Summary
Visuell, enmolekylär biokemi som studeras genom mikrofluidiska kamrar underlättas kraftigt med hjälp av glasfat, gastäta sprutor, stabila anslutningar av slangar till flödesceller och eliminering av bubblor genom att placera omkopplingsventiler mellan sprutorna och slangen. Protokollet beskriver dubbla optiska fällor som möjliggör visualisering av DNA-transaktioner och intermolekylära interaktioner.
Abstract
Visuell biokemi är en kraftfull teknik för att observera de stokastiska egenskaperna hos enskilda enzymer eller enzymkomplex som döljs i medelvärdet som äger rum i bulkfasstudier. För att uppnå visualisering fokuseras dubbla optiska pincett, där en fälla är fixerad och den andra är mobil, i en kanal i en mikrofluidisk kammare med flera strömmar placerad på scenen i ett inverterat fluorescensmikroskop. Den optiska pincetten fångar enstaka molekyler av fluorescerande märkt DNA och vätska strömmar genom kammaren och förbi de fångade pärlorna, sträcker DNA till B-form (under minimal kraft, dvs 0 pN) med nukleinsyran observerad som en vit sträng mot en svart bakgrund. DNA-molekyler flyttas från en ström till en annan genom att översätta scenen vinkelrätt mot flödet för att möjliggöra initiering av reaktioner på ett kontrollerat sätt. För att uppnå framgång paras mikrofluidiska anordningar med optiskt klara kanaler till glassprutor som hålls på plats i en sprutpump. Optimala resultat använder kontakter som är permanent bundna till flödescellen, slangar som är mekaniskt styva och kemiskt resistenta och som är anslutna till omkopplingsventiler som eliminerar bubblor som förbjuder laminärt flöde.
Introduction
Förmågan att visualisera protein-DNA-interaktioner på enmolekylnivå och i realtid har gett betydande inblick i genomstabilitet 1,2. Förutom att arbeta med enstaka molekyler av DNA en i taget, ger möjligheten att se transaktioner mellan enskilda molekyler i närheten ytterligare insikt 3,4,5. Manipuleringen av ytterligare DNA-molekyler kräver både ytterligare optiska fällor såväl som högkvalitativa, flerkanaliga, mikrofluidiska flödesceller6.
Det finns flera metoder tillgängliga för att generera mer än en optisk fälla. Dessa inkluderar galvanometerskanningsspeglar, akustiska optiska modulatorer och diffraktiv optik, som genererar holografisk optisk pincett 4,7,8,9. Ofta producerar skanningsspeglar och akustiska optiska modulatorer fällor som timeshare. I den inställning som beskrivs här delas strålen från en enda Nd: YAG-laser på polarisation, och sedan styr galvanometerlaserskanningsspeglar positionen för det som kallas mobilfällan (figur 1)4. För att underlätta placeringen av speglar och filter för att rikta fångststrålen till mikroskopmålets bakre bländare används en HeNe-laser. Detta gör den övergripande inriktningen enklare eftersom HeNe-strålen är synlig för blotta ögat, medan infraröda strålar inte är det. HeNe-balken är också säkrare att arbeta med vilket gör placeringen av speglar och andra komponenter mindre stressande. Ursprungligen är strålvägen för denna laser skild från 1064 nm-strålen, men införs i samma strålväg och sedan i mikroskopmålet. När fysisk inriktning har uppnåtts görs positionering av 1064 nm-strålen ovanpå HeNe-strålen och detta underlättas genom användning av en infraröd tittare och olika strålavbildningsverktyg för att visualisera strålposition och kvalitet. Därefter införs strålutvidgaren och den resulterande expanderade infraröda strålen är inriktad på målets bakre öppning. Slutligen avlägsnas målet och effekten i varje polariserad stråle mäts och justeras med λ/2 vågplattor för att vara lika (figur 1C). Effektmätningar görs också när målet har returnerats och vanligtvis finns det en effektförlust på 53%. Det finns dock tillräcklig kraft för att bilda stabila fasta och rörliga optiska fällor i fokalplanet (figur 1D).
För att avbilda DNA-transaktioner spelar mikrofluidiska flödesceller en nyckelroll eftersom de tillåter kontrollerade mätningar på enmolekylnivå med hög rumslig och tidsmässig upplösning (figur 2). Termen mikrofluidik avser förmågan att manipulera vätskor i en eller flera kanaler med dimensioner från 5-500 μm10,11. Termen ström avser den faktiska vätskan i en kanal och kanalen hänvisar till den fysiska kanalen där en vätskeström eller strömmar rör sig. Enkanalsflödescelldesign har en gemensam, fysisk kanal där reaktioner observeras och det finns vanligtvis bara en vätskeström närvarande. Således är dessa mönster kända som enströmsflödesceller. Däremot definieras flerströmsflödesceller som en mikrofluidisk anordning där två eller flera ingångskanaler konvergerar till en enda, gemensam, fysisk kanal (figur 2A). Inom den gemensamma kanalen flyter vätskeströmmarna som härstammar från de enskilda kanalerna parallellt med varandra och förblir separerade med endast minimal blandning mellan dem som uppstår på grund av diffusion (figur 2B). I de flesta experimentella inställningar skjuter en enda pump vätskor in i varje kanal med samma hastighet. Däremot, när gränsstyrning används, trycker tre eller flera, oberoende styrda pumpar vätskor genom kanalerna. Varje pump arbetar dock med olika hastighet men nettoflödet i den gemensamma kanalen är konstant12. Detta möjliggör snabbt utbyte av huvudkanalkomponenter helt enkelt genom att ändra pumphastigheten.
