Summary
トンネリングナノチューブ(TNT)は、主にオープンエンドのFアクチン膜ナノチューブであり、隣接する細胞を接続し、細胞間コミュニケーションを促進します。TNTを他の細胞突起と区別する注目すべき特徴は、細胞間のナノチューブのホバリング特性です。ここでは、共焦点zスタック画像の3Dボリュームビューを構築することにより、TNTを特徴付けます。
Abstract
最近の発見により、細胞はナノスケールのアクチン膜導管、すなわち「トンネリングナノチューブ」(TNT) を介して 直接、長距離、細胞間移動を行うことが明らかになりました。TNTは、直径50 nmから1 μmの範囲の隣接細胞間の連続性を媒介する、オープンエンドの脂質二重層で囲まれた膜伸長として定義されます。 TNTは当初神経細胞で実証されましたが、連続した研究により、神経変性疾患、ウイルス感染、癌など、いくつかの細胞型および疾患におけるTNTの存在が明らかになりました。いくつかの研究では、隣接する細胞間のクローズエンドの電気的に結合された膜ナノ構造をTNTまたはTNT様構造と呼んでいます。
エンドポイントでの膜連続性の観点からの微細構造の解明は技術的に困難です。さらに、細胞間コミュニケーションに関する研究は、特異的マーカーがないため、従来の方法を使用したTNTの特性評価の観点から困難です。TNTは、主にFアクチンベースのオープンエンド膜突起として定義されます。ただし、大きな制限の1つは、F-アクチンがすべてのタイプの突起に存在するため、TNTを他の突起と区別することが難しいことです。F-アクチンベースのTNTの注目すべき特徴の1つは、これらの構造が基層に触れることなく2つの細胞間をホバリングすることです。したがって、明確なFアクチン染色TNTは、細胞間のホバリングに基づいて、糸状足や神経突起などの他の突起と便利に区別できます。
我々は最近、アクチン依存性エンドサイトーシスを介したオリゴマーアミロイドβ1-42(oAβ)の内在化が、SH-SY5Y神経細胞間でホスホPAK1と共発現するF-アクチン含有TNTの形成を媒介する活性化p21活性化キナーゼ-1(PAK1)を刺激することを示した。このプロトコルは、oAβ処理された神経細胞におけるF-アクチンおよびホスホ-PAK1免疫染色膜突起のキャプチャされたzスタック画像からTNTを同定および特性評価するための3D体積分析方法の概要を示しています。さらに、TNTは、F-アクチンおよびβ-IIIチューブリン免疫染色膜導管に基づく神経突起およびニューロン増殖の発生とは区別されます。
Introduction
トンネリングナノチューブ(TNT)は、Fアクチンベースの、主にオープンエンド膜導管であり、貨物および細胞小器官の細胞間移動において重要な役割を果たします1。TNTのユニークな特徴は、基層と接触することなく隣接する細胞を接続することです。それらは長さが10〜300μmを超え、直径は50nm〜1μmの間で変化します2,3。TNTは一時的な構造であり、その寿命は数分から数時間続きます。TNTは、PC12ニューロン細胞で最初に実証されました1。その後、多くの研究が、インビトロおよびインビボ4,5のいくつかの細胞型でそれらの存在を示しました。いくつかの研究は、神経変性疾患、癌、およびウイルス感染などの様々な疾患モデルにおけるTNTの病理学的意義を明らかにしている6,7,8。
TNTの構造的不均一性は、さまざまな細胞系におけるいくつかの研究によって実証されています9。違いは、細胞骨格の組成、形成のメカニズム、および転送される貨物の種類に基づいています10。主に、2つの隣接する細胞間をホバリングし、細胞小器官を移すオープンエンドのFアクチン陽性膜連続性は、TNTs11からなると考えられる。しかし、TNTの形成に見られる明瞭さや多様性の欠如は、TNT特異的マーカーの開発を困難にしています。したがって、従来の検出方法でTNT構造を同定し、膜ナノチューブを開放端突起と閉端突起12で区別することは困難である。しかし、2つの細胞間のF-アクチン膜突起としてホバリングするTNTの特性は、従来のイメージング技術を使用して識別するのが比較的簡単で実行可能です。糸状足や背側糸状突起などの他のアクチンベースの細胞突起は、特に細胞が固定されている場合、2つの離れた細胞の間をホバリングすることはできません。注目すべきことに、近接し、電気的に結合し、発達中の神経突起は、しばしばTNT様構造と呼ばれる13。
F-アクチンがTNT形成に重要な役割を果たすことが知られており、いくつかの研究は、F-アクチン阻害剤サイトカラシンDがTNTの形成を阻害することを示した14,15。対照的に、微小管の阻害剤はTNT形成に何の影響も及ぼさない16。過去20年間で、病理学と腫瘍抵抗性および治療の広がりにおいてTNTが果たす重要な役割に関するいくつかの報告が見られました17。したがって、TNTの特性評価のためのより良い技術に対する終わりのない要求があります。
