Summary
الأنابيب النانوية النفقية (TNTs) هي في المقام الأول أنابيب نانوية ذات غشاء F-actin مفتوحة النهاية تربط الخلايا المجاورة ، مما يسهل الاتصال بين الخلايا. السمة البارزة التي تميز TNTs عن نتوءات الخلايا الأخرى هي الطبيعة التي تحوم للأنابيب النانوية بين الخلايا. هنا ، نقوم بتمييز TNTs من خلال إنشاء عرض حجم 3D لصور z-stack متحدة البؤر.
Abstract
كشفت الاكتشافات الحديثة أن الخلايا تقوم بنقل مباشر وطويل المدى بين الخلايا عبر قنوات غشاء الأكتين على نطاق النانو ، وهي "الأنابيب النانوية النفقية" (TNTs). تعرف TNTs بأنها امتدادات غشائية مفتوحة وثنائية الطبقة دهنية تتوسط في الاستمرارية بين الخلايا المجاورة بأقطار تتراوح بين 50 نانومتر و 1 ميكرومتر. تم إثبات TNTs في البداية في الخلايا العصبية ، لكن الدراسات المتتالية كشفت عن وجود TNTs في العديد من أنواع الخلايا والأمراض ، مثل الأمراض التنكسية العصبية والالتهابات الفيروسية والسرطان. أشارت العديد من الدراسات إلى الهياكل النانوية الغشائية المغلقة والمقترنة كهربائيا بين الخلايا المجاورة على أنها TNTs أو هياكل تشبه TNT.
إن توضيح البنية التحتية من حيث استمرارية الغشاء عند نقطة النهاية يمثل تحديا تقنيا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الدراسات حول الاتصال بين الخلية والخلية تمثل تحديا من حيث توصيف TNTs باستخدام الطرق التقليدية بسبب عدم وجود علامات محددة. يتم تعريف TNTs في المقام الأول على أنها نتوءات غشائية مفتوحة النهاية قائمة على F-actin. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية هو أن F-actin موجود في جميع أنواع النتوءات ، مما يجعل من الصعب التمييز بين TNTs والنتوءات الأخرى. واحدة من الخصائص البارزة ل TNTs القائمة على F-actin هي أن هذه الهياكل تحوم بين خليتين دون لمس الطبقة التحتية. لذلك ، يمكن تمييز TNTs المميزة الملطخة ب F-actin بسهولة عن النتوءات الأخرى مثل filopodia والخلايا العصبية بناء على تحليقها بين الخلايا.
لقد أظهرنا مؤخرا أن استيعاب الأميلويد قليل القسيمات β 1-42 (oAβ) عبر الإندوثرويد المعتمد على الأكتين يحفز كيناز -1 المنشط p21 (PAK1) ، والذي يتوسط في تكوين TNTs المحتوية على F-actin المعبر عنها مع phospho-PAK1 بين الخلايا العصبيةSH-SY5Y. يحدد هذا البروتوكول طريقة تحليل حجم 3D لتحديد وتوصيف TNTs من صور z-stack الملتقطة لنتوءات الغشاء المناعي F-actin- و phospho-PAK1 في الخلايا العصبية المعالجة ب oAβ. علاوة على ذلك ، تتميز TNTs عن تطوير الخلايا العصبية والنواتج العصبية القائمة على قنوات الغشاء الملطخ بالمناعة من الفوبولين F-actin و β-III.
Introduction
الأنابيب النانوية النفقية (TNTs) هي قنوات غشائية مفتوحة تعتمد على F-actin وتلعب دورا حيويا في النقل بين الخلايا للبضائع والعضيات1. السمة الفريدة ل TNTs هي أنها تربط الخلايا المجاورة دون أي اتصال مع الطبقة التحتية. يزيد طولها عن 10-300 ميكرومتر وتتراوح أقطارها بين 50 نانومتر إلى 1 ميكرومتر 2,3. TNTs هي هياكل عابرة ، ويستمر عمرها ما بين بضع دقائق إلى عدة ساعات. تم عرض TNTs لأول مرة في الخلايا العصبية PC121 ؛ في وقت لاحق ، أظهرت العديد من الدراسات وجودها في عدة أنواع من الخلايا في المختبر وفي الجسم الحي 4,5. كشفت العديد من الدراسات عن الأهمية المرضية ل TNTs في نماذج الأمراض المختلفة ، مثل الأمراض التنكسية العصبية والسرطان والالتهابات الفيروسية6،7،8.
تم إثبات عدم التجانس الهيكلي ل TNTs من خلال العديد من الدراسات في الأنظمة الخلوية المختلفة9. وتستند الاختلافات على تكوين الهيكل الخلوي ، وآلية التكوين ، وأنواع البضائع المنقولة10. في المقام الأول ، تعتبر استمرارية الغشاء المفتوح الموجب للأكتين F التي تحوم بين خليتين متجاورتين وتنقل العضيات تتكون من TNTs11. ومع ذلك ، فإن عدم الوضوح أو التنوع الذي لوحظ في تكوين TNTs يضيف إلى صعوبة تطوير علامات خاصة بمادة TNT. وبالتالي ، من الصعب تحديد هياكل TNT بطرق الكشف التقليدية والتمييز بين الأنابيب النانوية الغشائية من حيث النتوءات المفتوحة والمغلقة12. ومع ذلك ، فإن خاصية TNTs التي تحوم كنتوءات غشاء F-actin بين خليتين أسهل نسبيا وأكثر جدوى في التعرف عليها باستخدام تقنيات التصوير التقليدية. لا يمكن للنتوءات الخلوية الأخرى القائمة على الأكتين مثل الفيلوبوديا والفيلوبوديا الظهرية أن تحوم بين خليتين بعيدتين ، خاصة عندما تكون الخلايا ثابتة. وتجدر الإشارة إلى أن الخلايا العصبية النامية ذات النهاية المغلقة والمقترنة كهربائيا غالبا ما تسمى الهياكل الشبيهة بمادة تي إن تي13.