Förutom laminärt flöde är en annan kritisk faktor den paraboliska hastighetsprofilen i den laminära vätskeströmmen. Den högsta flödeshastigheten inträffar i mitten av strömmen och den långsammaste inträffar bredvid ytorna (figur 2C)13. Denna profil måste anses helt sträcka en DNA-molekyl som är fäst vid en pärla som hålls i strömmen för exakt visualisering av fluorescerande DNA och exakta enmolekylanalyser. Här sträcks DNA till B-form och hålls på plats under 0 pN kraft. För att uppnå detta bör fokuseringen av den optiska fällans läge vara till en position 10-20 μm från bottenytan (figur 2D). Försiktighet måste vidtas så att DNA-molekylen inte sträcker sig bortom B-form eftersom detta kan hämma enzymreaktioner. Under typiska buffertförhållanden är 1 μm = 3 000 bp DNA14. Dessutom, genom att fånga 10-20 μm från täckglaset, placeras DNA-komplexet långt från ytan vilket minimerar ytinteraktioner.
Många metoder har använts för att skapa mikrofluidiska enhetskanaler och dessa kan göras i laboratoriet eller flödesceller kan köpas från kommersiella källor 6,15,16,17. De optimala materialen som används för att konstruera flödescellerna måste vara mekaniskt styva, optiskt transparenta med låg fluorescens och ogenomträngliga för organiska lösningsmedel6. Ofta används borosilikatflottglas eller smält kiseldioxid för att ge en stabil flödesmiljö under en längre tid som är lämplig för optisk fångst, visualisering och kraftdetektering. Dessa material tillåter också användning av icke-vattenhaltiga lösningsmedel (t.ex. metanol av spektrofotometrisk kvalitet) för att förenkla ytvätning och avlägsnande av luftbubblor och denatureringsmedel (t.ex. 6M guanidiniumhydroklorid) eller tvättmedel för att rengöra flödescellen. Slutligen varierar metoderna som används för att införa vätskor i flödesceller från komplexa vakuumpumpsystem till enstaka sprutpumpar 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. I det tillvägagångssätt som beskrivs här används en sprutpump som rymmer upp till 10 sprutor (figur 3A). Detta ger flexibilitet att använda enkanaliga flödesceller eller flödesceller med flera inloppskanaler. Här används en trekanals flödescell och paras med sprutor som hålls på plats på sprutpumpen med hjälp av polyeter-eter-keton (PEEK) -slang (figur 3A-C). Flödet av vätskor styrs av fyrvägs omkopplingsventiler och tjänar därmed till att minimera införandet av bubblor i flödescellen (figur 3A,D). Dessutom rekommenderas Hamilton gastäta sprutor som har styva glasväggar och polytetrafluoretylen (PTFE)-belagda kolvar eftersom de ger exceptionellt jämn kolvrörelse som är nödvändig för att få ett jämnt flöde14,27.
I det beskrivna experimentella systemet har flödesceller med två till fem inloppskanaler använts. Antalet inloppskanaler dikteras av experimentet som görs. För studien av RecBCD och Hop2-Mnd1 var två strömkanaler tillräckliga14,28. För helikasen var enzymet bundet till den fria änden av DNA och översattes till en ström innehållande magnesium och ATP för att initiera translokation och avveckling. För Hop2-Mnd1 översattes optiskt fångat DNA till den intilliggande vätskeströmmen innehållande proteiner och buffert ± tvåvärda metalljoner. Användningen av trekanaliga flödesceller gör det möjligt för en att fånga DNA i ström 1, översätta DNA till ström 2 för att tillåta proteinbindning att ske och sedan strömma 3 där ATP är närvarande, till exempel för att initiera reaktioner. En variant på ovanstående är att använda fluorescerande märkt protein i kanal 2, vilket resulterar i att vätskeströmmen är helt vit och utesluter visualisering av DNA. När denna molekyl översätts till ström 3 är både proteiner och DNA nu synliga när reaktioner initieras.
Användningen av fyrvägs omkopplingsventiler för att styra vätskeflödet är en kritisk komponent i systemet för att eliminera bubblor i flödescellerna. Bubblor är skadliga för stabilt vätskeflöde när de drar ihop sig och expanderar på oförutsägbara sätt, vilket resulterar i snabba förändringar i flödeshastighet och införande av turbulens. När ventilerna är placerade mellan sprutor och inloppsslangar kopplas flödesbanan bort genom att byta ventilläge när sprutorna byts ut. När den nya sprutan sätts på plats kan kolven tryckas ned manuellt så att >6 μL matas ut (ventilens dödvolym) och detta eliminerar bubblor nästan helt.
Kopplingen av kopplingar till flödesceller är ofta det hastighetsbegränsande steget i flödescellanvändningen. Vi beskriver användningen av två typer av kontakter: avtagbara som kallas press-fit och permanenta (nanoportaggregat). De avtagbara kontakterna är enkla att fästa vid en flödescell och olika typer av flexibla slangar utöver den rekommenderade PTFE kan testas med dessa kontakter. Detta är ett snabbt och kostnadseffektivt sätt att testa slangar och kontakter utan att offra dyrare glasflödesceller. Däremot är nanoportaggregat fästa permanent, tål tryck upp till 1 000 psi, och i våra händer är deras användning begränsad till PEEK-rör med olika diametrar. Detta är inte en nackdel eftersom PEEK-slangar företrädesvis används. En enda glasflödescell med permanenta enheter fästa kan återanvändas i mer än 1 år med noggrann användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Laserfällans inriktning och testning med polystyrenpärlor
OBS: För inställningen, se figur 1A,B.
VARNING: Experimentalisten bör bära lämpliga skyddsglasögon eller laserskyddsglasögon under laserstrålens inriktning. Eftersom det optiska pincettsystemet som beskrivs häri använder både HeNe- och IR-strålar krävs två separata uppsättningar lasersäkerhetsglas.
- HeNe Beam-inriktning
- Placera alla optiska komponenter på brödbrädan. Rikta in brödbrädan så att den är så nära 90° vinkel som möjligt i förhållande till mikroskopet.
- Fäst parningsröret som innehåller objektivet och telanlinsen på mikroskopet (figur 1A-11,12).
OBS: Telan-linsen är ett linssystem som används för att fokusera bilden på det mellanliggande bildplanet i okularen. - Slå på HeNe-lasern och öppna slutaren (bild 1A-18). Strålen ska träffa filtret (figur 1A-3) på en höjd av 54 mm som reflekterar 50% av ljuset på spegel 5 (figur 1A-5). De återstående 50% av strålen träffar spegel 4 (figur 1A-4) i samma höjd som spegel 3.
- Justera spegel 4 (figur 1A-4) så att strålen träffar spegel 6 (figur 1A-6) på en höjd av 51 mm.
- Justera spegel 6 (figur 1A-6) så att strålen riktas mot den nedre galvaniska spegeln i en höjd av 51 mm. Strålen som går ut från den övre galvaniska spegeln kommer att vara 57,5 mm.
- Justera spegel 3 (figur 1A-3) så att denna stråle träffar spegel 5 (figur 1A-5) på en höjd av 57,5 mm. När den har reflekterats från spegel 5 ska strålen träffa spegel 9 (figur 1A-9) i samma höjd. Strålen rekombineras effektivt vid spegel 9, passerar genom målet och telanlinssystemet till spegel 21 (figur 1A-21), vilket återspeglar den i målet.
- Placera en ren mikroskopbild på mikroskopets scen. Slå på kameran och avbilda strålarna från de fasta och skanningsstrålarna individuellt på skärmen. Börja med spegel 3, sedan 5 och 9, slutligen 21, utför små justeringar för att placera den fasta strålen i mitten av skärmen.
- För att säkerställa att vinkeln på strålen som lämnar spegeln 21 är 90 °, ändra mikroskopets Z-höjd och placera strålen som avbildas på bildens övre och nedre ytor. När de är identiska är strålen i rätt läge, vilket är vinkelrätt mot scenen. Slutför denna stråle med slutare 19 (figur 1A-19).
- Börja med speglarna 4 och 6, utför små justeringar för att placera den fasta strålen i mitten av skärmen. Stäng den här strålen.
- Infraröd (IR) stråljustering
VARNING: Utför alla steg med låg lasereffekt av säkerhetsskäl.- Justera vågplattan 14 (figur 1A-14) för att justera förhållandet mellan överförda och reflekterade strålar som delas vid stråldelaren 2 (figur 1A-2). Stråldelare 2 reflekterar laserstrålens s-komponent och överför p-komponenten.
- Strålen som passerar genom 2, träffar spegel 7 (figur 1A-7), som avböjer strålen på den nedre galvaniska spegeln. Den ska följa HeNe-strålens väg till spegel 21. Utför små rörelser av spegel 7 för att uppnå denna positionering.
- Justera spegel 2 så att strålen som reflekteras av spegel 2, träffar spegel 10 (figur 1A-10) på en höjd av 57,5 mm.
- Strålen reflekteras från spegel 10 till spegel 8 (figur 1A-8) på en höjd av 57,5 mm. Den efterföljande strålen ska slå spegel 9 i samma höjd. Om inte, gör små justeringar av speglarna 10 och 8 efter behov.
