Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Positronemissionstomografiavbildning av celltrafik: En metod för cellradiomärkning

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/64117
Automatic Translation
1, 2, 1
1Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, Mayo Clinic, 2Department of Radiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Här presenteras ett protokoll för radiomärkning av celler med en positronemissionstomografi (PET) radioisotop, 89 Zr (t1/2 78,4 h), med användning av en radioaktivt märkande synton som är färdig att använda, [89 Zr]Zr-p-isotiocyanatobensyl-desferrioxamin ([89Zr]Zr-DBN). Radiomärkning av celler med [89Zr]Zr-DBN möjliggör icke-invasiv spårning och avbildning av administrerade radiomärkta celler i kroppen med PET i upp till 7 dagar efter administrering.

Abstract

T-cellsterapier med stamceller och chimära antigenreceptorer (CAR) håller på att utvecklas till lovande terapier för organregenerering och som immunterapi för olika cancerformer. Trots att betydande framsteg har gjorts inom dessa områden finns det fortfarande mer att lära för att bättre förstå farmakokinetiken och farmakodynamiken hos de administrerade terapeutiska cellerna i det levande systemet. För icke-invasiv, in vivo-spårning av celler med positronemissionstomografi (PET) har en ny [89 Zr]Zr-p-isotiocyanatobensyl-desferrioxamin ([89 Zr]Zr-DBN)-medierad cellradiomärkningsmetod utvecklats med användning av 89Zr (t1/2 78,4 h). Det aktuella protokollet beskriver en [89Zr]Zr-DBN-medierad, färdig att använda, radiomärkningssynton för direkt radiomärkning av olika celler, inklusive mesenkymala stamceller, linjestyrda kardiopoetiska stamceller, leverregenererande hepatocyter, vita blodkroppar, melanomceller och dendritiska celler. Den utvecklade metodiken möjliggör icke-invasiv PET-avbildning av celltrafik i upp till 7 dagar efter administrering utan att påverka de radiomärkta cellernas natur eller funktion. Dessutom beskriver detta protokoll en stegvis metod för radiosyntes av [89 Zr]Zr-DBN, biokompatibel formulering av [89 Zr]Zr-DBN, beredning av celler för radiomärkning och slutligen radiomärkning av celler med [89Zr]Zr-DBN, inklusive alla intrikata detaljer som behövs för framgångsrik radiomärkning av celler.

Introduction

Stamcells- och chimär antigenreceptor (CAR) T-cellsterapier blir allt populärare och undersöks aktivt för behandling av olika sjukdomar, såsom myokardsvikt1,2, näthinnedegeneration 2, makuladegeneration 2, diabetes 2, hjärtinfarkt 3,4,5 och cancer 6,7,8,9,10. Bland de två troliga tillvägagångssätten för stamcellsterapier kan stamceller antingen transplanteras direkt på sjukdomsstället för att orsaka ett terapeutiskt svar, eller orsaka förändringar i mikromiljön på sjukdomsstället utan att fästa vid sjukdomsstället för att initiera ett indirekt terapeutiskt svar. Ett indirekt terapeutiskt svar kan orsaka förändringar i mikromiljön på sjukdomsstället genom att frigöra faktorer som skulle reparera ellerbehandla sjukdomen. Dessa metoder för stamcellsterapier kan utvärderas genom icke-invasiv avbildning av radioaktivt märkta stamceller. Icke-invasiv avbildning kan korrelera upptaget av de radioaktivt märkta cellerna på sjukdomsstället med ett terapeutiskt svar för att dechiffrera det direkta kontra indirekta terapeutiska svaret.

Dessutom utvecklas immuncellsbaserade terapier för att behandla olika cancerformer med hjälp av CAR T-cell 6,7,8,9,10 och dendritisk cellimmunterapi 11,12. Mekanistiskt, i CAR T-cellsimmunterapi 6,7,8,9,10, är T-celler konstruerade för att uttrycka en epitop som binder till ett specifikt antigen på tumörer som behöver behandlas. Dessa modifierade CAR T-celler binder vid administrering till det specifika antigen som finns på tumörcellerna genom en epitop-antigeninteraktion. Efter bindning aktiveras de bundna CAR T-cellerna och förökar sig sedan och frisätter cytokiner, som signalerar till värdens immunsystem att attackera tumören som uttrycker det specifika antigenet. Däremot, när det gäller dendritiska cellterapier11,12, är dendritiska celler konstruerade för att presentera ett specifikt cancerantigen på sin yta. Dessa modifierade dendritiska celler, när de administreras, hem till lymfkörtlarna och binder till T-cellerna i lymfkörtlarna. T-cellerna aktiveras/prolifereras och initierar ett immunsvar hos värden mot tumören som uttrycker det specifika antigenet, när de binder till de specifika cancerantigenerna på de administrerade dendritiska cellerna. Därför är det möjligt att bedöma smuggling av administrerade CAR T-celler till ett tumörställe9,10 och målsökning av dendritiska celler till lymfkörtlarna11,12 genom att avbilda radiomärkta CAR T-celler och dendritiska celler för att bestämma effekten av immunterapi. Dessutom kan icke-invasiv celltrafik bidra till att bättre förstå den terapeutiska potentialen, klargöra det direkta kontra indirekta terapeutiska svaret och förutsäga och övervaka det terapeutiska svaret från både stamcells- och immuncellsbaserade terapier.

Olika avbildningsmodaliteter för celltrafik har undersökts 3,4,9,10,12, inklusive optisk avbildning, magnetisk resonanstomografi (MRI), single-photon emission computed tomography (SPECT) och positronemissionstomografi (PET). Var och en av dessa tekniker har sina egna fördelar och nackdelar. Bland dessa är PET den mest lovande modaliteten på grund av dess kvantitativa natur och höga känslighet, vilket är avgörande för tillförlitlig kvantifiering av celler i avbildningsbaserad celltrafik 3,4,9,10.

Den positronemitterande radioisotopen 89Zr, med en halveringstid på 78,4 timmar, är lämplig för cellmärkning. Det möjliggör PET-avbildning av celltrafik i över 1 vecka och produceras lätt av allmänt tillgängliga, lågenergimedicinska cyklotroner 13,14,15,16,17. Dessutom är en lämpligt funktionaliserad, p-isotiocyanatobensyl-desferrioxamin (DFO-Bn-NCS) kelator kommersiellt tillgänglig för syntes av en 89 Zr-märkt, färdig att använda, cellmärkningssynton, [89 Zr]Zr-p-isotiocyanatobensyl-desferrioxamin, även känd som [89Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24,25. Principen för [89 Zr]Zr-DBN-medierad cellmärkning är baserad på en reaktion mellan primära aminer av cellmembranproteiner och isotiocyanatdelen (NCS) av [89Zr]Zr-DBN för att producera en stabil kovalent tioureabindning.