من المعروف أن F-actin يلعب دورا مهما في تكوين مادة TNT ، وقد أظهرت العديد من الدراسات أن مثبط F-actin cytochalasin D يمنع تكوين TNTs14,15. في المقابل ، مثبطات الأنابيب الدقيقة ليس لها أي تأثير على تكوين مادة تي إن تي16. شهدت العقود الماضية 2 العديد من التقارير حول الدور الهام الذي تلعبه TNTs في انتشار علم الأمراض ومقاومة الورم والعلاج17. لذلك ، هناك طلب لا ينتهي على تقنيات أفضل لتوصيف مادة تي إن تي.
إن عدم وجود علامات محددة ل TNTs والتنوع في التشكل والتكوين الخلوي الهيكلي يجعل من الصعب تطوير طريقة فريدة للتوصيف. استخدمت بعض الدراسات الكشف الآلي عن الصور وتقنيات القياس الكمي TNT18,19. ومع ذلك ، هناك العديد من المزايا لطريقة التحليل اليدوي لحجم 3D الحالية على تحليل الصور التلقائي للكشف عن مادة تي إن تي وقياسها. في كثير من الأحيان ، يمكن للعيون البشرية المدربة اكتشاف هذه الهياكل النانوية التي تحوم بسهولة أكبر من طريقة الكشف الآلي عن الصور. علاوة على ذلك ، قد يكون من الصعب تنفيذ طرق الكشف التلقائي في المختبرات التي تفتقر إلى خبرة الخوارزميات. يمكن اعتماد الطريقة الحالية على نطاق واسع من قبل الباحثين بسبب دقتها وقابليتها للتكاثر.
في دراسة حديثة ، أظهرنا أن oAβ يعزز التكوين الحيوي ل TNTs في الخلايا العصبية عبر آلية التداخل الخلوي بوساطة PAK1 ، المعتمدة على الأكتين ،12. oتعبر TNTs المستحثة ب Aβ أيضا عن PAK1 المنشط (أو phospho-PAK1). قمنا بتطوير طريقة إعادة بناء صورة عرض حجم 3D للتمييز بين مادة TNTs الملطخة بالمناعة من oAβ و F-actin و phospho-PAK1. غالبا ما تشبه الخلايا العصبية النامية الإيجابية للتوبولين β-III هياكل تحوم تشبه مادة تي إن تي20. ومن ثم ، قمنا بتمييز TNTs القائمة على F-actin عن الخلايا العصبية الإيجابية للتوبولين β-III وغيرها من النتوءات الشبيهة بمادة TNT. تم استخدام صور عرض حجم 3D لتحديد TNTs على أساس خصائصها في التحليق فوق الطبقة التحتية والبقاء على اتصال بين خليتين متجاورتين. يصف هذا البحث تحديد واكتشاف القنوات الغشائية المحتوية على الأكتين أو TNTs باستخدام صور z-stack متحدة البؤر ، وأخيرا ، القياس الكمي اليدوي للهياكل المحددة من صور إعادة بناء عرض حجم 3D. لا يمكن للطريقة المقدمة التمييز بين TNTs الصحيحة المفتوحة النهاية والهياكل الشبيهة بمادة TNT المغلقة. تساعد هذه الطريقة في تحديد TNTs في ثقافة الخلايا 2D في المختبر على طبقة تحتية مسطحة. ومع ذلك ، فإن الطريقة سهلة التنفيذ والتكاثر ويمكن استخدامها على نطاق واسع للقياس الكمي الدقيق ل TNTs القائمة على الأكتين فقط ولتمييزها عن الخلايا العصبية والهياكل الشبيهة بمادة TNT الإيجابية β tubulin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم تمييز خلايا SH-SY5Y المستزرعة في وسائط DMEM / F-12 بحمض الريتينويك 10 ميكرومتر لمدة 7 أيام وعولجت ب 1 ميكرومتر oAβ oligomers لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية (5٪ CO2). بعد العلاج ، تم تثبيت الخلايا بمحلول Karnovsky المثبت وملطخة بالمناعة المزدوجة بجسم مضاد phospho-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) و fhalloidin المرتبط ب F-actin. في وقت لاحق ، تم التقاط صور z-stack متحدة البؤر باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر. تم قياس TNTs عن طريق العد اليدوي وتمييزها عن نتوءات الخلايا العصبية / الخلايا الأخرى من خلال بناء صور عرض حجم 3D وتحديد الهياكل من خصائصها المتمثلة في التحليق بين خليتين دون لمس الطبقة التحتية (الشكل 1).
1. زراعة الخلايا والتمايز
- قم بزراعة الخلايا العصبية SH-SY5Y في وسائط DMEM / F12 (Ham's) 1: 1 مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ خليط بنسلين - ستربتومايسين - نيومايسين (PSN). بذر الخلايا في طبق تصوير 35 مم مع بئر 14 مم مكون من غطاء # 1.5 في وسط الطبق المتصل بالأسفل. بذر الخلايا على طبق التصوير بتركيز 12000 خلية / سم2 وإجراء التجارب عند التقاء 60٪ -70٪.
- التفريق جزئيا بين الخلايا التي تحتوي على حمض الريتينويك 10 ميكرومتر (RA) من محلول مخزون 100 مللي متر (5 ملغ من RA في 15 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO]). بعد ذلك ، احتضان الخلايا لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية (5٪ CO2) للتمايز مع تغيير الوسائط كل يومين.
ملاحظة: كن حذرا بشأن الحفاظ على التقاء (60٪ -70٪) من الخلايا (كل من الخلايا غير المتمايزة والمتمايزة جزئيا). يمكن أن تؤثر كثافة الخلايا على تكوين مادة تي إن تي بين الخلايا.
2. تحضير أوليغومرات الأميلويد β1-42 (oAβ) لعلاج الخلايا العصبية
- قم بإذابة Aβ 1-42 (1 مجم) في 200 ميكرولتر من 1،1،1،3،3،3-سداسي فلورو -2-بروبانول وقسم المحلول إلى 20 قلمة ، يحتوي كل منها على 0.05 مجم من الببتيدات. تجفيف وتخزين القسمة عند -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
- تحضير محلول المخزون (5 mM) من Aβ 1-42 المجفف بالتجميد في DMSO بإضافة 2.2 ميكرولتر من DMSO إلى 0.05 مجم من الببتيد المجفف بالتجميد. لإذابة الببتيدات بعناية ، دوامة الحل و sonicate لمدة 2 دقيقة في سونيكاتور حمام مائي.
- قم بتخفيف محلول المخزون إلى تركيز 100 ميكرومتر في DMEM ، ودرجة الحموضة 7.4 ، والدوامة لتحويل الببتيدات إلى مونومرات ، تليها الحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة للحصول على oligomers من Aβ 1-42 (oAβ) 12،21،22.
- قم بتوصيف oAβ قبل التجارب كما ورد سابقا21,22 عن طريق التصوير المجهري الإلكتروني النافذ.
- عالج خلايا SH-SY5Y المتمايزة جزئيا ب 1 ميكرومتر oAβ. قم بإزالة الوسط قبل العلاجات ، وأضف DMEM طازجا خاليا من FBS. بعد التغيير المتوسط ، أضف oAβ (100 ميكرومتر) المعد مسبقا إلى الوسط إلى تركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر. احتضان الخلايا مع 1 ميكرومتر oAβ لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية (5٪ CO2). تضمين عنصر تحكم سلبي في شكل خلايا غير معالجة.
3. التلوين المناعي ل F-actin و PAK1 المنشط لتوصيف TNTs
- قم بإجراء تلطيخ مناعي تفاضلي باستخدام الجسم المضاد phospho-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) وفالوتوكسين فالويدين المرتبط ب F-actin.
- اغسل الخلايا الضابطة والخلايا المعالجة بمحلول ملحي 1x مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة 2 × 2 دقيقة قبل التثبيت. تحضير محلول كارنوفسكي المثبت باستخدام 2 ٪ مثبت الفورمالين و 2.5 ٪ الجلوتارالدهيد المذاب في 0.1 M عازلة الفوسفات ، درجة الحموضة 7.2. بعد ذلك ، قم بإصلاح الخلايا في طبق التصوير عن طريق إضافة محلول Karnovsky المثبت (يكفي فقط لتغطية الخلايا) لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الخلايا الثابتة 2 × 2 دقيقة باستخدام مخزن الحضانة. تحضير المخزن المؤقت الحضانة (20x) عن طريق إذابة 0.1 غرام من الصابونين في 5 مل من FBS وتخفيفه إلى 1x بإضافة 95 مل من 1x PBS.
- بعد التثبيت ، أضف أول جسم مضاد ضد phopho-PAK1 بتخفيف 1: 250 في مخزن الحضانة واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية في غرفة رطبة مظلمة.
- في اليوم التالي ، بعد 24 ساعة من الحضانة ، اغسل الخلايا 2 × 2 دقيقة مع المخزن المؤقت للحضانة ؛ بعد ذلك ، أضف الجسم المضاد الثانوي المترافق إلى Alexa Fluor 488 (1: 1,000 تخفيف) و Phalloidin 555 (1: 1,000 تخفيف). احتضان الخلايا في الغرفة الرطبة المظلمة لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- بعد الحضانة ، اغسل الخلايا 2 × 2 دقيقة مع المخزن المؤقت للحضانة. قم بتلطيخ النواة بإضافة 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) في تخفيف 1: 2,000 واحتضانها لمدة 5 دقائق إلى 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- تحضير وسط تركيب دابكو باستخدام 25 ملغ من دابكو في 90٪ جلسرين و 10٪ 1x PBS. للذوبان بشكل صحيح ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 8.6 باستخدام الدرجة الطيفية ، وقم بتخفيف حمض الهيدروكلوريك (المخفف 1:20 بالماء) واحتفظ بالمحلول على هزاز للخلط.