- Ta bort målet och placera kraftmätarens huvud över porten i måltornet.
- Använd plattorna 14, 15 och 16 (figur 1A-14,15,16) för att justera effekten för varje laserstråle så att de är lika som visas i figur 1C.
- Sätt balkutvidgare 1 (figur 1A-1) på plats. Justera den expanderade laserstrålen så att den är cirkulär utan koma eller astigmatism.
- För att testa de optiska fällorna, gör en lösning av 1 μm polystyrenpärlor suspenderade i vatten. Placera sedan 10 μL av denna lösning på ett mikroskopglas, placera en täckglas ovanpå och försegla med nagellack. Placera bilden på mikroskopsteget och testa de optiska fällorna genom att fånga dessa 1 μm pärlor. Se till att pärlorna sugs in i fällorna och hålls stabilt när scenen flyttas. Fångst bör ske lika effektivt från alla sidor av fällan.
2. Beredning av mikrofluidiska kammare
- Om flödescellen är en kommersiellt konstruerad anordning tillverkad av polydimetylsiloxan (PDMS) på ett täckglas, fortsätt till steg 3. Om det är en glasanordning med anslutna kontakter, fortsätt till steg 4.
- Om flödescellen inte har kopplingar fästa, binda dem först till ingångshålen på mikroskopglaset. Se steg 3 för stegen för att ansluta kontakter.
3. Flödescellsanslutningar med hjälp av en PDMS-flödescell
OBS: För installationen, se figur 2D.
- Placera flödescellen på en ren plan yta. Håll PTFE-slangen 3 mm från den fria änden med pincett. Tryck in slangen i den förformade porten (porten kan stödja 2 bar ledningstryck).
- Upprepa den här proceduren för var och en av de återstående portarna. Anslut inloppsportarna till sprutpumpen och utloppet till en avfallsflaska (figur 4A,B).
- Fyll varje glasspruta med 1 ml spektrofotometrisk metanol. Fäst varje spruta på en omkopplingsventil. Se till att ventilen har utloppet riktat mot avfall och rensa varje linje med 50 μl metanol (figur 4C, stängt läge).
- Växla utloppsläget till flödescellen (bild 4C, öppet läge). Pumpa 800 μl metanol genom flödescellen med en flödeshastighet på 100 μl/h för att väta ytorna och eliminera bubblor.
- Nästa dag, upprepa denna process med 800 μL ultrarent vatten. Flödescellen är nu klar att användas.
4. Fastsättning av pressmonterade slanganslutningar
OBS: För installationen, se figur 2F.
- Om slanganslutningar med presspassning ska användas, ta försiktigt bort tejpen från ena sidan av kontakten och placera den över hålet i mikroskopglaset. Tryck ner i några sekunder. Upprepa processen för de återstående anslutningarna.
- Placera flödescellen på en ren plan yta. Håll PTFE-slangen 3 mm från den fria änden med pincett. Tryck slangen i det förformade hålet i porten och upprepa proceduren för var och en av de återstående portarna.
- Fäst slangar från inloppen till omkopplingsventilerna. Fortsätt till steg 7.
5. Fastsättning av fasta enheter
OBS: För installationen, se figur 2A-C.
- Utför fästet antingen på en ren, plan yta eller på ett specialbyggt grenrör för att hålla flödescellen och kontakterna på plats medan limning sker.
- Placera flödescellen på en ren plan yta eller i den infällda delen av grenröret (figur 2B). Placera en liten mängd glaslim på botten av enheten och sätt in tätningen.
- Placera nanoporten över ett av ingångshålen på mikroskopglaset. Tryck försiktigt ner och håll på plats utan sidorörelse. Upprepa processen för de återstående portarna.
- Låt torka eller kläm fast på plats i grenröret. Ta försiktigt bort flödescellen från grenröret och se till att enheterna stämmer väl överens med ingångsportarna i flödescellen. Fortsätt till steg 7 när du är klar.
6. Flödescellanslutningar och förberedelse
OBS: För installationen, se figur 4A,B.
- Placera en flödescell på mikroskopsteget. Fäst slangen med de fingertäta kontakterna.
- Fyll varje glasspruta med 1 ml spektrofotometrisk metanol. Fäst varje spruta på en omkopplingsventil. Se till att ventilen har utloppet riktat mot avfall och rensa varje linje med 50 μl metanol (figur 4C, stängt läge).
- Växla utloppsläget till flödescellen (bild 4C, öppet läge). Pumpa 800 μl metanol genom flödescellen med en flödeshastighet på 100 μl/h för att väta ytorna och eliminera bubblor.
- Nästa dag, upprepa denna process med 800 μL ultrarent vatten. Flödescellen är nu klar att användas.
7. Kontroll av vätskeflödet
- Vrid omkopplingsventilerna till stängt läge (bild 4C). Ta bort sprutorna, kassera restvattnet och fyll sprutorna med experimentella lösningar, till exempel DNA-pärlor; enzym; och ATP. Sätt tillbaka sprutorna till pumpen och anslut dem till omkopplingsventilerna.