[89Zr] Zr-DBN-baserad cellmärkning och avbildning har publicerats för att spåra en mängd olika celler, inklusive stamceller 18,23,25, dendritiska celler18, kardiopoetiska stamceller19, deciduala stromaceller 20, benmärgshärledda makrofager20, mononukleära celler i perifert blod 20, Jurkat/CAR T-celler21, hepatocyter 22,24 och vita blodkroppar 25. Följande protokoll tillhandahåller steg-för-steg-metoder för beredning och radiomärkning av celler med [89Zr]Zr-DBN och beskriver ändringar som kan krävas i radiomärkningsprotokollet för en specifik celltyp. För tydlighetens skull är den metod för radiomärkning av celler som presenteras här uppdelad i fyra avsnitt. Det första avsnittet handlar om framställningen av [89 Zr]Zr-DBN genom kelatering av 89Zr med DFO-Bn-NCS. I det andra avsnittet beskrivs beredningen av en biokompatibel formulering av [89Zr]Zr-DBN som lätt kan användas för radiomärkning av celler. I det tredje avsnittet behandlas de steg som behövs för att förkonditionera celler för radioaktiv märkning. Förkonditioneringen av celler innebär att cellerna tvättas med proteinfri fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och HEPES-buffrad Hanks-balanserad saltlösning (H-HBSS) för att avlägsna externa proteiner, som kan störa eller konkurrera med reaktionen av [89Zr]Zr-DBN med primära aminer som finns på cellytans proteiner under radiomärkning. Det sista avsnittet innehåller steg som är involverade i själva radiomärkningen av cellerna och kvalitetskontrollanalysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dendritiska celler och melanomceller erhölls kommersiellt18. Hepatocyter isolerades från levern hos svin efter laparoskopisk partiell hepatektomi22,24. Stamceller isolerades från benmärgsaspirat18,19,26. De fettvävnadshärledda stamcellerna erhölls från Human Cellular Therapy Laboratory, Mayo Clinic Rochester23. Humana vita blodkroppar isolerades från det insamlade blodet som erhölls från Division of Transfusion Medicine, Mayo Clinic Rochester25. Olika celler som användes för radiomärkning erhölls och användes i enlighet med riktlinjer som rekommenderades av Institutional Animal Care and Use Committee, Mayo Clinic Stem Cell Research Oversight Subcommittee, Division of Transfusion Medicine Research Committee, Institutional Biosafety Committee och av Radiation Safety Committee.

1. Preparat av [ 89 Zr ]Zr-p-isotiocyanatobensyl-desferrioxamin ([ 89Zr ]Zr-DBN)

Tidtagning: ~160-220 min
Anm.: För beredning av [89 Zr]Zr-DBN, isolera 89 Zr i form av [89 Zr]Zr-vätefosfat ([89 Zr]Zr(HPO 4)2) eller [89 Zr]Zr-klorid ([89Zr]ZrCl4), enligt beskrivningen i steg 1.1.