TNTの特異的マーカーの欠如、形態および細胞骨格組成の多様性は、独自の特性評価方法を開発することを困難にしている。いくつかの研究では、自動画像検出およびTNT定量化技術が使用されています18,19。しかしながら、TNTの検出および定量化のための自動画像解析よりも、現在の3D体積手動解析法にはいくつかの利点がある。 多くの場合、訓練された人間の目は、自動画像検出方法よりも簡単にこれらのホバリングナノ構造を見つけることができます。さらに、自動検出方法は、アルゴリズムの専門知識がないラボでは実装が難しい場合があります。本手法は、その精度と再現性から研究者に広く採用されている。
最近の研究では、oAβがPAK1を介したアクチン依存性のエンドサイトーシスメカニズム を介して 神経細胞におけるTNTの生合成を促進することを示しました12。oAβ誘導性TNTは、活性化されたPAK1(またはホスホPAK1)も発現します。我々は、oAβ誘導性、F-アクチンおよびホスホ-PAK1免疫染色TNTを区別するための3Dボリュームビュー画像再構成法を開発しました。 β-IIIチューブリン陽性の発達中の神経突起は、しばしばTNT様ホバリング構造に似ています20。したがって、F-アクチンベースのTNTをβ-IIIチューブリン陽性神経突起および他のTNT様突起とさらに区別しました。3Dボリュームビュー画像は、基層上にホバリングし、2つの隣接するセル間の接続を維持するという特性に基づいてTNTを識別するために使用されてきました。この論文では、共焦点zスタック画像を使用したアクチン含有膜導管またはTNTの識別と検出、および最後に、3Dボリュームビュー再構成画像から識別された構造の手動定量について説明します。提示された方法は、オープンエンドの適切なTNTとクローズエンドのTNT様構造を区別することはできません。この方法は、平坦な基層上の in vitro 2D細胞培養でTNTを同定するのに役立ちます。しかし、この方法は実施と再現が容易であり、アクチンベースのTNTのみを正確に定量し、神経突起やβチューブリン陽性TNT様構造と区別するために広く使用できます。
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Protocol
注:DMEM/F-12培地で培養したSH-SY5Y細胞を10 μMレチノイン酸で7日間分化させ、1 μMのoAβオリゴマーで37°C(5%CO2)で2時間処理しました。処理後、細胞をカルノフスキー固定液で固定し、ホスホ-PAK1(Thr423)/PAK2(Thr402)抗体とF-アクチン結合ファロイジンで二重免疫染色しました。その後、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて共焦点zスタック画像を撮影した。TNTは手作業でカウントし、3Dボリュームビュー画像を構築し、基層に触れることなく2つの細胞間をホバリングするという特性から構造を特定することにより、他の神経突起/細胞突起と区別されました(図1)。
1. 細胞培養と分化
- SH-SY5Y神経細胞をDMEM/F12(ハム)培地で10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシン-ネオマイシン混合物(PSN)で1:1で培養します。底に取り付けられた皿の中央に#1.5カバーガラスで構成された14 mmウェルを備えた35 mmイメージング皿に細胞を播種します。細胞をイメージングディッシュに12,000細胞/cm2 の濃度で播種し、60%〜70%のコンフルエントで実験を行います。
- 100 mMストック溶液(15 mLジメチルスルホキシド[DMSO]中の5 mgのRA)から10 μMのレチノイン酸(RA)で細胞を部分的に分化させます。次いで、細胞を37°C(5%CO2)で7日間インキュベートし、2日毎に培地交換で分化させる。
注:細胞(未分化細胞と部分分化細胞の両方)のコンフルエンシー(60%〜70%)を維持することに注意してください。細胞密度は、細胞間のTNTの形成に影響を与える可能性があります。
2. 神経細胞を治療するためのアミロイドβ1-42 (oAβ)のオリゴマーの調製
- Aβ 1-42(1 mg)を200 μLの1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールに溶解し、溶液をそれぞれ0.05 mgのペプチドを含む20アリコートに分割します。後で使用するために、アリコートを凍結乾燥して-20°Cで保存します。
- 凍結乾燥ペプチド0.05 mgに2.2 μLのDMSOを加えて、凍結乾燥Aβ 1-42のDMSO溶液(5 mM)を調製します。ペプチドを注意深く溶解するには、溶液をボルテックスし、水浴超音波処理器で2分間超音波処理します。
- 原液をDMEM、pH 7.4、ボルテックスで100 μMの濃度に希釈してペプチドをモノマーに変換した後、4°Cで24時間インキュベートして、Aβ 1-42(oAβ)12,21,22のオリゴマーを得ました。
- 以前に報告されたように実験前にoAβを特徴付ける21,22 透過型電子顕微鏡イメージングによる。
- 部分的に分化したSH-SY5Y細胞を1μM oAβで処理します。治療の前に培地を取り出し、新鮮なFBSフリーDMEMを追加します。培地交換後、予め調製したoAβ(100μM)を最終濃度1μMになるまで培地に加え、細胞を1μM oAβと共に37°C(5%CO2)で2時間インキュベートする。未処理細胞の形でネガティブコントロールを含める。
3. TNTの特性評価のためのF-アクチンおよび活性化PAK1の免疫染色
- ホスホ-PAK1(Thr423)/PAK2(Thr402)抗体およびF-アクチン結合ファロトキシンファロイジンを用いて鑑別免疫染色を行います。
- コントロールおよびoAβ処理した細胞を、固定前に1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2 x 2分間洗浄します。0.1 Mリン酸緩衝液、pH 7.2に溶解した2%ホルマリン固定液と2.5%グルタルアルデヒドを使用して、カルノフスキー固定液を調製します。次に、カルノフスキーの固定液(細胞を覆うのにちょうど十分)を室温で45分間加えて、イメージングディッシュ内の細胞を固定します。
- インキュベーションバッファーを使用して固定細胞を2 x 2分間洗浄します。0.1 gのサポニンを5 mLのFBSに溶解してインキュベーションバッファー(20x)を調製し、95 mLの1x PBSを加えて1xに希釈します。
- 固定後、phopho-PAK1に対する最初の抗体をインキュベーションバッファーに1:250の希釈率で加え、暗湿潤チャンバー内で4°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、インキュベーションの24時間後、細胞をインキュベーションバッファーで2 x 2分間洗浄します。次に、Alexa Fluor 488(1:1,000希釈)およびファロイジン555(1:1,000希釈)に結合した二次抗体を追加します。暗くて湿ったチャンバー内で細胞を室温で1.5時間インキュベートします。
- インキュベーション後、細胞をインキュベーションバッファーで2 x 2分間洗浄します。4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を1:2,000希釈で添加して核を染色し、暗所で室温で5分から10分間インキュベートします。
- 90%グリセロールおよび10%1x PBS中の25 mgのDABCOを使用してDABCO封入剤を準備します。適切に溶解するには、分光光度グレードを使用してpHを8.6に調整し、HClを希釈し(水で1:20に希釈)、溶液をロッカーに置いて混合します。
- 漂白防止剤として、DABCO封入剤を、底部にカバーガラスを含むイメージング皿に直接追加します。少なくとも1〜2時間待ってから、直接共焦点イメージングの実行に進みます。
注意: カバーガラスを固定するために接着剤は必要ありません。
4. TNTと神経突起を区別するためのF-アクチンおよびβ-IIIチューブリンの免疫染色
- β-IIIチューブリン抗体とF-アクチン結合ファロトキシンファロイジンによる鑑別免疫染色を行います。
- カルノフスキーの固定液を加える前に、oAβ処理された細胞を1x PBSで2回洗浄します。細胞を室温で45分間インキュベートし、インキュベーションバッファーで細胞を2 x 2分間洗浄します。
- 固定後、β-IIIチューブリン(TUBb3)に対する抗体をインキュベーションバッファーに1:250の希釈率で加え、暗所の湿ったチャンバーで4°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、細胞をインキュベーションバッファー(2 x 2分)で洗浄し、Alexa Fluor 488(1:1,000希釈)とファロイジン555(1:1,000希釈)に結合した二次抗体を同じディッシュに加えます。その後、細胞を暗湿潤チャンバー内で室温で1.5時間インキュベートする。
- 細胞をインキュベーションバッファーで2回洗浄し、核染色DAPIを1:2,000希釈液で室温暗所で5〜10分間加えます。
- 上記のように封入剤に漂白防止剤DABCOを加え、2時間待ってからイメージングします。
5. 共焦点顕微鏡によるイメージング
