalstreck = 0,5 mm) (E) Representativ kärlställning tillverkad med hjälp av beskrivprotokollet (skalstreck = 5 mm). (F) CAD-design för det 3D-bioprintade rhCollMA-mikrovaskulära nätverket. Rutnätslinjer = 1 mm. (G) Representativ bild av ett högt utvecklat bioprintat vaskulärt nätverk som visar HAMEC-ZsGreen1 i grönt. Skalstreck = 200 μm. Förkortningar: CAD = datorstödd design; rhCollMA = rekombinant humant kollagenmetakrylat; HAMEC = humana fettmikrovaskulära endotelceller; PLLA = poly-L-mjölksyra; PLGA = polymjölksyra-ko-glykolsyra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa bilder av den monterade vaskulära klaffen (A) Ett fotografi av en representativ sammansättning av bioprintad mikrovaskulatur och kärlställningen. Skalstreck = 1 mm. (B) Sidovy av en representativ konstruerad flik avbildad 4 dagar efter endotelfoder på kärlställningen. Den bioprintade mikrovaskulaturen visas i grönt (HAMEC-ZsGreen1), medan endotelfodret visas i rött (HAMEC-tdTomato). Skalstreck = 1 mm. (C) Representativ bild av anastomoser mellan den biotryckta vaskulaturen i grönt och endotelfodret i rött. Skalstreck = 200 μm. (D) Representativ bild av immunfärgning för glattmuskelaktin (röd), kärnor (blå) och endotelceller (grön) efter 7 dagars inkubation. Skalstång = 0,1 mm. (E) Representativ bild av en färdig anastomos av den konstruerade klaffen med en råttas lårbensartär före klämborttagning och (F) efter klämborttagning. Förkortningar: HAMEC = humana fettmikrovaskulära endotelceller; SMA = glattmuskelaktin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande video S1: Representativt mikrokirurgiskt förfarande för anastomosering av kärlställningen till en råttas lårbensartär. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
Att konstruera vaskulära vävnader är en av de största utmaningarna inom vävnadsteknik20. Nuvarande metoder för att skapa konstruerad kärlvävnad fokuserar på att skapa självmonterad mikrovaskulatur 21,22,23 eller tillverka mesoskala vaskulära byggnadsställningar 24,25 och inte på att återskapa ett system av hierarkisk vaskulatur, som kan perfuseras omedelbart och direkt vid implantation26 . I detta arbete beskriver vi ett protokoll som använder två 3D-utskriftsmetoder för att tillverka ett hierarkiskt kärlnätverk bestående av mikroskala och mesoskala vaskulatur. Protokollet kombinerar ett 3D-bioprintat, självmonterat mikrovaskulärt nätverk med en vaskulär byggnadsställning i mesoskala, vilket ger en implanterbar, vaskulär flik. Dessutom presenterar detta papper ett protokoll för att direkt anastomosera denna flik till en råttas lårbensartär.
3D-bioprintning har fått intresse de senaste åren på grund av dess mångsidighet jämfört med traditionella vävnadstekniktekniker. Medan detta protokoll beskriver genereringen av ett mikrovaskulärt nätverk i rhCollMA biobläck, kan de använda metoderna tillämpas med få modifieringar på många andra biobläck från överflödet av studerade och nya biobläck och stödbad27,28. Vi valde att använda rhCollMA som ett biobläck på grund av överflödet av kollagen av typ I i den mänskliga ECM, vilket ger en lämplig miljö för cellfästning. Dessutom produceras den rekombinant i växter och modifieras ytterligare med metakrylatgrupper, vilket möjliggör fotopolymerisation och bildning av stabila 3D-hydrogeler29,30. Fotokrysslänkning uppnåddes genom tillägg av fotoinitiatorn LAP, som har visat sig vara giftfri och aktiveras genom exponering för 405 nm blått ljus, vilket minskar UV-ljusets möjliga fototoxicitet. Användningen av ljuskänsliga biobläck kräver emellertid användning av ett fenolrött fritt odlingsmedium för framställning av biobläcket och stödmaterialet. Dessutom beskriver protokollet användningen av gelatinstödmaterial, vilket möjliggör högkvalitativ extrudering av biobläck som rhCollMA. Således är det viktigt att säkerställa användningen av kallt medium under beredningen och kylningen av skrivarbädden. Överdriven uppvärmning kan uppstå på grund av ljuskällan som används för tvärbindning eller från förhöjda omgivningstemperaturer.
En extruderingsbaserad bioprinter har använts här för att skapa det bioprintade mikrovaskulära nätverket, och det finns för närvarande många kommersiellt tillgängliga bioprinters som kan generera liknande konstruktioner. Dessutom kan de föreslagna metoderna enkelt modifieras och tillämpas för att studera olika geometrier, storlekar och fyllnadsmönster. I detta arbete valdes ett rätlinjigt utfyllnadsmönster för att skapa sammankopplade porer, och detta kan skrivas ut relativt snabbt med hög trohet.