- كعامل مضاد للتبييض، أضف وسيط تركيب دابكو مباشرة إلى طبق التصوير الذي يحتوي على غطاء الغطاء في الأسفل. انتظر لمدة 1-2 ساعة على الأقل وتابع مباشرة لإجراء التصوير البؤري.
ملاحظة: لا يلزم وجود مواد لاصقة لإصلاح أغطية الغطاء.
4. التلوين المناعي ل F-actin و β-III tubulin لتمييز TNTs عن الخلايا العصبية
- إجراء تلطيخ مناعي تفاضلي باستخدام الجسم المضاد للتوبولين β-III و Phallotoxin phalloidin المرتبط ب F-actin.
- اغسل الخلايا المعالجة ب oAβ 2x مع 1x PBS قبل إضافة محلول Karnovsky المثبت. احتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وغسل الخلايا 2 × 2 دقيقة مع عازلة الحضانة.
- بعد التثبيت ، أضف الجسم المضاد ضد توبولين β-III (TUBb3) بتخفيف 1: 250 في مخزن الحضانة واحتضانه عند 4 درجات مئوية طوال الليل في الغرفة الرطبة المظلمة.
- في اليوم التالي ، اغسل الخلايا بمخزن مؤقت للحضانة (2 × 2 دقيقة) ، وأضف جسما مضادا ثانويا مقترنا إلى Alexa Fluor 488 (1: 1000 تخفيف) و Phalloidin 555 (1: 1000 تخفيف) معا إلى نفس الطبق. ثم ، احتضان الخلايا لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الغرفة الرطبة المظلمة.
- اغسل الخلايا 2x مع مخزن الحضانة ، وأضف DAPI الملطخ النووي بتخفيف 1: 2000 لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- أضف عامل مضاد للتبييض DABCO في وسط التركيب كما هو مذكور أعلاه وانتظر لمدة 2 ساعة قبل التصوير.
5. التصوير باستخدام المجهر متحد البؤر
- لتحديد TNTs ، التقط صور z-stack للخلايا المناعية باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر. التقط الصور باستخدام هدف 40x / 1.40 Oil DIC مع مجموعات مرشح DAPI و fluorescein isothiocyanate (FITC) و tetramethylrhodamine (TRITC).
- أولا ، حدد القنوات بالنقر فوق أشعة الليزر المطلوبة بالتتابع في النوافذ المسار 1 والمسار 2 والمسار 3 في برنامج متحد البؤر. انقر فوق الخيار T-PMT أسفل نافذة المسار 1 لالتقاط صور تباين التداخل التفاضلي (DIC) مع قنوات مضان.
ملاحظة: يتم التقاط صور DIC بواسطة كاشف مختلف يسمى T-PMT. - حدد علامة تبويب الاستحواذ الخاصة بالبرنامج ، وانقر فوق علامة التبويب Z-stack ، وانتظر حتى تفتح نافذة. ثم ، انقر فوق المسح المباشر لتركيز الخلايا في أسفل الطبق. حدد تلك الصورة المركزة كأول مكدس. بعد ذلك ، ركز لأعلى لرؤية الجزء العلوي من الخلية وحدده كآخر مكدس. أوقف المسح المباشر وانقر فوق الرقم الموجود بجوار علامة التبويب المثلى لإصلاح حجم خطوة المكدسات. يحدد حجم الخطوة عدد الشرائح والفواصل الزمنية بناء على سمك الخلايا.
ملاحظة: سيتم تحديد حجم الخطوة بناء على أخذ عينات Nyquist لأخذ شرائح كافية والتأكد من عدم وجود فجوات بين الأكوام. يتم تحديد أخذ عينات Nyquist على أساس الهدف والأطوال الموجية للأضواء23. - التقط صورا متسلسلة لثلاث قنوات من DAPI و FETC و TRITC بليزر 405 نانومتر و 488 نانومتر و 561 نانومتر والتقطها بوقت سكون بكسل يبلغ 1.02 ميكرو ثانية. التقط الصور في قناة DIC باستخدام قنوات مضان لمراقبة حدود الخلية.
- التقط مجموعة من الصور بأبعاد x: 224.92 ميكرومتر و y: 224.92 ميكرومتر ، مع كل بكسل بحجم 220 نانومتر 2 وقياس z 415 نانومتر.
- التقط صورا تلتقط عدة مكدسات z (15-22 مكدسا) من أسفل الخلايا إلى أعلىها. احصل على 10 صور على الأقل من الحقل العشوائي لطبق الثقافة للحصول على إجمالي ~ 200-300 خلية.
- تحليل الصور الملتقطة في وضع عدم الاتصال لتحديد TNTs بواسطة تحليل عرض حجم 3D
6. تحليل صور z-stack متحدة البؤر لتحديد وقياس TNTs
- افتح الصور البؤرية المحفوظة بتنسيق بيانات .czi في برنامج فيجي للتحليل.
- حدد خيار Hyperstack لرؤية كل مكدس z وقناة الصورة. ابحث عن المكدسات الفائقة لمكدسات وقنوات z ، والتي تفتح في نافذة واحدة كما هو موضح في الشكل 2. قم بتمرير القناة (المشار إليها بالأسهم الحمراء والخضراء) وأشرطة تمرير z-stack (المشار إليها بالأسهم الزرقاء) لتحديد المكدس الدقيق لقناة معينة ذات أهمية.
ملاحظة: في الخلايا الثابتة ، حيث تبقى TNTs أو قنوات الغشاء التي تحوم فوق السطح ، فإن الهياكل غير مرئية في الأجزاء السفلية من مداخن z. ومع ذلك ، في الخلايا الثابتة ، تقع الخلايا العصبية على السطح ويمكن اكتشافها في الأجزاء السفلية من مداخن z (z = 0 إلى 2). انظر الشكل 2 للاطلاع على خطوات تحديد الهوية. - كما هو موضح في الشكل 2 ، حدد القناة الملطخة ب F-actin (المشار إليها بالأسهم الحمراء) أولا عن طريق تمرير شريط القناة. بعد ذلك ، قم بالتمرير يدويا مكدسات z (المشار إليها بالأسهم الزرقاء) لرؤية كل مكدس واحدا تلو الآخر. حدد الهياكل الملطخة ب F-actin التي يبدو أنها تربط الخلايا ، وتكون مرئية في الأجزاء السفلية من مداخن z ، وتكون قريبة من سطح طبق التصوير (z = 2) كخلايا عصبية (يشار إليها بأسهم بيضاء).
ملاحظة: من السهل التعرف على غالبية الخلايا العصبية لأنها تظهر على شكل نتوءات ممتدة (يشار إليها بأسهم وردية). - حدد TNTs ، القنوات الإيجابية ل F-actin ، التي تحوم من خلية إلى خلية ، عن طريق تمرير مداخن z نحو الأعلى (من z = 4 في الشكل 2 ؛ يشار إليها بالأسهم الصفراء). ابحث عن الخلايا العصبية بالقرب من الأجزاء السفلية من مداخن z باتجاه السطح ولاحظ أنها تبدأ في الاختفاء مع تمرير مداخن z نحو الأعلى (عند z = 6 في الشكل 2 ؛ الخلايا العصبية غير مرئية بوضوح).
- حدد TNTs إيجابية الفوسفو-PAK1 بشكل مشابه ل TNTs إيجابية F-actin من خلال تحليل طبيعة التحليق للقنوات من مداخن z. نظرا لأن تلطيخ phospho-PAK1 أضعف من تلطيخ F-actin ، فابحث عن TNTs الملطخة ب phopho-PAK1 عند z = 4 (مرئي بشكل خافت) وعند z = 6 (بارز).
- علاوة على ذلك ، راقب صور DIC للتحقق من أن هياكل TNT الملطخة ب F-actin و phospho-PAK1 هي قنوات غشائية بين الخلايا (الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك ، قم بدمج قنوات F-actin (الحمراء) و phospho-PAK1 (الخضراء) للتحقق من أن TNTs المحددة هي هياكل F-actin و phospho-PAK1 ذات صبغة مشتركة (الشكل 3).
- لتحديد كمية TNTs ، قم بحساب إجمالي أرقام الخلايا و TNTs المحددة يدويا وتمثيل الأرقام كنسب مئوية.
- للتمييز بين قنوات TNTs إيجابية F-actin وقنوات تحوم إيجابية β-III tubulin (TUBb3) تشبه TNT من صور z-stack ، قم بدمج قنوات F-actin (الحمراء) و TUBb3 (الخضراء) (الشكل 4). بعد ذلك ، قم بتحليل مكدسات z للصور المدمجة.
- ابحث عن TNTs الملطخة ب F-actin حصريا والتي تكون مرئية بشكل خافت عند z = 3 وبارزة عند z = 6 و z = 9 (الأسهم الصفراء). وبالمثل ، حدد قنوات F-actin و β-III tubulin (TUBb3) المزدوجة الإيجابية التي تشبه TNT عند z = 6 و z = 9 (الأسهم السماوية). حدد نتوءات F-actin- و β-III الأخرى الملطخة بالتوبولين وغير المحمرة من الأجزاء السفلية من مداخن z (الأسهم البيضاء).
- قم بقياس قطر TNTs باستخدام أداة الخط في فيجي. تحقق من مقياس القياس بالنقر على تحليل | اضبط Scale بحيث يتم تعيين "المسافة بالبكسل" تلقائيا من صور .czi. قم بقياس أقطار TNTs عند المستوى xy.
ملاحظة: معظم الأقطار بين 1 بكسل و 4 بكسل (أي 220-880 نانومتر) ؛ كل بكسل هو 220 نانومتر. انظر الشكل 5 للحصول على ملخص لبروتوكول تحليل الصور متحدة البؤر z-stack.
7.3D إعادة بناء صور z-stack لتوصيف TNTs
- استخدم المكون الإضافي لعارض الحجم في فيجي ، والذي يسمح بإعادة التقطيع ثلاثي الأبعاد والتصور ثلاثي الأبعاد الممكن للعتبة (الشكل 6).
- قسم صور z-stack إلى قنوات فردية. بعد ذلك ، قم بقص صور z-stack أحادية القناة (قناة F-actin) لاستخدام عرض إعادة البناء 3D لتمييز واحد أو اثنين من TNTs أو الخلايا العصبية في وقت واحد. قم بتمكين المكون الإضافي لعرض وحدة التخزين لتصور طرق العرض xy و yz و xz.
- قم بتثبيت مادة تي إن تي واحدة أو عصبية في المستوى xy (تمثل الأسهم البيضاء الخلايا العصبية في الشكل 6 أ ؛ تمثل الأسهم الصفراء TNTs في الشكل 6 ب) وعلامة xz (أحمر) و yz (أخضر) المقاطع العرضية للمحور. لاحظ الخلايا العصبية في الجزء السفلي من المستوى xz في المستويين xz و yz (الأسهم البيضاء ، الشكل 6A) و TNTs في مداخن z العلوية (الأسهم الصفراء ، الشكل 6B).
- حدد TNT الفردي أو neurite لإعادة بناء عرض وحدة التخزين 3D في المستوى xz (الشكل 6C ، D). في إعادة البناء ثلاثية الأبعاد ، لاحظ الخلايا العصبية في الجزء السفلي من المستوى z (الأسهم البيضاء ، الشكل 6C) و TNTs التي تظهر كهياكل تحوم تربط خليتين دون لمس المستوى z السفلي (الأسهم الصفراء ، الشكل 6D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا ، نحدد ونوصيف TNTs التي يسببها oAβ في الخلايا العصبية SH-SY5Y من خلال إنشاء طرق عرض حجم 3D من صور z-stack متحدة البؤر (الشكل 1). كانت الخلايا ملطخة بمناعة مزدوجة مع F-actin و phospho-PAK1. تم تحليل صور z-stack متحدة البؤر للخلايا المناعية لتحديد TNTs (الشكل 2). علاوة على ذلك ، تم تحليل صور DIC للتحقق من أن هياكل TNT الملطخة ب F-actin و phospho-PAK1 كانت قنوات غشائية بين الخلايا (الشكل 3). علاوة على ذلك ، كانت الخلايا ملطخة بمناعة مزدوجة مع F-actin و β-III tubulin (الشكل 4). تم تمييز قنوات الغشاء المزدوجة الإيجابية F-actin الشبيهة بمادة TNT و β-III tubulin عن TNTs الإيجابية F-actin فقط (الشكل 4). تم تمييز TNTs المعبر عنها مع phospho-PAK1 (أو PAK1 المنشط) و F-actin عن نتوءات عصبية / خلية أخرى من خلال إنشاء صور عرض حجم 3D بناء على خصائصها المتمثلة في التحليق بين خليتين دون لمس الطبقة التحتية (الشكل 6). تم رصد TNTs المحددة يدويا ، وتم حساب النسبة المئوية ل TNTs بدقة من صور عرض حجم 3D. كما تم تحديد قطر وطول المواد الثلاثية الأبعاد من خلال تحليل المواد الثلاثية التي تم تحديدها بشكل فردي.
الشكل 1: رسم تخطيطي يمثل ملخص البروتوكول لطريقة الكشف عن TNTs. شريط المقياس = 100 ميكرومتر للصور المجهرية (أعلى) ؛ 10 ميكرومتر (مشاهدات حجم 3D). الاختصارات: oAβ = أميلويد قليل القسيمات -β1-42 ؛ PAK1 = كيناز المنشط p21 -1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تحليل صور مكدس z متحد البؤر لتحديد وقياس TNTs. تم تحليل صور z-stack متحدة البؤر في برنامج فيجي. تم فتح مكدسات فائقة من مكدسات z والقنوات في نافذة واحدة تعرض (A) F-actin و (B) phospho-PAK1. من خلال تمرير القناة (المشار إليها بالأسهم الحمراء والخضراء) وأشرطة التمرير z-stack (المشار إليها بالأسهم الزرقاء) ، تم تحليل الأكوام الفردية لقناة معينة ذات أهمية. (أ) تم تحديد الهياكل الملطخة ب F-actin التي تربط الخلايا ، والتي تظهر في الأجزاء السفلية من مداخن z ، وتعتبر قريبة من سطح طبق الصورة (z = 2) على أنها عصبية (يشار إليها بأسهم بيضاء). في المقابل ، تم تحديد القنوات المتصلة بالخلايا التي تحوم في الأجزاء الأعلى من مداخن z على أنها TNTs (يشار إليها بالأسهم الصفراء). (ب) وبالمثل ، تم تحديد الخلايا العصبية الملطخة بالفوسفو-PAK1 و TNTs. يشار إلى نتوءات قصيرة إيجابية F-actin أخرى غير متصلة بالخلايا المجاورة بواسطة أسهم وردية. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: TNT = الأنابيب النانوية النفقية ؛ PAK1 = كيناز المنشط p21 -1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تحليل صور DIC لتأكيد TNTs. (أ) لوحظت صور DIC للتحقق من أن TNTs الملطخة ب F-actin و phospho-PAK1 والنتوءات العصبية كانت بالفعل قنوات غشائية. (ب) بالإضافة إلى ذلك ، تم دمج قنوات F-actin (الحمراء) و phospho-PAK1 (الخضراء) للتحقق من أن TNTs المحددة التي يسببها oAβ كانت هياكل ملطخة ب F-actin و phospho-PAK1. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: TNT = الأنابيب النانوية النفقية ؛ DIC = تباين التداخل التفاضلي ؛ PAK1 = كيناز المنشط p21 -1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: صور مكدس z متحد البؤر تم تحليلها باستخدام برنامج فيجي لتمييز TNTs الملطخة ب F-actin فقط من أنابيب التوبولين β-III وقنوات التحليق المزدوجة الملطخة ب F-actin والتي تشبه مادة TNT. أولا ، تم دمج قنوات F-actin (الحمراء) و TUBb3 (الخضراء) للمداخن الفائقة. بعد ذلك ، تم فتح الصور المدمجة في نافذة واحدة. من خلال التمرير على أشرطة التمرير z-stack ، تم تحديد TNTs الملطخة ب F-actin حصريا ؛ كانت هذه مرئية بشكل خافت عند z = 3 وبارزة عند z = 6 و z = 9 (الأسهم الصفراء ، B). وبالمثل ، كان من الممكن اكتشاف قنوات التحليق F-actin و TUBb3 المزدوجة الإيجابية التي تشبه TNT عند z = 6 و z = 9 (الأسهم السماوية ، A). تم تحديد نتوءات أخرى ملطخة بالأنبوبين F-actin و β-III ، لا تحوم من الأجزاء السفلية من مداخن z (الأسهم البيضاء). قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: TNTs = الأنابيب النانوية النفقية ؛ TUBb3 = توبولين β-III. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: ملخص تخطيطي يمثل البروتوكول التفصيلي لتحليل الصور متحدة البؤر z-stack. اختصار: TNTs = أنابيب نانوية نفقية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: عرض إعادة البناء ثلاثي الأبعاد لتسليط الضوء على واحد أو اثنين من TNTs أو الخلايا العصبية في وقت واحد. يتم استخدام المكون الإضافي "عرض الحجم" في فيجي لتصور طرق العرض xy و yz و xz. تظهر إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد الخلايا العصبية في الجزء السفلي من المستوى z (الأسهم البيضاء في الألواح A و C) ، بينما تظهر TNTs كهياكل تحوم تربط خليتين دون لمس المستوى z السفلي (السهم الأصفر في الألواح B و D). قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. اختصار: TNTs = أنابيب نانوية نفقية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يحاول العديد من الباحثين في العقدين الماضيين فهم وتوصيف بنية TNTs18. إن عدم وجود علامات محددة يعيق التقدم ، وهناك طلب متزايد على طريقة ملائمة وموحدة يمكن استخدامها لتحديد وتوصيف وقياس TNTs. تعرف TNTs بأنها قنوات غشائية قائمة على F-actin تحوم بين خليتين. أظهرت الدراسات أن الخلايا العصبية النامية β التوبولين الإيجابية والمغلقة تحوم بين خليتين بعيدتين وتشبه الهياكل الشبيهة بمادة تي إن تي12,13. لذلك ، يتم تحديد TNTs وتمييزها عن الخلايا العصبية وغيرها من الهياكل الشبيهة ب TNT بناء على إيجابيتها للأكتين فقط ولكونها قنوات غشائية تحوم بين خليتين بعيدتين. غالبا ما يجد الباحثون صعوبة في الحصول على هياكل TNT سليمة أثناء التثبيت قبل التصوير24. للتغلب على هذه المشكلة ، استخدمنا محلولا مثبتا معدلا يحتوي على 2.5٪ جلوتارالدهيد (مثبت كارنوفسكي) لإصلاح الخلايا العصبية SH-SY5Y المستخدمة في هذا البروتوكول25.
الخطوة الحاسمة في كل تجربة للكيمياء المناعية / الكيمياء المناعية هي تثبيت العينة ، والتي تعتمد على اختيار العامل المثبت المناسب. قد يؤدي التثبيت غير الكامل للعينة إلى تدهور سريع للبروتين للبروتينات المستهدفة وتقليل النشاط المناعي المحدد. يؤدي التثبيت الزائد إلى إخفاء الخاتمة وعدم اليقين في وضع العلامات المحددة بسبب الخلفية غير المحددة. تؤثر الطريقة والتوقيت أو المدة ودرجة الحرارة ودرجة الحموضة أيضا على التثبيت المناسب للخلايا26.
يستخدم بارافورمالدهيد على نطاق واسع كعامل مثبت في التلطيخ المناعي للخلايا. تشمل عيوب استخدام بارافورمالدهيد كعامل مثبت فقدان المستضدات والتغيرات في التشكل. يحتوي الجلوتارالدهيد على ضغط تناضحي أقل ، وهو أكثر استقرارا في المحلول ، وروابط متقاطعة بسهولة ، مما يعطي نتائج أفضل27. يؤدي الجمع بين مثبت الفورمالديهايد-جلوتارالدهيد (في محلول الفوسفات) إلى تثبيت استثنائي لمجموعة واسعة من عينات الأنسجة / الخلايا. يتيح هذا المزيج التثبيت السريع للبنية التحتية للخلية بواسطة الفورمالديهايد ، يليه تثبيت دائم من خلال عمل اختراق أبطأ للجلوتارالدهيد28.
تتميز TNTs الموجبة ل F-actin و phospho-PAK1 عن الخلايا العصبية بناء على خصائصها المتمثلة في التحليق بين خليتين في ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد في المختبر على طبقة تحتية مسطحة. تم رصد TNTs المحددة يدويا باستخدام تحليل عرض حجم 3D ، وتم حساب النسب المئوية ل TNTs التي تم تشكيلها عن طريق العد اليدوي. تجعل الطريقة اليدوية القياس الكمي لكميات كبيرة من البيانات أمرا صعبا لأنها تتطلب قوة بشرية هائلة19. ومع ذلك ، يمكن للعيون المدربة اكتشاف TNTs بكفاءة وتمييزها عن الخلايا العصبية بدقة أفضل من طرق الكشف التلقائي. من الصعب أيضا تنفيذ طرق الكشف التلقائي الحالية في كل مختبر بدون الخبرة المتاحة لتطوير خوارزمية و / أو تغيير الخوارزمية الحالية كما هو مطلوب للإعداد التجريبي. تسهل طريقة تحليل عرض الحجم اليدوي 3D تحديد الهياكل الغشائية الموجودة بين الخلايا في الأجزاء السفلية من مداخن z وتلك التي تحوم في الأجزاء الوسطى والعليا من مداخن z للتمييز بوضوح بين الخلايا العصبية و TNTs.
يمكن تمييز TNTs عن نتوءات الغشاء الأخرى مثل الخلايا العصبية أو الأنابيب الدقيقة للورم. ومع ذلك ، من الصعب التمييز بين الأنابيب المفتوحة والمغلقة ، ذات الحجم النانوي ، والغشاء القطري ، مما يثير السؤال التالي: هل هي TNTs أم هياكل تشبه TNT؟ منذ العقد الماضي ، تم تجميع كمية هائلة من البيانات لإظهار الدور الحتمي ل TNTs في انتشار علم الأمراض ومقاومة السرطان والعلاج17. لذلك ، يبحث الباحثون عن تطوير صانعي محددين من شأنه تغيير مجال الاتصال المباشر بين الخلايا لمسافات طويلة. حتى ذلك الحين ، هناك طلب كبير على طرق التصوير القابلة للتكرار للتوصيف لتمهيد الطريق للتقدم المستمر في هذا المجال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تشكر D.K.V و A.R أكاديمية مانيبال للتعليم العالي على زمالة TMA Pai. نشكر مجلس أبحاث العلوم والهندسة في الهند على SERB-SRG (#SRG/2021/001315) ، وكذلك المجلس الهندي للبحوث الطبية في الهند (# 5 / 4-5 / Ad-hoc / Neuro / 216/2020-NCD-I) والصندوق الداخلي لأكاديمية مانيبال للتعليم العالي ، مانيبال ، الهند. نشكر مرفق JNCASR (مركز جواهر لال نهرو للبحوث العلمية المتقدمة ، الهند) و B. Suma على الفحص المجهري متحد البؤر في JNCASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip | Cellvis | D35-14-1.5-N | Imaging dish used to seed cells for staining experiments |
| Aβ (1-42) 1 mg | AnaSpec | #64129 | Oligomers of amyloid beta to treat the cells |
| Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11070 | Secondary antibody for phospho-PAK1 |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific (MSC Advantage) | 51025411 | Provide aspetic conditions duirng cell culture |
| CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) | 51026556 | For growing cells at or near body temperature |
| Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS (Carl Zeiss) | LSM 880 | Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution |
| DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] | Merck | 8034560100 | Anti-bleaching reagent |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-1MG | Neuclear stainer |
| DMEM media | Gibco | 11965092 | Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42) |
| DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) | Gibco | 12500062 | Culture media for SH-SY5Y |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade | Cryopur | CP-100 | Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade | Himedia | MB058 | Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42) |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | Major supplement for Culture media (US origin) |
| Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) | Sigma Aldrich | HT5014-120ML | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) | Sigma | G5882 | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution | TCI | H024 | Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg |
| Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) | National Institute of Health (NIH) | Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer". | |
| Lyophilizer | Christ, Alpha | 2.4 LDplus | 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture | Thermo fisher Scientific | 15640055 | Antibiotic mixture |
| Phalloidin-iFlor 555 | Abcam | ab176756 | F-actin binding stain |
| Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] | CST | #2601 | Primary antibody |
| Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) | Cloud clone | PAE711Hu01 | Primary antibody |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Differentiating reagent |
| Saponin | Merck | 8047-15-2 | Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining |
| Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) | Ultrasonic Cleaner | 3.0 L/3.2 | Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42) |
| ZEN Microscopy software | ZEISS (Carl Zeiss) | Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation |
References
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Desir, S., et al. Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer. Scientific Reports. 8, 9484 (2018).
- Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-The path forward. The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).
- Dieriks, B. V., et al. α-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients. Scientific Reports. 7, 42984 (2017).
- Chen, J., Cao, J. Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes. Scientific Reports. 11, 16798 (2021).
- Mittal, R., et al. Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications. Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).
- Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment. Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).
- Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses. Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).
- Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Communicative & Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).
- Han, X., Wang, X. Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).
- Zurzolo, C.
- Dilna, A., et al. Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).
- Chang, M., et al. Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation. Science Advances. 8 (13), (2022).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Zhang, J., et al. Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).
- Hanna, S. J., et al. The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis. Scientific Reports. 7, 8547 (2017).
- Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy. Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).
- Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking. Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).
- Hodneland, E., et al. Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images. Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).
- Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes. PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).
- Nath, S., et al. Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).
- Domert, J., et al. Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance. Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).
- Pawley, J. B. Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer. New York, NH. 59-79 (2006).
- Pontes, B., et al. Structure and elastic properties of tunneling nanotubes. European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).
- Haimovich, G., Gerst, J. E. Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH). Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).
- Qin, Y., et al. The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria. Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).
- Graham, R. C., Karnovsky, M. J. The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).