  1. Isolera 89 Zr från förälder 89Y med hjälp av en etablerad hydroxamathartsbaserad reningsmetod13,17. I korthet, förbered först en kolonn med ~100 mg hydroxamatharts, aktivera sedan hydroxamathartset genom att tvätta kolonnen med 8,0 ml ren vattenfri acetonitril, följt av en spolning med 5,0-6,0 ml luft. Tvätta sedan kolonnen med 15 ml avjoniserat vatten, följt av ytterligare en spolning med 5,0-6,0 ml luft och passera sedan 2,0 ml 0,50 N HCl (spårmetallbaskvalitet) följt av ytterligare en spolning med 5,0-6,0 ml luft. Fyll sedan långsamt på lösningen som innehåller både 89 Zr och 89 Y i hydroxamathartset och tvätta det obundna 89Y från hydroxamathartset med 20 ml 2,0 N HCl, följt av 10 ml avjoniserat vatten och en spolning med 5,0-6,0 ml luft.
    OBS: Efter spolning med luft kan elueringen av 89Zr utföras enligt bilden nedan.
    1. För eluering av 89 Zr i form av [89 Zr]Zr(HPO 4)2, tillsätt först 0,50 ml 1,2 M K 2 HPO 4/KH 2 PO 4-buffert (pH 3,5) till kolonnen från steg 1.1 och låt den sitta på kolonnen i 30 minuter för att främja frisättningen av 89 Zr som en [89Zr]Zr(HPO4)2 från hartset. Eluera sedan 89Zr från kolonnen med ytterligare 1,50 ml 1,2 M K 2 HPO 4/KH2PO4 buffert (pH 3,5). Efter elueringen av [89 Zr]Zr(HPO 4)2, följ steg 1.2, 1.2.1 och 1.2.2 för beredning av [89 Zr]Zr-DBN med [89Zr]Zr(HPO 4)2, som visas i figur 1.
    2. För att erhålla 89 Zr som [89 Zr]ZrCl4, eluera först 89 Zr som [89Zr]Zr-oxalat.
      1. För eluering av 89 Zr i form av [89 Zr]Zr-oxalat, tillsätt 0,50 ml 1,0 M oxalsyra till kolonnen från steg 1.1 och låt den sitta på kolonnen i 1 minut för att främja frisättningen av 89 Zr som ett [89Zr]-oxalat från hartset. Eluera sedan 89Zr från kolonnen med ytterligare 2,50 ml 1,0 M oxalsyra (totalt 3,0 ml)17.
      2. För att omvandla [89 Zr]Zr-oxalat till [89Zr]ZrCl4 med hjälp av en anjonbytarkolonn, som beskrivs av Larenkov et al.14, aktivera först kolonnen genom att tvätta med 6,0 ml acetonitril, följt av en spolning med 5,0-6,0 ml luft. Tvätta sedan kolonnen med 10,0 ml saltlösning, följt av ytterligare en spolning med 5,0-6,0 ml luft. Passera slutligen 10,0 ml avjoniserat vatten, följt av en spolning med 5,0-6,0 ml luft.
      3. Fyll långsamt på 3,0 ml lösningen som innehåller [89Zr]Zr-oxalat på den aktiverade anjonbytarkolonnen, följt av en spolning av 5,0-6,0 ml luft. Tvätta sedan den 89Zr-laddade kolonnen med 50,0 ml avjoniserat vatten för att avlägsna obundna oxalatjoner, följt av en spolning med 5,0-6,0 ml luft.
      4. För eluering av 89 Zr i form av [89 Zr]ZrCl 4, tillsätt 0,10 ml 1,0 N HCl till kolonnen, låt den sitta på kolonnen i 1,0 minuter för att främja frisättningen av 89 Zr som [89 Zr]ZrCl4 från hartset och eluera 89Zr från kolonnen med ytterligare 0,40 ml 1,0 N HCl (totalt 0,5 ml). Torka den eluerade [89Zr]ZrCl4 i en V-formad injektionsflaska genom att placera den i ett värmeblock vid 65 °C under ett jämnt flöde av kvävgas i 10–30 minuter. Efter torkning bereds den torkade [89 Zr]ZrCl 4 i vatten och följ steg 1.3 och 1.3.1 för beredning av [89 Zr]Zr-DBN med [89Zr]ZrCl4, som visas i figur 1.
  2. Ta ~120 μL [89Zr]Zr(HPO 4)2, formulerad i 1,2 M K 2 HPO 4/KH 2 PO4 (pH 3,5) (10-25 MBq) från steg 1.1.1, och neutralisera lösningen för att uppnå pH 7,5-8,0 med ~100 μL 1,0 M HEPES-KOH (pH 7,5) och ~65 μL av 1,0 M K 2 CO3.
    1. För att erhålla lämplig mängd DFO-Bn-NCS för steg 1.2.2 eller 1.3.1 för olika 89 Zr-formuleringar med en varierad skenbar specifik aktivitet på 89 Zr, utför en uppsättning kelatreaktioner med användning av en fast volym av en neutraliserad formulering av [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl4 med ett intervall av DFO-Bn-NCS (7,5-15 μg). När det gäller [89Zr]Zr(HPO4)2, inkubera kelatbildningsreaktionen vid 37 °C i en skakapparat vid ~550 varv/min i 60 minuter. I fallet med [89Zr]ZrCl4, inkubera kelatbildningsreaktionen vid 25 °C i en skakapparat vid ~550 varv/min i 30 minuter. Kassera kelatreaktionen som visar fällning under eller i slutet av inkubationen. I slutet av inkubationen, utför radioaktiv tunnskiktskromatografi (rad-TLC) med 100 mM dietylentriaminpentaacetat (DTPA), pH 7,0, som en mobil fas för att uppskatta keleringseffektiviteten för DFO-Bn-NCS för varje kelatreaktion, som diskuteras nedan i steg 1.5.
      OBS: Baserat på keleringseffektiviteten, använd den minsta mängd DFO-Bn-NCS i steg 1.2.2 eller 1.3.1 som behövs för att uppnå en keleringseffektivitet på ≥97 % utan att orsaka utfällning av DFO-Bn-NCS i den neutraliserade formuleringen av [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl4. Häri syntetiserades [89Zr]Zr-DBN i ≥97 % radiokemisk renhet.
    2. Bered färsk 5,0 mM DFO-Bn-NCS i vattenfri DMSO (3,76 mg/ml) och tillsätt 4,0 μl 5,0 mM DFO-Bn-NCS (20 nmol eller 15 μg) till ~285 μL neutraliserad [89Zr]Zr(HPO4)2 (10-25 MBq) från steg 1.2 och blanda lösningen genom pipettering. Håll den slutliga DMSO-koncentrationen i kelatblandningen under 2 % av den totala volymen.
  3. Ta ~180 μL [89Zr]ZrCl 4 formulerad i 0,1 N HCl (40-80 MBq) från steg 1.1.2.4 och neutralisera den resulterande lösningen för att uppnå pH 7,5-8,0 med ~25 μL 1,0 M Na2CO3.
    1. Bered färsk 2,5 mM DFO-Bn-NCS i vattenfri dimetylsulfoxid (DMSO) (1,88 mg/ml) och tillsätt 4,0 μl 2,5 mM DFO-Bn-NCS (10 nmol eller 7,5 μg) till ~205 μL neutraliserad [89 Zr]ZrCl4 (40-80 MBq) från steg 1.3. Blanda lösningen genom pipettering. Håll den slutliga DMSO-koncentrationen i kelatblandningen under 2 % av den totala volymen.
  4. Fortsätt med kelateringen av 89 Zr vid 37 °C i en skakapparat vid ~550 varv/min i 60 minuter för [89 Zr]Zr(HPO 4)2, eller vid 25 °C i en skakapparat vid ~550 varv/min i 30 minuter för [89Zr]ZrCl4.
  5. Bestäm 89Zr-keleringseffektiviteten genom rad-TLC med 100 mM DTPA (pH 7.0) som det mobila lösningsmedlet rad-TLC. Förvänta dig att [89 Zr]Zr-DBN visar en R f på ~0,021-0,035, [89 Zr]ZrCl 4 visar en R f på ~1,0 och [89Zr]Zr(HPO4)2 visar en R f på ~1,0. Beräkna keleringseffektiviteten (%) med hjälp av ekvation (1):
    Procentandel av 89 Zr kelaterad till DFO-NCS för att bilda [89 Zr]Zr-DBN = [ (Radioaktivitet vid R f av [89 Zr]Zr - DBN) / (Summan av radioaktiviteten vid R f av [89 Zr]Zr - DBN och vid R   f av [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl4) ] × 100 (1)
    OBS: Den acceptabla 89Zr-keleringseffektiviteten för att fortsätta med cellradiomärkning, som bestäms av rad-TLC, är ≥97 %. Den föreslagna radiokemiska renhetsgraden på ≥97 % för [89Zr]Zr-DBN fastställdes i enlighet med standardkravet för radiokemisk renhet för andra radiofarmaka som används i fält. Se den representativa rad-TLC i tilläggsfigur S1 och tilläggsfigur S2.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av [89Zr]Zr-DBN-beredning. För beredning av [89 Zr]Zr-DBN, neutralisera förformulerade [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl4 till ett pH på 7,5-8,0. Inkubera den neutraliserade lösningen med DFO-Bn-NCS. Kontrollera keleringseffektiviteten för 89Zr till DFO-Bn-NCS med rad-TLC. Klicka här för att se en större version av denna figur.

2. Biokompatibel formulering av [ 89Zr ]Zr-DBN för radioaktiv märkning av celler (figur 2)

Tidtagning: ~35 min
OBS: Med tanke på den tid det tar för beredning av celler i steg 3, starta steg 3 cirka 20 minuter innan steg 2 börjar för en ~30 minuters inkubation. Detta gör att radiomärkning av celler i steg 4 kan påbörjas inom ~5-10 minuter efter slutförandet av steg 2-3.2.2.

  1. För [89 Zr]Zr-DBN-formulering framställd av [89 Zr]ZrCl 4, tillsätt 50,0 μL av en cellkompatibel blandning bestående av ~27,0 μL 1,2 M K 2 HPO 4/KH2PO 4 (pH 3,5) + ~23,0 μL 1,0 M HEPES-KOH-buffert (pH 7,5) till 50,0 μL [89 Zr]Zr-DBN. Inkubera den [89Zr]Zr-DBN-cellkompatibla blandningen i ~30 minuter vid rumstemperatur (25 °C).
    OBS: [89 Zr]Zr-DBN-formuleringen framställd av [89Zr]Zr(HPO4)2 är biokompatibel för radiomärkning av celler och kräver inte steg 2.

