Summary
Nous fournissons des méthodes détaillées pour générer quatre types de tissus à partir de cellules souches mésenchymateuses humaines, qui sont utilisées pour récapituler le cartilage, l’os, le coussinet adipeux et la synoviale dans l’articulation du genou humain. Ces quatre tissus sont intégrés dans un bioréacteur personnalisé et connectés par microfluidique, générant ainsi une articulation du genou sur puce.
Abstract
La forte prévalence de maladies articulaires débilitantes comme l’arthrose (OA) pose un fardeau socio-économique élevé. Actuellement, les médicaments disponibles qui ciblent les troubles articulaires sont principalement palliatifs. Le besoin non satisfait de médicaments efficaces modificateurs de la maladie pour l’arthrose (DMOAD) a été principalement causé par l’absence de modèles appropriés pour étudier les mécanismes de la maladie et tester les DMOAD potentiels. Ici, nous décrivons l’établissement d’un système microphysiologique miniature imitant l’articulation synoviale (miniJoint) comprenant des composants de tissus adipeux, fibreux et ostéochondrals dérivés de cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM). Pour obtenir les microtissus tridimensionnels (3D), les CSM ont été encapsulées dans de la gélatine méthacrylée photoréticulable avant ou après la différenciation. Les constructions tissulaires chargées de cellules ont ensuite été intégrées dans un bioréacteur imprimé en 3D, formant le miniJoint. Des flux séparés de milieux ostéogène, fibrogéniques et adipogènes ont été introduits pour maintenir les phénotypes tissulaires respectifs. Un flux commun a été perfusé à travers les tissus cartilagineux, synovial et adipeux pour permettre la diaphonie tissulaire. Ce schéma d’écoulement permet l’induction de perturbations dans un ou plusieurs composants tissulaires pour les études mécanistiques. En outre, les DMOAD potentiels peuvent être testés soit par « administration systémique » à travers tous les flux intermédiaires, soit par « administration intraarticulaire » en ajoutant les médicaments uniquement au flux de simulation de « liquide synovial » partagé. Ainsi, le miniJoint peut servir de plateforme in vitro polyvalente pour étudier efficacement les mécanismes de la maladie et tester des médicaments en médecine personnalisée.
Introduction
Les maladies articulaires comme l’arthrose (OA) sont très répandues et débilitantes et représentent l’une des principales causes d’invalidité dans le monde1. On estime qu’aux États-Unis seulement, l’arthrose touche 27 millions de patients et survient chez 12,1% des adultes âgés de 60 ans et plus2. Malheureusement, la plupart des médicaments actuellement utilisés pour gérer les maladies articulaires sont palliatifs, et aucun médicament modificateur de la maladie (DMOAD) efficace n’est disponible3. Ce besoin médical non satisfait découle principalement de l’absence d’un modèle efficace pour étudier les mécanismes de la maladie et développer des DMOAD potentiels. La culture cellulaire bidimensionnelle conventionnelle (2D) ne reflète pas la nature 3D des tissus articulaires, et la culture d’explants tissulaires est souvent entravée par une mort cellulaire importante et ne parvient généralement pas à reproduire les interconnexions tissulaires dynamiques4. De plus, les différences génétiques et anatomiques réduisent significativement la pertinence physiologique des modèles animaux4.
Les organes sur puce (OoC), ou systèmes microphysiologiques, sont un domaine de recherche prometteur à l’interface de l’ingénierie, de la biologie et de la médecine. Ces plateformes in vitro sont des unités fonctionnelles minimales qui reproduisent des caractéristiques saines ou pathologiques définies de leurs homologues in vivo 5. De plus, ces systèmes miniaturisés peuvent héberger diverses cellules et matrices et simuler les interactions biophysiques et biochimiques entre différents tissus. Par conséquent, un système microphysiologique capable de récapituler fidèlement l’articulation synoviale native promet d’offrir une plate-forme efficace pour la modélisation des maladies articulaires et le développement de DMOAD potentiels.
Les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM) peuvent être isolées de nombreux tissus dans tout le corps et différenciées en lignées ostéogène, chondrogéniques et adipogènes6. Les CSM ont été utilisées avec succès pour concevoir divers tissus, y compris les os, le cartilage et le tissu adipeux6, ce qui signifie qu’ils représentent une source cellulaire prometteuse pour l’ingénierie des composants tissulaires de l’articulation du genou. Nous avons récemment mis au point un système microphysiologique miniature imitant les articulations, appelé miniJoint, qui comprend des tissus osseux, cartilagineux, fibreux et adipeux dérivésdu MSC 7. En particulier, la nouvelle conception permet la diaphonie tissulaire par écoulement microfluidique ou perméation (Figure 1). Nous présentons ici les protocoles pour la fabrication des composants de la puce, l’ingénierie des composants tissulaires, la culture des tissus modifiés dans la puce et la collecte des tissus pour les analyses en aval.
Figure 1 : Schéma de la puce miniJoint montrant la disposition des différents composants tissulaires et des écoulements du milieu. OC = tissu ostéochondral. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le protocole suivant suit les directives éthiques de l’Université de Pittsburgh et du comité d’éthique de la recherche humaine de l’Université de Pittsburgh. L’information sur les matériaux utilisés dans cette étude est présentée dans le tableau des matériaux.
1. Fabrication de bioréacteurs imprimés en 3D
- Utiliser un logiciel informatique pour concevoir des bioréacteurs ostéochondrals (Figure 2A) et miniJoint (Figure 2B) comprenant des chambres, des inserts et des couvercles. Les informations de dimension pour chaque pièce sont présentées à la figure S1.
- Transférez le dessin sur une imprimante 3D et imprimez avec une encre photopolymère.
- Rincer trois fois les pièces imprimées en 3D (figure 2C-F) avec 15 ml d’éthanol à 95 %. Ensuite, réticulez complètement les pièces imprimées pendant 200 s dans un dispositif de polymérisation à la lampe de poche.
- Ajouter des joints toriques aux inserts et aux couvercles (Figure 2C, D) et vérifier si les pièces sont ajustées (Figure 2G, H).
Figure 2 : Fabrication des différents composants pour fabriquer le bioréacteur miniJoint (A,B), modèles 3D de bioréacteurs pour la création (A) de puces ostéochondrales et (B) de puces miniJoint. Couvercles (C, D) imprimés en 3D (C) et inserts (D) avec le joint torique installé. (E,F) chambres imprimées en 3D pour (E) culture ostéochondrale et (F) mini-culture tissulaire articulaire. (G,H) Assemblage de puces (G) ostéochondrales et (H) mini-articulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
2. Ingénierie des composants tissulaires
NOTE: Les procédés de fabrication du phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate de lithium (LAP) et de la gélatine méthacrylée (GelMA) sont décrits dans des études antérieures 8,9.
- Pour créer GelMA, suivez les étapes ci-dessous.
- Ajouter 17 g de gélatine de type B à 500 mL d’eau distillée, puis mélanger sur un agitateur pendant 30 min à 37 °C.
- Ensuite, ajouter 13 mL d’anhydride méthacrylique, remettre sur le shaker à 37 °C et laisser agiter toute la nuit.
- Le lendemain, aliquote le GelMA dans des sacs de dialyse individuels, avec ~60 ml dans chaque sac.
- Placez tous les sacs de dialyse dans de l’eau distillée à l’aide d’une barre d’agitation et prévoyez 7 jours de dialyse. Changez l’eau plusieurs fois par jour et laissez les sacs à 4 °C pendant la nuit.
- Le jour 7, congeler le GelMA à −80 °C. Une fois complètement congelé, procéder à la lyophilisation.
- Placez le GelMA dans un plat dans la chambre à vide d’un lyophilisateur et laissez sécher par lyophilisation. Assurez-vous que le GelMA est complètement séché avant de le retirer du lyophiliseur.
- Dissoudre le GelMA dans la solution saline équilibrée de Hank (HBSS avec Ca 2+ et Mg2+) à 15% (p / v). Pour vous assurer que le pH est à 7,4, ajoutez du NaOH en petites quantités jusqu’à ce que le pH atteigne 7,4. Complétez la solution avec 1x antibiotique-antimycotique et 0,15% (p/v) LAP en fonction du volume acquis. Conservez la solution de GelMA à 15 % à −20 °C jusqu’à utilisation et à l’abri de la lumière.
- Placez les chambres de bioréacteur à double flux, les couvercles et les inserts imprimés en 3D dans des sacs d’autoclave, et autoclavez à 121 °C pendant 20 min avec de la vapeur, puis pendant 20 min avec de la chaleur sèche.
- À l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique, faites tremper les chambres du bioréacteur, les couvercles et les inserts dans 15 ml de solution saline tamponnée au phosphate stérile pendant la nuit, après quoi laissez-les sécher.
- Isoler les CSM dérivées de la moelle osseuse humaine des déchets chirurgicaux totaux d’arthroplastie articulaire avec l’approbation de l’IRB (Université de Pittsburgh et Université de Washington).
- Plus précisément, rincer la moelle osseuse de l’os trabéculaire du col et de la tête du fémur et la remettre en suspension dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM).
- Filtrer la suspension à travers une crépine de 40 μm et centrifuger le débit à 300 x g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant, remettre les granulés en suspension à l’aide d’un milieu de croissance [DMEM, sérum fœtal bovin à 10 % et 1x antibiotique-antimycotique], puis placer dans des flacons de culture tissulaire.
- Changez le milieu de culture tous les 3 jours à 4 jours. Assurez-vous qu’une confluence de 70 % à 80 % est atteinte avant d’aller plus loin.
- Détacher les cellules en incubant avec de la trypsine-EDTA pendant 2-3 min, et passage à un rapport de 1 million de cellules par fiole T150.
- Développez les cellules à P5. Après trypsinisation, suspendre les cellules, les compter, puis granuler par centrifugation à 300x g pendant 5 min.
- À l’aide d’une pipette de 1 000 μL, remettre les cellules en suspension à 20 x 106 cellules/ml dans une solution de GelMA à 15 %.
REMARQUE : Éteignez la lumière de l’enceinte de sécurité biologique. - À l’aide de gants stériles, pressez un moule en silicone stérile et sec contre une boîte de Pétri. Ensuite, placez un insert dans chaque trou du moule en silicone avec une pince, avec le côté trou de l’insert tourné vers le bas.
- À l’aide d’une pipette de 200 μL, ajouter la suspension cellulaire pour remplir l’insert (~50 μL par insert).
- Utilisez une lampe de poche UV (lumière LED avec une longueur d’onde de 395 nm) pour réticuler le haut du gel/insert pendant 1,5 min. Ensuite, illuminez l’autre côté pendant 30 s. La réticulation se produit lorsque le photoinitiateur LAP est exposé à la lumière UV.
REMARQUE: La suspension cellulaire peut être conservée dans l’incubateur pendant cette période ou protégée de la lumière. - À l’aide d’une pince stérile, transférer immédiatement les inserts dans 8 mL de milieu de croissance dans une plaque de culture non tissulaire à 6 puits (DMEM supplémenté avec 10 % [v/v] FBS et 1x antibiotique-antimycotique) pour permettre aux cellules de récupérer pendant la nuit.
- Différencier les cellules en quatre lignées.
- Pour concevoir le tissu adipeux (AT), transférer les inserts dans 8 mL de milieu adipogène (AM; Alpha-MEM, FBS à 10 %, indométacine 0,2 mM, 1 insuline-transférrine-sélénium (ITS), 0,45 mM 3-isobutyl-1-méthylxanthine, 0,1 μM de dexaméthasone et 1 x antibiotique-antimycotique) pour initier la différenciation. Idéalement, quatre inserts sont placés dans un seul puits d’une plaque de puits de culture non tissulaire avec 8 mL de milieu adipogénique. Culture des cellules dans les plaques de puits pendant 28 jours, avec des changements de milieu tous les deux jours.
- Pour concevoir les unités ostéochondrales (OC), placer les inserts dans des chambres de bioréacteur à double flux, boucher les puits et infuser les deux flux séparément à un débit de 5 μL/min avec 35 mL de milieu ostéogénique (OM; DMEM, FBS à 10 %, 1x antibiotique-antimycotique, 0,1 μM de dexaméthasone, 0,01 M β-glycérophosphate, 100 ng/mL de protéine morphogénique osseuse 7 (BMP7), 50 μg/mL d’acide ascorbique et 10 nM de vitamine D3) et 35 mL de milieu chondrogène (CM; DMEM, 1x antibiotique-antimycotique, 1x ITS, 0,1 μM de dexaméthasone, 40 μg/mL de proline, 50 μg/mL d’acide ascorbique et 10 ng/mL de facteur de croissance transformant β3)10. Maintenir la différenciation cellulaire pendant 28 jours en effectuant des changements de milieu toutes les deux semaines.
- Pour dériver les fibroblastes, différencier les CSM en culture 2D sur 21 jours dans un flacon de culture tissulaire T150 cm2 en utilisant 20 mL de milieu fibrogène (FM; DMEM avancé, 5% FBS, 1x GlutaMAX, 1x antibiotique-antimycotique et 50 μg / mL d’acide ascorbique). Changez le support chaque semaine. Utilisez 4 mL de trypsine pour détacher les cellules et encapsulez les gels 3D dans les inserts, en suivant le protocole décrit ci-dessus, pour obtenir du tissu synovial semblable à fibreux (SFT).
NOTE: Les compositions de tous les milieux de différenciation se trouvent dans le tableau 1.
3. Mise en place de la puce miniJoint
- Autoclave les chambres de bioréacteur 3D miniJoint, les tubes en silicone d’un diamètre intérieur de 0,062 pouce et d’un diamètre extérieur de 0,125 pouce, et les connecteurs Luer-lock F 1/16. Connectez le tube en silicone à la barbe du bioréacteur miniJoint à une extrémité et connectez le verrou Luer à l’autre extrémité.
- Préparez le AM, l’OM (en supprimant BMP7) et le FMCM mentionnés à l’étape 2.11. De plus, préparer le milieu commun partagé (SM; DMEM sans phénol rouge, 1x antibiotique-antimycotique, 1x Na-pyruvate, 1x ITS, 40 μg/mL de proline, 50 μg/mL d’acide ascorbique et 0,5 ng/mL de facteur de croissance transformant β3) à utiliser pour la culture miniJoint Charger 35 mL de chaque milieu dans les réservoirs du milieu.
- Utilisez une pince droite pour transférer l’unité ostéochondrale du bioréacteur à double flux vers le puits droit du bioréacteur mini-joint. Transférer l’insert de tissu adipeux et l’insert de tissu fibreux dans les puits gauche et moyen, respectivement. Boucher tous les puits avec des couvercles stérilisés.
- Connectez les entrées de la puce miniJoint aux réservoirs du milieu et les sorties aux seringues (Figure 3A-C).
- Montez les seringues sur une pompe à seringue (Figure 3C) et transférez la pompe et les copeaux dans un incubateur. Les réservoirs moyens sont maintenus sur de la glace à l’extérieur de l’incubateur.
- Faites fonctionner la pompe en mode retrait, en aspirant le fluide du réservoir moyen dans la chambre du bioréacteur mini-joint. Ce processus de culture miniJoint dure 28 jours.
- Pour modéliser l’inflammation articulaire et la dégénérescence du cartilage, ajouter de l’interleukine 1β (IL-1β) au flux de milieu fibrogène à 10 ng / mL. Remplacez les seringues le troisième jour du traitement par IL-1β et apportez de l’IL-1β fraîche au milieu fibrogénique. Le traitement dure 7 jours.
- Au cours de l’étape de test médicamenteux, après 3 jours de traitement par IL-1β, administrer le médicament soit dans le milieu partagé, simulant une « administration intra-articulaire » (Figure 3D) lorsque le médicament est utilisé localement dans l’articulation du genou, soit dans tous les types de milieux, simulant une « administration systémique » (Figure 3E) lorsque le médicament agit sur l’articulation du genou à travers la circulation.
- Prélever des tissus individuels pour analyse après 7 jours de traitement IL-1β, que les échantillons aient ou non subi un traitement médicamenteux au cours des 4 jours précédents.
Figure 3 : Assemblage de la miniJoint (A,B) Les milieux spécifiques aux tissus sont introduits à partir des entrées 1 à 3 (I1-3) et sortis des prises 1 à 3 (O1-3). Le milieu partagé est perfusé de I4 à O4. (C) La mise en place complète de la culture mini-joint. Les médicaments (formes de soleil vert) peuvent être introduits dans (D) le milieu partagé uniquement ou (E) tous les milieux pour simuler respectivement « l’administration intra-articulaire » ou « l’administration systémique ». Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
4. Prélèvement individuel de tissus
- Utilisez des pinces incurvées stériles pour retirer les inserts.
- Poussez un poinçon de biopsie à travers le centre de l’insert pour retirer le gel, et placez le gel dans PBS.
- Couper les gels ostéochondrals en deux lors de l’évaluation de l’expression des gènes.
REMARQUE: Puisque le gel ostéochondral se compose de deux types de tissus, il est important de séparer les cellules ostéogéniques et chondrogènes. - Recueillir les milieux et les tissus conditionnés pour diverses expériences.
- Prélever environ 1,5 mL de chaque source moyenne.
- Congeler le milieu conditionné dans de l’azote liquide après avoir centrifugé à 14 000 x g pendant 10 min et éliminé les sédiments.
- Pour la coloration histologique et l’immunomarquage, fixez d’abord les échantillons OC et SFT dans du formol tamponné à 10%, déshydratez-les dans de l’éthanol de concentrations croissantes, éliminez-les dans du xylène, incorporez-les dans de la paraffine et enfin sectionnez-les sur une épaisseur de 6 μm.
- Pour les microtissus AT, fixez les échantillons dans du formol tamponné à 10% et colorez-les directement avec une solution Oil Red O ou BODIPY.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tous les tissus de la miniJoint ont été prélevés pour analyser leurs phénotypes après 28 jours de culture dans la miniJoint (Figure 4A). Cela a été détaillé dans notre publication précédente7.
Grâce à l’utilisation de la RT-qPCR, de l’immunomarquage et de la coloration histologique, il a été confirmé que les phénotypes spécifiques aux tissus étaient bien maintenus pour les microtissus individuels (Figure 4). Par exemple, la composante osseuse des microtissus OC (OC-O), mais pas les autres composantes tissulaires, exprimait des niveaux élevés d’ostéocalcine (OCN). En revanche, dans la partie cartilagineuse des tissus ostéochondrals (OC-C), le collagène de type II (COL2) et l’aggrecan (ACAN) étaient exprimés à des niveaux significativement plus élevés que dans les autres tissus (Figure 4B). Les niveaux d’expression de l’adiponectine (ADIPOQ) et de la leptine (LEP), deux gènes adipogènes représentatifs, étaient beaucoup plus élevés dans l’AT que dans les autres tissus. Le dépôt de minéraux de calcium (figure 4F,G) ainsi que de phosphatase alcaline (PA) et de protéines OCN (figure 4D) a été principalement observé dans l’OC-O, et l’OC-C a montré des glycosaminoglycanes (GAG) bien retenus (Figure 4C) et COL2 (Figure 4D). De plus, l’expression de deux marqueurs associés à l’hypertrophie des chondrocytes, le collagène de type X (COL10) et le hérisson indien (IHH), qui ont été détectés dans l’OC-C au jour 28, s’est avérée significativement régulée à la baisse après 28 jours de culture dans le miniJoint (Figure 4E).
Les résultats de la RT-qPCR, de l’immunomarquage et de l’histologie ont confirmé que les phénotypes de l’AT et de la SFT ont été maintenus avec succès après 4 semaines de miniJoint culture (Figure 4B,H,I). En utilisant la coloration BODIPY et la coloration Oil Red O, nous avons observé un dépôt abondant de gouttelettes lipidiques dans l’AT (Figure 4H). Les images de coloration par immunofluorescence de la figure 4I montrent une expression robuste de la lubricine et de la cadhérine 11 (CDH11) par le SFT après 4 semaines de mini-culture articulaire.
En combinaison, ces résultats indiquent la création d’un modèle fonctionnel d’articulation synoviale multi-tissulaire dans le système mini-articulaire.
Figure 4 : Maintien des phénotypes tissulaires individuels des microtissus après 4 semaines de co-culture dans la puce miniJoint. (A) Calendrier de génération d’une puce miniJoint normale avec les phénotypes spécifiques aux tissus maintenus. (B) Résultats RT-qPCR montrant des gènes marqueurs clés dans tous les composants tissulaires. Les données OCN ont été normalisées aux valeurs des OC-O, des données COL2 et ACAN aux valeurs de l’OC-C, les données ADIPOQ et LEP aux valeurs de l’AT, et les données TNC et COL1 aux valeurs de l’OC-O. Les données ont été analysées par ANOVA unidirectionnelle (N = 3 réplications biologiques). * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; p < 0,0001. (C) Coloration à la safranine O de l’unité OC biphasique. Barre d’échelle = 1 mm. (D) Images de coloration histologique et d’immunomarquage confirmant la présence de marqueurs spécifiques aux os et au cartilage dans les composants correspondants de l’unité OC. Barre d’échelle = 50 μm. (E) Immunomarquage montrant une expression beaucoup plus faible de deux marqueurs d’hypertrophie, COLX et IHH, dans l’OC-C au jour 56 qu’au jour 28. Barre d’échelle = 50 μm. (F) Coloration au rouge alizarine de l’unité OC montrant la présence de dépôts de calcium principalement dans l’OC-O. Barre d’échelle = 500 μm. (G) Vues agrandies de l’image de coloration rouge Alizarin en (F). Barre d’échelle = 200 μm. (H) Images de coloration Oil Red O et BODIPY montrant la rétention de gouttelettes lipidiques dans l’AT. Barre d’échelle = 50 μm. (I) Images d’immunomarquage montrant l’expression de la lubricine et de CDH11 par le tissu fibreux de type synovial (SFT). Barre d’échelle = 50 μm. Reproduit avec la permission de Li et al.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Pour créer un modèle de maladie, l’interleukine 1β (IL-1β) a été introduite dans le flux FM après 28 jours de co-culture (Figure 5A,B). Le traitement par IL-1β a entraîné une apoptose cellulaire et des taux élevés de MMP-13 dans la SFT (Figure 5C). Fait intéressant, nous avons observé une dégradation du cartilage dans la miniJoint traitée par IL-1β (Figure 5D), suggérant l’apparition d’une diaphonie entre l’OC-C et le SFT.
Figure 5: Modélisation de l’inflammation et de la dégénérescence articulaires dans la miniArticulation . (A) Schéma montrant l’induction de la « synovite » en défiant le SFT avec IL-1β. (B) Calendrier d’établissement et d’analyse du modèle de maladie. (C) dosage TUNEL et immunomarquage MMP-13 montrant les changements pathologiques dans le SFT. La fragmentation de l’ADN est indiquée par les pointes de flèches rouges. Barre d’échelle = 50 μm. (D) Images de coloration de safranine O et d’immunomarquage MMP-13 montrant la dégénérescence de l’OC-C. Barre d’échelle = 50 μm. Reproduit avec la permission de Li et al.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Enfin, nous avons testé l’efficacité thérapeutique du naproxène (NPX) par « administration systémique » (Figure 6A), dont il a été démontré qu’il réduisait la dégradation du cartilage dans la miniJoint traitée par IL-1β (Figure 6B). Nous avons également examiné quatre autres DMOAD potentiels par « administration intra-articulaire » (figure 6A). Les résultats de la PCR en temps réel ont indiqué que ces quatre composés étaient capables d’inverser partiellement la perte de cartilage (Figure 6C).
Figure 6 : Tests de médicaments par voies « systémique » et « intra-articulaire » dans le modèle de maladie établi. (A) Schéma montrant les deux différentes voies d’administration du médicament, y compris « l’administration systémique » de naproxène (NPX) et « l’administration intraarticulaire » du facteur de croissance des fibroblastes 18 (FGF18), du SM04690, de la sclérostine (SOST) et de l’antagoniste des récepteurs de l’IL-1 (IL-1RN). (B) Images de coloration de la safranine O et du MMP-13 montrant une dégénérescence OC-C atténuée après traitement NPX. Barre d’échelle = 50 μm. (C) Expression génique dans l’OC-C après « administration intra-articulaire » de quatre médicaments différents. Les différences statistiques entre chaque groupe traité par médicament et le groupe témoin sont indiquées par * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001; et **** p < 0,0001. Les données ont été analysées par le test t de Student (N = 4 réplications biologiques). Reproduit avec la permission de Li et al.7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans cet article, nous présentons un protocole pour créer un système d’articulation du genou sur puce, dans lequel l’os, le cartilage, le tissu adipeux et les tissus de type synoviale sont formés à partir de CSM et co-cultivés dans un bioréacteur personnalisé. Ce système multi-composants, dérivé de cellules humaines avec des fonctionnalités plug-and-play, représente un nouvel outil pour étudier la pathogenèse des maladies articulaires et développer des médicaments.
Étant donné que différents tissus favorisent des milieux de culture spécifiques, il est essentiel de fournir le milieu respectif pour chaque tissu et d’empêcher les échanges libres entre les flux. En particulier, lors de la génération de tissus ostéochondrals biphasiques, le sort des CSM naïves est déterminé par le milieu auquel ils sont exposés. Dans la conception actuelle, nous utilisons un hydrogel à base de gélatine comme échafaudage, qui fournit un modèle pour la croissance cellulaire et scelle l’espace potentiel entre les tissus et les parois des inserts. Par conséquent, il est essentiel de photoréticuler in situ le gel dans les inserts. De plus, des facteurs de croissance tels que BMP7 et TGFβ3 sont complétés respectivement dans le milieu ostéogénique et le milieu chondrogénique. Pour maintenir leurs bioactivités pendant plusieurs jours, les milieux frais doivent être conservés à l’extérieur de l’incubateur avant d’être introduits dans la culture de puces. Par conséquent, nous devons utiliser des seringues pour retirer le média des réservoirs au lieu de le perfuser dans l’incubateur.
Un autre point critique lors de la manipulation du bioréacteur est d’éviter toute pression inutile. Les tissus dépendent de la liaison physique à la paroi d’insertion pour rester en position. Comme ils sont exposés aux écoulements de milieu supérieur et inférieur, si une phase de l’écoulement a une pression plus élevée, elle peut pousser les tissus hors des inserts, entraînant ainsi une fuite. Par conséquent, pendant les processus de manipulation, par exemple lors de l’élimination des bulles, une légère poussée de la seringue est essentielle. Si l’échafaudage d’hydrogel est poussé, il peut être remis en place, de l’hydrogel non durci supplémentaire peut être appliqué pour combler l’espace et il peut être durci, permettant un ajustement sûr et ferme de l’échafaudage dans l’insert.
Compte tenu de sa biocompatibilité prouvée, des échafaudages à base de gélatine sont utilisés pour créer les quatre tissus du système actuel. Il convient de noter que la gélatine peut ne pas représenter le meilleur matériau pour soutenir la formation de tissus. Par conséquent, si nécessaire, d’autres types d’échafaudages peuvent être adaptés à l’utilisation. Par exemple, on peut utiliser un échafaudage poreux et rigide et le combiner avec de la gélatine pour améliorer encore l’ostéogenèse MSC11. Dans ce cas, il faut s’assurer qu’il n’y a pas de changement de milieu libre entre les flux supérieur et inférieur. Comme discuté ci-dessus, on peut utiliser des hydrogels biocompatibles pour sceller les points de fuite potentiels. De plus, les CSM sont utilisés dans la puce tissulaire actuelle. Compte tenu de leur potentiel de différenciation démontré dans les tissus musculo-squelettiques, les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) peuvent également être utilisées à l’avenir pour remplacer les CSM. Comme première étape vers cette étude, nous avons récemment utilisé des CSPi pour créer des tissus ostéochondrals12.
L’inflammation du synovium, ou synovite, est une caractéristique clé de l’arthrose et de nombreuses autres maladies articulaires. De plus, Atukorala et coll. ont constaté que la synovite est un prédicteur important de l’arthrose radiographiqueultérieure 13. Par conséquent, nous avons induit une inflammation SFT par traitement IL-1β pour générer des caractéristiques de type arthrose dans la miniArticulation. Cependant, nous sommes conscients que cette méthode d’induction de la maladie ne peut pas capturer toutes les facettes de l’arthrose. Ainsi, dans nos recherches futures, nous explorerons des approches alternatives à la modélisation de l’arthrose dans la miniJoint en utilisant, par exemple, une charge hyperphysiologique pour induire une lésion mécanique du composant cartilagineux14. Pour appliquer une charge mécanique, l’adaptation de la conception miniJoint sera nécessaire. Par exemple, le fond de la puce miniJoint peut potentiellement être modifié pour rendre le tissu cartilagineux accessible à l’extrémité de l’impacteur d’un dispositif d’impact à ressort personnalisé développé dans notre laboratoire15.
À notre connaissance, l’articulation du genou sur puce décrite ici est le premier modèle in vitro qui comprend plusieurs tissus dans un système pour simuler une articulation synoviale. La nouvelle capacité plug-and-play permet d’étudier le rôle d’un seul tissu dans la progression de la maladie et sa réponse à divers traitements. Ce système peut également être utilisé pour modéliser des maladies articulaires autres que l’arthrose. Par exemple, des bactéries et d’autres agents pathogènes peuvent éventuellement être introduits dans le SM pour modéliser l’arthrite septique16. De plus, la conception permet une diaphonie en temps réel entre les tissus, surmontant ainsi la limitation de l’utilisation du milieu conditionné. Plus précisément, les tissus adipeux, synoviaux et cartilagineux peuvent communiquer par le milieu partagé, et les os et le cartilage peuvent interagir par liaison physique directe. Cependant, il existe certaines limitations au miniJoint actuel. Tout d’abord, des tissus dérivés de cellules souches sont utilisés, et la question de savoir si leur phénotype et leur fonction ressemblent à leurs homologues dans l’articulation native du genou doit faire l’objet d’une enquête plus approfondie. Deuxièmement, les cellules immunitaires telles que les macrophages, qui jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse de l’arthrose, ne sont pas incluses. Notre étude précédente a démontré la faisabilité de l’inclusion de macrophages dans les échafaudages de gélatine17. Enfin, un mécanisme de contrainte physique n’est pas inclus pour simuler la charge mécanique sur les tissus de l’articulation native du genou. Récemment, Occhetta et al. ont développé un modèle de cartilage sur puce, dans lequel une compression contrôlée par déformation a été appliquée pour stimuler le tissu cartilagineux modifié14. Une méthode similaire peut être adoptée pour permettre le chargement mécanique dans le miniJoint.
En résumé, le miniJoint peut servir de plate-forme unique pour étudier la pathogenèse de l’arthrose et des affections connexes in vitro et fournir un mécanisme pour explorer les DMOAD potentiels et les interventions pour la médecine personnalisée. Le système miniJoint peut également être intégré à des OoC imitant d’autres organes pour établir des systèmes de corps sur puce qui peuvent être utilisés pour étudier les interactions entre divers imitations d’organes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Cette recherche a été principalement financée par les National Institutes of Health (UG3/UH3TR002136, UG3/UH3TR003090). De plus, nous remercions le Dr Paul Manner (Université de Washington) d’avoir fourni les échantillons de tissus humains et le Dr Jian Tan de son aide dans l’isolement des CSM et la création du pool cellulaire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma -Aldrich | I17018-1G | |
| 6 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351146 | |
| 24 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351147 | |
| 30 mL syringes | BD Syringe Luer Lock Cascade Health | 302832 | |
| Alcian blue stain | EK Industries | 1198 | 1% w/v, pH 1.0 |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491-015 | |
| αMEM | Gibco | 12571-063 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Biopsy punch | Integra Miltex | 12-460-407 | |
| BODIPY® fluorophore | Molecular Probes | ||
| Bone morphogenic protein 7 (BMP7) | Peprotech | ||
| Curved forceps | Fisher Brand | 16100110 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium |
| Dexmethasome | Sigma -Aldrich | 02-05-2002 | |
| E-Shell 450 photopolymer in | EnvisionTec | RES-01-4022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini-Bio Products | 900-208 | |
| GlutaMAX | Gibco | 3505-061 | |
| gelatin from bovine skin | Hyclone | 1003372809 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma -Aldrich | SH30588.02 | |
| indomethacin | Sigma -Aldrich | I7378-56 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS) | Gibco | 51500-056 | |
| interleukin 1β | Peprotech | 200-01B | |
| Leur-loc connectors | Cole-Parmer Instruments | 45508-50 | |
| L-proline | Sigma -Aldrich | 115388-93-7 | |
| β-glycerophosphate | Sigma -Aldrich | 1003129352 | |
| Medium bags | KiYATEC | FC045 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma -Aldrich | 102378580 | |
| Phosphate buffered Saline | Corning | 21-040-CM | |
| Pointed forceps | Fisher Brand | 12000122 | |
| Silicon mold | McMaster-Carr | RC00114P | |
| Silicon o-rings | McMaster-Carr | ZMCCs1X5 | 1mm x 5mm |
| SolidWorks | Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France | ||
| Surgical Blades | Integra Miltex | 4-122 | |
| Syringe pump | Lagato210P, KD Scientific | Z569631 | 10 syringe racks |
| T-182 tissue culture flasks | Fisher Brand | FB012939 | |
| Tissue Culture Dish 150 mm | Fisher Brand | FB012925 | |
| Transforming Growth Factor Beta (TGF-β3) | Peprotech | 100-36E | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| UV Flashlight | KBS | KB70109 | 395 nm |
| Vida Desktop 3D Printer | EnvisionTec | ||
| Vitamin D3 | Sigma -Aldrich | 32222-06-3 | 1,25-dihydroxyvitamin D3 |
References
- Safiri, S., et al. Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017. Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).
- Lawrence, R. C., et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II. Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).
- Makarczyk, M. J., et al. Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs. Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).
- He, Y., et al. Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models. Biology. 9 (8), 194 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
- Li, Z., et al. Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing. Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).
- Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1β. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).
- Yin, B., et al. Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).
- Lin, Z., et al. Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).
- Atukorala, I., et al. Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).
- Occhetta, P., et al. Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).
- He, C., et al. Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models. Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).
- Elsissy, J. G., et al. Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review. JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).
- Romero-Lopez, M., et al. Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model. Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).