Luftbubblor utgör en betydande utmaning vid extrudering av bioprinting, särskilt inuti stödmaterial. Därför är det avgörande att minimera närvaron och bildandet av dessa bubblor genom att använda positiva förskjutningspipetter för överföring av stödmaterialet, framställning av biobläckcellsuspensionen och deras överföring till tryckpatronerna.
I detta arbete användes humana fett-härledda endotelceller och tandmassastamceller som stödjande celler på grund av deras relativt enkla isolering från patienter. Dessutom valdes en total cellkoncentration på 8 x 106 celler / ml eftersom denna koncentration har visat sig etablera de mest utvecklade vaskulära nätverken16. Även om detta protokoll kan användas för att generera mikrovaskulatur med hjälp av olika celltyper och källor, liksom olika biobläck, måste en kalibrering av cellkoncentrationen göras för att skapa de bästa förutsättningarna för utvecklingen av det mikrovaskulära nätverket. Dessutom kan vävnadsspecifika celler (dvs. myoblaster eller osteoblaster) införlivas i biobläcket för att uppnå vävnadsspecifika vaskulära flikar.
Formen för den porösa kärlställningen tillverkades med 3D-tryckt vattenlösligt material på en kommersiellt tillgänglig extruderings 3D-skrivare. Detta resulterar i en kostnadseffektiv teknik baserad på snabba prototypplattformar, så att många olika geometrier och storlekar på kärlställningar kan studeras och screenas snabbt31. Ändå är en begränsning av denna metod upplösningsgränsen för de flesta 3D-skrivare32. Men med den snabbt utvecklande industrin kring additiv tillverkning förväntas dessa gränser förbättras med tiden. Användningen av organiska lösningsmedel för tillverkningsprocessen är en annan begränsning av protokollet, eftersom de flesta organiska lösningsmedel är giftiga för celler, vilket förhindrar förmågan att kombinera bioprintningsproceduren med tillverkningsprocessen för kärlställningar.
Den beskrivna metoden att så ställningens lumen med hjälp av aspiration i motsats till att trycka på cellsuspensionen har stora effekter på lokaliseringen av de sådda cellerna. Användning av undertryck möjliggör endotelisering av ställningens inre lumen samtidigt som eventuellt spill av cellsuspensionen minimeras genom perforeringarna på ställningens vägg16.
Den beskrivna "manschett" -metoden för mikrokirurgiska anastomoser kan enkelt modifieras och anpassas till olika vaskulära byggnadsställningar eller storlekar, liksom till olika artärer och vener i en stor skala av djurmodeller. Anpassningarna av protokollet skulle inkludera olika polyimidrörstorlekar och suturstorlekar. Denna metod kräver inte perforering av ställningsväggen, vilket kan leda till utveckling av defekter. Detta arbete presenterar ett protokoll som kan utökas till många applikationer. De kritiska aspekterna av detta protokoll, som inkluderar tillverkning av meso- och mikroskala vaskulatur och deras montering och implantation, representerar kritiska aspekter av konstruerade klaffar både för rekonstruktiva applikationer, såväl som vaskulära och andra vävnadstekniska studier.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta projekt fick finansiering från Europeiska forskningsrådet (ERC) inom ramen för Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 (bidragsavtal nr 818808). rhCollMA tillhandahölls generöst av CollPlant (Rehovot, Israel). Författarna tackar Technions prekliniska forskningsmyndighet för hjälpen med djurvård, liksom Janette Zavin, Galia Ben David och Idan Redenski.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dioxane | Biosolve Chemical | 42405 | |
| 27 G x 0.5" blunt tip dispensing needles | CML supply | 901-27-050 | |
| 3cc amber syringe barrel & piston set | Nordson EFD | 7012085 | Amber syringes used to block light and prevent premature crosslinking |
| 5-0 AssuCryl PGA absorbale suture | Assut Sutures | Absorbable sutures used for skin wound closure | |
| 6-0 polypropelene sutures | Assut Sutures | 9351 | |
| Acland clamps | S&T | B-1V | |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-15 | |
| Angled no.3 jeweler's forceps | S&T | JFAL-3-18 | |
| BioAssemblyBot 400 3D Bioprinter | Advanced Solutions | a 6-axis 3D bioprinter | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Buprenorphine | vetmarket | B15100 | |
| BVOH filament | Verbatim | 55903 | a water-soluble 1.75 mm diameter filament |
| Clamp applying forceps | S&T | CAF-4 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| Dietrich bulldog clamps | Fine Science Tools (FST) | 18039-45 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carlo Erba Reagents | 480141 | |
| Dissection scissors | S&T | 18039-45 | |
| DMEM, High Glucose, No Phenol Red | Sartorius | 01-053-1A | |
| Duratears | Alcon | DJ03 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | glutamine substitute |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Heparin Sodium 5,000 I.U./mL | Panpharma | - | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | A stock concentration of 1 mg/mL |
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal Critical Care | NDC 66794-011-25 | |
| LifeSupport | Advanced Biomatrix | 5244 | a gelatin support slurry for FRESH 3D bioprinting |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| MICROMAN E M1000E, 100-1,000 µL | Gilson | FD10006 | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Poly(ethylene oxide), M.W. 250,000 to 400,000 | Acros Organics | 178602500 | |
| Poly(L-lactic acid), IV 5.0 dl/g (PLLA) | Polysciencse, Inc. | 18582-10 | |
| Polyimide tubing, ID: 0.0249", OD: 0.0273" | Cole-Parmer | 95820-05 | A thin-walled tube used to fabricate cuffs for microsurgical anastomoses |
| Prusa I3 MK2.5 3D Printer | Prusa Research | http://www.prusa3d.com/ | a popular commercial 3D printer |
| Resomer RG 503 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Evonik Industries | 719870 | |
| rhCollMA | CollPlant | https://collplant.com/ | generously provided by CollPlant (Rehovot, Israel) |
| round-handled needle holder | S&T | B-15-8 | |
| Scalpel handle - #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
| Sodium Chloride | Biosolve Chemical | 19030591 | |
| Sodium Phosphate dibasic (NaH2PO4) | Riedel-de Haen | 4276 | |
| Solidworks | Dassault Systems | CAD software | |
| Straight no.3 jeweler's forceps | S&T | JF-3-18 | |
| Straight serrated forceps | Fine Science Tools (FST) | 11050-10 | |
| Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton Limited | 305 | |
| Triton-X 100 | BioLab LTD | 57836 | |
| TSIM | Advanced Solutions | 3D slicing and design software for the BioAssembly Bot | |
| Vessel dilator | S&T | D-5a.1 | |
| Zeiss Tivato 700 surgical microscope | Zeiss |
References
- Wallace, C. G., Wei, F. -C. C. The current status, evolution and future of facial reconstruction. Chang Gung Medical Journal. 31 (5), 441-449 (2008).
- Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G.
- Duan, B. State-of-the-art review of 3D bioprinting for cardiovascular tissue engineering. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 195-209 (2017).
- Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
- Ouyang, L., Armstrong, J. P. K., Chen, Q., Lin, Y., Stevens, M. M. Void-free 3D bioprinting for in situ endothelialization and microfluidic perfusion. Advanced Functional Materials. 30 (1), 1908349 (2020).
- Baltazar, T., et al. Three dimensional bioprinting of a vascularized and perfusable skin graft using human keratinocytes, fibroblasts, pericytes, and endothelial cells. Tissue Engineering - Part A. 26 (5-6), 227-238 (2020).
- Chia, H. N., Wu, B. M. Recent advances in 3D printing of biomaterials. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 4 (2015).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
- Guillotin, B., et al. Laser assisted bioprinting of engineered tissue with high cell density and microscale organization. Biomaterials. 31 (28), 7250-7256 (2010).
- Catros, S., et al. Laser-assisted bioprinting for creating on-demand patterns of human osteoprogenitor cells and nano-hydroxyapatite. Biofabrication. 3 (2), (2011).
- Ronca, A., Ambrosio, L., Grijpma, D. W. Preparation of designed poly(d,l-lactide)/nanosized hydroxyapatite composite structures by stereolithography. Acta Biomaterialia. 9 (4), 5989-5996 (2013).
- Lan, P. X., Lee, J. W., Seol, Y. J., Cho, D. W. Development of 3D PPF/DEF scaffolds using micro-stereolithography and surface modification. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 20 (1), 271-279 (2009).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- Bhattacharjee, T., et al.
- Szklanny, A. A., et al. 3D bioprinting of engineered tissue flaps with hierarchical vessel networks (VesselNet) for direct host-to-implant perfusion. Advanced Materials. 33 (42), 2102661 (2021).
- Schleimer, K., et al. Training a sophisticated microsurgical technique: interposition of external jugular vein graft in the common carotid artery in rats. Journal of Visualized Experiments JoVE. (69), (2012).
- Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: A new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
- Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats. Comparative Medicine. 64 (4), (2014).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
- Szklanny, A. A., et al. High-throughput scaffold system for studying the effect of local geometry and topology on the development and orientation of sprouting blood vessels. Advanced Functional Materials. 1901335, 1-13 (2019).
- Song, W., et al. Engineering transferrable microvascular meshes for subcutaneous islet transplantation. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).
- Ying, G. L., et al. Aqueous two-phase emulsion bioink-enabled 3D bioprinting of porous hydrogels. Advanced Materials. 30 (50), 1-9 (2018).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
- Jang, J., Park, J. Y., Gao, G., Cho, D. W. Biomaterials-based 3D cell printing for next-generation therapeutics and diagnostics. Biomaterials. 156, 88-106 (2018).
- Suntornnond, R., An, J., Chua, C. K. Roles of support materials in 3D bioprinting - present and future. International Journal of Bioprinting. 3 (1), 83-86 (2017).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human recombinant type I collagen produced in plants. Tissue Engineering - Part A. 19 (13-14), 1527-1533 (2013).
- Stein, H., et al. Production of bioactive, post-translationally modified, heterotrimeric, human recombinant type-I collagen in transgenic tobacco. Biomacromolecules. 10 (9), 2640-2645 (2009).
- Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of precision polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , 120062 (2020).
- Karakurt, I., Lin, L. 3D printing technologies: techniques, materials, and post-processing. Current Opinion in Chemical Engineering. 28, 134-143 (2020).