Figure 2
Figur 2: Beredning av den biokompatibla formuleringen av [89Zr]Zr-DBN för radiomärkning av celler. För beredning av en bruksfärdig biokompatibel formulering av det radioaktivt märkta syntetonet, tillsätt en lika stor volym cellkompatibel blandning, bestående av 1,2 M K 2 HPO 4/KH2PO 4 (pH 3,5) + 1,0 M HEPES-KOH till en lika stor volym [89Zr]Zr-DBN. Inkubera vid 25 °C i ~30 min. Klicka här för att se en större version av denna figur.

3. Beredning av celler för radioaktiv märkning

Tidtagning: ~40-50 min

  1. Trypsinisera ~12 × 106 vidhäftande celler (stamceller, melanomcancerceller, kardiopoetiska stamceller, dendritiska celler eller hepatocyter) och centrifugera cellerna i ett 15,0 ml koniskt centrifugrör vid ~96 × g i 10 minuter vid 4 °C.
    1. Kassera supernatanten, återsuspendera cellpelleten i ~500 μL PBS och överför cellsuspensionen till ett 1.5 ml mikrocentrifugrör. Centrifugera cellerna i en mikrocentrifug vid ~96 × g i 10 minuter vid 4 °C.
    2. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i ~500 μL H-HBSS. Centrifugera cellerna i en 1,5 ml mikrocentrifug vid ~96 × g i 10 minuter vid 4 °C. Upprepa steg 3.1.2 en gång till och fortsätt till steg 4.1.1.
      OBS: H-HBSS är Hanks balanserade saltlösning med 0,01 M HEPES (pH 8,0).
  2. När det gäller icke-vidhäftande celler, t.ex. humana vita blodkroppar (nyligen isolerade humana vita blodkroppar från blodet), hoppa över trypsiniseringen och centrifugera cellsuspensionen innehållande ~12 × 106 celler i en 1,5 ml mikrocentrifug vid ~96 × g i 10 minuter vid 4 °C.
    1. Kassera supernatanten, återsuspendera cellpelleten i ~500 μL PBS och centrifugera cellerna i en 1,5 ml mikrocentrifug vid ~96 × g i 10 minuter vid 4 °C.
    2. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i ~500 μL H-HBSS. Centrifugera cellerna i en 1,5 ml mikrocentrifug vid ~96 × g i 10 minuter vid 4 °C. Upprepa steg 3.2.2 en gång till och fortsätt till steg 4.1.1.

4. Radioaktiv märkning av celler

Tidtagning: ~125-155 min

  1. Initiering av radioaktiv märkning av celler (figur 3)
    1. Använd cellsuspensionen från steg 3.1.2 eller steg 3.2.2 för att bereda en ~500 μL cellsuspension med cirka ~6 × 106 celler i ~500 μL H-HBSS vid pH 7,5-8,0 i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
    2. Tillsätt ~100 μL av den biokompatibelt formulerade [89Zr]Zr-DBN från steg 2.
  2. Cellinkubation för radioaktiv märkning (figur 4)
    1. Blanda det biokompatibla formulerade [89 Zr]Zr-DBN och cellsuspensionen genom att försiktigt pipettera upp och ner med en mikropipett inställd på ~500 μL. Mät mängden radioaktivitet i inkubationsröret med hjälp av en kalibrator för radioaktivitetsdos vid inställningen 489 för 89Zr-isotop16.
    2. Inkubera cellerna och [89Zr]Zr-DBN-blandningen i en skakapparat vid ~550 rpm vid 25-37 °C i 30-45 min för cellmärkning.
      OBS: Inkubationstemperaturen kommer att variera beroende på vilka celltyper som används för radiomärkning, som visas i tabell 1.
    3. Efter inkubation i steg 4.2.2, utför rad-TLC på cellens radiomärkningsreaktion med nyberett rad-TLC-lösningsmedel (20 mM natriumcitrat [pH 4,9-5,1]:metanol [1:1, V:V]). Efter rad-TLC-körningen, leta efter [89 Zr]Zr-DBN och [89 Zr]ZrCl4 runt R f = ~0,73-0,81 och R f = ~0,01-0,02 för de radiomärkta cellerna. Beräkna den procentuella andelen radioaktivitet vid Rf = ~0,01-0,02 med hjälp av ekvation (2).
      Procentuell andel radioaktivitet vid R f = ~0,01-0,02 = [ (Radioaktivitet vid R f= ~0,01 - 0,02) / (Summan av radioaktiviteten vid R f = ~0,01 - 0,02 och R f= ~0,73 - 0,81) ] × 100 (2)
      OBS: För att förstå topparna som visualiseras vid R f = ~0,01-0,02 och R f = ~0,73-0,81, se rad-TLC för radiomärkningsreaktion av vita blodkroppar i tilläggsfigur S3.
    4. Blanda ~100 μL av den biokompatibelt formulerade [89Zr]Zr-DBN med ~500 μL H-HBSS vid pH 7,5-8,0 i ett separat 1,5 ml mikrocentrifugrör för användning som celllös kontroll för bakgrundskorrigering i steg 4.2.5. Efter inkubation vid liknande temperatur och tid som används i steg 4.2.2, utför rad-TLC. Efter rad-TLC-körningen letar du efter [89 Zr]Zr-DBN och [89 Zr]ZrCl4 runt Rf = ~0,73-0,81. Beräkna den procentuella andelen radioaktivitet vid Rf = ~0,01-0,02 med hjälp av ekvation (3).
      Radioaktivitet vid R f = ~0,01-0,02 = [ (Radioaktivitet vid R f= ~0,01 - 0,02) / (Summan av radioaktiviteten vid R f= ~0,01 - 0,02 och R f= ~0,73 - 0,81) ] × 100 (3)
      OBS: För att förstå topparna visualiserade vid Rf = ~0,01-0,02 och ~0,73-0,81, se rad-TLC för kontrollreaktion utan cell i tilläggsfigur S4.
    5. Beräkna den effektiva radioaktiva cellmärkningen (%) genom att subtrahera radioaktivitetsprocenten vid R f = ~0,01-0,02 (från rad-TLC från steg 4.2.4) från radioaktivitetsprocenten vid R f = ~0,01-0,02 (från rad-TLC från steg 4.2.3).
  3. Släckning av radioaktiv märkning och celltvätt (figur 5)
    1. Efter att ha bekräftat att radioaktiv märkning har slutförts med rad-TLC i steg 4.2.5 ska släckning av radiomärkningsreaktionen utföras genom tillsats av ~600 μl kylt, celllämpligt komplett medium eller genom tillsats av H-HBSS, såsom visas i tabell 1.
    2. Centrifugera cellerna i en mikrocentrifug vid ~96 × g i 10 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten.
    3. Återsuspendera försiktigt de pelleterade cellerna i ~500 μL kylt medium (Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) + 10 % fetalt bovint serum + 5 % penicillin/streptomycin eller Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) + 10 % fetalt bovint serum + 5 % penicillin/streptomycin eller H-HBSS för en viss celltyp, som visas i tabell 1. Utför resuspension av cellpelleten genom att försiktigt pipettera upp och ner med en mikropipett inställd på ~500 μL.
    4. Centrifugera cellerna i en mikrocentrifug vid ~96 × g i 10 minuter vid 4 °C.
    5. Upprepa steg 4.3.2-4.3.4 två gånger för att tvätta bort den obundet radioaktiva aktiviteten.
    6. Överför pelleten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör med DMEM + 10 % fetalt bovint serum + 5 % penicillin/streptomycin när det gäller stamceller eller H-HBSS och mät radioaktiviteten i cellpelleten med hjälp av en doskalibrator vid inställningen 489 för 89Zr-isotop16.
    7. Beräkna den slutliga effektiviteten för radioaktiv märkning efter alla tvättar med hjälp av ekvation (4).
      Radiomärkningseffektivitet = [(Sönderfallskorrigerad radioaktivitet i cellpellet i steg 4.3.6) / (Sönderfallskorrigerad radioaktivitet i cellpellets och H-HBSS i steg 4.2.1) ] × 100 (4)
    8. För att säkerställa kvaliteten på de radiomärkta cellerna, inspektera först visuellt den slutliga suspensionen av radiomärkta celler för att se om det finns några klumpar. Om det inte finns några klumpar, fortsätt med denna slutliga suspension till nästa steg. Om det finns klumpar, men de kan återsuspenderas genom pipettering eller genom försiktig skakning, gör det och fortsätt till nästa steg, eftersom detta klarar den visuella inspektionen. Om klumparna inte återsuspenderas, antingen genom pipettering eller försiktig skakning, kasseras suspensionen och börja om.
    9. Om den okulärbesiktningen godkänns, utför ett viabilitetstest för trypanblått med 0,4 % trypanblå lösning berett i PBS inom 1 timme efter radiomärkning och tvättningsstegen (4.3.3-4.3.7) för att bedöma cellviabiliteten hos de radioaktivt märkta cellerna.
      1. För att utföra testet, tillsätt 10,0 μl 0,4 % trypanblå lösning till 10,0 μL cellsuspensionen av både radioaktivt märkta och omärkta celler och blanda dem genom att pipettera trypansuspensionen av blå blodkroppar upp och ner med mikropipett inställd på 10,0 μL.
      2. Ladda en hemacytometer med ~10,0 μL av trypansuspensionsblandningen, räkna omedelbart antalet blåfärgade celler och det totala antalet celler i hemacytometern under ett mikroskop vid låg förstoring eller med hjälp av en automatiserad cellräknare. Beräkna den procentuella andelen livsdugliga celler med hjälp av ekvation (5).
        Procentuell andel livskraftiga celler = 100 - [(Antal blå - färgade celler) / (Antal totala celler)] × 100 (5)
    10. Använd de radiomärkta cellerna om det inte finns någon förändring i procentandelen livsdugliga celler i den radiomärkta cellsuspensionen jämfört med den omärkta motsvarigheten. Kassera de radiomärkta cellerna om procentandelen livsdugliga celler är mindre än omärkt motsvarighet.

