Summary
Visuell, enkeltmolekylær biokjemi studert gjennom mikrofluidiske kamre blir i stor grad tilrettelagt ved bruk av glassfat, gasstette sprøyter, stabile tilkoblinger av rør til strømningsceller og eliminering av bobler ved å plassere koblingsventiler mellom sprøyter og rør. Protokollen beskriver doble optiske feller som muliggjør visualisering av DNA-transaksjoner og intermolekylære interaksjoner.
Abstract
Visuell biokjemi er en kraftig teknikk for å observere de stokastiske egenskapene til enkeltenzymer eller enzymkomplekser som er skjult i gjennomsnittet som foregår i bulkfasestudier. For å oppnå visualisering er dobbel optisk pinsett, hvor en felle er festet og den andre er mobil, fokusert i en kanal av et multi-stream mikrofluidisk kammer plassert på scenen av et omvendt fluorescensmikroskop. Den optiske pinsetten fanger enkeltmolekyler av fluorescerende merket DNA og væskestrøm gjennom kammeret og forbi de fangede perlene, strekker DNA til B-form (under minimal kraft, dvs. 0 pN) med nukleinsyren observert som en hvit streng mot en svart bakgrunn. DNA-molekyler flyttes fra en strøm til den neste, ved å oversette scenen vinkelrett på strømmen for å muliggjøre initiering av reaksjoner på en kontrollert måte. For å oppnå suksess parres mikrofluidiske enheter med optisk klare kanaler til glasssprøyter som holdes på plass i en sprøytepumpe. Optimale resultater bruker kontakter permanent bundet til strømningscellen, rør som er mekanisk stive og kjemisk motstandsdyktige, og som er koblet til koblingsventiler som eliminerer bobler som forbyr laminær strømning.
Introduction
Evnen til å visualisere protein-DNA-interaksjoner på enkeltmolekylnivå og i sanntid har gitt betydelig innsikt i genomstabilitet 1,2. I tillegg til å jobbe med enkeltmolekyler av DNA en om gangen, gir evnen til å se transaksjoner mellom individuelle molekyler i nærheten ytterligere innsikt 3,4,5. Manipulering av ytterligere DNA-molekyler krever både ekstra optiske feller samt høykvalitets, flerkanals, mikrofluidiske strømningsceller6.
Det finnes flere metoder tilgjengelig for å generere mer enn én optisk felle. Disse inkluderer galvanometerskanningsspeil, akustiske optiske modulatorer og diffraktiv optikk, som genererer holografisk optisk pinsett 4,7,8,9. Ofte produserer skannespeil og akustiske optiske modulatorer feller som timeshare. I oppsettet som er beskrevet her, er strålen til en enkelt Nd: YAG-laser delt på polarisasjon, og deretter kontrollerer galvanometer laserskanningsspeil posisjonen til det som kalles mobilfellen (figur 1) 4. For å lette plasseringen av speil og filtre for å lede fangststrålen til bakåpningen på mikroskopmålet, brukes en HeNe-laser. Dette gjør den generelle justeringen enklere ettersom HeNe-strålen er synlig for det blotte øye, mens infrarøde stråler ikke er det. HeNe-strålen er også tryggere å jobbe med, noe som gjør plasseringen av speil og andre komponenter mindre stressende. I utgangspunktet er strålebanen for denne laseren skilt fra 1064 nm-strålen, men blir introdusert i samme strålebane, og deretter inn i mikroskopmålet. Når fysisk justering er oppnådd, er posisjonering av 1064 nm strålen på toppen av HeNe-strålen gjort, og dette forenkles ved bruk av en infrarød seer og ulike strålebildeverktøy for å visualisere stråleposisjon og kvalitet. Deretter introduseres stråleutvidelsen, og den resulterende utvidede infrarøde strålen er justert på baksiden av målet. Til slutt fjernes målet og kraften i hver polarisert stråle måles og justeres ved hjelp av λ/2 bølgeplater for å være lik (figur 1C). Effektmålinger gjøres også når målet er returnert, og vanligvis er det et strømtap på 53%. Det er imidlertid tilstrekkelig kraft til å danne stabile faste og bevegelige optiske feller i fokalplanet (figur 1D).
For å avbilde DNA-transaksjoner spiller mikrofluidiske strømningsceller en nøkkelrolle da de tillater kontrollerte målinger på enkeltmolekylnivå med høy romlig og tidsmessig oppløsning (figur 2). Begrepet mikrofluidisk refererer til evnen til å manipulere væsker i en eller flere kanaler med dimensjoner fra 5-500 μm10,11. Begrepet strøm refererer til den faktiske væsken i en kanal, og kanalen refererer til den fysiske kanalen der en væskestrøm eller strømmer beveger seg. Enkanals strømningscelledesign har en felles, fysisk kanal hvor reaksjoner observeres, og det er vanligvis bare en væskestrøm tilstede. Dermed er disse designene kjent som single-stream flow celler. I motsetning til dette er flerstrømsstrømningsceller definert som en mikrofluidisk enhet der to eller flere inngangskanaler konvergerer til en enkelt, vanlig, fysisk kanal (figur 2A). Innenfor den felles kanalen strømmer væskestrømmene som stammer fra de enkelte kanalene parallelt med hverandre, og forblir separert med bare minimal blanding mellom dem som oppstår på grunn av diffusjon (figur 2B). I de fleste eksperimentelle oppsett skyver en enkelt pumpe væsker inn i hver kanal med samme hastighet. I kontrast, når grensestyring brukes, skyver tre eller flere, uavhengig kontrollerte pumper væsker gjennom kanalene. Imidlertid opererer hver pumpe med forskjellig hastighet, men nettostrømningshastigheten i den vanlige kanalen er konstant12. Dette tillater rask utveksling av hovedkanalkomponenter ganske enkelt ved å endre pumpehastigheten.