- I detta läge tvingar du ner kolvarna manuellt 5-10 μL för att ta bort eventuella bubblor. Ändra omkopplingsventilens läge till Öppna.
- Använd flödeshastighetsschemat för att uppnå en vätskeflödeshastighet som är optimal för svällning och visualisering enligt beskrivningen i tabell 1. Det optimala vätskeflödet för optisk fångst bör möjliggöra stabil fångst av pärlor och när DNA har sträckts ut bör det vara B-form (~ 3,000 bp / μm).
8. Fångst av polystyrenpärlor med enstaka DNA-molekyler fästa
- Vid 10x förstoring, lokalisera gränsen mellan vätskeströmmar nära kanalens ingångspunkter. Tillsätt olja till 100x-målet och byt till den högre förstoringen.
- Öppna fönsterluckorna för de optiska fällorna (antingen båda eller en i taget). De fokuserade laserstrålarna ska fånga pärlor och DNA ska sträcka ut sig omedelbart.
- När ett komplex har svällts översätter du scenen vinkelrätt mot flödet (figur 3A,C, infälld). Detta kommer att flytta det fångade komplexet från DNA-pärllösningen till ström 2. Ytterligare översättning kommer att flytta komplexet till ström 3.
9. Rengöring av flödesceller
OBS: Utför detta dagligen.
- Stäng av pumpen när experimentet är klart. Vrid omkopplingsventilerna till stängt läge (bild 4C).
- Ta bort sprutorna och töm dem. Skölj tre gånger med filtrerat destillerat vatten.
- Fyll sprutorna med rengöringslösning. Placera sprutor i pumpen och anslut till omkopplingsventiler.
- Rensa omkopplingsventiler och ändra läget för att öppna. Pumpa 800 μl rengöringslösning med en flödeshastighet på 100 μl/h, vanligtvis över natten.
- Nästa dag stänger du omkopplingsventilerna och tar sedan bort och sköljer sprutorna med vatten. Skölj flödescellen och ledningarna med 4-800 μl vatten med en flödeshastighet på 400-800 μl/h. Om mer ansträngande rengöring av flödesceller krävs, byt ut rengöringslösningen med 6 M guanidiumhydroklorid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den första testningen av fällans inriktning och styrka görs med 1 μm, icke-fluorescerande polystyrenpärlor. Eftersom det mesta av forskningen som gjorts i laboratoriet använder fluorescens, testar vi ytterligare fällstyrka med 1 μm, Dragon gröna polystyrenpärlor (Figur 1D, E). Därefter övergår arbetet till optisk fångst av DNA-pärlkomplex där DNA:t färgas med det bis-interkalerande färgämnet YOYO-114,29. När dessa komplex fångas 10-15 μm över täckytan i en mikrofluidisk flödescell, sträcker sig vätskeflödet förbi pärlan ut DNA (figur 3B,C). Det är viktigt att mäta längden på det vätskesträckta DNA:t för att säkerställa att det sträcks ut till sin B-formlängd, vilket är den förväntade längden. Till exempel, för bakteriofag lambda DNA, är hela längden något längre än 16 μm, vilket motsvarar 48 504 bp14.
För att karakterisera vätskeflödet infördes fluorescerande pärlor i flödesceller med en fokushöjd på 15 μm över täckplattans yta med olika pumphastigheter och i lösningar med olika viskositet. Filmer av pärlposition fångades och pärlposition spårades med hjälp av bildanalysprogramvara. Resultaten visar att för pärlor med en diameter på 1 μm kan linjär hastighet spåras exakt vid en pumpflödeshastighet på 100 μl/h i sackaroslösningar från 10%-50% (figur 5A). Under liknande förhållanden kan kraften på pärlan beräknas och befinnas sträcka sig från 10 till 400 pN, beroende på pumpens flödeshastighet och lösningsviskositet (figur 5B). Slutligen utvärderades effekten av pärldiameter från 120 till 970 nm på kraft i olika koncentrationer av sackaros. Data avslöjar att krafter som sträcker sig från 1-27 pN kan mätas genom att fästa pärlor med olika diameter på ett motorprotein och be motorn att dra den pärlan mot vätskeflödet (figur 5C).
Bild 1: Optisk layout och demonstration av svällningsaktivitet. (A) Schematisk över den optiska layouten med IR-strålen i rött och HeNe-strålen i svart. (B) Fotografi av optiska komponenter monterade på en brödbräda. Komponentnumren i panelerna A och B är följande: 1), Beam expander; 2), Interferensspegel (Rsmax = 1064 nm; Tpmax = 1064 nm); 3), Interferensspeglar (633 nm; R = 50%; T = 50%); 4-6), Interferensspeglar (Rmax = 633 nm); 7), Interferens spegel (Rmax = 1064 nm; Tmax = 633 nm); 8), Interferensspegel (Rsmax = 1064 nm; Tp max = 1064 nm, Tmax = 633 nm); 9), Interferensspegel (Rmax = 1064 nm, 633 nm; Tmax = 1064 nm, 633 nm); 10), Interferensspegel (Rmax = 1064 nm); 11), Objektiv lins, f = 110 nm; 12), Telan-lins; 13), Galvaniska speglar; 14-16), Rotatorer (/2); 17), IR-skanningskanalslutare; 18), Synlig kanalslutare; 19), IR Fast kanalslutare; 20), Strålstopp och 21), Interferensspegel (Rmax = 1064 nm; Tmax = 633 nm). (C) Mätning av uteffekt. Effekten från lasern mäts innan laserhuvudet installeras i den optiska layouten. När fällans inriktning är klar mäts stråleffekten efter 100x-målet för varje fälla. (D) och (E) Bilder som visar stabil, optisk fångst av 1 μm fluorescerande pärlor. F, fast fälla och M, mobil fälla med den mobila fällan i skanningsläge som rör sig genom en liten (D) eller stor (E) cirkel vid 30 mHz. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mikrofluidiska flödesceller. (A) Montering av en trekanals flödescell tillverkad av borosilikatglas. (B) Ett grenrör för att stabilt placera flödesceller under anslutningsbindning. Ovanpå, basen på aluminiumgrenröret med en 1 mm försänkt sektion för att placera flödescellen i sidled. De fyra stolparna (en i varje hörn) styr grenrörets lock på plats, medan de mer centralt placerade gängade bultarna används för att klämma fast locket på plats. Botten, grenrörslock med borrade hål för att matcha stolparna och bultarna på grenrörsbasen. (1), muttrar som fästs på grenrörets basbultar; (2) fjädrar som placeras mellan muttrarna och grenrörslocket för att ge lätt spänning under bindningsprocessen. (C) En närbild av inloppskanalernas konvergens till en gemensam enda vätskeström i en glasflödescell med kopplingar som redan är fästa. En fjärdedel placeras bredvid flödescellen som referens. (D) En bild av PDMS-flödescellen. PDMS-skikten är 3 mm tjocka. (E) En smält kiseldioxidflödescell med luerkontakter. (F) En flödescell av borosilikatglas med presspassningskontakter på plats. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Vätskeflödesegenskaper genom en glasflödescell. (A) Vätskeflödet i flödescellen är laminärt. Schemat visar flödescellen uppifrån för att visa att diffusion mellan kanaler är den huvudsakliga källan till blandning mellan intilliggande vätskeströmmar. Flödesriktningen indikeras med blå pilar och de enskilda strömmarna är färgade vita, ljusgrå och vita. De vidgade regionerna med tvärgående diffusion mellan kanaler indikeras i rött. Insatsen visar en fluorescensbild av intilliggande vätskeströmmar vid 10x förstoring med fluorescerande märkta DNA-pärlkomplex i den nedre strömmen och buffert endast i den övre strömmen. De vita fläckarna i den övre strömmen är skottbrus från CCD-kameran. (B) Flödesprofilen (ljuslila) i laminära flödesceller är parabolisk. Flödescellen ses från sidan och flödesriktningen anges ovanför varje cell. De snabbaste vätskehastigheterna inträffar i flödescellen i mitten medan de långsammaste vätskehastigheterna inträffar bredvid flödescellytorna. Följaktligen, för ett optiskt fångat DNA-pärlkomplex placerat i mitten av flödescellen, sträcker vätskeflödet bakteriofag λ DNA-molekylen (48 504 bp) till 16 μm (B-form) så att tydlig visualisering kan göras (vänster bild). Däremot upplever samma molekyl placerad nära flödescellens yta låga flödeshastigheter och kan inte sträckas ut. (C) Ett enda DNA-pärlkomplex är placerat i en flödescell. Olika djupflödesceller kan användas men i varje fall kan strålinriktningarna ställas in så att optimal fångst sker 10-20 μm över täckplattans yta, vilket eliminerar yteffekter och har stabilt flöde så att DNA-molekyler kan sträckas till B-form. Som anges i den vänstra bilden i (C) sträcks DNA för att möjliggöra tydlig visualisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Flödes- och reaktionskontroll av optiskt instängt DNA i en flödescell i mikroskopsteget . (A) Parning av flödescellen med en sprutpump. Ett fotografi av en trekanals flödescell ansluten till en sprutpump via trevägs omkopplingsventiler presenteras. Flödescellen hålls på plats på ett motoriserat steg i ett inverterat mikroskop. Flödescellen är ansluten till en avfallsledning (vänster) och omkopplingsventiler (streckad cyancirkel) via orange, 500 μm slang (indikerad med grön tejp). Ventilerna är stabilt monterade på ett specialbyggt grenrör anpassat till sprutpumpsapparaten, som rymmer 1 ml gastäta sprutor (gula pilar avgränsar kolvar). Avfallsledningarna används för att avlägsna luftbubblor som kan fastna i omkopplingsventilen vid sprutbyten. (B) Närbild