Figure 3
Figur 3: Schematisk bild av initieringen av radioaktiv märkning av celler. Initiera radiomärkning av celler genom tillsats av den biokompatibelt formulerade [89Zr]Zr-DBN till cellsuspensionen beredd i HEPES-buffrad Hanks balanserade saltlösning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Schematisk bild av cellinkubation för radioaktiv märkning. Blanda noggrant den biokompatibla formuleringen [89Zr]Zr-DBN med cellsuspensionen och inkubera cellsuspensionen i ett temperaturkontrollerat värmeblock på en shaker i 30-60 minuter. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Schematisk bild av släckning av radioaktiv märkning och celltvätt. Släck radioaktiv märkning av celler genom tillsats av kylt cellmedium eller H-HBSS, följt av centrifugering vid 4 °C. För celltvätt, kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i ~500 μL kylt cellmedium eller H-HBSS. Upprepa cykeln med att kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i ett färskt medium för att avlägsna eventuellt obundet radioaktivt märkt syntet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representativa resultaten som presenteras i detta manuskript har sammanställts från de tidigare [89Zr]Zr-DBN-syntes- och cellradiomärkningsstudierna 18,19,22,23,24,25. I korthet kan 89Zr framgångsrikt komplexeras med DFO-Bn-NCS på ~30-60 minuter vid 25-37 °C med 7,5-15 μg DFO-Bn-NCS (tabell 2). Cellens radiomärkningseffektivitet varierar från 20-50 % som ett okorrigerat utbyte som observerats i den radiomärkta cellpelleten efter tvätt (tabell 1). 18,19,22,23,24,25 (tabell 1).

Sammantaget uppnåddes följande radioaktivitetskoncentrationer: 0,1 MBq/10 6 celler för hepatocyter 22,24, 0,50 ± 0,10 MBq/106 för melanomceller (mMC) 18, 0,47 ± 0,10 MBq/10 6 för humana mesenkymala stamceller (hMSCs)18, 0,39 ± 0,20 MBq/10 6 för dendritiska celler (mDCs)18, 0,27± 0,30 MBq/10 6 för vita blodkroppar 25, och 0,70 ± 0,20 MBq/106 för kardiopoetiska stamceller19 (tabell 1) . Däremot observerades ingen cellmärkning med [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl425. Som tidigare visats visade sig radioaktiv märkning vara stabil i mMC, hMSC och mDC, med endast en försumbar procentandel av utflödet observerat under 7 dagar efter märkning (figur 6)18. För kardiopoetiska stamceller observerades inget utflöde under 2 dagar efter märkning19.

Tabell 1: Cellernas radioaktiva märkningseffektivitet i olika celltyper med [89Zr]Zr-DBN. Stamceller, melanomceller, kardiopoetiska stamceller, hepatocyter, dendritiska celler och vita blodkroppar radiomärktes med [89Zr]Zr-DBN med variabel cellradiomärkningseffektivitet. *Cellens radioaktiva märkningseffektivitet (%) uppskattades enligt beskrivningen i steg 4.3.7. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: 89Zr-keleringseffektivitet för DFO-Bn-NCS. Keleringseffektiviteten för DFO-Bn-NCS för 89 Zr med [89 Zr]Zr(HPO 4)2 och [89Zr]ZrCl4 är olika, mätt med rad-TLC. *Värdena presenteras som medelvärde ± standardavvikelse. Med 50 mM DTPA (pH 7,0) som rad-TLC-lösningsmedel visar [89 Zr]Zr(HPO4)2 en R f på ~0,9 18 och [89Zr]Zr-DBN visar en R f på ~0,018. Med 100 mM DTPA (pH 7,0) som rad-TLC-lösningsmedel visar [89Zr]ZrCl4 en Rf på ~1,0. [89Zr] Zr(HPO4)2 visar en R f på ~1,0 och [89Zr]Zr-DBN visar en R f på ~0,021-0,035. Keleringseffektivitet (%) = procentuell andel av 89 Zr-kelaterad till DFO-Bn-NCS för att bilda [89 Zr]Zr-DBN = (radioaktivitet vid R f av [89 Zr]Zr-DBN/(summan av radioaktiviteten vid R f av [89 Zr]Zr-DBN och vid R f av [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl4) × 100. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Effekten av radiomärkning på viabiliteten hos de radioaktivt märkta cellerna utvärderades i mMC 18, grishepatocyter 22,24, hMSCs 18, humana kardiopoetiska stamceller19 och immunceller, såsom musdendritiska celler (mDC) 18 och vita blodkroppar 25, med hjälp av trypan blue exclusion viability test. Det observerades att radioaktiv märkning inte hade någon negativ inverkan på cellernas livsduglighet. <5 % av de döda cellerna hittades upp till 7 dagar efter märkning för både [89Zr]Zr-DBN-märkta och omärkta mMC och hMSC18. Radiomärkning påverkade inte heller viabiliteten hos hepatocyterfrån gris 22,24 när de testades inom 1 timme efter radiomärkning eller 2 dagar efter radiomärkning för odlade radiomärkta humana kardiopoetiska stamceller19.

Radiomärkningen av humana vita blodkroppar påverkade inte heller cellernas livsduglighet negativt eftersom ~90-95 % av de livskraftiga cellerna observerades i både de omärkta och märkta cellpopulationerna inom 1 timme efter radiomärkning25. Radiomärkningen av kardiopoetiska stamceller påverkade inte morfologin, livsdugligheten eller spridningskapaciteten hos humana kardiopoetiska stamceller19. Funktionella studier utfördes med kardiopoetiska stamceller i en hjärtinfarkt modell19. I de funktionella studierna förblev det karakteristiska uttrycket av mesodermala och pro-kardiogena transkriptionsfaktorer som definierar den kardiopoetiska fenotypen oförändrat i radioaktivt märkta kardiopoetiska stamceller19. De radioaktivt märkta kardiopoetiska stamcellerna kunde förbättra ejektionsfraktionen i vänster kammare i ett kroniskt infarkterat mushjärta i det infarktdrabbade hjärtat modell19.

Figure 6
Figur 6: Stabilitet hos olika celler som radiomärkts med 89Zr under 7 dagar. Retentionen av 89Zr-radioaktivitet av radioaktivt märkta celler visade sig vara stabil i alla studerade celler, med ett försumbart utflöde observerat under 7 dagar efter märkning. Värdena visas som medelvärde ± standardavvikelse, n = 3. Denna siffra är från Bansal et al.18. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tilläggsfigur S1: Representativ rad-TLC för 89 Zr-kelering med DFO-Bn-NCS med användning av [89Zr]Zr(HPO4)2 i 100 mM DTPA (pH 7,0) lösning. Rad-TLC kördes i 100 mM DTPA (pH 7,0) som den mobila fasen; [89Zr] Zr-DBN ; visar en R f på ~0,021-0,035 och [89Zr]Zr(HPO4)2 visar en R f på ~1,0. Keleringseffektivitet (%) = procentuell andel av 89 Zr-kelaterad till DFO-Bn-NCS för att bilda [89 Zr]Zr-DBN = [radioaktivitet vid R f av [89 Zr]Zr-DBN/(summan av radioaktiviteten vid R f av [89 Zr]Zr-DBN och vid R f av [89Zr]Zr(HPO4)2] × 100. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfigur S2: Representativ rad-TLC för 89 Zr-kelering med DFO-Bn-NCS med användning av [89Zr]ZrCl4 i 100 mM DTPA (pH 7,0) lösning. Rad-TLC kördes i 100 mM DTPA (pH 7,0) som den mobila fasen; [89Zr] Zr-DBN visar en R f på ~0,021-0,035 och [89Zr]ZrCl4 visar en R f på ~1,0. Kelatbildningseffektivitet (%) = procentuell andel av 89 Zr-kelaterad till DFO-Bn-NCS för att bilda [89 Zr]Zr-DBN = [radioaktivitet vid R f av [89 Zr]Zr-DBN/(summan av radioaktiviteten vid R f av [89 Zr]Zr-DBN och vid R f av [89Zr]ZrCl4)] × 100. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfigur S3: Representativ rad-TLC för radioaktiv cellmärkningsreaktion från steg 4.2.3 i en 20 mM natriumcitratlösning (pH 4,9-5,1):metanol (1:1, V:V). Rad-TLC kördes i 20 mM natriumcitrat (pH 4,9-5,1):metanol (1:1, V:V) som den mobila fasen; de radiomärkta cellerna visar ett R f på ~0,01-0,02 och [89 Zr]Zr-DBN och [89 Zr]ZrCl4 visar ett R f på ~0,73-0,81. Den procentuella andelen radioaktivitet vid en R f på ~0,01-0,02 beräknas med formeln: [(radioaktivitet vid R f = ~0,01-0,02)/(summan av radioaktiviteterna vid R f = ~0,01-0,02 och R f = ~0,73-0,81)] × 100. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfigur S4: Representativ rad-TLC för icke-cellkontrollreaktion från steg 4.2.4 i en 20 mM natriumcitrat pH 4,9-5,1: metanollösning (1:1, V:V). Med 20 mM natriumcitrat (pH 4,9-5,1): metanol (1:1, V:V) som rad-TLC-lösningsmedel, kördes rad-TLC i 20 mM natriumcitrat (pH 4,9-5,1):metanol (1:1, V:V) som mobil fas; [89Zr] Zr-DBN och [89Zr]ZrCl4 visar en Rf på ~0,73-0,81. Den procentuella andelen radioaktivitet vid R f = ~0,01-0,02 beräknas med formeln: [(radioaktivitet vid R f = ~0,01-0,02)/(summan av radioaktiviteterna vid R f = ~0,01-0,02 och R f = ~0,73-0,81)] × 100. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Följande är kritiska steg i protokollet som behöver optimeras för effektiv cellradiomärkning. I protokollsteg 1.2 och 1.3 måste en lämplig volym (mikroliter) bas, beroende på volymen av [89 Zr]Zr(HPO 4)2 eller [89Zr]ZrCl4 användas. 1,0 M K 2 CO3 lösning måste användas för neutralisering av [89 Zr] Zr(HPO 4)2 och 1,0 M Na 2 CO3 lösning för neutralisering av [89Zr] ZrCl4 för att uppnå ett pH-intervall på 7,5-8,0. I steg 2.1 måste den cellkompatibla blandningen bestående avK 2 HPO 4/KH2PO 4 och HEPES tillsättas till [89 Zr]Zr-DBN-formuleringen, när den bereds från [89Zr]ZrCl 4, för att öka cellens radiomärkningseffektivitet. Det bör noteras att desferrioxamin-Bn-NCS som radiomärkts med [89 Zr]ZrCl 4 inte radiomärktes stamceller om inte fosfat- och HEPES-buffertar tillsattes i cellmärkningsblandningen, vilket tyder på att det behövs en lämplig formulering för att använda [89Zr]ZrCl4 som utgångsformulering.