I tillegg til laminær strømning er en annen kritisk faktor den parabolske hastighetsprofilen i den laminære væskestrømmen. Den høyeste strømningshastigheten skjer midt i strømmen, og den tregeste oppstår ved siden av overflatene (figur 2C)13. Denne profilen må vurderes for å strekke et DNA-molekyl som er festet til en perle som holdes i strømmen for presis visualisering av fluorescerende DNA og nøyaktige enkeltmolekylanalyser. Her strekkes DNA-et til B-form og holdes på plass under 0 pN kraft. For å oppnå dette, bør fokusering av den optiske felleposisjonen være til en posisjon 10-20 μm fra bunndekselets overflate (figur 2D). Det må utvises forsiktighet slik at DNA-molekylet ikke strekkes utover B-form, da dette kan hemme enzymreaksjoner. Under typiske bufferforhold er 1 μm = 3000 bp DNA14. Videre, ved å fange 10-20 μm fra dekselet, er DNA-komplekset plassert langt fra overflaten og minimerer dermed overflateinteraksjoner.
Mange metoder har blitt brukt til å lage mikrofluidiske enhetskanaler, og disse kan gjøres i laboratoriet eller strømningsceller kan kjøpes fra kommersielle kilder 6,15,16,17. De optimale materialene som brukes til å konstruere strømningscellene, må være mekanisk stive, optisk gjennomsiktige med lav fluorescens og ugjennomtrengelige for organiske løsningsmidler6. Ofte brukes borosilikatfløteglass eller smeltet silika for å gi et stabilt strømningsmiljø i lengre tid som er egnet for optisk fangst, visualisering og kraftdeteksjon. Disse materialene tillater også bruk av ikke-vandige løsningsmidler (f.eks. metanol av spektrofotometrisk kvalitet) for å forenkle overflatefukting og fjerning av luftbobler, og denaturanter (f.eks. 6M guanidiniumhydroklorid) eller vaskemidler for å rengjøre strømningscellen. Til slutt varierer metodene som brukes til å introdusere væsker i strømningsceller fra komplekse vakuumpumpesystemer til enkeltsprøytepumper 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. I tilnærmingen som er beskrevet her, brukes en sprøytepumpe med plass til opptil 10 sprøyter (figur 3A). Dette gir fleksibilitet til å bruke enkeltkanals flytceller eller flytceller med flere innløpskanaler. Her brukes en trekanals strømningscelle og pares med sprøyter som holdes på plass på sprøytepumpen ved hjelp av poly-eter-eter-keton (PEEK) -rør (figur 3A-C). Strømmen av væsker styres av fireveis koblingsventiler og tjener dermed til å minimere innføringen av bobler i strømningscellen (figur 3A, D). I tillegg anbefales Hamilton gasstette sprøyter som har stive glassvegger og polytetrafluoretylen (PTFE)-belagte stempler, da de gir eksepsjonelt jevn stempelbevegelse som er avgjørende for å oppnå en jevn flyt14,27.
I det eksperimentelle systemet som er beskrevet, har strømningsceller med to til fem innløpskanaler blitt brukt. Antall innløpskanaler dikteres av eksperimentet som gjøres. For studiet av RecBCD og Hop2-Mnd1 var to strømkanaler tilstrekkelig14,28. For helikasen ble enzymet bundet til den frie enden av DNA og oversatt til en strøm som inneholdt magnesium og ATP for å initiere translokasjon og avvikling. For Hop2-Mnd1 ble optisk fanget DNA oversatt til den tilstøtende væskestrømmen som inneholder proteiner og buffer ± divalente metallioner. Bruken av trekanals strømningsceller gjør det mulig å fange DNA i strøm 1, oversette DNA til strøm 2 for å tillate proteinbinding å forekomme, og deretter å streame 3 der ATP er tilstede, for eksempel for å initiere reaksjoner. En variant av ovenstående er å bruke fluorescerende merket protein i kanal 2, noe som resulterer i at væskestrømmen er helt hvit og utelukker visualisering av DNA. Når dette molekylet oversettes til strøm 3, er både proteiner og DNA nå synlige når reaksjoner initieres.
Bruken av fireveis koblingsventiler for å kontrollere væskestrømmen er en kritisk komponent i systemet for å eliminere bobler i strømningscellene. Bobler er skadelige for stabil væskestrøm når de trekker seg sammen og ekspanderer på uforutsigbare måter, noe som resulterer i raske endringer i strømningshastighet og innføring av turbulens. Når ventilene er plassert mellom sprøyter og innløpsrør, kobles strømningsbanen fra ved å bytte ventilposisjon når sprøyter skiftes ut. Når den nye sprøyten er satt på plass, kan stempelet trykkes ned manuelt slik at >6 μL kastes ut (ventilens dødvolum), og dette eliminerer bobler nesten helt.
Festing av kontakter til flytceller er ofte det hastighetsbegrensende trinnet i bruk av flytceller. Vi beskriver bruken av to typer kontakter: flyttbar kjent som press-fit og permanente (nanoport-enheter). De avtakbare kontaktene er enkle å feste til en flytcelle, og forskjellige typer fleksible rør i tillegg til den anbefalte PTFE kan testes med disse kontaktene. Dette er en rask og kostnadseffektiv måte å teste slanger og kontakter uten å ofre dyrere glassflytceller. I motsetning til dette er nanoportenheter festet permanent, tåler trykk opp til 1,000 psi, og i våre hender er bruken av dem begrenset til PEEK-rør med forskjellige diametre. Dette er ikke en ulempe da PEEK-slanger fortrinnsvis brukes. En enkelt glassflytcelle med permanente enheter festet kan gjenbrukes i mer enn 1 år med forsiktig bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Laserfellejustering og testing med polystyrenperler
MERK: For oppsettet, se figur 1A,B.
FORSIKTIG: Eksperimentalisten bør bruke passende vernebriller eller lasersikkerhetsbriller under laserstrålejustering. Siden det optiske pinsettsystemet som er beskrevet her, bruker både HeNe- og IR-stråler, kreves det to separate sett med lasersikkerhetsglass.
- HeNe Beam-justering
- Plasser alle optiske komponenter på brødbrettet. Juster brødbrettet slik at det er så nær en 90 ° vinkel som mulig i forhold til mikroskopet.
- Fest parringsrøret som inneholder objektivet og telanlinsen til mikroskopet (Figur 1A-11,12).
MERK: Telan-objektivet er et linsesystem som brukes til å fokusere bildet på det mellomliggende bildeplanet i okularene. - Slå på HeNe-laseren og åpne lukkeren (figur 1A-18). Strålen skal slå filter (Figur 1A-3) i en høyde på 54 mm som reflekterer 50% av lyset på speil 5 (Figur 1A-5). De resterende 50% av bjelken treffer speil 4 (figur 1A-4) i samme høyde som speil 3.
- Juster speilet 4 (Figur 1A-4) slik at strålen treffer speil 6 (Figur 1A-6) i en høyde på 51 mm.
- Juster speil 6 (figur 1A-6) slik at strålen er rettet mot det nedre galvaniske speilet i en høyde på 51 mm. Strålen som kommer ut fra det øvre galvaniske speilet vil være på 57,5 mm.
- Juster speil 3 (figur 1A-3) slik at denne strålen treffer speil 5 (figur 1A-5) i en høyde på 57,5 mm. Når den er reflektert fra speil 5, skal strålen slå speil 9 (figur 1A-9) i samme høyde. Strålen rekombineres effektivt ved speil 9, passerer gjennom målet, og telan linsesystem på speil 21 (figur 1A-21), som reflekterer det inn i målet.
- Plasser et rent mikroskop lysbilde på scenen av mikroskopet. Slå på kameraet og avbilde strålene til de faste og skannestrålene individuelt på skjermen. Fra og med speil 3, deretter 5 og 9, til slutt 21, utfør små justeringer for å plassere den faste strålen i midten av skjermen.
- For å sikre at vinkelen på strålen som går ut av speilet 21 er 90 °, endrer du Z-høyden på mikroskopet og plasserer strålen som er avbildet på lysbildets øvre og nedre overflate. Når de er identiske, er strålen i riktig posisjon, som er vinkelrett på scenen. Lukk denne strålen ved hjelp av lukker 19 (Figur 1A-19).
- Begynn med speil 4 og 6, utfør små justeringer for å plassere den faste strålen midt på skjermen. Lukk denne strålen.
- Infrarød (IR) strålejustering
FORSIKTIG: Utfør alle trinn ved lav lasereffekt av sikkerhetsgrunner.- Juster bølgeplate 14 (figur 1A-14) for å justere forholdet mellom overførte og reflekterte bjelker som deles ved strålesplitteren 2 (figur 1A-2). Strålesplitter 2 reflekterer s-komponenten i laserstrålen og overfører p-komponenten.
- Strålen som passerer gjennom 2, treffer speil 7 (Figur 1A-7), som avleder strålen på det nedre galvaniske speilet. Den skal følge banen til HeNe-strålen på speil 21. Utfør små bevegelser av speil 7 for å oppnå denne posisjoneringen.
- Juster speil 2 slik at strålen som reflekteres av speil 2, treffer speil 10 (figur 1A-10) i en høyde på 57,5 mm.
- Bjelken reflekteres fra speil 10 til speil 8 (figur 1A-8) i en høyde på 57,5 mm. Den påfølgende bjelken skal slå speil 9 i samme høyde. Hvis ikke, gjør små justeringer av speil 10 og 8 etter behov.
- Fjern målet og plasser hodet på strømmåleren over porten i måltårnet.
- Bruk platene 14, 15 og 16 (figur 1A-14,15,16) til å justere kraften til hver laserstråle slik at de er like som vist i figur 1C.
- Sett stråleutvidelse 1 (Figur 1A-1) på plass. Juster den utvidede laserstrålen for å være sirkulær uten koma eller astigmatisme.
- For å teste de optiske fellene, lag en løsning av 1 μm polystyrenperler suspendert i vann. Plasser deretter 10 μL av denne løsningen på et mikroskopglass, legg et deksel på toppen og forsegl med neglelakk. Plasser lysbildet på mikroskopstadiet og test de optiske fellene ved å fange disse 1 μm perlene. Sørg for at perlene suges inn i fellene og holdes stabilt når scenen flyttes. Overlapping bør skje like effektivt fra alle sider av fellen.
2. Mikrofluidisk kammerpreparasjon
- Hvis strømningscellen er en kommersielt konstruert enhet laget av polydimetylsiloksan (PDMS) på en deksel, fortsett til trinn 3. Hvis det er en glassenhet med kontakter festet, fortsett til trinn 4.
- Hvis flytcellen ikke har kontakter festet, må du først binde dem til inngangshullene på mikroskopet. Se trinn 3 for fremgangsmåten for å koble til koblinger.
3. Flytcelleforbindelser ved hjelp av en PDMS-flytcelle
MERK: For oppsettet, se figur 2D.
- Plasser flytcellen på en ren, flat overflate. Hold PTFE-slangen 3 mm fra den frie enden med tang. Skyv slangen inn i den forhåndsformede porten (porten kan støtte 2 bar linjetrykk).
- Gjenta denne fremgangsmåten for hver av de gjenværende portene. Koble innløpsportene til sprøytepumpen og utløpet til en avfallsflaske (figur 4A,B).
- Fyll hver glasssprøyte med 1 ml metanol av spektrofotometrisk kvalitet. Fest hver sprøyte til en koblingsventil. Forsikre deg om at ventilen har utløpet rettet mot avfall og rens hver linje med 50 μL metanol (figur 4C, lukket stilling).
- Bytt utløpsposisjon til flytcellen (figur 4C, åpen posisjon). Pump 800 μL metanol gjennom strømningscellen med en strømningshastighet på 100 μL / t for å fukte overflatene og eliminere bobler.
- Neste dag, gjenta denne prosessen ved å bruke 800 μL ultrarent vann. Flytcellen er nå klar til bruk.
4. Feste av trykkslangekontakter
MERK: For oppsettet, se figur 2F.
- Hvis press-fit slangekontakter skal brukes, fjern forsiktig tape fra den ene siden av kontakten og plasser den over hullet i mikroskopet lysbildet. Trykk ned i noen sekunder. Gjenta prosessen for de gjenværende kontaktene.
- Plasser flytcellen på en ren, flat overflate. Hold PTFE-slangen 3 mm fra den frie enden med tang. Skyv slangen inn i det forhåndsformede hullet i porten og gjenta denne prosedyren for hver av de gjenværende portene.
- Fest slangen fra innløpene til koblingsventilene. Gå videre til trinn 7.
5. Vedlegg av permanente forsamlinger
MERK: For oppsettet, se figur 2A-C.
- Utfør vedlegget enten på en ren, flat overflate eller på en spesialbygd manifold for å holde flytcellen og kontaktene på plass mens liming skjer.
- Plasser flytcellen på en ren, flat overflate eller i den innfelte delen av manifolden (figur 2B). Plasser en liten mengde glasslim på bunnen av forsamlingen og sett inn tetningen.
- Plasser nanoporten over et av inngangshullene på mikroskopsklien. Skyv forsiktig ned og hold på plass uten sideveis bevegelse. Gjenta prosessen for de gjenværende portene.
- La tørke eller klemme på plass i manifolden. Fjern flytcellen forsiktig fra manifolden og sørg for at enhetene stemmer godt overens med inngangsportene i flytcellen. Fortsett til trinn 7 når du er klar.
6. Flytcelleforbindelser og forberedelse
MERK: For oppsettet, se figur 4A, B.
- Plasser en strømningscelle på mikroskopstadiet. Fest slangen med de fingertette kontaktene.
- Fyll hver glasssprøyte med 1 ml metanol av spektrofotometrisk kvalitet. Fest hver sprøyte til en koblingsventil. Forsikre deg om at ventilen har utløpet rettet mot avfall og rens hver linje med 50 μL metanol (figur 4C, lukket stilling).
- Bytt utløpsposisjon til flytcellen (figur 4C, åpen posisjon). Pump 800 μL metanol gjennom strømningscellen med en strømningshastighet på 100 μL / t for å fukte overflatene og eliminere bobler.
- Neste dag, gjenta denne prosessen ved å bruke 800 μL ultrarent vann. Flytcellen er nå klar til bruk.
7. Kontroll av væskestrøm
- Vri koblingsventilene til lukket stilling (figur 4C). Fjern sprøytene, kast restvannet og fyll sprøytene med eksperimentelle løsninger, for eksempel DNA-perler; enzym; og ATP. Sett sprøyter tilbake til pumpen og koble dem til koblingsventilene.
- I denne posisjonen må du manuelt tvinge stemplene ned 5-10 μL for å fjerne eventuelle bobler. Endre koblingsventilposisjonen til Åpen.
- Bruk strømningshastighetsskjemaet for å oppnå en væskestrømningshastighet som er optimal for overlapping og visualisering som beskrevet i tabell 1. Den optimale væskestrømmen for optisk fangst skal muliggjøre stabil fangst av perler, og når DNA er strukket, bør det være B-form (~ 3000 bp / μm).
8. Fangst av polystyrenperler med enkelt-DNA-molekyler festet
- Ved 10x forstørrelse, finn grensen mellom væskestrømmer nær kanalens inngangspunkter. Tilsett olje til 100x-målet og bytt til høyere forstørrelse.
- Åpne skodder for de optiske fellene (enten begge eller en om gangen). De fokuserte laserstrålene skal fange perler og DNA skal strekke seg ut umiddelbart.
- Når et kompleks er fanget, oversetter du scenen vinkelrett på strømmen (figur 3A, C, innfelt). Dette vil flytte det fangede komplekset fra DNA-perleløsningen, inn i strøm 2. Videre oversettelse vil flytte komplekset til stream 3.
9. Rengjøring av flytceller
MERK: Utfør dette daglig.
- Slå av pumpen når eksperimentet er fullført. Vri koblingsventilene til lukket stilling (figur 4C).
- Fjern sprøyter og tøm dem. Skyll tre ganger med filtrert destillert vann.
- Fyll sprøytene med rengjøringsmiddel. Plasser sprøyter i pumpen og koble til koblingsventiler.
- Rens koblingsventiler og endre posisjonen for å åpne. Pump 800 μL rengjøringsmiddel ved en strømningshastighet på 100 μL/t, vanligvis over natten.
- Neste dag, lukk koblingsventilene, og fjern og skyll sprøyter med vann. Skyll strømningscellen og linjene med 4-800 μL vann med en strømningshastighet på 400-800 μL / t. Hvis det er behov for mer anstrengende rengjøring av strømningsceller, bytt ut rengjøringsløsningen med 6 M guanidiumhydroklorid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den første testingen av fellejusteringen og styrken gjøres med 1 μm, ikke-fluorescerende polystyrenperler. Siden det meste av forskningen som gjøres i laboratoriet bruker fluorescens, tester vi videre fellestyrke ved hjelp av 1 μm, Dragon green polystyrenperler (figur 1D, E). Deretter endres arbeidet til optisk fangst av DNA-perlekomplekser der DNA er farget med bis-interkalerende fargestoff YOYO-114,29. Når disse kompleksene er fanget 10-15 μm over dekseloverflaten i en mikrofluidisk strømningscelle, strekker væskestrømmen forbi perlen ut DNA (figur 3B, C). Det er viktig å måle lengden på det væskestrakte DNA for å sikre at det strekkes til sin B-form lengde, som er forventet lengde. For eksempel, for bakteriofag lambda DNA, er hele lengden litt lengre enn 16 μm, noe som tilsvarer 48.504 bp14.
For å karakterisere væskestrømmen ble fluorescerende perler introdusert i strømningsceller med en fokushøyde på 15 μm over dekseloverflaten ved hjelp av forskjellige pumpehastigheter og i løsninger med forskjellig viskositet. Filmer av perleposisjon ble tatt, og perleposisjonen ble sporet ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. Resultatene viser at for perler med en diameter på 1 μm kan lineær hastighet spores nøyaktig ved en pumpestrømningshastighet på 100 μL / t i sukroseløsninger fra 10% -50% (figur 5A). Under lignende forhold kan kraften på perlen beregnes og finnes å variere fra 10 til 400 pN, avhengig av pumpens strømningshastighet og løsningsviskositet (figur 5B). Endelig ble effekten av perlediameter fra 120 til 970 nm på kraft evaluert i forskjellige konsentrasjoner av sukrose. Dataene viser at krefter fra 1-27 pN kan måles ved å feste perler med forskjellig diameter til et motorprotein og be motoren om å trekke den perlen mot væskestrømmen (figur 5C).
Figur 1: Optisk layout og demonstrasjon av overlappingsaktivitet. (A) Skjematisk for det optiske oppsettet med IR-strålen i rødt og HeNe-strålen i svart. (B) Fotografi av optiske komponenter montert på et brødbrett. Komponentnumrene i panelene A og B er som følger: 1), Beam expander; 2), Interferensspeil (Rsmax = 1064 nm; Tpmaks = 1064 nm); 3), Interferensspeil (633 nm; R = 50%; T = 50%); 4-6), Interferensspeil (Rmax = 633 nm); 7), Interferensspeil (R max = 1064 nm; Tmaks = 633 nm); 8), Interferensspeil (Rsmax = 1064 nm; Tp maks = 1064 nm, Tmaks = 633 nm); 9), Interferensspeil (R max = 1064 nm, 633 nm; Tmaks = 1064 nm, 633 nm); 10), Interferensspeil (R max = 1064 nm); 11), objektivlinse, f = 110 nm; 12), Telan linse; 13), Galvaniske speil; 14-16), rotatorer (/2); 17), IR-skannekanallukker; 18), Synlig kanal lukker; 19), IR Fast kanal lukker; 20), Strålestopp og 21), Interferensspeil (R max = 1064 nm; Tmaks = 633 nm). (C) Måling av utgangseffekt. Utgangseffekten fra laseren måles før laserhodet installeres i det optiske oppsettet. Når fellejusteringen er fullført, måles strålekraften etter 100x-målet for hver felle. (D) og (E) Bilder som demonstrerer stabil, optisk fangst av 1 μm fluorescerende perler. F, fast felle og M, mobilfelle med mobilfellen i skannemodus som beveger seg gjennom en liten (D) eller stor (E) sirkel ved 30 mHz. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Mikrofluidiske strømningsceller. (A) Montering av en trekanals strømningscelle laget av borosilikatglass. (B) En manifold for stabilt å plassere strømningsceller under koblingsbinding. Topp, basen av aluminiumsmanifolden med en 1 mm innfelt seksjon for å sideplassere strømningscellen. De fire stolpene (en i hvert hjørne) fører lokket på manifolden på plass, mens de mer sentralt plasserte gjengede boltene brukes til å klemme lokket på plass. Bunn, manifoldlokk med borede hull for å matche stolpene og boltene på manifoldbasen. (1), muttere som festes til manifoldbaseboltene; (2) fjærer som er plassert mellom mutrene og manifoldlokket for å gi lett spenning under bindingsprosessen. (C) Et nærbilde av konvergensen av innløpskanalene i en felles enkeltvæskestrøm i en glassflytcelle med kontakter som allerede er festet. Et kvartal plasseres ved siden av flytcellen som referanse. (D) Et bilde av PDMS-flytcellen. PDMS-lagene er 3 mm tykke. (E) En smeltet silikastrømcelle med luerkontakter. (F) En borosilikatglass flytcelle med press-fit kontakter på plass. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Væskestrømningsegenskaper gjennom en glassstrømningscelle. (A) Væskestrømmen i strømningscellen er laminær. Skjemaet viser strømningscellen fra toppen for å demonstrere at interkanaldiffusjon er hovedkilden til blanding mellom tilstøtende væskestrømmer. Strømningsretningen er indikert med blå piler, og de enkelte strømmene er farget hvite, lysegrå og hvite. De utvidede områdene av tverrgående diffusjon mellom kanaler er indikert i rødt. Innfellingen viser et fluorescensbilde av tilstøtende væskestrømmer ved 10x forstørrelse med fluorescerende merkede DNA-perlekomplekser i den nedre strømmen og buffer bare i den øvre strømmen. De hvite flekkene i den øvre strømmen er skuddstøy fra CCD-kameraet. (B) Strømningsprofilen (lys lilla) i laminære strømningsceller er parabolsk. Strømningscellen ses fra siden og strømningsretningen er angitt over hver celle. De raskeste væskehastighetene forekommer i strømningscellen som ligger i midten, mens de tregeste væskehastighetene oppstår ved siden av strømningscelleoverflatene. Følgelig, for et optisk fanget DNA-perlekompleks plassert i midten av strømningscellen, strekker væskestrømmen bakteriofagen λ DNA-molekylet (48.504 bp) til 16 μm (B-form) slik at klar visualisering kan gjøres (venstre bilde). I motsetning til dette opplever det samme molekylet som er plassert nær overflaten av strømningscellen lave strømningshastigheter og kan ikke strekkes ut. (C) Et enkelt DNA-perlekompleks er plassert i en strømningscelle. Ulike dybdestrømningsceller kan brukes, men i hvert tilfelle kan strålejusteringene stilles inn slik at optimal fangst skjer 10-20 μm over dekseloverflaten, noe som eliminerer overflateeffekter og har stabil strømning slik at DNA-molekyler kan strekkes til B-form. Som angitt i bildet til venstre i (C), strekkes DNA-et for å muliggjøre tydelig visualisering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Strømnings- og reaksjonskontroll av optisk fanget DNA i en strømningscelle i mikroskopstadiet . (A) Parring av strømningscellen til en sprøytepumpe. Et fotografi av en trekanals strømningscelle koblet til en sprøytepumpe via treveis koblingsventiler presenteres. Strømningscellen holdes på plass på et motorisert stadium i et omvendt mikroskop. Strømningscellen er koblet til en avfallsledning (venstre) og koblingsventiler (stiplet cyan sirkel) via oransje, 500 μm rør (indikert med grønn tape). Ventilene er stabilt montert på en spesialbygd manifold tilpasset sprøytepumpeapparatet, som huser 1 ml gasstette sprøyter (gule piler avgrenser stempler). Avfallsledningene brukes til å fjerne luftbobler som kan fanges i koblingsventilen under sprøytebytte. (B) Nærbilde av flytcellen med tre kanaler. For å lette visualisering av væskestrømmer, har de ytre blitt farget med konditorfarge med den sentrale strømmen som bare inneholder vann. Den zoomede regionen indikerer hvordan et optisk fanget perle-DNA-molekylkompleks oversettes fra en væskestrøm til den neste (blå pil) ved å oversette scenen vinkelrett på strømmen (svart pil). (C) Skjemaer for treveis koblingsventiler som indikerer deres driftsposisjoner. Bokstavbetegnelsene F, S og W tilsvarer retningsvæsken og kan strømme til henholdsvis strømningscellen, sprøyten og avfallet. En port lukkes permanent som indikert av den svarte pluggen på toppen av hvert skjema. I åpen eller operativ stilling (venstre panel) passerer væskestrømmen direkte gjennom koblingsventilen fra sprøyten (S) til strømningscellen (F). I lukket posisjon (høyre panel) dreies hjulet slik at flytcellen forsegles fra miljøet. I denne posisjonen er strømmen rettet mot avfall og sprøyter kan slås ut uten å introdusere luftbobler i strømningscellen. Siden ventilene har et dødvolum på 6 μL, er det svært lite løsning som går til spille når du renser linjer før du går tilbake til Open-konfigurasjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Perlebevegelse og motkraft påvirkes av væskestrøm. (A) Lineær dråpehastighet påvirkes av pumpehastighet og sukrosekonsentrasjon. (B) Den motsatte kraften på en perle påvirkes av løsningsviskositeten. (C) Perlediameter påvirker kraften på perler under strømning. I alle eksperimenter ble fluorescerende perler brukt (Dragon green). I (A) og (B) ble det brukt 0,97 μm diameter perler og i (C) ble perler med forskjellig diameter brukt. Sukroseløsninger ble laget i ultrarent vann, filtrert gjennom 0,2 μm filtre og brytningsindeks målt ved hjelp av et håndholdt refraktometer, med viskositet bestemt i centipoise ved hjelp av ISCO-tabeller og til slutt konvertert til SI-enheter i mPa.s. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Strømningshastighet (μL/t)b | Tid per trinn (min) | Volum dispensert (μL) |
| 800 | 5 | 67 |
| 400 | 5 | 33 |
| 200 | 5 | 17 |
| 100 | 5 | 8 |
| 50 | 5 | 4 |
| 25 | 5 | 2 |
| 15 | 5 eller flere | 1 eller flere |
| en. Dette er væskestrømningshastigheter beregnet av sprøytepumpeprogramvaren og er unike for hver sprøytediameter som brukes. Strømningshastighetene muliggjør rask fylling av linjene og strømningskammeret (800 μl/t), etterfulgt av en gradvis reduksjon til den ideelle strømningshastigheten for overlapping og visualisering | ||
| b. Sprøytepumpen kan styres fra tastaturet eller ved hjelp av programvare levert av leverandøren. | ||
Tabell 1: Væskestrømningshastigheter for å minimere bobler og oppnå stabil fangst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den forsiktige monteringen av strømningssystemet er avgjørende for det vellykkede resultatet av eksperimenter 4,6. En av de mest utfordrende aspektene ved protokollen er festing av kontakter til glassoverflaten. For dette bruker vi følgende to tilnærminger: press-fit fit slangekontakter og nanoport-enheter. Press-fit-kontakter fester seg lett til glass etterfulgt av å skyve PTFE-rør inn i de forhåndsformede hullene ved hjelp av tang. Når et mer stabilt vedlegg er nødvendig, foretrekkes binding av nanoport-enheter. Ved forsiktig bruk og rengjøring kan en enkelt glassflytcelle med permanente enheter brukes i mer enn 1 år. Hvis strømningsceller må byttes ut oftere, kan PDMS-strømningsceller brukes, da de er et utmerket og billigere alternativ. De kan gjenbrukes, men PDMS er utsatt for hevelse, noe som kan endre væskestrømningsadferden over tid.
Både glass- og PDMS-strømningsceller er ikke uforgjengelige. I laboratoriet er den maksimale strømningshastigheten som brukes 800 μL / t. Hvis dette overskrides daglig og/eller over lengre tid, kan strømningscellevridning (glassstrømningsceller) og forvrengning av PDMS forekomme. Mens den første fukteprosedyren med metanol og vann tar tid, er det vel verdt det da alle bobler elimineres, og også lekkasjer ved kontakter kan oppdages. Strømningscellene beskrevet her gir fleksibilitet til eksperimentene som gjøres. Ved hjelp av disse tilnærmingene til forskjellige strømningsceller, rør og festing av forskjellige kontakter, kan eksperimentelle forhold lett tilpasses og raskt optimaliseres for å sikre at optimale data oppnås. Y-formede kanalstrømningsceller presenteres, men et stort utvalg av mikrofluidiske enhetsdesign er tilgjengelig fra flere selskaper både uten og med kontakter festet. Dette gir etterforskeren enda større fleksibilitet i eksperimentell design.
Bruken av fireveis koblingsventiler er en enkel og effektiv metode som sikrer at når strømningssystemet er montert og testet, blir det effektivt et lukket miljø, hvor forurensning er minimal, og bobler elimineres. Sistnevnte er kritisk da bobler har en tendens til å komprimere og dekomprimere tilfeldig under et eksperiment, og dette forstyrrer væskestrømmen som forårsaker at fangede DNA-molekyler beveger seg på uventede måter og til og med går i stykker. Det bør utvises stor forsiktighet for å sikre at de forhindres i å danne seg i systemet.
Til slutt er systemet beskrevet her optimalisert for visuell biokjemi hvor nøye analyse av DNA, perler festet til proteiner eller fluorescerende merkede proteiner kan utføres. Selv om systemet ikke er designet for å gjøre kraftmålinger med de doble fellene og tilsetningen av kvadrantfotodetektorer, kan krefter måles ved å feste perler med forskjellig diameter til DNA-motorproteiner, for eksempel, og be motoren om å trekke denne perlen mot væskestrøm. Ved å variere løsningsviskositet, væskestrøm og dråpediameter kan et stort utvalg av motstridende krefter påføres for å gi detaljert innsikt i motorisk proteinfunksjon (figur 5). Dette er en enkel og billig måte å måle krefter knyttet til biologiske transaksjoner, men det mangler presisjonen forbundet med mer følsomme tilnærminger. Når den visuelle biokjemiske tilnærmingen kombineres med følsomme kraftdeteksjonsmetoder, kan mer komplette bilder av biokjemiske reaksjoner gis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forskning i Bianco-laboratoriet støttes av NIH-tilskudd GM100156 og GM144414 til PRB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x objective | Leica | 506318 or 506038 | Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging |
| 10X Objective | Leica | 506263 | Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell |
| 1 mm fluorescent beads | Bangs Labs | FSDG004 | Used for tap performance, focal position determination |
| 1 mm polystyrene beads | Bangs Labs | CPO1004 | Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules |
| 63x objective | Leica | 506081 | Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens |
| Alignment laser | Lumentum | 1100 series | 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics |
| Beam alignment camera | Amscope | MU303 | A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position |
| Camera control and Image capture software | Hamamatsu | HCImage | Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching |
| Camera; Orca flash 4 | Hamamatsu | c13440-20cu | CCD camera for imaging of single-molecule experiments |
| C-mount for the beam alignment camera | Spot imaging solutions | DE50CMT | Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment |
| C-mount for the Orca Flash 4 camera | Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects. | ||
| Cy5 fluorescence filter cube | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only |
| Fitc-Txred fluorescence filter cube | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed |
| Fluidics tubing | Grace Bio | 46004 | PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used |
| GFP fluorescence filter cube | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only |
| Glass flow cells | Translume | Custom | Clear flow channels for imaging (Fig. 2E) |
| Glass glue | Loctite | 233841 | Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells |
| Glass/PDMS sandwich flow cells | CIDRA Precision services | Custom design | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C) |
| Hamilton Cleaning solution | Hamilton | 18311 | Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Image analysis software | Media cybernetics | Image Pro Premiere | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image analysis software | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image display card | Melles Griot | 06 DLA 001 | Alternate product from Thorlabs: VRC5 |
| Immersion oil | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F fluorescence free |
| Laser beam alignment tools | Thor labs | FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 | Used to ensure beams are horizontal and at the correct height |
| Laser beam viewer | Canadian Photonics labs | IR 3150 | Used to image IR beam spots on mirrors and targets |
| Laser power meter | Thor labs | Measurement of laser output as well as trap strength | |
| Laser safety glasses (HeNe) | Thor labs | LG7 or 8 | Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm |
| Laser safety glasses (IR) | Thor labs | LG11 | Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm |
| Mcherry fluorescence filter cube | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only |
| Microscope | Leica | DMIRE2 | DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror |
| Microscope control software | UCSF/shareware | uManager | Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control |
| Nanoport assembly | IDEX | N333 | Connectors that are bonded to flow cells |
| Optical table support | Thor Labs | PA52502 | Active isolation table support |
| Optics and lenses | Solar TII | Various | Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system |
| PDMS flow cells | ufluidix | Custom | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D) |
| PEEK tubing | IDEX | 1532 | Provides excellent connection to flow cells and switching valves |
| Pinkel fluorescence filter cube | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly |
| Press fit tubing connectors | GraceBio | 46003 | Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass |
| Scanning mirrors | GSI Lumonics | VM500 | Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific |
| Stage | Leica | ||
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 68042-08 | Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration |
| Switching valves | IDEX | V-101T | Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells |
| Syringe and valve manifold | Machine shop | None | Custom built |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controls fluid flow through flow cells |
| Syringe pump software | Harvard Apparatus | 70-6000 | Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow |
| Syringes | Hamilton | 81320 | Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers |
| Table top | Thor Labs | T36H | Optical table top or breadboard |
| Trapping laser | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser |
References
- Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
- Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. 491 (2019).
- Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
- Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
- Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
- Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
- Vermeulen, K. C., Mameren, J. v Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).
- Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
- Weibel, D. B., Whitesides, G. M.
- Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
- Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
- Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
- Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
- Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
- Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).
- Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
- Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
- Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
- Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
- Merenda, F., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G. , 6483 (2007).
- Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
- Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
- Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
- Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
- Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).