- TNTを同定するには、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して免疫染色細胞のzスタック画像をキャプチャします。DAPI、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、テトラメチルローダミン(TRITC)フィルターセットを備えた40倍/1.40オイルDIC対物レンズを使用して画像を撮影します。
- まず、共焦点ソフトウェアのウィンドウトラック1、トラック2、トラック3で必要なレーザーを順番にクリックして、チャンネルを選択します。トラック1ウィンドウの下にあるT-PMTオプションをクリックして、蛍光チャンネル付きの微分干渉コントラスト(DIC)画像を撮影します。
注:DIC画像は、 T-PMTというラベルの付いた別の検出器によってキャプチャされます。 - ソフトウェアの [取得 ]タブを選択し、[ Zスタック ]タブをクリックして、ウィンドウが開くのを待ちます。次に、 ライブスキャン をクリックして、皿の下部にあるセルに焦点を合わせます。フォーカスされた画像を最初のスタックとして選択します。次に、上にフォーカスしてセルの一番上の部分を表示し、それを最後のスタックとして選択します。ライブスキャンを停止し、 最適な タブの横にある数字をクリックして、スタックの ステップサイズ を修正します。ステップサイズは、セルの厚さに基づいてスライスの数と間隔を決定します。
注:ステップサイズは、ナイキストサンプリングに基づいて選択され、十分なスライスを取得し、2つのスタック間にギャップがないことを確認します。ナイキストサンプリングは、光23の対物レンズおよび波長に基づいて決定される。 - 405 nm、488 nm、および561 nmレーザーを使用してDAPI、FITC、およびTRITCの3つのチャネルのシーケンシャル画像を撮影し、1.02μsのピクセル滞留時間でキャプチャします。 蛍光チャンネルでDICチャンネルで画像を撮影し、細胞境界を観察します。
- x: 224.92 μm および y: 224.92 μm の寸法で、各ピクセルが 220 nm2 サイズ、z スケーリングが 415 nm の画像のスタックをキャプチャします。
- セルの下から上まで、いくつかのzスタック(15〜22スタック)をキャプチャした画像を撮ります。培養皿のランダムフィールドから少なくとも10枚の画像を取得して、合計~200-300個の細胞を取得します。
- キャプチャした画像をオフラインで分析して、3Dボリュームビュー分析によってTNTを特定します
6. TNTを同定・定量するための共焦点Zスタック画像の解析
- フィジーのソフトウェアで.cziデータ形式で保存された共焦点画像を開いて分析します。
- [ハイパースタック] オプションを選択して、イメージの各 Z スタックとチャネルを表示します。図 2 に示すように、1 つのウィンドウで開く z スタックとチャネルのハイパースタックを探します。チャネル(赤と緑の矢印で示されます)とzスタック(青い矢印で示されます)スクロールバーをスクロールして、関心のある特定のチャネルの正確なスタックを選択します。
注:固定セルでは、ホバリングしているTNTまたは膜導管が表面の上にとどまるため、構造はzスタックの下部に見えません。ただし、固定細胞では、神経突起は表面に存在し、zスタックの下部で検出できます(z = 0〜2)。識別手順については、 図 2 を参照してください。 - 図2に示すように、最初にチャンネルバーをスクロールして、Fアクチン染色チャンネル(赤い矢印で示す)を選択します。次に、zスタック(青い矢印で示されている)を手動でスクロールして、各スタックを1つずつ表示します。細胞をつなぐように見え、zスタックの下部に見え、イメージングディッシュの表面に近い(z = 2)神経突起(白い矢印で示す)Fアクチン染色構造を特定します。
注:神経突起の大部分は、拡張された突起(ピンクの矢印で示されている)として表示されるため、簡単に識別できます。 - Tnt(Fアクチン陽性のホバリングする細胞間導管)を特定するには、zスタックを上部にスクロールします(図2のz = 4から、黄色の矢印で示されています)。zスタックの下部近くで表面に向かって神経突起を探し、zスタックを上部に向かってスクロールすると神経突起が消え始めることを確認します(図2のz = 6で、神経突起ははっきりと見えません)。
- Zスタックからの導管のホバリング特性を分析することにより、ホスホPAK1陽性TNTをFアクチン陽性TNTと同様に同定します。ホスホPAK1染色はF-アクチン染色よりも弱いため、z = 4 (かすかに見える)および z = 6 (目立つ)のphopho-PAK1染色TNTを探します。
- さらに、DIC画像を観察して、F-アクチンおよびホスホ-PAK1染色されたTNT構造が細胞間の膜導管であることを確認しました(図3)。さらに、F-アクチン(赤)チャネルとホスホ-PAK1(緑)チャネルをマージして、同定されたTNTがF-アクチンとホスホ-PAK1の共染色構造であることを確認します(図3)。
- TNTを定量化するには、合計セル数と識別されたTNTを手動でカウントし、その数をパーセンテージで表します。
- F-アクチン陽性TNTとβ-IIIチューブリン(TUBb3)陽性のTNT様ホバリング導管をzスタック画像から区別するには、Fアクチン(赤)チャネルとTUBb3チャネル(緑)をマージします(図4)。次に、マージされた画像の Z スタックを解析します。
- z = 3でかすかに見え、z = 6およびz = 9で目立つFアクチン染色TNTのみを探します(黄色の矢印)。同様に、F-アクチンとβ-IIIチューブリン(TUBb3)の二重陽性のTNT様ホバリング導管をz = 6およびz = 9で特定します(シアンの矢印)。zスタックの下部から、他のFアクチンおよびβ-IIIチューブリン染色された非ホバリング突起(白い矢印)を特定します。
- フィジーの ライン ツールを使用してTNTの直径を測定します。[解析] をクリックして測定のスケールを確認します | .czi画像から「ピクセル単位の距離」が自動的に設定されるようにスケールを設定します。xy平面でのTNTの直径を測定します。
注:ほとんどの直径は1ピクセルから4ピクセル(つまり、 220〜880 nm)です。各ピクセルは220nmです。Zスタック共焦点画像の解析のためのプロトコルの概要については、 図5 を参照してください。
7.3D TNTを特徴付けるためのZスタック画像の再構成
- フィジーの ボリュームビューア プラグインを使用すると、3D再スライスとしきい値対応の3D視覚化が可能になります(図6)。
- Z スタック画像を個々のチャネルに分割します。次に、シングルチャンネル(Fアクチンチャンネル)のzスタック画像をトリミングして、 3D再構成ビュー を使用して、一度に1つまたは2つのTNTまたは神経突起を強調表示します。ボリュームビュープラグインを有効にして、xy、yz、およびxz ビュー を視覚化します。
- 単一のTNTまたはニューライトをxy平面にピン留めし(白い矢印は図 6Aのニューロ突起を表し、黄色の矢印は 図6BのTNTを表します)、xz(赤)とyz(緑)の軸断面をマークします。xz平面とyz平面のxz平面の下部にある神経突起(白い矢印、図 6A)と上部のzスタックのTNTを観察します(黄色の矢印、 図6B)。
- 個々のTNTまたは神経突起を選択して、xz平面の3Dボリュームビューを再構築します(図6C、D)。3D再構成では、z平面の下部にある神経突起(白い矢印、図 6C)と、下部のz平面に触れることなく2つの細胞を接続するホバリング構造として現れるTNTを観察します(黄色の矢印、 図6D)。
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Representative Results
ここでは、共焦点Zスタック画像から3Dボリュームビューを構築することにより、SH-SY5Yニューロン細胞におけるoAβ誘導TNTを同定し、特性評価します(図1)。細胞をF-アクチンおよびホスホ-PAK1で二重免疫染色した。免疫染色細胞の共焦点zスタック画像を解析してTNTを同定しました(図2)。さらに、DIC画像を解析し、F-アクチンおよびホスホ-PAK1染色されたTNT構造が細胞間の膜導管であることを確認しました(図3)。さらに、細胞をFアクチンとβ-IIIチューブリンで二重免疫染色した(図4)。TNT様Fアクチンおよびβ-IIIチューブリン二重陽性膜導管は、F-アクチン陽性TNTのみと区別されました(図4)。ホスホPAK1(または活性化PAK1)およびF-アクチンと共発現するTNTは、基層に触れることなく2つの細胞間をホバリングするという特性に基づいて3Dボリュームビュー画像を構築することにより、他の神経突起/細胞突起と区別されました(図6)。識別されたTNTは手動で発見され、TNTの割合は3Dボリュームビュー画像から正確に計算されました。TNTの直径と長さも、個別に識別されたTNTを分析することによって決定されました。
図1:TNTの検出方法のプロトコル概要を表す模式図。スケールバー = 顕微鏡画像の場合は100 μm(上)。10 μm (3D ボリューム ビュー)。略語:oAβ=オリゴマーアミロイド-β1-42;PAK1 = p21活性化キナーゼ-1。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:TNTを識別および定量化するための共焦点zスタック画像の分析。 共焦点zスタック画像はフィジーのソフトウェアで分析されました。zスタックのハイパースタックと、(A)F-アクチンと(B)ホスホPAK1を示す単一のウィンドウで開かれたチャネル。チャネル(赤と緑の矢印で示される)およびzスタック(青の矢印で示される)スクロールバーをスクロールすることにより、関心のある特定のチャネルの個々のスタックを分析した。(a)zスタックの下部に見え、画像皿の表面に近いと考えられる細胞をつなぐFアクチン染色構造(z=2)を神経突起と同定した(白矢印)。対照的に、zスタックのより高い部分に見えるホバリングセル間接続導管は、TNTとして識別されました(黄色の矢印で示されています)。(B)同様に、ホスホPAK1染色された神経突起およびTNTが同定された。隣接する細胞に接続されていない他のFアクチン陽性の短い突起は、ピンク色の矢印で示されています。スケールバー= 10 μm。略語:TNT =トンネリングナノチューブ;PAK1 = p21活性化キナーゼ-1。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:TNTを確認するためのDIC画像の解析 (A)DIC画像を観察し、F-アクチンおよびホスホ-PAK1染色されたTNTと神経突起が実際に膜導管であることを確認しました。(B)さらに、F-アクチン(赤)チャネルとホスホ-PAK1(緑)チャネルをマージして、同定されたoAβ誘導TNTがF-アクチンとホスホ-PAK1の共染色構造であることを確認しました。スケールバー= 10 μm。略語:TNT =トンネリングナノチューブ;DIC = 微分干渉コントラスト;PAK1 = p21活性化キナーゼ-1。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:フィジーのソフトウェアを使用して分析された共焦点zスタック画像は、Fアクチン染色TNTのみをβ-IIIチューブリンおよびFアクチン二重染色されたTNT様ホバリング導管と区別しました。 まず、ハイパースタックのFアクチン(赤)チャネルとTUBb3チャネル(緑)をマージしました。次に、マージされた画像が1つのウィンドウで開かれました。zスタックスクロールバーをスクロールすることにより、Fアクチン染色TNTが排他的に同定されました。これらはz = 3でかすかに見え、z = 6とz = 9で顕著でした(黄色の矢印、 B)。同様に、F-アクチンおよびTUBb3の二重陽性のTNT様ホバリング導管は、z = 6およびz = 9で検出可能であった(シアン矢印、 A)。他のF-アクチンおよびβ-IIIチューブリン染色、非ホバリング突起がzスタックの下部から確認されました(白い矢印)。スケールバー= 10 μm。略語:TNT =トンネリングナノチューブ;TUBb3 = β-IIIチューブリン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:zスタック共焦点画像の解析のための詳細なプロトコルを表す概略図。略語:TNTs =トンネリングナノチューブ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:一度に1つまたは2つのTNTまたは神経突起を強調する3D再構成ビュー。 フィジーの「ボリュームビュー」プラグインは、xy、yz、およびxzビューを視覚化するために使用されます。3D再構成では、神経突起がz平面の下部にあることを示し(パネル A と Cの白い矢印)、TNTは下部のz平面に触れることなく2つのセルを接続するホバリング構造として表示されます(パネル B と Dの黄色の矢印)。スケールバー= 10 μm。略語:TNTs =トンネリングナノチューブ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
過去20年間の何人かの研究者は、TNTの構造を理解し、特徴付けようとしてきました18。特定のマーカーの欠如は進歩を妨げ、TNTの識別、特性評価、および定量に使用できる便利で標準化された方法に対する需要が高まっています。 TNTは、2つの細胞間をホバリングするFアクチンベースの膜導管として定義されます。研究によると、βチューブリン陽性のクローズエンドの発達中の神経突起は、2つの離れた細胞の間をホバリングし、TNT様構造に似ています12,13。したがって、TNTは、アクチンのみの陽性性、および2つの離れた細胞間をホバリングする膜導管であることに基づいて、神経突起および他のTNT様構造と識別および区別されます。研究者は、イメージング前の固定中に無傷のTNT構造を取得することが難しいと感じることがよくあります24。この問題を克服するために、このプロトコル25で使用されるSH-SY5Yニューロン細胞を固定するために、2.5%グルタルアルデヒド(カルノフスキーの固定液)を含む修正固定液を使用しました。
すべての免疫組織化学/免疫細胞化学実験の重要なステップは、適切な固定剤の選択に依存するサンプルの固定です。サンプルの不完全な固定は、標的タンパク質の急速なタンパク質分解および特異的免疫反応性の低下をもたらす可能性がある。過剰固定は、エピトープのマスキングと非特異的バックグラウンドによって引き起こされる特異的標識の不確実性を引き起こします。方法、タイミングまたは持続時間、温度、およびpHも、細胞26の適切な固定に影響を与える。
パラホルムアルデヒドは、細胞の免疫染色における固定剤として広く使用されています。パラホルムアルデヒドを固定剤として使用することの不利な点には、抗原性の喪失および形態の変化が含まれる。グルタルアルデヒドは浸透圧が低く、溶液中でより安定しており、架橋しやすいため、より良い結果が得られます27。ホルムアルデヒド-グルタルアルデヒド(リン酸緩衝液中)固定液の組み合わせにより、幅広い組織/細胞サンプルの優れた固定が得られます。この組み合わせにより、ホルムアルデヒドによる細胞の超微細構造の迅速な安定化が可能になり、続いてグルタルアルデヒド28のより遅い浸透作用による永久固定が可能になります。
F-アクチンおよびホスホ-PAK1陽性のTNTは、平坦な基層上の in vitro2D 細胞培養において2つの細胞間をホバリングするという特徴に基づいて神経突起と区別される。特定されたTNTは、3Dボリュームビュー分析で手動で発見され、形成されたTNTの割合は手動カウントによって計算されました。手動の方法では、膨大な人的資源を必要とするため、大量のデータの定量化が困難になります19。しかし、訓練された目はTNTを効率的に見つけ、自動検出方法よりも高い精度で神経突起と区別することができます。既存の自動検出方法は、アルゴリズムを開発したり、実験のセットアップに必要な既存のアルゴリズムを変更したりするための専門知識がなければ、すべてのラボに実装することも困難です。手動の3Dボリュームビュー分析方法により、zスタックの下部にある細胞とzスタックの中央および高い部分にある細胞の間にある膜構造を簡単に識別して、神経突起とTNTを明確に区別できます。
TNTは、神経突起や腫瘍マイクロチューブなどの他の膜突起と区別できます。しかし、オープンエンドとクローズエンド、ナノサイズの直径の膜チューブを区別することは困難であり、次の疑問が生じます:それらはTNTまたはTNTのような構造ですか?過去10年間、病理学、癌耐性、および治療の普及におけるTNTの必然的な役割を示すために、膨大な量のデータが蓄積されてきました17。したがって、研究者は、直接の長距離細胞間コミュニケーションの分野を変える特定のメーカーの開発を探しています。それまでは、この分野での継続的な進歩への道を開くために、再現性のあるイメージング特性評価法の需要が高まっています。
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Disclosures
著者は開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
D.K.VとA.Rは、TMAパイフェローシップを提供してくれたマニパル高等教育アカデミーに感謝します。SERB-SRG(#SRG/2021/001315)、インド医学研究評議会(#5 / 4-5 / Ad-hoc/Neuro / 216/2020-NCD-I)、およびインドのマニパルにあるマニパル高等教育アカデミーの壁内基金に感謝します。JNCASR(インドのジャワハルラールネルー高等科学研究センター)の共焦点施設と、JNCASRの共焦点顕微鏡法を提供してくれたB.スマに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip | Cellvis | D35-14-1.5-N | Imaging dish used to seed cells for staining experiments |
| Aβ (1-42) 1 mg | AnaSpec | #64129 | Oligomers of amyloid beta to treat the cells |
| Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11070 | Secondary antibody for phospho-PAK1 |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific (MSC Advantage) | 51025411 | Provide aspetic conditions duirng cell culture |
| CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) | 51026556 | For growing cells at or near body temperature |
| Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS (Carl Zeiss) | LSM 880 | Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution |
| DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] | Merck | 8034560100 | Anti-bleaching reagent |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-1MG | Neuclear stainer |
| DMEM media | Gibco | 11965092 | Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42) |
| DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) | Gibco | 12500062 | Culture media for SH-SY5Y |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade | Cryopur | CP-100 | Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade | Himedia | MB058 | Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42) |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | Major supplement for Culture media (US origin) |
| Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) | Sigma Aldrich | HT5014-120ML | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) | Sigma | G5882 | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution | TCI | H024 | Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg |
| Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) | National Institute of Health (NIH) | Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer". | |
| Lyophilizer | Christ, Alpha | 2.4 LDplus | 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture | Thermo fisher Scientific | 15640055 | Antibiotic mixture |
| Phalloidin-iFlor 555 | Abcam | ab176756 | F-actin binding stain |
| Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] | CST | #2601 | Primary antibody |
| Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) | Cloud clone | PAE711Hu01 | Primary antibody |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Differentiating reagent |
| Saponin | Merck | 8047-15-2 | Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining |
| Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) | Ultrasonic Cleaner | 3.0 L/3.2 | Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42) |
| ZEN Microscopy software | ZEISS (Carl Zeiss) | Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation |
References
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