För optimering av cellmärkningseffektiviteten för varje celltyp (protokollsteg 4.2) måste inkubationstiden ökas till upp till ~60 min, och inkubationstemperaturen ökas från 25 °C till 37 °C eller märkningslösningens pH ökas till ~8,0. Valet av inkubationstid, temperatur och pH är enligt celltypens kompatibilitet. Till exempel utfördes radiomärkning av hepatocyter vid 27 °C i 45 minuter vid pH ~7,522,24, men radiomärkning av stamceller utfördes vid 37 °C i 30 minuter vid pH ~7,5 18.

För att förhindra förlust av celler under tvättning i protokoll 4.3 måste supernatanten pipetteras ut försiktigt med en pipettvolyminställning som är lägre än den supernatantvolym som behöver pipetteras ut. Till exempel, om supernatantens volym är ~600 μL, måste supernatanten pipetteras ut i steg om ~200-500 μL. Detta hjälper till att undvika att störa cellpelleten. Om cellpelleten störs när du pipetterar ut supernatanten, bör pipetteringen ut ur supernatanten stoppas och centrifugeras igen för att få en väldefinierad cellpellet. Vissa celler, t.ex. monocyter i de vita blodkropparna, är benägna att binda till rörets väggar. Detta påverkar återhämtningen av alla radioaktivt märkta vita blodkroppar från sonden efter tvätt.

Efter radioaktiv märkning av celler godtas ett okulärbesiktningstest, ett viabilitetstest för trypanblått och en stabilitets-/utflödesanalys som kriterier för kvalitetskontroll. Om cellviabiliteten konsekvent minskar vid varje radioaktivt märkningsförsök för en viss celltyp, bör de celler som radiomärks kontrolleras för att säkerställa att de är kompatibla med det cellmedium och den buffert som används vid radiomärkning av celler. Olika kompatibla buffertar och cellmedier sammanfattas i tabell 1. Det är att föredra att använda kända kompatibla cellodlingsbetingelser för stabilitets-/utflödesstudier. Till exempel kan stabilitets-/utflödesstudier utföras med stamceller, dendritiska celler, makrofager, cancerceller, deciduala stromaceller och mononukleära celler i perifert blod under cellodlingsförhållanden som visats av Bansal et al.18och Friberger et al.20.

De potentiella problemen med låg keleringseffektivitet eller inkonsekvent keleringseffektivitet och/eller lågt utbyte eller förlust av cellviabilitet med radioaktiv märkning kan lösas genom att ändra steg 1.5, 4.3.7 och 4.3.10, baserat på de skäl som sammanfattas i tabell 3.

Tabell 3: Felsökning relaterad till [89Zr]Zr-DBN-syntes och radiomärkning av celler. Möjliga orsaker och lösningar för en låg/inkonsekvent keleringseffektivitet, lågt cellradiomärkningsutbyte eller förlust av cellviabilitet. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

PET-avbildning av celltrafik erbjuder hög känslighet, lämplig rumslig upplösning och låg bakgrund25 som fördelar jämfört med andra modaliteter 3,4,9,10. Den [89Zr]Zr-DBN-medierade märkningen av cellyteproteiner med en stabil kovalent bindning ger stabilitet hos den radioaktiva märkningsmärkningen 18,19,20,21,22,23,24,25. Som ett resultat av detta förbättrar [89Zr]Zr-DBN-baserad cellmärkning tillförlitligheten och konfidensen för radiosignalen (positronemission och gamma som produceras efter annihilation) som erhålls från de radiomärkta cellerna. Samtidigt är andra metoder, såsom [89Zr]Zr-oxinbaserad radiomärkning, kända för att stöta på utflöde av märkningsradiotaggen över tid på grund av den icke-kovalenta karaktären hos deras radiomärkning, vilket producerar lägre och off-märkta radiosignaler27,28.

En begränsning med denna radiomärkningsteknik är att radioaktivitetssignalerna i PET-bilderna förvärvas efter in vivo-administrering av levande radiomärkta celler, men ger ingen ledtråd om signalen kommer från levande radiomärkta celler eller från rester av radiomärkta celler som kan ha dött i kroppen efter administreringen.

PET-avbildning för celltrafik har en enorm potential, eftersom den kan stödja utvecklingen av nya cellbaserade terapier 29,30. Läkare och forskare som arbetar med cellbaserade terapier för att behandla cancer 6,7,8,9,10, hjärtinfarkt 3,4,5, myokardsvikt 1,2, näthinnedegeneration 2 och makula 2 och diabetes 2 kommer att finna detta 89Zr-baserat cellmärkningsprotokoll instrumentellt, för att bättre förstå svaren från deras cellbaserade terapier såsom stamcellsterapier. Dessutom har 89Zr-märkta stamceller31, vita blodkroppar32, dendritiska celler 33,34 och CAR T-celler35 stor potential att komma in i den kliniska sfären inom de närmaste 3-5 åren. Dessutom kan läkemedelsföretag använda denna teknik för att utveckla och validera sina cellbaserade terapeutiska medel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget ekonomiskt konkurrerande intresse men är uppfinnarna av denna teknik (Patent # US20210330823A1).

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH 5R21HL127389-02, NIH 4T32HL007111-39, NIH R01HL134664 och DOE DE-SC0008947 anslag, International Atomic Energy Agency, Wien, Mayo Clinic Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, och Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, Rochester, MN. Alla figurer är skapade med hjälp av BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA A996-4
Alpha Minimum Essential Medium Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 12571063
Anion exchange column Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany 731876 Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge
Conical centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc., Glendale, AZ, USA 352096 Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes
Dendritic cells The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA CRL-11904
DFO-Bn-NCS Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA B-705 p-SCN-Bn-Deferoxamine
DMSO Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO 276855
Dose calibrator Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA 5130-3234 CRC -55tR Dose Calibrator 
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA 30-2002
Fetal Bovine Serum (FBS) The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA 30-2020
Hanks Balanced Salt solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 14025092 For preparation of H-HBSS
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade) Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA A508P212
Melanoma cells The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA CRL-6475
Methanol Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO 34860
Microcentrifuge tube Eppendorf, Hamburg, Germany 30108442 Protein LoBind microcentrifuge tube
Murine GM-CSF R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA 415-ML-010
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 15140-122
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA 10010023 For washing cells
Saline Covidien LLC, Mansfield, MA, USA 1020 0.9% Sterile Saline Solution
Shaker  Eppendorf, Hamburg, Germany T1317 Thermomixer
Silica gel-rad-TLC paper sheet  Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA SGI0001 iTLC-SG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhawnani, N., et al. Effectiveness of stem cell therapies in improving clinical outcomes in patients with heart failure. Cureus. 13 (8), e17236 (2021).
  2. Zakrzewski, W., Dobrzynski, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 68 (2019).
  3. Bukhari, A. B., Dutta, S., De, A. Image guidance in stem cell therapeutics: unfolding the blindfold. Current Drug Targets. 16 (6), 658-671 (2015).
  4. Momeni, A., Neelamegham, S., Parashurama, N. Current challenges for the targeted delivery and molecular imaging of stem cells in animal models. Bioengineered. 8 (4), 316-324 (2017).
  5. Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circulation Research. 103 (11), 1204-1219 (2008).
  6. D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
  7. Zhang, Q., et al. CAR-T cell therapy in cancer: tribulations and road ahead. Journal of Immunology Research. 2020, 1924379 (2020).
  8. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).
  9. Shao, F., et al. Radionuclide-based molecular imaging allows CAR-T cellular visualization and therapeutic monitoring. Theranostics. 11 (14), 6800-6817 (2021).
  10. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  11. Wang, Y., et al. Dendritic cell biology and its role in tumor immunotherapy. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 107 (2020).
  12. Bulte, J. W. M., Shakeri-Zadeh, A. In vivo MRI tracking of tumor vaccination and antigen presentation by dendritic cells. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 198-207 (2022).
  13. Holland, J. P., Sheh, Y., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36 (7), 729-739 (2009).
  14. Larenkov, A., et al. Preparation of zirconium-89 solutions for radiopharmaceutical purposes: interrelation between formulation, radiochemical purity, stability and biodistribution. Molecules. 24 (8), 1534 (2019).
  15. Pandey, M. K., et al. A new solid target design for the production of 89Zr and radiosynthesis of high molar activity [89Zr]Zr-DBN. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 12 (1), 15-24 (2022).
  16. Pandey, M. K., et al. Improved production and processing of 89Zr using a solution target. Nuclear Medicine and Biology. 43 (1), 97-100 (2016).
  17. Pandey, M. K., Engelbrecht, H. P., Byrne, J. P., Packard, A. B., DeGrado, T. R. Production of 89Zr via the 89Y(p,n)89Zr reaction in aqueous solution: effect of solution composition on in-target chemistry. Nuclear Medicine and Biology. 41 (4), 309-316 (2014).
  18. Bansal, A., et al. Novel 89Zr cell labeling approach for PET-based cell trafficking studies. EJNMMI Research. 5, 19 (2015).
  19. Bansal, A., et al. 89Zr]Zr-DBN labeled cardiopoietic stem cells proficient for heart failure. Nuclear Medicine and Biology. 90-91, 23-30 (2020).
  20. Friberger, I., et al. Optimisation of the synthesis and cell labelling conditions for [89Zr]Zr-oxine and [89Zr]Zr-DFO-NCS: a direct in vitro comparison in cell types with distinct therapeutic applications. Molecular Imaging and Biology. 23 (6), 952-962 (2021).
  21. Lee, S. H., et al. Feasibility of real-time in vivo 89Zr-DFO-labeled CAR T-cell trafficking using PET imaging. PLoS One. 15 (1), e0223814 (2020).
  22. Nicolas, C. T., et al. Hepatocyte spheroids as an alternative to single cells for transplantation after ex vivo gene therapy in mice and pig models. Surgery. 164 (3), 473-481 (2018).
  23. Yang, B., et al. Tracking and therapeutic value of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell transplantation in reducing venous neointimal hyperplasia associated with arteriovenous fistula. Radiology. 279 (2), 513-522 (2016).
  24. Nicolas, C. T., et al. Ex vivo cell therapy by ectopic hepatocyte transplantation treats the porcine tyrosinemia model of acute liver failure. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 738-750 (2020).
  25. Bansal, A., Sharma, S., Klasen, B., Rosch, F., Pandey, M. K. Evaluation of different 89Zr-labeled synthons for direct labeling and tracking of white blood cells and stem cells in healthy athymic mice. Scientific Reports. 12 (1), 15646 (2022).
  26. Behfar, A., et al. Guided cardiopoiesis enhances therapeutic benefit of bone marrow human mesenchymal stem cells in chronic myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 56 (9), 721-734 (2010).
  27. Charoenphun, P., et al. 89Zr]oxinate4 for long-term in vivo cell tracking by positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 42 (2), 278-287 (2015).
  28. Sato, N., et al. In vivo tracking of adoptively transferred natural killer cells in rhesus macaques using 89zirconium-oxine cell labeling and PET imaging. Clinical Cancer Research. 26 (11), 2573-2581 (2020).
  29. Volpe, A., Pillarsetty, N. V. K., Lewis, J. S., Ponomarev, V. Applications of nuclear-based imaging in gene and cell therapy: probe considerations. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 447-458 (2021).
  30. Fogli, L. K., et al. Challenges and next steps in the advancement of immunotherapy: summary of the 2018 and 2020 National Cancer Institute workshops on cell-based immunotherapy for solid tumors. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e003048 (2021).
  31. Li, X., Hacker, M. Molecular imaging in stem cell-based therapies of cardiac diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 71-88 (2017).
  32. Puges, M., et al. Retrospective study comparing WBC scan and 18F-FDG PET/CT in patients with suspected prosthetic vascular graft infection. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 57 (6), 876-884 (2019).
  33. Butterfield, L. H. Dendritic cells in cancer immunotherapy clinical trials: are we making progress. Frontiers in Immunology. 4, 454 (2013).
  34. de Vries, I. J. M., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nature Biotechnology. 23 (11), 1407-1413 (2005).
  35. Gosmann, D., et al. Promise and challenges of clinical non-invasive T-cell tracking in the era of cancer immunotherapy. EJNMMI Research. 12 (1), 5 (2022).

Tags

Cancer Research nummer 200
Positronemissionstomografiavbildning av celltrafik: En metod för cellradiomärkning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bansal, A., DeGrado, T. R., Pandey,… More

Bansal, A., DeGrado, T. R., Pandey, M. K. Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling. J. Vis. Exp. (200), e64117, doi:10.3791/64117 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter