Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Основные компоненты анализов транскрипции Borreliella (Borrelia) burgdorferi in vitro

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64134
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Medicine, Creighton University

Summary

Анализы транскрипции in vitro могут расшифровать механизмы регуляции транскрипции у Borreliella burgdorferi. Этот протокол описывает этапы очистки РНК-полимеразы B. burgdorferi и проведения реакций транскрипции in vitro. Экспериментальные подходы с использованием анализов транскрипции in vitro требуют надежной очистки и хранения активной РНК-полимеразы.

Abstract

Borreliella burgdorferi — бактериальный патоген с ограниченным метаболическим и геномным репертуаром. B. burgdorferi проходит внеклеточно между позвоночными и клещами и резко реконструирует свой транскрипционный профиль, чтобы выжить в разрозненных средах во время инфекции. Основное внимание в исследованиях B. burgdorferi уделяется четкому пониманию того, как бактерии реагируют на окружающую среду посредством транскрипционных изменений. Анализы транскрипции in vitro позволяют биохимически препарировать основные механизмы регуляции транскрипции. Здесь мы представляем подробный протокол, описывающий очистку и хранение РНК-полимеразы B. burgdorferi , очистку сигма-фактора, генерацию матрицы ДНК и анализы транскрипции in vitro . В протоколе описано использование РНК-полимеразы, очищенной от B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC). 5A4-RpoC представляет собой ранее опубликованный штамм, содержащий 10XHis-метку на гене rpoC , кодирующую самую большую субъединицу РНК-полимеразы. Анализы транскрипции in vitro состоят из РНК-полимеразы, очищенной от штамма 5A4-RpoC, рекомбинантной версии домашнего сигма-фактора RpoD и двухцепочечной матрицы ДНК, сгенерированной ПЦР. В то время как методы очистки белка и подходы к сборке анализов транскрипции in vitro концептуально хорошо изучены и относительно распространены, соображения обработки РНК-полимераз часто различаются от организма к организму. Представленный здесь протокол предназначен для ферментативных исследований РНК-полимеразы B. burgdorferi. Метод может быть адаптирован для проверки роли транскрипционных факторов, промоторов и посттрансляционных модификаций на активность РНК-полимеразы.

Introduction

Болезнь Лайма и возвратный тиф вызываются возбудителями спирохет родов Borrelia и Borreliella 1,2,3. Болезнь Лайма является известным трансмиссивным заболеванием в Северной Америке, и, следовательно, Borreliella burgdorferi является выдающимся модельным организмом для изучения биологии спирохеты 4,5. Исследования механизмов регуляции транскрипции B. burgdorferi направлены на то, чтобы лучше понять его адаптацию к изменениям в окружающей среде, когда он циклически переключается между своим клещом-переносчиком и хозяевами млекопитающих 6,7. Изменения рН, температуры, осмолярности, доступности питательных веществ, короткоцепочечных жирных кислот, органических кислот и уровней растворенного кислорода и углекислого газа модулируют экспрессию генов, которые важны для выживания B. burgdorferi в его членистоногом векторе и заражения животных 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. Связь этих реакций на стимулы с регуляторными механизмами была важным аспектом исследования B. burgdorferi 19.

Транскрипционные факторы и сигма-факторы контролируют транскрипцию генов, осуществляющих клеточные процессы. Спирохеты болезни Лайма и возвратного тифа содержат относительно редкий набор транскрипционных факторов и альтернативных сигма-факторов. Несмотря на это, существуют сложные транскрипционные изменения, направляющие реакцию B. burgdorferi на окружающую среду20,21,22. Конкретные механизмы, приводящие к транскрипционным изменениям у B. burgdorferi в ответ на изменения окружающей среды, остаются неясными. Транскрипционные анализы in vitro являются мощными инструментами для использования биохимического подхода к анализу функции и регуляторных механизмов транскрипционных факторов и сигма-факторов23,24,25,26.

Недавно была создана система анализа транскрипции in vitro с использованием РНК-полимеразы B. burgdorferi 24. Поскольку бактерии часто имеют уникальную клеточную физиологию, РНК-полимеразы разных видов и родов по-разному реагируют на очистку ферментов, хранение ферментов и условия буфера реакции27. B. burgdorferi также генетически далек от многих видов бактерий, у которых были изучены РНК-полимеразы20. Аспекты ферментной подготовки, такие как условия буфера лизиса, промывки и элюирования, буфер хранения, буфер реакции транскрипции in vitro и метод построения анализа, могут изменять активность РНК-полимеразы. Здесь мы предлагаем протокол очистки РНК-полимеразы и сигма-фактора RpoD, получения линейной двухцепочечной матрицы ДНК и построения анализов транскрипции in vitro для облегчения воспроизводимости между лабораториями, использующими эту систему. Мы подробно описываем пример реакции, чтобы продемонстрировать линейный диапазон для RpoD-зависимой транскрипции, и обсуждаем ограничения и альтернативы этому подходу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Очистка РНК-полимеразы и получение РНК-полимеразного сырья

  1. Собирают клеточную гранулу из 2-4 л B. burgdorferi RpoC-His10X, культивируемой в среде BSKII в микроаэрофильной среде (34 °C, 5% CO 2, 3% O 2) до плотности2-4 x 107 клеток/мл с использованием ранее описанных протоколов клеточного сбора 28,29. Проведите центрифугирование при 10 000 x g при 4 ° C в течение 30 мин в центробежных бутылках по 500 мл и слейте надосадочную жидкость.
  2. Ресуспендируют клетки в 30 мл ледяного буфера HN (10 мМ HEPES, 10 мМ NaCl, pH 8,0). Повторите этап центрифугирования, как описано выше, используя центрифужную пробирку объемом 50 мл и сцедите надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остановочный пункт. Заморозьте клеточный гранул при температуре −80 °C, чтобы хранить клетки до 2 недель, или немедленно приступайте к лизису клеток.
  3. Поддерживайте клетки, лизат и очищенные белки при температуре 4 ° C или на льду, если не замораживать. Сохраняйте РНК-полимеразу в восстановительной среде, добавляя свежеприготовленный DTT в концентрации 2 мМ в каждый буфер, используемый в этом протоколе, и поддерживайте pH 8,0.
  4. Приготовьте лизат из гранул клеток B. burgdorferi с помощью коммерческого набора для лизиса бактерий, следуя инструкциям набора. Ресуспендировать гранулу в 10-15 мл раствора B-per комнатной температуры (РТ) без ингибитора протеазы и дать лизису продолжаться в течение 5 мин на льду. Объем лизиса зависит от размера гранул ячейки, как описано в инструкциях к набору.
  5. Добавьте коктейль ингибитора протеазы в раствор для лизиса, а затем три раунда обработки ультразвуком, как описано в разделе репрезентативных результатов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно лизировать клетки во французской ячейке давления, как описано ранее24. Пропустите шаг 1.4. и шаг 1.5.
  6. Осветляют лизат клеток с помощью центрифугирования и фильтрации с помощью центрифужной пробирки объемом 50 мл. Заполните объем пробирки не менее чем до 30 мл общего объема, добавив в раствор буфер загрузки кобальтовой колонны (таблица 1). Гранулируйте клеточный мусор центрифугированием при 20 000 x g в течение 30 мин.
  7. Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью шприцевого фильтра 0,45 мкм.
  8. Разбавьте лизат в загрузочном буфере кобальтовой колонны (таблица 1), используя конечное соотношение разбавления 1:10.
  9. Проведите аффинную хроматографию надосадочной жидкости лизата осветленных клеток с помощью колонки из кобальта или никелевой смолы, следуя инструкциям производителя. Пример см. в разделе репрезентативных результатов. Используйте буферы, перечисленные в таблице 1. Соберите проточные, промывочные и элюирующие образцы для анализа.
  10. Немедленно замените РНК-полимеразу в элюирующем буферном растворе на буферный раствор для хранения РНК-полимеразы (таблица 1) с помощью буферной обменной колонки, следуя инструкциям производителя.
  11. Подготовьте запасы в морозильной камере, сконцентрировав РНК-полимеразу с помощью центробежных фильтрующих блоков с отсечкой 10 кДа до концентрации 0,2-0,4 мг/мл, определенной с помощью спектрофотометрии (280 нм без корректировки коэффициента экстинкции [1 абс при 1 см = 1 мг·мл-1]).
  12. Аликвотная РНК-полимераза в морозильной камере хранится в объемах 20-50 мкл в пробирках для ПЦР и хранит РНК-полимеразу при -80 ° C.
  13. Определите качество аффинной хроматографии с помощью SDS-PAGE и измерьте общий выход белка с помощью спектрофотометрии или анализа BCA. Запустите образцы на 7,5% полиакриламидном геле при 120 В в течение 50 минут для хорошего разрешения SDS-PAGE.

2. Очистка рекомбинантного RpoD и подготовка сырья RpoD

  1. Культивируйте и индуцируйте экспрессию рекомбинантного B. burgdorferi RpoD (MBP-RpoD), меченного белкомбинантным белком, меченным мальтозой, в BL21::MBP-RpoDBb, как описано в руководстве по эксплуатации системы слияния и очистки белка, приведенном в таблице материалов, и собирайте клетки центрифугированием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остановочный пункт. Заморозьте гранулы клеток при температуре -80 °C, чтобы хранить клетки до 2 недель, или немедленно приступайте к лизису клеток.
  2. Выполните лизис, используя коммерческий набор для лизиса бактериальных клеток или французский датчик давления. Пример буфера лизиса приведен в таблице 1.
  3. Осветляют лизат клеток с помощью центрифугирования и фильтрации. Гранулируйте клеточный мусор центрифугированием при 20 000 x g в течение 30 мин. Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью фильтра 0,45 мкм.
  4. Экстракция MBP-RpoD с использованием протокола экстракции белка для системы экспрессии. В разделе «Репрезентативные результаты» см., например, сведения о реализации и результаты.
  5. Определите качество процесса аффинной хроматографии и элюирования с помощью SDS-PAGE и измерьте выход белка с помощью спектрофотометрии (280 нм без корректировки коэффициента экстинкции [1 абс при 1 см = 1 мг · мл − 1]). Используйте 10% полиакриламидный гель при 200 В в течение 30 мин для разделения в SDS-PAGE.
  6. Концентратируют MBP-RpoD с помощью центробежного фильтра с отсечкой 10 кДа до концентрации >2 мг/мл, определяемой с помощью спектрофотометрии.
  7. Отщепите MBP от RpoD на сайте расщепления фактора Xa. Добавьте CaCl 2 к фракциям элюирования аффинной хроматографии, содержащим MBP-RpoD в концентрации2 мМ. Добавьте 200 мкг протеазы фактора Ха на каждые 30 мг очищенного белка. Инкубация в течение ночи при RT.
  8. Подтвердите полное отщепление MBP от RpoD с помощью SDS-PAGE. Используйте 10% полиакриламидный гель при 200 В в течение 30 мин для разделения в SDS-PAGE.
  9. Разбавляют MBP и RpoD-содержащий раствор в соотношении 1:10 гепарин-связывающим буфером.
  10. Разделите MBP и RpoD на гепариновой колонке с помощью FPLC. Настройки FPLC см. в таблице 2 .
  11. Определите качество продуктов аффинной хроматографии с помощью SDS-PAGE и измерьте выход белка с помощью спектрофотометрии. Используйте 10% полиакриламидный гель при 200 В в течение 30 мин для разделения в SDS-PAGE.
  12. Концентратируют элюирующие фракции, содержащие RpoD, с помощью центробежного фильтра с отсечкой 10 кДа до конечного объема 2-3 мл.
  13. Буфер обменивает концентрированные фракции элюирования RpoD на буфер хранения с помощью колонны для фильтрации геля.
  14. Сконцентрируйте сырье RpoD с помощью центробежного фильтра с отсечкой 10 кДа до концентрации 0,2-0,8 мг/мл, определенной с помощью спектрофотометрии.
  15. Aliquot RpoD хранится в объемах 20-50 мкл в ПЦР-пробирках и хранится при -80 °C.

3. Подготовка материала шаблона ДНК

  1. ПЦР амплифицирует область 500.н., окружающую промоторный сайт, управляемый RpoD, из геномной ДНК B. burgdorferi , используя реакцию 200 мкл (таблица 3).
  2. Очистите продукты ПЦР с помощью коммерческого набора для очистки ПЦР. Элюте ДНК в молекулярной биологии класс H2O.
  3. Отрегулируйте молярную концентрацию матриц ДНК, сгенерированных ПЦР, до 100 нМ путем разбавления в молекулярной биологии класса H2O.

4. Выполнить транскрипцию in vitro с включением радиоактивно меченных нуклеотидов

  1. Подготовьте экспериментальный план транскрипции in vitro . Определите концентрацию РНК-полимеразы, RpoD и матрицы ДНК. Определите аликвотные объемы и заказы на пипетирование для реакционных пробирок. Пример см. в таблице 4 и на рисунке 1 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включите контрольные элементы в план эксперимента, такие как реакции, не содержащие РНК-полимеразы, альтернативной полимеразы, без шаблона или альтернативные шаблоны.
  2. Рассчитайте объем α-32-АТФ, необходимый для эксперимента. Включите это в план эксперимента. Как правило, включают 2 мкКи активности на реакцию транскрипции in vitro для обнаружения люминофорного экрана.
  3. Подготовьте рабочие поверхности, включая радиационный стенд, чтобы снизить риск радиационного загрязнения.
  4. Размораживание свежих аликвот РНК-полимеразы, Rpo, 5-кратного буфера NTP и шаблонных исходных растворов на льду. Перед пипеткой тщательно перемешайте все размороженные замороженные бульоны.
  5. Приготовьте мастер-реакционную смесь и отдельную смесь NTP для радиоактивно меченных нуклеотидов в соответствии с планом эксперимента.
  6. Распределите контрольные реакции и экспериментальные наборы в ПЦР-пробирки для подготовки к добавлению радиоактивной метки в реакцию. Аккуратно распределите H2O, основную реакционную смесь, РНК-полимеразу и RpoD в специальные пробирки для ПЦР и перемешайте пипеткой.
  7. Перенесите подготовленные материалы на радиационный стенд.
  8. Добавьте α-32P-АТФ в NTP и перемешайте легким пипетированием.
    ВНИМАНИЕ: При работе с радиоактивными материалами используйте соответствующее защитное снаряжение и процедуры обращения с радиоактивными изотопами.
  9. Добавляют NTP в пробирки, содержащие реакционные смеси транскрипции in vitro , начиная с шага 4.6.
  10. Начните реакцию транскрипции in vitro с добавлением матрицы ДНК. Перемешайте реакционный объем, аккуратно пипетируя.
  11. Инкубируйте пробирки при 37 °C в течение 5 мин в термоциклере или тепловом блоке.
  12. Удалите реакции из термоциклера или теплового блока и добавьте 2x краситель, загружающий РНК, содержащий 50% формамида, к равному объему реакции, чтобы остановить реакции транскрипции in vitro .
  13. Денатурируют ферменты путем инкубации реакций при 65 ° C в течение 5 мин в термоциклере или тепловом блоке.
  14. Отделите РНК в смеси реакции транскрипции in vitro с помощью гель-электрофореза с использованием 10%-15% полиакриламидных гелей мочевины TBE при 180 В в течение 30-45 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от условий гель-электрофореза буферный раствор может быть загрязнен радиоактивно меченными нуклеотидами, или гель может содержать большую часть или все радиоактивно меченные нуклеотиды. Планирование надлежащего хранения или утилизации радиоактивных веществ.
  15. Визуализируйте РНК с радиоактивной меткой с помощью фосфоэкрана после удаления любой части геля, содержащей неинкорпорированную АТФ с радиоактивной меткой. Подвергните гель воздействию фосфоэкрана на ночь (16 ч) и получите изображение с помощью тепловизора phosphoscreen (разрешение 100 мкм, напряжение трубки ФЭУ 700 В).
  16. Анализ данных методами денситометрии24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В реакции транскрипции in vitro , в которой ограничивающим этапом реакции является инициация транскрипции, опосредованная сигма-фактором, активность транскрипции должна линейно увеличиваться с количеством сигма-фактора. Мы представляем подготовку экспериментов по транскрипции in vitro , тестирующих диапазон концентраций RpoD вместе с двумя концентрациями РНК-полимеразы для наблюдения результирующего изменяющегося сигнала от включения радиоактивно меченных нуклеотидов в продукты РНК. Приведены репрезентативные результаты получения РНК-полимеразы, RpoD и двухцепочечных матричных запасов ДНК. Репрезентативные реакции транскрипции in vitro служат примером приемлемых для анализа уровней активности РНК-полимеразы.

Для очистки РНК-полимеразы выращивали 4-литровую культуру B. burgdorferi RpoC-His10X при 34 °C в микроаэрофильных условиях (5%CO2, 3% O2). Культуры тщательно контролировались на плотность спирохет с помощью темнопольной микроскопии и собирались до достижения плотности выше 4 x 107 спирохет/мл. Клетки ресуспендировали в смеси B-PER для лизиса (табл. 1). Клеточную гранулу гомогенизировали пипеткой с последующей 5-минутной инкубацией в RT и последующими раундами обработки ультразвуком в течение 3 с в трех экземплярах. Осветленные лизаты разбавляли буфером загрузки кобальтовой колонны и 5 мл кобальтовой смолы до общего объема 180 мл. RpoC-His10X позволяли связываться с кобальтовой смолой путем нутации смеси в течение 1 ч при 4 °C. Смесь переносили в самотечную колонну и промывали пять раз 40 мл буфера для промывки колонны. Связанный белок высвобождался путем пропускания 5 мл элюирующего буфера через колонку, и элюирование повторяли семь раз. Образцы проточных, промывочных и элюирующих фракций разделяли с помощью SDS-PAGE и визуализировали путем включения пятна (рис. 1). Основной комплекс РНК-полимеразы состоит из RpoC, RpoB и RpoA размером 154 кДа, 129 кДа и 38,5 кДа соответственно. Репрезентативный результат, показанный на рисунке 1 , показывает три заметные полосы при размерах трех пептидов, составляющих комплекс РНК-полимеразы. Проточный из аффинной хроматографии содержал 0,5-1 мг / мл белка с соотношением 260/280 от 1,0 до 1,7, что указывает на более высокую концентрацию нуклеиновых кислот. Выход белка РНК-полимеразы после концентрации белковой смеси, определенной с помощью спектрофотометрии, составил 0,3 мг/мл.

Для получения запасов белка RpoD рекомбинантный RpoD с меткой C-концевого белка, связывающего мальтозу, экспрессировали из плазмиды pMAL-C5X в BL21 (DE3) pLysS E. coli. 2 л кишечной палочки выращивали при 32 ° C до OD600нм 0,5. Затем культуру обрабатывали 0,3 мМ IPTG, чтобы индуцировать экспрессию RpoD в течение 1 ч. Клетки гранулировали центрифугированием и лизировали в B-PER. Полученные 200 мл разбавленного клеточного лизата фильтровали через 10 мл амилозной смолы. Смолу восемь раз промывали 40 мл связывающего буфера для удаления остаточной ДНК и пептидов. RpoD, меченный MBP, пять раз элюировали 5 мл элюирующего буфера в колонку смолы. Проточные потоки от стадий связывания и промывки, а также фракции элюирования были проанализированы с помощью SDS-PAGE (рис. 2A). Основным компонентом элюирующей фракции является пептид ~ 115 кДа, соответствующий размеру меченого MBP рекомбинантного B. burgdorferi RpoD. Фракции элюирования объединяли, концентрацию CaCl 2 доводили до2 мМ, а к 40 мг очищенного белка добавляли 100 мкг протеазы FactorXa. После ночного сглаживания при комнатной температуре реакцию анализировали с помощью SDS-PAGE (рис. 2B). После расщепления протеазой фактора Ха двумя основными продуктами в смеси были RpoD (73,6 кДа) и MBP (45 кДа). Смесь белков RpoD и MBP разделяли с помощью гепариновой аффинной хроматографии. Смесь разбавляли в соотношении 1:10 в гепаринсвязывающем буфере и загружали в колонну смолы, связанной с гепарином, в FPLC. RpoD элюировали с возрастающим градиентом NaCl до концентрации 1 М. Когда фракции были проанализированы с помощью SDS-PAGE, основная полоса размером 73,6 кДа была очевидна во фракции элюирования в диапазоне 400-600 мМ NaCl (рис. 2C). Некоторые разложившиеся фрагменты RpoD были совместно очищены. Фракции, содержащие RpoD, объединяли, обменивали буфер на буфер хранения RpoD, а затем концентрировали с помощью центробежного фильтра с отсечкой 10 кДа. Конечная концентрация RpoD составила 0,67 мг/мл (9,1 мМ), как определено с помощью спектрофотометрии.

Двухцепочечная матрица ДНК, охватывающая промоторный сайт B. burgdorferi flgB, была получена с помощью ПЦР. Промотор flgB амплифицировали праймерами, которые соответствовали 250.н. выше и ниже по течению от промотора (таблица 6), используя реакцию 200 мкл, содержащую 30 нг ДНК B. burgdorferi 24,30. Продукт ПЦР анализировали методом гель-электрофореза в 1% агарозном геле (рис. 3). Продукт ПЦР имел размер примерно 500.н. с кажущейся однородностью. Важно отметить, что загрязнение солями и клеточными компонентами может способствовать вариабельности результатов реакции транскрипции in vitro; мы следим за тем, чтобы матрица ДНК была тщательно обессолена на колонке очистки ПЦР.

Экспериментальная схема, в которой транскрипция инициируется добавлением матричной ДНК, может проверить скорость распознавания промотора и инициации транскрипции. В наших репрезентативных экспериментах серию разбавления белка RpoD получали путем двойного разведения в воде в диапазоне от 16 нМ до 1 мкМ. Была создана мастер-смесь, содержащая РНК-полимеразу в реакционном буфере, содержащем двухвалентные катионы, необходимые для активности (Таблица 4 и Таблица 5). RpoD и мастер-микс были аликвотированы вместе на льду. Мастер-смесь, содержащая РНК-полимеразу и RpoD, была допущена к инкубации, в то время как были приготовлены другие этапы транскрипции in vitro . Мы включили три контрольные реакции: положительную контрольную реакцию, приготовленную отдельно от основной смеси, отрицательную контрольную реакцию, не содержащую матричной ДНК, чтобы гарантировать, что сигнал транскрипции in vitro зависит от матрицы, и отрицательную контрольную реакцию без РНК-полимеразы, чтобы убедиться, что сигнал зависит от РНК-полимеразы. Радиоактивно меченные нуклеотиды добавляли в реакцию путем смешивания 5 мкл (α-32-АТФ) с 20 мкл 10-кратной исходной смеси NTP, чтобы создать достаточную аликвоту для 20 реакций для компенсации невосстановимых объемов. Наконец, матричная ДНК, кодирующая промотор flgB , вводили в реакционные пробирки путем пипетки в соответствии с ранее запланированным порядком пипетирования (рис. 4).

Сигнал от фрагментов РНК, генерируемых транскрипцией in vitro , был обнаружен с помощью люминофорного экрана после 16-часового периода воздействия геля TBE-мочевины, содержащего РНК, разделенного гель-электрофорезом. Эксперимент, содержащий 50 нМ РНК-полимеразы и RpoD в диапазоне от 500 нМ до 16 нМ, дал продукты РНК 250.н. (рис. 5). При каждом двукратном разведении концентрации RpoD наблюдался более низкий уровень накопленного РНК-продукта. Был ряд продуктов с более низким bp, которые появлялись ниже заметной полосы, что указывает на неполные фрагменты РНК из-за остановки транскрипции или фрагментированной матрицы ДНК. Продукты РНК отсутствовали в контроле без матрицы, что указывает на отсутствие экзогенных фрагментов ДНК, способствующих сигналу в этом анализе. В контроле без РНК-полимеразы не было обнаружено никакого сигнала, что указывает на то, что РНК-полимераза B. burgdorferi была единственной полимеразой, способствующей производству РНК в этом анализе.

Во втором эксперименте мы использовали более низкую концентрацию РНК-полимеразы 25 нМ (рис. 6). Меньшее количество продуктов РНК было обнаружено в диапазоне протестированных концентраций RpoD по сравнению с рисунком 5, а интенсивность фонового сигнала была выше. Это проблематично для последующего анализа с помощью денситометрии. Когда люминофорное изображение было проанализировано с помощью денситометрии (рис. 7), сигнал денситометрии, полученный от фосфоэкрана, показал линейную зависимость между количеством RpoD, присутствующим в реакции в обоих экспериментах. Однако в эксперименте с высоким фоновым сигналом реакция, содержащая 25 нМ РНК-полимеразы и менее 100 нМ RpoD, была ненадежной для сравнения относительных уровней транскрипции.

Figure 1
Рисунок 1: Разделение РНК-полимеразы B. burgdorferi , помеченной His, очищенной аффинной хроматографией. Проточную фракцию клеточного лизата (полоса 1), фракцию первой промывки (полоса 2), последнюю фракцию промывки (полоса 3) и пять фракций элюирования (полоса 4-8) разбавляли в буфере загрузки образца 2x, кипятили и разделяли SDS-PAGE в градиентном полиакриламидном геле при 200 В в течение 30 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Анализ очистки RpoD гель-электрофорезом. (A) Объединенные проточные фракции (полоса 1 и полоса 2), промывочные фракции (полосы 3-5) и элюирующие фракции (полосы 6-10) в результате очистки RpoD, меченного MBP, с помощью хроматографии, сродственной к амилозной смоле. (B) Белковая смесь после расщепления MBP и RpoD с использованием протеазы фактора Xa. (C) Проточный раствор (полоса 1) и фракции элюирования с возрастающим градиентом NaCl (полосы 2-9) от аффинной хроматографии к гепарину для разделения MBP и RpoD. В каждом представленном геле образцы смешивали с 2-кратным загрузочным буфером, кипятили и отделяли в градиентном полиакриламидном геле с использованием SDS-PAGE при 200 В в течение 30 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: ПЦР-генерация шаблонов транскрипции in vitro. Показаны ампликоны размером 500.н., содержащие промотор flgB (полоса 1 и полоса 2), и контрольные реакции ПЦР, содержащие ампликоны других промоторных сайтов (полосы 3-4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Схема эксперимента и план последовательности пипетирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: RpoD-зависимая вариабельность сигнала люминофорного изображения от РНК, генерируемого транскрипцией in vitro с использованием РНК-полимеразы B. burgdorferi. Реакции транскрипции in vitro содержали 50 нМ РНК-полимеразы и различные уровни RpoD, указанные выше полос24. РНК разделяли 10% гелем TBE-мочевины, а для захвата сигнала от радиоактивного распада в течение 16 ч использовался люминофорный экран. Эта цифра была изменена из Boyle et al.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: RpoD-зависимая вариабельность сигнала люминофорного изображения от РНК, генерируемого транскрипцией in vitro . Транскрипция in vitro содержала 25 нМ РНК-полимеразы и различные уровни RpoD, указанные над полосами. РНК разделяли 15% гелем мочевины TBE, а для захвата сигнала от радиоактивного распада в течение 16 ч использовали люминофорный экран. Более низкая концентрация РНК-полимеразы и более высокий фоновый сигнал увеличивали сложность точного измерения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Увеличение накопления радиоактивно меченной РНК в реакциях транскрипции in vitro с повышением уровня RpoD. Сигналы, обнаруженные на люминофорном экране, были проанализированы методом денситометрии без вычитания фона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Медиа-рецепты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Настройки FPLC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 3: ПЦР-реакции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 4: План эксперимента с РНК-полимеразой 50 нМ и расчет объема. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 5: План эксперимента с РНК-полимеразой 25 нМ и расчет объема. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 6: Штаммы и олигонуклеотиды, используемые в этом протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анализы транскрипции in vitro, построенные с использованием представленного протокола, недавно были использованы для изучения роли транскрипционного фактора у B. burgdorferi и могут быть применены для построения аналогичных экспериментов с использованием других транскрипционных факторов, сигма-факторов и молекул23. После получения активной РНК-полимеразы из B. burgdorferi и определения ее активности компоненты и условия в анализах транскрипции in vitro могут быть изменены. Анализ очень гибкий и модифицируемый. Реакции являются модульными и построены из замороженных источников и требуют небольшого времени после выбора экспериментальных параметров. При достаточном запасе можно провести несколько экспериментов за 1 день.

Получение активной РНК-полимеразы является наиболее важным аспектом подготовки реакции транскрипции in vitro . Мы рекомендуем собирать РНК-полимеразу из клеток, выращенных до середины логарифмической фазы роста, как описано в этом протоколе. При очистке РНК-полимеразы от любых бактерий скорость роста была отмечена как важный фактор очистки активной РНК-полимеразы. РНК-полимеразы могут накапливать посттрансляционные модификации и могут ассоциироваться с ингибирующими факторами транскрипции в стационарной фазероста 31. Нам не удалось очистить большое количество активной РНК-полимеразы из культур B. burgdorferi , выращенных до стационарной фазы. Подход аффинной хроматографии, по сравнению с подходомфизического разделения 32, также полезен для очистки от B. burgdorferi , поскольку организм достигает низкой плотности в культуре, а накопление больших количеств клеточной культуры является относительно материалоемким.

При очистке других бактериальных РНК-полимераз сигма-факторы могут соочищаться в значительных количествах в зависимости от способа очистки и условий33,34,35,36. Совместная очистка сигма-факторов может ограничить последующие эксперименты с использованием альтернативных сигма-факторов, модифицированных сигма-факторов или отсутствия сигма-факторов. Кроме того, добавление домашнего сигма-фактора RpoD полезно для обнаружения активности независимо от первоначальной совместной очистки сигма-фактора37. Из-за гибкости отделения сигма-фактора от ядра РНК-полимеразы мы считаем выгодным, что сигма-факторы не соочищаются в условиях очистки His-аффинной хроматографии, описанных здесь. Возможно, что условия очистки могут быть изменены для получения более интактных и активных холоферментов, содержащих RpoD. Например, концентрации соли, вероятно, влияют на стабильность ферментов множественных субъединиц, и влияние концентрации имидазола на стабильность РНК-полимеразного комплекса B. burgdorferi или его двухвалентного катионного включения также неизвестно.

Б. burgdorferi Ферментативная активность РНК-полимеразы чувствительна к типу и количеству присутствующих двухвалентных катионов24. Мы обнаружили, что марганец необходим для максимальной активности РНК-полимеразы, а магний, по-видимому, вносит меньший вклад в активность. Загрязняющие ионы в воде придают высокую вариабельность ферментативной активности РНК-полимеразы. Следовательно, высокочистая вода, такая как класс молекулярной биологии, класс ВЭЖХ и класс анализа металлов H2O с небольшим количеством присутствующих ионов металлов, необходима для более высокой активности РНК-полимеразы в протоколе, описанном здесь. РНК-полимеразы также чувствительны к рН и требуют восстановительной среды во время очистки27. Изменение рН или использование BME в качестве восстановителя привело к неактивной РНК-полимеразе. Мы рекомендуем использовать коммерчески доступную РНК-полимеразу E. coli в качестве контроля для обеспечения правильного построения анализов транскрипции in vitro 24. Кишечная палочка РНК-полимераза позволит проверить жизнеспособность нуклеотидов, метод построения матрицы, включение радиоактивной метки, разделение РНК и метод детектирования сигналов. Однако следует отметить, что РНК-полимераза B. burgdorferi имеет специфические требования к двухвалентному катиону, буферу и промотору по сравнению с E. coli.

Существует несколько методов обнаружения реакций транскрипции in vitro. Включение красителя и анализы молекулярных маяков являются распространенными альтернативами методу обнаружения радиоактивной метки38,39. Включение нуклеотидов с радиоактивной меткой в настоящее время является наиболее чувствительным методом обнаружения РНК. Альтернативные анализы требуют большего количества РНК-полимеразы для достижения измеримых уровней сигнала по сравнению с радиоактивными анализами. Кроме того, методы включения красителей и молекулярных маяков обычно имеют больше способов ошибочных сигналов. Например, загрязнение ДНКазой может привести к тому, что молекулярные маяки будут излучать сигнал в отсутствие их цели. Используя включение радиоактивной метки, относительная активность фермента РНК-полимеразы B. burgdorferi может быть обнаружена даже на низких уровнях, что подходит для первоначальных экспериментов с ферментами РНК-полимеразы.

В то время как концентрация фермента РНК-полимеразы B. burgdorferi , включенного в реакцию, стандартизирована с помощью спектрофотометрии, это измерение может быть источником изменчивости. Удельная активность РНК-полимераз может зависеть от количества полностью образованных активных холоферментов, входящих в состав общей белковой смеси40. Например, молярное количество 50 нМ РНК-полимеразы, представленное в наших результатах, было определено с помощью спектрофотометрии, но анализ количеств субъединиц с помощью количественного вестерн-блоттинга показал, что субъединица RpoA является лимитирующим компонентом в количестве потенциальных РНК-полимеразных холоферментов, и в нашей смеси 24 возможно максимум только21 нМ полностью сформированной РНК-полимеразы. Всегда следует проводить эксперименты для контроля вариаций РНК-полимеразы и других компонентов реакции транскрипции in vitro от партии к партии.

В нашем репрезентативном эксперименте, показанном на рисунке 5, уровни RpoD были изменены, и была продемонстрирована линейная зависимость между RpoD и обнаруженным сигналом. Транскрипция in vitro является универсальным методом, который может быть легко изменен с помощью представленного экспериментального шаблона (табл. 4). Например, альтернативные сигма-факторы или альтернативные шаблоны ДНК могут быть легко протестированы24. Альтернативные шаблоны могут включать различные промоторные области, генерируемые с помощью ПЦР или плазмиды, очищенной из клеток, для введения суперспиральных и метилированных функций ДНК. Для данного уровня RpoD, РНК-полимеразы и матрицы могут быть добавлены различные уровни транскрипционного фактора, чтобы увидеть ингибирование или усиление активности промотора23. Порядок добавления компонентов и молярных соотношений в реакции транскрипции in vitro может быть изменен таким образом, что комплексы инициации транскрипции образуются до начала реакции; Эти реакции могут измерять удлинение транскрипции вместо инициациитранскрипции 40. Анализ транскрипции in vitro может быть изменен в соответствии с различными исследованиями биологии B. burgdorferi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом Фонда стратегических инвестиций в области здравоохранения Крейтонского университета. Штамм B. burgdorferi RpoC-His10X был любезно предоставлен доктором Д. Скоттом Сэмюэлсом из Университета Монтаны. Штамм E. coli , содержащий плазмиду pMAL-C5X, кодирующую аллель rpoD , меченный мальтозосвязывающим белком, был любезно предоставлен доктором Фрэнком Герардини из Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 micron syringe filter Thermo Scientific 726-2545 Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes MidSci C50B Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes Thermo Scientific 3119-0050PK Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles Thermo Scientific 3120-9500PK Step 1.1
B-PER and instruction manual Thermo Scientific 78248 Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride Fisher Scientific 10035-04-8 Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff Millipore Sigma UFC8010 Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual Thermo Scientific 89969 Step 1.9
Dithiothreitol Acros Organics 426380500 Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease) Millipore Sigma 70746 Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease  Haematologic Technologies HCXA-0060 Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager GE lifesciences Multiple Step 4.15
Gel Imager Bio-Rad Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription Fisher Scientific 7732-18-5 Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit New England Biolabs M0530S Step 3.1
High-speed centrifuge Eppendorf Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL Cytiva Life Sciences 17040601 Step 2.8
Imidazole Sigma-Aldrich 56750-100G Step 1.9
Lysozyme Thermo Scientific 90082 Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride  Fisher Scientific S25401 Step 4.1
Manganese chloride Fisher Scientific S25418 Step 4.1
Mini protean tetra cell Bio-Rad Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40 Thermo Scientific 85124 Step 4.1
NTP mixture Thermo Scientific R0481 Step 4.1
PCR purification kit Qiagen 28506 Step 3.2
PCR tubes MidSci PR-PCR28ACF Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual Cytiva 17085101 Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion
and Purification System Instruction manual		 New England Biolabs E8200S Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD Bio-Rad 456-8125 Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate Sigma-Aldrich G1251 Step 4.1
Protease inhibitor Thermo Scientific 78425 Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP Perkin Elmer BLU503H Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x) New England Biolabs B0363S Step 4.13
Rnase inhibitor Thermo Scientific EO0381 Step 4.1
Spectrophotometer Biotek Mutiple Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent Bio-Rad 4566033 Step 4.14

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  2. Kingry, L. C., et al. Surveillance for and discovery of Borrelia Species in US patients suspected of tickborne illness. Clinical Infectious Diseases. 66 (12), 1864-1871 (2018).
  3. Cutler, S. J. Relapsing fever Borreliae: A global review. Clinics in Laboratory Medicine. 35 (4), 847-865 (2015).
  4. Barbour, A. G., Hayes, S. F. Biology of Borrelia species. Microbiological Reviews. 50 (4), 381-400 (1986).
  5. Tilly, K., Rosa, P. A., Stewart, P. E. Biology of infection with Borrelia burgdorferi. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 217-234 (2008).
  6. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  7. Caimano, M. J., Drecktrah, D., Kung, F., Samuels, D. S. Interaction of the Lyme disease spirochete with its tick vector. Cellular Microbiology. 18 (7), 919-927 (2016).
  8. Dulebohn, D. P., Richards, C. L., Su, H., Lawrence, K. A., Gherardini, F. C. Weak organic acids decrease Borrelia burgdorferi cytoplasmic pH, eliciting an acid stress response and impacting RpoN- and RpoS-dependent gene expression. Frontiers in Microbiology. 8, 1734 (2017).
  9. Bontemps-Gallo, S., Lawrence, K., Gherardini, F. C. Two different virulence-related regulatory pathways in Borrelia burgdorferi are directly affected by osmotic fluxes in the blood meal of feeding ixodes ticks. PLoS Pathogens. 12 (8), 1005791 (2016).
  10. Bugrysheva, J. V., et al. Characterization of the RelBbu Regulon in Borrelia burgdorferi reveals modulation of glycerol metabolism by (p)ppGpp. PLoS One. 10 (2), 0118063 (2015).
  11. Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 67 (7), 3181-3187 (1999).
  12. Drecktrah, D., et al. The Borrelia burgdorferi RelA/SpoT homolog and stringent response regulate survival in the tick vector and global gene expression during starvation. PLoS Pathogens. 11 (9), 1005160 (2015).
  13. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  14. Lin, Y. H., Chen, Y., Smith, T. C., Karna, S. L. R., Seshu, J. Short-chain fatty acids alter metabolic and virulence attributes of Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 86 (9), 00217-00218 (2018).
  15. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  16. Stevenson, B., Schwan, T. G., Rosa, P. A. Temperature-related differential expression of antigens in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 63 (11), 4535-4539 (1995).
  17. Troxell, B., et al. Manganese and zinc regulate virulence determinants in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 81 (8), 2743-2752 (2013).
  18. Yang, X., et al. Interdependence of environmental factors influencing reciprocal patterns of gene expression in virulent Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 37 (6), 1470-1479 (2000).
  19. Samuels, D. S., et al. Gene regulation and transcriptomics. Current Issues in Molecular Biology. 42, 223-266 (2021).
  20. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  21. Iyer, R., Schwartz, I. Microarray-based comparative genomic and transcriptome analysis of Borrelia burgdorferi. Microarrays. 5 (2), 9 (2016).
  22. Iyer, R., et al. Stage-specific global alterations in the transcriptomes of Lyme disease spirochetes during tick feeding and following mammalian host adaptation. Molecular Microbiology. 95 (3), 509-538 (2015).
  23. Boyle, W. K., et al. DksA-dependent regulation of RpoS contributes to Borrelia burgdorferi tick-borne transmission and mammalian infectivity. PLoS Pathogen. 17 (2), 1009072 (2021).
  24. Boyle, W. K., et al. Establishment of an in vitro RNA polymerase transcription system: a new tool to study transcriptional activation in Borrelia burgdorferi. Scientific Reports. 10 (1), 8246 (2020).
  25. Silar, R., et al. Use of in vitro transcription system for analysis of Corynebacterium glutamicum promoters recognized by two sigma factors. Current Microbiology. 73 (3), 401-408 (2016).
  26. Maciag, A., et al. In vitro transcription profiling of the sigmaS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the sigmaS regulon and identification of sigmaS-specific promoter sequence elements. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5338-5355 (2011).
  27. Chang, A., et al. BRENDA, the ELIXIR core data resource in 2021: New developments and updates. Nucleic Acids Research. 49, 498-508 (2021).
  28. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  29. Hyde, J. A., Weening, E. H., Skare, J. T. Genetic transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols in Microbiology. 20, 1-17 (2011).
  30. Ge, Y., Old, I. G., Saint Girons, I., Charon, N. W. Molecular characterization of a large Borrelia burgdorferi motility operon which is initiated by a consensus sigma70 promoter. Journal of Bacteriology. 179 (7), 2289-2299 (1997).
  31. Ozaki, M., Wada, A., Fujita, N., Ishihama, A. Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli. Molecular Genetics and Genomics. 230 (1-2), 17-23 (1991).
  32. Jasinski, D. L., Schwartz, C. T., Haque, F., Guo, P. Large scale purification of RNA nanoparticles by preparative ultracentrifugation. Methods in Molecular Biology. 1297, 67-82 (2015).
  33. Gierl, A., Zillig, W., Stetter, K. O. The role of the components sigma and y of the DNA-dependent RNA polymerase of Lactobacillus curvatus in promotor selection. European Journal of Biochemistry. 125 (1), 41-47 (1982).
  34. Stetter, K. O., Zillig, W. Transcription in lactobacillaceae. DNA-dependent RNA polymerase from Lactobacillus curvatus. European Journal of Biochemistry. 48 (2), 527-540 (1974).
  35. Borbley, G., Schneider, G. Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167, 3 (1988).
  36. Svetlov, V., Artsimovitch, I. Purification of bacterial RNA polymerase: Tools and protocols. Methods in Molecular Biology. 1276, 13-29 (2015).
  37. Shimada, T., Yamazaki, Y., Tanaka, K., Ishihama, A. The whole set of constitutive promoters recognized by RNA polymerase RpoD holoenzyme of Escherichia coli. PLoS One. 9 (3), 90447 (2014).
  38. Daubendiek, S. L., Ryan, K., Kool, E. T. Rolling-circle RNA synthesis: Circular oligonucleotides as efficient substrates for T7 RNA polymerase. Journal of the American Chemical Society. 117 (29), 7818-7819 (1995).
  39. Marras, S. A., Gold, B., Kramer, F. R., Smith, I., Tyagi, S. Real-time measurement of in vitro transcription. Nucleic Acids Research. 32 (9), 72 (2004).
  40. Chamberlin, M. J., Nierman, W. C., Wiggs, J., Neff, N. A quantitative assay for bacterial RNA polymerases. Journal of Biological Chemistry. 254 (20), 10061-10069 (1979).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 185 Боррелия Боррелиелла транскрипция in vitro РНК-полимераза RpoD RpoC
Основные компоненты анализов транскрипции <em>Borreliella</em> (<em>Borrelia</em>) <em>burgdorferi in vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boyle, W. K., Sorensen, H. N.,… More

Boyle, W. K., Sorensen, H. N., Bourret, T. J. Essential Components of Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcription Assays. J. Vis. Exp. (185), e64134, doi:10.3791/64134 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter