Summary
この手順では、マウスにおける平行移動可能なプログレッシブロードランニングホイール抵抗トレーニングモデルについて説明します。このレジスタンストレーニングモデルの主な利点は、それが完全に自発的であるため、動物のストレスと研究者の負担を軽減することです。
Abstract
相乗的アブレーション、電気刺激、加重はしご登山、そして最近では加重そり引っ張りを含む、以前に開発されたげっ歯類抵抗ベースの運動モデルは、骨格筋の適応を誘発する肥大刺激を提供するのに非常に効果的です。これらのモデルは骨格筋の研究に非常に貴重であることが証明されていますが、侵襲的または不随意で労働集約的です。幸いなことに、多くのげっ歯類の系統は、ランニングホイールへのアクセスを与えられると、自発的に長距離を走ります。げっ歯類のロードホイールランニング(LWR)モデルは、筋肉量の増加や線維肥大、筋タンパク質合成の刺激など、ヒトのレジスタンストレーニングで一般的に観察される適応を誘発することができます。ただし、適度なホイール負荷を追加すると、マウスが長距離を走るのを思いとどまらせることができないか(これは、持久力/レジスタンストレーニングモデルをより反映している)、または負荷の適用方法のためにマウスがほぼ完全にランニングを中止します。そこで、外部抵抗が加わり、徐々に増加するマウス用の新しい高負荷ホイールランニングモデル(HLWR)が開発され、マウスは以前に利用されていたよりもはるかに高い負荷で走り続けることができます。この新しいHLWRモデルの予備的な結果は、9週間のトレーニングプロトコルにわたって肥大適応を誘発するのに十分な刺激を提供することを示唆しています。本明細書では、この簡便でありながら安価な漸進的抵抗ベースの運動訓練モデルをマウスで実行するための具体的な手順について説明する。
Introduction
骨格筋量は、成人の体重の約40%を占めています。したがって、生涯を通じて骨格筋量を維持することが重要です。骨格筋量は、エネルギー代謝、深部体温の維持、およびグルコース恒常性に不可欠な役割を果たします1。骨格筋の維持は、タンパク質合成とタンパク質分解のバランスですが、これらのプロセスを推進する複雑な分子メカニズムの理解にはまだ多くのギャップがあります。筋肉量の維持と成長を調節する分子メカニズムを研究するために、機械的刺激が骨格筋量の調節に不可欠な役割を果たすため、人間の被験者の研究モデルはしばしば抵抗運動ベースの介入を採用します。ヒトを対象とした研究は成功していますが、侵襲的処置(すなわち、筋生検)に関する適応と倫理的懸念を示すために必要な時間は、取得できるデータの量を制限します。レジスタンス運動への適応は哺乳類の種全体にかなり遍在していますが、動物モデルは、食事と運動レジメンを正確に制御できると同時に、脳、肝臓、心臓、骨格筋などの全身の組織を収集できるという利点があります。
げっ歯類で使用するために、多くのレジスタンストレーニングモデルが開発されています:相乗的アブレーション2、電気刺激3,4、加重はしご登り5、加重そり引っ張り6、キャンバススクワット7。これらのモデルはすべて、正しく行われれば、肥大などの骨格筋の適応を誘発するための効果的なモデルになり得ることは明らかです。ただし、これらのモデルの欠点は、ほとんどが非自発的であり、通常のげっ歯類の行動の一部ではなく、時間/労働集約的で、侵襲的であることです。
幸いなことに、多くのマウスとラットの系統は、ランニングホイールへのアクセスを与えられると、自発的に長距離を走ります。さらに、フリーランニングホイール(FWR)運動モデルは、運動や筋肉活動を強制するために、広範なコンディショニング、正/負の強化、または麻酔に依存しません8,9。ランニング活動は、マウスの系統、性別、年齢、および個人ベースに大きく依存します。Lightfootらは、15種類のマウス系統のランニング活動を比較し、毎日のランニング距離は2.93kmから7.93kmの範囲であり、C57BL/6マウスは性別に関係なく最も遠くまで走っていることを発見した10。FWRは、骨格筋および心筋の持久力適応を誘導するための優れたモデルとして一般に受け入れられています11,12,13,14,15,16;ただし、レジスタンストレーニングモデルでホイールランニングを利用することはあまり一般的ではありません。
推測できるように、ホイールランニングの肥大効果は、ロードホイールランニング(LWR)と呼ばれるランニングホイールに抵抗を追加することによって増強される可能性があるため、レジスタンストレーニングをより厳密に模倣するためにホイール上を走るためのより大きな努力が必要になります。負荷適用の様々な方法を用いて、ラットおよびマウスを利用したLWRモデルが、6〜8週間のうちに5%〜30%の四肢筋肉量の増加を日常的に示していることが実証されている17、18、19、20、21。さらに、D'hulstらは、LWRの1回の発作がFWR22と比較してタンパク質合成シグナル伝達経路の活性化の50%大きな増加をもたらすことを実証した。車輪抵抗は、摩擦ベースの定荷重法によって最も一般的に適用されており、それによって磁気ブレーキまたはテンションボルトを利用して車輪抵抗を適用する12、19、23、24。摩擦ベースの定荷重法の注意点の1つは、中程度から高い抵抗が適用されると、動物は高い抵抗を克服して車輪の動きを開始できず、効果的にトレーニングを停止することです。最も重要なことは、げっ歯類のランニングホイールモデルに使用されるケージおよびホイールシステムの多くは非常に高価であり、特殊な機器を必要とすることです。
最近、Dunganらは、ホイールの片側に付着した外部質量 を介して 非対称にホイールに荷重を加えるプログレッシブウェイトホイールランニング(PoWeR)モデルを開発しました。PoWeRモデルの不均衡なホイール負荷と可変抵抗は、継続的なランニング活動を促進し、マウスでのロードされたホイールランニングのより短いバーストを促進し、レジスタンストレーニングで実行されるセットと繰り返しをより厳密に模倣すると考えられています17。平均走行距離は1日あたり10〜12 kmであるにもかかわらず、PoWeRモデルは足底筋湿潤量と繊維断面積(CSA)がそれぞれ16%と17%増加しました。多くの実用的な利点にもかかわらず、LWRのPoWeRモデルにはいくつかの制限があります。著者らが認識しているように、PoWeRモデルは、より厳密な抵抗運動ベースのモデルとは対照的に、混合持久力/抵抗運動モデル(すなわち、ヒトでの同時トレーニング)を反映した大量の「ハイブリッド」刺激であり、干渉効果を導入し、あまり目立たない肥大または肥大が誘発されるさまざまなメカニズムに寄与する可能性があります25.レジスタンス運動トレーニングモデルとなることを意図したもので同時トレーニング現象が発生しないようにすることが不可欠です。そのため、PoWeRモデルを修正して、以前使用されていたよりも高い負荷を利用してレジスタンストレーニングモデルに似せるLWRモデルを開発しました。本明細書では、C57BL/6マウスにおける簡単で安価な9週間の進行性レジスタンストレーニングLWRモデルについて詳細を提供する。
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Protocol
この研究は、アパラチア州立大学の施設動物管理および使用委員会(#22-05)によって承認されました。
1.動物
- C57BL/6マウスを社内マウスコロニーから調達する。
注:研究開始時に生後5〜8か月の雄マウスを使用しました。毎日のランニング活動は、9〜10週齢の約26でピークとプラトーになります。以前の研究では、古いマウス(22〜24か月)もロードホイールランニング27を実行することが示されています。 - ワイヤー蓋付きの標準的なげっ歯類ケージにマウスを個別に収容し、ケージを制御された環境(20〜24°C、12:12時間の明暗サイクル)に保ちます。
- 標準的なげっ歯類のチャウと水を 自由に提供します。
2.ランニングホイール装置
- ランニングホイールのセットアップ:
注意: ランニングホイールは、1gまたは2.5gのロードマグネットを追加することを除いて、すべてのランニングプロトコルで同様に組み立て/セットアップされます。- 1つの1gセンサー磁石をランニングホイールの外側中央円周に接着します(図1)。
- このホイールを1gセンサーマグネット1個と一緒に使用して、ホイール順応の最初の1週間のみ使用します。
- ロードされたホイールランニング(LWR、PoWeR17と同じローディングプロトコル):手順2.1.4〜2.1.6に従います。
- LWRの第2週には2 gの負荷が必要です(表1を参照)。
- 2つの1g磁石をホイールの外周に並べて接着します(図2A)。
注意: ここでは、接着剤がしっかりと乾くまでテープを使用して磁石を所定の位置に保持すると便利です。そうしないと、センサーの磁石に引き付けられて外れる可能性があります。 - 3週目、4週目、6週目に、すでに存在する磁石のいずれかの上に別の1gの磁石を配置して、追加の負荷をかけます。
注意: 磁石は互いにしっかりと接着するため、接着剤は必要ありません。たとえば、第6週に6 gの負荷がかかると、磁石はそれぞれ3つの高さに積み重ねられます(図2B)。 - 高負荷ホイールランニング(HLWR):手順2.1.8〜2.1.11に従います。
注: HLWR プロトコルには 3 セットのホイールが必要です。異なるホイールセットを組み立てることで、ホイールが完全に洗浄および消毒された後、研究者は他のマウスのホイールセットアップを再利用できます(各セットの数は、コホート/グループサイズに基づいて研究者が決定する必要があります)。 - 最初のホイールセット(2週目のみ必要)には、2.5gの磁石が1つ付いています。ホイールの外周に2.5gの磁石1つを接着します(ステップ2.1.5の下の注を参照)。
- 2番目のホイールセット(3週目のみ必要)には、2.5gの磁石が2つ付きます。接着剤(ステップ2.1.5の下の注を参照)2.5gの磁石をホイールの外周に並べて取り付けます(図3B)。
- 3番目のホイールセット(4週以降に必要)には、3つの2.5gマグネットが並んでいます。接着剤(ステップ2.1.5の下の注を参照)3つの2.5g磁石をホイールの外周に並べて取り付けます(図3C)。
- すでに存在する磁石のいずれかの上に別の2.5gの磁石を置き、6週目と8週目に追加の負荷をかけます(図3D、E)。
図1:ホイールの中央外周に接着された単一の1gセンサー磁石を備えた基本的なランニングホイール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:センサーマグネットと1gのローディングマグネットを備えたロードされたランニングホイール(LWR)。 (A)2gの荷重の例、2つの1g磁石をホイールの外縁に並べて接着する。(B)6gの荷重の例、2つの1g磁石をホイールの外縁に並べて接着し、さらに4gの荷重を加える。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:センサーマグネットと2.5gローディングマグネットを備えた高負荷ランニングホイール(HLWR)。 (A)2.5gの荷重の例、ホイールの外縁に接着された1つの2.5g磁石。(B)5gの荷重の例、2つの2.5g磁石をホイールの外縁に並べて接着する。(C)7.5gの荷重の例、3つの2.5g磁石をホイールの外縁に並べて接着する。(D)10gの荷重の例、3つの2.5gの磁石をホイールの外縁に並べて接着し、さらに2.5gの荷重を加える。(E)12.5gの荷重の例、3つの2.5gの磁石をホイールの外縁に並べて接着し、さらに5gの荷重を加えます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3.ケージアセンブリ
- デジタルバイクコンピューターを備えたケージを使用してランニングホイールを組み立て、運動時間(h)と移動距離(km)を監視します。平均速度(km / h)は算術的に導き出されます。
- 組み立てる前に、新しいバッテリーがバイクコンピューターに挿入されていることを確認してください。
- 最初のバイクコンピュータープログラミング中にホイールサイズを設定します(製造元の指示を参照)。走行輪の外周を測定することによって回転間距離を計算する(例えば、本明細書で使用される車輪タイプについては3,580mm)。
- バイクコンピューターのセンサーを、ケージの蓋の外側、ホイールのセンサーマグネットが配置されている場所の真上にある固体面に配置します。マウスがコンポーネントを噛むのを防ぐために、すべてのコンピューターとセンサーコンポーネントがケージの外側の頑丈なバリア内に含まれていることを確認してください。
- 磁気自転車センサーを配置するために切り取られた小さな長方形が付いた空のピペットチップボックスの蓋と、ボックスの主要部分(チップラックグリッドを取り外した状態)を使用して、サイクルコンピューターとワイヤーを保持します(図4A)。
- 固体表面の角に4つの穴を開けて、磁気自転車センサーとランニングホイールスタンドをケージの外側の所定の位置に固定します(図4A)。
- ランニングホイールベースを逆さまにして、ケージの蓋の隙間から挿入しますが、手順3.2で説明した固体表面の上に挿入します(図4B)。
- ホイールベースとコンピューターセンサーをハードウェアでケージの上部に固定します(図4C、D)。
- 車輪の動きを適切に記録できるように、センサーマグネットとコンピューターセンサーの間隔が1cm以下であることを確認してください(ほとんどの標準的なバイクコンピューターセンサーは双方向であり、どちらの回転方向でも正の車輪の動きを記録します)。
- ケージの蓋の内側から適切なランニングホイール(上記のように)をホイールベースに取り付け、蓋をケージにしっかりと置きます(図4E、F)。
- ホイールをケージの蓋からぶら下げた状態で、ケージの床から少なくとも2.5cmの隙間を確保します。ケージに最小限の寝具を置き、ホイールが自由に回転するが、寝具の蓄積によって妨げられないようにします。
- 実験中は、サイクルコンピューターからのデータを一定の間隔で記録して、正確なアクティビティモニタリングを確保します。
- マウスは夜行性の種であることを認識してください。したがって、彼らの自然なケージ活動(ホイールランニングを含む)のほとんどは、光サイクルの暗い時間に実行されます。
図4:ランニングホイールケージアセンブリ 。 (A)固形物の表面/トレイに配置されたバイクコンピューターと磁気センサー。(B)ソリッドサーフェス/トレイとセンサーの上部に配置された倒立ホイールベース(上面図;ベースをケージの蓋に固定するためのセンサー表面/トレイの2つの穴に注意してください)、(C)ハードウェアが組み立てられた倒立ホイールベース(下図)。(D)ハードウェアが組み立てられた倒立ホイールベース(上面図)。(E)フルケージアセンブリ(上面図)。(F)フルケージアセンブリ(側面図)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4.トレーニングローディングプロトコルを行使する
- 座りがちな(SED)マウスを、ランニングを防ぐためにロックされたランニングホイールを含むケージに9週間個別に収容します。
注: 表 1 は、実験デザインで使用される LWR (PoWeR) および HLWR プロトコルのロード スケジュールを示しています。 - 必要に応じて、LWRおよびHLWRグループの負荷を減らして、マウスが9週間のプロトコル全体にわたって運動を継続できるようにします。
| 週 | ||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | ||
| 軽水処理 (n = 4) | 荷重(g) | 0.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 | 5.0 | 5.0 | 6.0 | 6.0 | 6.0 |
| %BM | -- | 8% | 11% | 15% | 19% | 19% | 23% | 23% | 23% | |
| HLWR (n =7) | 荷重(g) | 0.0 | 2.5 | 5.0 | 7.5 | 7.5 | 10.0 | 10.0 | 12.5 | 12.5 |
| %BM | -- | 10% | 19% | 28% | 28% | 38% | 38% | 48% | 48% | |
表 1.ロードされたホイールランニングプロトコル
5. その場 での筋機能検査、組織採取、および組織分析
- 9週間のトレーニング介入に続いて、吸入イソフルラン(4%誘導、2%維持)と酸素補給を使用してマウスを麻酔し、手順全体を通して適切な麻酔面モニタリングを確保します。
- 腓腹筋、足底筋、ヒラメ筋(GPS)複合体の その場 筋機能試験を行い、等尺性筋力28を試験する。1〜300 Hzの11の上昇周波数で27 Gの電極針で坐骨神経を直接刺激することにより、力-周波数曲線を確立し、破傷風収縮は約100〜150 Hzで発生します29。
- 筋機能検査の直後に、マウスを頸部脱臼 により 安楽死させ、心臓を摘出して安楽死を確認する。足底筋とヒラメ筋を慎重に切除し、湿った組織の塊を記録します。
- 各筋肉サンプルを包埋培地(OCT)でコーティングし、コルクに取り付けます。液体窒素冷却イソペンタンで凍結し、筋肉組織の切片(厚さ10 μm)でさらに免疫組織化学(IHC)分析が行われるまで-80°Cで保存します。
- ラミニンの免疫蛍光を使用して筋線維CSAを分析します。自動画像定量化プラットフォーム30を用いてファイバCSAを測定する。
6.統計分析
- すべてのデータをSD±平均値で表します。
- 有意性をp ≤ 0.05に設定した統計分析ソフトウェアを使用して統計分析を実行します。
- ホイール走行とトレーニング量のデータを、反復測定の双方向ANOVAと比較します。
- 体重、組織量、CSA、および筋肉機能を一元配置ANOVAと比較します。有意なF比が見つかった場合は、フィッシャーLSD事後分析を使用してグループ内差を比較します。
- 効果サイズを計算し、小、中、大の効果サイズに対してそれぞれ0.01、0.06、0.14と解釈します。
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Representative Results
この研究では、24匹のC57BL / 6マウス(この研究の開始時に6.3±0.7か月)を、座りがちな(SED)、ロードホイールランニング(LWR;Dunganら17で説明されているPoWeRと同じ)、または高LWR(HLWR)の3つの治療グループのいずれかにランダムに割り当て、その後、それぞれの9週間のプロトコルを完了しました。順応週(1週目)の後、ランニング距離またはトレーニング量にグループまたはグループxの時間差はありませんでした(図5)。
図5:LWR(緑で塗りつぶされた正方形)およびHLWR(赤で塗りつぶされた三角形)グループの走行ホイール特性。 (A)1日の平均走行距離(km)(B)毎日の走行距離(km /日)に毎日の車輪荷重(g)を掛けたもので表される平均トレーニング量(km/日∙g)。データは、グループ平均±SDとして表されます。 LWR、n = 4;HLWR, n = 7. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
正規化ヒラメ筋質量は、線維CSA(p = 0.536)に差がないにもかかわらず、HLWR群でSED群よりも21.4%大きかった(p < 0.001)(図6A)。足底筋量と平均線維CSAは統計的に有意な差を示さなかったが(それぞれp = 0.573およびp = 0.111)、HLWRの足底ではSEDおよびLWRと比較してCSAが大きい線維の割合に変化があるようである(図6B)。 in situ 筋機能テストによって測定された群間で、GPS複合体のけいれんまたはピーク力に有意差はありませんでした(表2)。
図6:繊維断面積の割合。 (A)SED(黒塗りの円)、LWR(緑で塗りつぶされた正方形)、およびHLWR(赤で塗りつぶされた三角形)グループの断面積によるヒラメ筋線維の割合(%)(n = 3-4 /グループ)。ヒラメ筋は、すべてのグループで同様の繊維CSA比率を含んでいます。HLWR群の足底筋は、SED群およびLWR群と比較して、CSAが大きい線維の割合が高いようです。データは、各ファイバーサイズカテゴリのグループ平均として表されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 群 | |||||
| セド | 軽水泰 | ティッカー | p値 | 効果サイズ (ƞ2) | |
| トレーニング前の体重(g) | 26.35 ± 2.12 | 3.42±28.07 | 25.71±2.22 | 0.299 | 0.324 |
| トレーニング後の体重(g) | 26.82 ± 1.96 | 28.91 ± 2.80 | 27.43 ± 2.07 | 0.251 | 0.341 |
| ヒラメ筋質量 (mg/g BM) | ±0.28± ±0.03 | 0.31±0.02 | 0.34 ± 0.03# | 0.003 | 0.611 |
| 足底質量 (mg/g BM) | ±0.61± ±0.06 | ±0.64± ±0.03 | ±0.63± ±0.06 | 0.573 | 0.239 |
| ソラメ筋CSA(マイクロm²) | 2042±320 | 1964 ± 357 | 1800 ± 206 | 0.536 | 0.130 |
| 足底CSA (μm²) | 2032 ± 159 | 2483±579 | 2754 ± 109 | 0.111 | 0.519 |
| けいれん力(N / g GPS) | 2.96±0.47 | 3.19 ± 0.58 | 3.42±0.78 | 0.254 | 0.340 |
| 最大破傷風力 (N/g GPS) | 11.43 ± 1.77 | 13.04 ± 2.87 | 13.13 ± 1.70 | 0.136 | 0.395 |
| # - は SED とは大きく異なることを示します。効果サイズ (ƞ2): 小 = 0.01;ミディアム = 0.06;大きい = 0.140 | |||||
表 2.動物特性、組織量、筋力、繊維断面積
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Discussion
げっ歯類の既存の抵抗運動モデルは、骨格筋の研究に非常に貴重であることが証明されています。ただし、これらのモデルの多くは、侵襲的、非自発的、および/または時間と労力がかかります。LWRは、他の広く受け入れられているレジスタンス運動トレーニングモデルで観察されたものと同様の筋肉適応を誘発するだけでなく、研究者による最小限の時間/労力のコミットメントで動物に慢性的で低ストレスの運動刺激を提供する優れたモデルです。さらに、LWRモデルは研究者からの直接介入を最小限に抑える必要があるため、マウスのコホート全体を短期または長期の介入研究のために同時に簡単に運動トレーニングできます。ただし、中程度の車輪荷重を加えると、マウスが長距離を走るのを阻止できない(抵抗が少なすぎる)か、負荷の付与方法が原因でマウスがほぼ完全に走行を中止します(抵抗が多すぎます)。Dungan et al. (2019)17 によって開発されたプログレッシブ加重ホイールランニング(PoWeR)LWRモデルは、線維肥大などの有意な筋肉適応をもたらすだけでなく、より酸化的な表現型への移行も促進します。真の「抵抗ベース」モデルとしてのPoWeRの制限は、抵抗刺激と持久力刺激の両方の組み合わせを提供するハイブリッドトレーニングレジメンをより反映して、より高いボリューム(距離)とより低い負荷(抵抗)刺激を引き出すことです。したがって、PoWeRモデルを変更して、外部負荷が加えられ、徐々に増加する抵抗バイアス刺激を提供し、マウスが走り続けることを可能にする新しい高負荷ホイールランニング(HLWR)モデルがマウス用に開発されましたが、以前に使用されていたよりもはるかに高い負荷で。私たちのモデルは、PoWeRモデルと同じ不均衡なホイール荷重の概念を利用しましたが、よりシンプルで安価なシステムを採用しました。マウスの「通常の」散発的な(オンとオフの)走行ホイールの動作に加えて、不均衡なホイール負荷により、マウスは中断された「スパート」で実行されます。これは、回転の前半にマウスが荷物を車輪の上部(重力に反対)に引き寄せる必要があり、回転の後半に荷重が重力で下部に向かって落下するため、「惰性」または「フリーホイール」にのみ引っ張る必要があるためです。
9週間のトレーニング後、HLWRマウスのヒラメ筋は筋肉量が21.4%増加したが、線維CSAに差はなかった。HLWRマウスの足底筋は筋肉量の有意な増加を示さなかったが、より大きなCSAを有する繊維の割合は増加したように見えた。KonhilasらとSoffeらは、低抵抗ホイールと高抵抗ホイール走行の間で筋肉成長に違いを観察しませんでした19,23;しかし、現在の研究では、ヒラメ筋の質量は、LWR群とHLWR群でそれぞれ~10%と~20%増加しました。新しいHLWRレジスタンストレーニングモデルに応答した筋肥大は、筋肉および繊維タイプ特異的である可能性があるようです。ただし、この概念を確認するには、さらに調査が必要です。in situ筋機能テストは、安楽死と組織収集の直前の9週間のプロトコルの終わりにマウスの右肢でのみ、単一の急性セッションとして実行されました。ここで報告された筋肉量(体重に正規化された湿潤量)は、右肢の筋肉の湿潤量を変える可能性のある外科的処置による著しい腫脹/浮腫があるため、マウスの左肢のみからのものである。
この新しいHLWRモデルの重要性は、マウスがホイールに比較的高い負荷が加えられた状態で走り続けることを実証することです。C57BL/6マウスの平均体重(%BM)に対する車輪荷重は、このプロジェクトで使用したマウスの平均体重(~26 g)に基づいています。マウスの平均体重は、系統、年齢、性別によって異なります。HLWRモデルの10-12.5 gの最大荷重(マウスの体重の~40%-50%に相当)は、PoWeRモデル(最大= 6 g)よりもかなり高く、車輪抵抗の約2倍です。統計的に有意ではありませんが、HLWRモデルの6週目以降にホイール荷重が7.5 gを超えて進行したため、走行距離が大幅に減少したようですが、LWRは9週間のプロトコルの残りの期間、一定の平均走行距離を維持しました。HLWRモデルにおける高い車輪荷重が走行距離を大幅に減衰させなかったことは、これらの発見の限界です。ただし、グループ内のランニングパフォーマンスのばらつきが非常に大きいため、コホートサイズが大きいほど緩和される可能性があります。
車輪の走行に順応してから最初の1週間以内に一貫して走るマウスの傾向を評価するのは難しい場合があります。一部のマウスは筋肉の適応を誘発するのに十分な走りをしないため、特定のマウスをホイールランニンググループに継続して含めるための最小閾値カットオフの実装が推奨されます。最小しきい値カットオフは、順応の最初の週に少なくとも1 km /日の平均走行距離である必要があります。マウスが最初の週に平均して少なくとも1 km /日走らなかった場合、マウスが9週間のプロトコルの残りの部分で走行距離を大幅に増加させて、適応が起こるための実質的な刺激を提供する可能性は低いです。この場合、特定のマウスが最初の順応週の後に1 km /日の最小しきい値を満たしていない場合は、ホイールをロックし、そのマウスを座りがちなグループに再割り当てします。この最小閾値カットオフを実装すると、ランニング統計のばらつきが減少し、マウスが9週間のプロトコルにわたって適切なトレーニング刺激を確実に獲得できるようになります。これは、動物研究の3つの「R」、特に削減の精神に基づいています。第二に、高い車輪荷重が加えられたときにマウスが特定の距離を走れなかった場合の緊急時対応計画を組み込むことが重要です。マウスが9週間のプロトコル全体で運動を継続できるようにするには、ランニング距離が3日連続で0.25 km /日を下回った場合、負荷を前週の負荷に減らす必要があります。この場合、特定のマウスが負荷を追加してから3日間連続して平均0.25km以上走行しない場合は、ホイール負荷を前の負荷に戻して、マウスが9週間のプロトコルの残りの期間トレーニングを継続できるようにする必要があります。この研究では、HLWRプロトコルで最も高い負荷(12.5 g)でも、ほとんどのマウスが0.25 km /日>距離を続けることができることが観察されました(図5A)。ただし、この緊急時対応計画は、HLWRグループの7匹のマウスのうち3匹に対して実施され、9週間のトレーニングプロトコル中のある時点で負荷を10gまたは7.5gに減らす必要がありました。プロトコルの大部分でマウスが正常に実行され、非常に高いホイール負荷で次の段階に到達できなかったため、研究から削除されるのは残念です。負荷をわずかに減らして継続的なランニングを確実にすることで、福祉を損なうことなく個々の動物を最大限に活用できます。最後に、マウスが身体活動の増加を補うのに十分な食物を消費していることを確認するために、毎日(または少なくとも毎週)の食物消費量を追跡することも重要です。これは、マウスが個別に収容されている場合、比較的簡単です。座りがちなマウスと比較して~20%の食物摂取量の増加を期待する31.
これらの結果(走行距離など)をPoWeRモデル用に最初に公開されたものと直接比較することは困難です。Dunganらは、1日あたり~10-12kmの走行距離を報告したが17、LWRプロトコルを実行した現在のプロトコルのマウスは1日あたり~5-6km走った。顕著な不一致は、現在のプロトコルで使用されている雄マウスに起因する可能性があり、Dunganらが使用した雌マウスと比較して、雌マウスは~20%-40%遠くまで走ることが観察されています10,32。さらに、Dunganらは、金属棒走行面を有する金属ホイールを使用しており、これは、現在のプロトコルで使用されているプラスチック製ランニングホイールと比較して、より良い走行性能をもたらす可能性がある。若いメスのC57BL / 6マウスは、同じプラスチック製のランニングホイールセットアップで平均8〜10 km /日で走ったことが以前に報告されています33。したがって、ひずみ、性別、ホイールタイプ、個人差などの要因によるマウスの走行性能を判断するために、個々の実験室設定に対してパイロットテストを実施することを強くお勧めします。
ここで説明する高負荷抵抗ホイール走行モデルの主な利点は、高価な特殊機器を必要とする他のモデルよりもはるかに費用対効果が高いことです。このランニングホイールのセットアップのための機器は、商業ベンダーから入手可能な特殊なランニングホイール装置のほんの一部しかかかりません。最後に、ロードされたホイールランニングモデルは、動物研究の改良の3つの「R」のうちのもう1つを満たします。ホイールランニングは完全に自発的な刺激であるため、これらのモデルは非侵襲的であり、他の肥大モデル、特に相乗的アブレーションまたは数日または数週間のオペラント条件付けを必要とする他のモデルと比較して、マウスにとってストレスが大幅に少なくなります。今後の研究では、HLWRモデルがLWRモデルの混合持久力/抵抗刺激と比較してより大きな肥大刺激を提供することが確認されるはずです。結論として、正しく実行された場合、この新しい進歩的で高負荷抵抗の車輪走行モデルの潜在的な適用は、マウスに対する単純でありながら安価で、高スループットで、低ストレス耐性の運動介入です。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
このプロジェクトを支援するための資金を提供してくれたアパラチア州立大学の大学院生自治会、学生研究局、および健康運動科学部に感謝します。さらに、動物研究施設の日常業務を監督してくれたモニーク・エッカードとセリン・ウィリアムズ・フレイに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 g disc neodymium magnets | Applied Magnets | ND018-6 | Used for all sensor magnets and 1 g increments of wheel loading |
| 2.5 g disc neodymium magnets | Applied Magnets | ND022 | Used for 2.5 g increments of wheel loading |
| 8-32 x 1" stainless steel screws | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B07939RS23/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 | |
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| 10 µL pipette tip box (empty) | Thermo Scientific | 2140 | We used empty ART Pipette tip boxes, but any similar sized boxes/trays would suffice |
| Extreme Liquid Glue | Loctite | ||
| Laminin primary antibody | Novus Biologicals | NB300-144AF647 | primary antibody conjugated with AF657; 1:200 in PBS containing 10% normal goat serum |
| Lithium 3 V battery | n/a | CR2032 | |
| M10 (3/16" x 1 1/4") stainless steel fender washers | Amazon | https://www.amazon.com/gp/product/B00OHUHEU8/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&th=1 | |
| MyoVision: Automated Image Quantification Platform | Wen et al. (2017) | v1.0 | https://www.uky.edu/chs/center-for-muscle-biology/myovision |
| Polycarbonate rodent cage (430 mm L x 290 mm W x 201 mm H), with narrow width stainless steel wired bar lid | Orchid Scientific | Polycarbonate Rat Cage Type II | https://orchidscientific.com/product/rat-cage/ - 1519974600758-c29bc1c5-6dfa |
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