av trekanalsflödescellen. För att underlätta visualisering av vätskeströmmar har de yttre färgats med matfärgning med den centrala strömmen som endast innehåller vatten. Det zoomade området indikerar hur ett optiskt fångat pärl-DNA-molekylkomplex översätts från en vätskeström till nästa (blå pil) genom att översätta scenen vinkelrätt mot flödet (svart pil). C) Scheman över trevägskopplingsventilerna som anger deras driftslägen. Bokstavsbeteckningarna F, S och W motsvarar riktningsvätskan och kan strömma till flödescellen, sprutan respektive avfallet. En port är permanent stängd enligt den svarta kontakten på toppen av varje schema. I öppet eller operativt läge (vänster panel) passerar vätskeflödet direkt genom omkopplingsventilen från sprutan (S) till flödescellen (F). I stängt läge (höger panel) vrids ratten så att flödescellen förseglas från miljön. I detta läge riktas flödet till avfall och sprutor kan stängas av utan att luftbubblor införs i flödescellen. Eftersom ventilerna har en dödvolym på 6 μl slösas mycket lite bort vid rensning av ledningar innan de återgår till Open-konfigurationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Pärlrörelse och motsatt kraft påverkas av vätskeflödet. (A) Linjär pärlhastighet påverkas av pumphastighet och sackaroskoncentration. (B) Den motsatta kraften på en pärla påverkas av lösningens viskositet. (C) Pärldiametern påverkar kraften på pärlor under flöde. I alla experiment användes fluorescerande pärlor (Dragon green). I (A) och (B) användes pärlor med en diameter på 0,97 μm och i (C) användes pärlor med olika diameter. Sackaroslösningar tillverkades i ultrarent vatten, filtrerades genom 0,2 μm filter och brytningsindex mättes med hjälp av en handhållen refraktometer, med viskositet bestämd i centipoise med hjälp av ISCO-tabeller och slutligen konverterad till SI-enheter i mPa.s. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Flödeshastighet (μL/h)b | Tid per steg (min) | Dispenserad volym (μL) |
| 800 | 5 | 67 |
| 400 | 5 | 33 |
| 200 | 5 | 17 |
| 100 | 5 | 8 |
| 50 | 5 | 4 |
| 25 | 5 | 2 |
| 15 | 5 eller fler | 1 eller fler |
| a. Dessa är vätskeflödeshastigheter som beräknas av sprutpumpens programvara och är unika för varje sprutdiameter som används. Flödeshastigheterna möjliggör snabb fyllning av linjerna och flödeskammaren (800 μl/tim), följt av en gradvis minskning av den ideala flödeshastigheten för svällning och visualisering | ||
| b. Sprutpumpen kan styras från knappsatsen eller med hjälp av programvara som tillhandahålls av leverantören. | ||
Tabell 1: Vätskeflödeshastigheter för att minimera bubblor och uppnå stabil fångst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Noggrann montering av flödessystemet är avgörande för ett framgångsrikt resultat av experiment 4,6. En av de mest utmanande aspekterna av protokollet är fastsättning av kontakter på glasytan. För detta använder vi följande två tillvägagångssätt: presspassningskopplingar och nanoportaggregat. Presspassningskontakter fäster lätt på glas följt av att trycka in PTFE-slangar i de förformade hålen med pincett. När en mer stabil fastsättning krävs föredras bindning av nanoportenheter. Med noggrann användning och rengöring kan en enda glasflödescell med permanenta enheter användas i mer än 1 år. Om flödesceller behöver bytas ut oftare kan PDMS-flödesceller användas eftersom de är ett utmärkt och billigare alternativ. De kan återanvändas men PDMS är mottagligt för svullnad, vilket kan förändra vätskeflödesbeteendet över tid.
Både glas- och PDMS-flödesceller är inte oförstörbara. I laboratoriet är den maximala flödeshastigheten som används 800 μl / h. Om detta överskrids dagligen och/eller under längre tidsperioder kan flödescellsvridning (glasflödesceller) och förvrängning av PDMS uppstå. Medan det första vätningsförfarandet med metanol och vatten tar tid, är det väl värt det eftersom alla bubblor elimineras och även läckor vid kontakter kan upptäckas. Flödescellerna som beskrivs här ger flexibilitet till de experiment som görs. Med hjälp av dessa metoder för olika flödesceller, slangar och fastsättning av olika kontakter kan experimentella förhållanden enkelt anpassas och snabbt optimeras för att säkerställa att optimala data erhålls. Y-formade kanalflödesceller presenteras men ett stort antal mikrofluidiska enhetsdesigner finns tillgängliga från flera företag både utan och med anslutningar anslutna. Detta ger utredaren ännu större flexibilitet i experimentell design.
Användningen av fyrvägs omkopplingsventiler är en enkel och effektiv metod som säkerställer att när flödessystemet är monterat och testat blir det effektivt en sluten miljö där föroreningen är minimal och bubblor elimineras. Det senare är kritiskt eftersom bubblor tenderar att komprimera och dekomprimera slumpmässigt under ett experiment och detta stör vätskeflödet vilket får fångade DNA-molekyler att röra sig på oväntade sätt och till och med gå sönder. Stor försiktighet bör iakttas för att säkerställa att de hindras från att bildas i systemet.
Slutligen är systemet som beskrivs här optimerat för visuell biokemi där noggrann analys av DNA, pärlor kopplade till proteiner eller fluorescerande märkta proteiner kan utföras. Även om systemet inte är konstruerat för att göra kraftmätningar med de dubbla fällorna och tillsats av kvadrantfotodetektorer, kan krafter mätas genom att fästa pärlor med olika diameter till DNA-motorproteiner, till exempel, och be motorn att dra denna pärla mot vätskeflödet. Genom att variera lösningens viskositet, vätskeflöde och pärldiameter kan ett stort antal motsatta krafter appliceras för att ge detaljerad inblick i motorproteinfunktionen (figur 5). Detta är ett enkelt och billigt sätt att mäta krafter i samband med biologiska transaktioner, men det saknar den precision som är förknippad med mer känsliga tillvägagångssätt. När det visuella biokemiska tillvägagångssättet kombineras med känsliga kraftdetekteringsmetoder kan mer fullständiga bilder av biokemiska reaktioner tillhandahållas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Forskning i Bianco-laboratoriet stöds av NIH-bidrag GM100156 och GM144414 till P.R.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x objective | Leica | 506318 or 506038 | Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging |
| 10X Objective | Leica | 506263 | Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell |
| 1 mm fluorescent beads | Bangs Labs | FSDG004 | Used for tap performance, focal position determination |
| 1 mm polystyrene beads | Bangs Labs | CPO1004 | Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules |
| 63x objective | Leica | 506081 | Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens |
| Alignment laser | Lumentum | 1100 series | 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics |
| Beam alignment camera | Amscope | MU303 | A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position |
| Camera control and Image capture software | Hamamatsu | HCImage | Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching |
| Camera; Orca flash 4 | Hamamatsu | c13440-20cu | CCD camera for imaging of single-molecule experiments |
| C-mount for the beam alignment camera | Spot imaging solutions | DE50CMT | Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment |
| C-mount for the Orca Flash 4 camera | Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects. | ||
| Cy5 fluorescence filter cube | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only |
| Fitc-Txred fluorescence filter cube | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed |
| Fluidics tubing | Grace Bio | 46004 | PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used |
| GFP fluorescence filter cube | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only |
| Glass flow cells | Translume | Custom | Clear flow channels for imaging (Fig. 2E) |
| Glass glue | Loctite | 233841 | Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells |
| Glass/PDMS sandwich flow cells | CIDRA Precision services | Custom design | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C) |
| Hamilton Cleaning solution | Hamilton | 18311 | Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Image analysis software | Media cybernetics | Image Pro Premiere | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image analysis software | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image display card | Melles Griot | 06 DLA 001 | Alternate product from Thorlabs: VRC5 |
| Immersion oil | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F fluorescence free |
| Laser beam alignment tools | Thor labs | FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 | Used to ensure beams are horizontal and at the correct height |
| Laser beam viewer | Canadian Photonics labs | IR 3150 | Used to image IR beam spots on mirrors and targets |
| Laser power meter | Thor labs | Measurement of laser output as well as trap strength | |
| Laser safety glasses (HeNe) | Thor labs | LG7 or 8 | Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm |
| Laser safety glasses (IR) | Thor labs | LG11 | Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm |
| Mcherry fluorescence filter cube | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only |
| Microscope | Leica | DMIRE2 | DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror |
| Microscope control software | UCSF/shareware | uManager | Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control |
| Nanoport assembly | IDEX | N333 | Connectors that are bonded to flow cells |
| Optical table support | Thor Labs | PA52502 | Active isolation table support |
| Optics and lenses | Solar TII | Various | Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system |
| PDMS flow cells | ufluidix | Custom | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D) |
| PEEK tubing | IDEX | 1532 | Provides excellent connection to flow cells and switching valves |
| Pinkel fluorescence filter cube | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly |
| Press fit tubing connectors | GraceBio | 46003 | Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass |
| Scanning mirrors | GSI Lumonics | VM500 | Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific |
| Stage | Leica | ||
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 68042-08 | Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration |
| Switching valves | IDEX | V-101T | Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells |
| Syringe and valve manifold | Machine shop | None | Custom built |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controls fluid flow through flow cells |
| Syringe pump software | Harvard Apparatus | 70-6000 | Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow |
| Syringes | Hamilton | 81320 | Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers |
| Table top | Thor Labs | T36H | Optical table top or breadboard |
| Trapping laser | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser |
References
- Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
- Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. 491 (2019).
- Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
- Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
- Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
- Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
- Vermeulen, K. C., Mameren, J. v Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).
- Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
- Weibel, D. B., Whitesides, G. M.
- Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
- Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
- Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
- Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
- Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
- Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).
- Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
- Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
- Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
- Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
- Merenda, F., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G. , 6483 (2007).
- Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
- Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
- Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
- Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
- Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).
