Summary
نحن نقدم طرقا مفصلة لتوليد أربعة أنواع من الأنسجة من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية ، والتي تستخدم لتلخيص الغضروف والعظام ووسادة الدهون والغشاء الزليلي في مفصل الركبة البشري. يتم دمج هذه الأنسجة الأربعة في مفاعل حيوي مخصص وتوصيلها من خلال الموائع الدقيقة ، وبالتالي توليد مفصل الركبة على رقاقة.
Abstract
يشكل ارتفاع معدل انتشار أمراض المفاصل المنهكة مثل هشاشة العظام (OA) عبئا اجتماعيا واقتصاديا كبيرا. حاليا ، الأدوية المتاحة التي تستهدف اضطرابات المفاصل هي في الغالب ملطفة. إن الحاجة غير الملباة إلى أدوية OA الفعالة المعدلة للمرض (DMOADs) ناتجة في المقام الأول عن عدم وجود نماذج مناسبة لدراسة آليات المرض واختبار DMOADs المحتملة. هنا ، نصف إنشاء نظام فسيولوجي دقيق يحاكي المفصل الزليلي المصغر (miniJoint) يتألف من مكونات الأنسجة الدهنية والليفية والعظمية الغضروفية المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (MSCs). للحصول على الأنسجة الدقيقة ثلاثية الأبعاد (3D) ، تم تغليف MSCs في الجيلاتين الميثكريليت القابل للربط الضوئي قبل أو بعد التمايز. ثم تم دمج تركيبات الأنسجة المحملة بالخلايا في مفاعل حيوي مطبوع 3D ، لتشكيل miniJoint. تم إدخال تدفقات منفصلة من الوسائط العظمية والليفية المنشأ والشحمية للحفاظ على الأنماط الظاهرية للأنسجة المعنية. تم اختراق تيار مشترك بشكل شائع من خلال الغضروف والأنسجة الزليلية والدهنية لتمكين تداخل الأنسجة. يسمح نمط التدفق هذا بتحريض الاضطرابات في واحد أو أكثر من مكونات الأنسجة للدراسات الآلية. علاوة على ذلك ، يمكن اختبار DMOADs المحتملة إما عن طريق "الإدارة الجهازية" من خلال جميع التيارات المتوسطة أو "الإدارة داخل المفصل" عن طريق إضافة الأدوية إلى تدفق محاكاة "السائل الزليلي" المشترك فقط. وبالتالي ، يمكن أن يكون miniJoint بمثابة منصة متعددة الاستخدامات في المختبر لدراسة آليات المرض بكفاءة واختبار الأدوية في الطب الشخصي.
Introduction
أمراض المفاصل مثل هشاشة العظام (OA) منتشرة للغاية وموهنة وتمثل سببا رئيسيا للإعاقة في جميع أنحاء العالم1. تشير التقديرات إلى أنه في الولايات المتحدة وحدها ، يؤثر OA على 27 مليون مريض ويحدث في 12.1٪ من البالغين الذين تتراوح أعمارهم بين 60 وما فوق2. لسوء الحظ ، فإن معظم الأدوية المستخدمة حاليا لإدارة أمراض المفاصل ملطفة ، ولا تتوفر أدوية OA فعالة لتعديل المرض (DMOADs)3. تنبع هذه الحاجة الطبية غير الملباة في المقام الأول من عدم وجود نموذج فعال لدراسة آليات المرض وتطوير DMOADs المحتملة. لا تعكس زراعة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) الطبيعة ثلاثية الأبعاد لأنسجة المفاصل ، وغالبا ما يتم إعاقة زراعة الأنسجة من خلال موت الخلايا الكبير وعادة ما تفشل في تكرار الترابط الديناميكي للأنسجة4. بالإضافة إلى ذلك ، تقلل الاختلافات الجينية والتشريحية بشكل كبير من الأهمية الفسيولوجية للنماذج الحيوانية4.
تعد الأجهزة على الرقائق (OoCs) ، أو الأنظمة الفيزيولوجية الدقيقة ، مجالا بحثيا واعدا في واجهة الهندسة والبيولوجيا والطب. هذه المنصات في المختبر هي الحد الأدنى من الوحدات الوظيفية التي تكرر السمات الصحية أو المرضية المحددة لنظيراتها في الجسم الحي 5. علاوة على ذلك ، يمكن لهذه الأنظمة المصغرة استضافة خلايا ومصفوفات متنوعة ومحاكاة التفاعلات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية بين الأنسجة المختلفة. لذلك ، فإن النظام الفسيولوجي الدقيق الذي يمكنه تلخيص المفصل الزليلي الأصلي بأمانة يعد بتقديم منصة فعالة لنمذجة أمراض المفاصل وتطوير DMOADs المحتملة.
يمكن عزل الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية (MSCs) من العديد من الأنسجة في جميع أنحاء الجسم وتمييزها إلى سلالات عظمية المنشأ ، غضروفية ، وأديبوجينية6. تم استخدام MSCs بنجاح لهندسة الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك العظام والغضاريف والأنسجة الدهنية6 ، مما يعني أنها تمثل مصدرا واعدا للخلايا لهندسة مكونات الأنسجة في مفصل الركبة. لقد طورنا مؤخرا نظاما مصغرا يحاكي المفاصل ، يسمى miniJoint ، والذي يشتمل على أنسجة العظام والغضاريف والأنسجة الليفية والدهنية المشتقة من MSC7. على وجه الخصوص ، يتيح التصميم الجديد الحديث المتبادل للأنسجة عن طريق تدفق الموائع الدقيقة أو التغلغل (الشكل 1). هنا ، نقدم بروتوكولات تصنيع مكونات الرقاقة ، وهندسة مكونات الأنسجة ، وزراعة الأنسجة المهندسة في الرقاقة ، وجمع الأنسجة للتحليلات النهائية.
الشكل 1: رسم تخطيطي لشريحة miniJoint يوضح ترتيب مكونات الأنسجة المختلفة والتدفقات المتوسطة. OC = الأنسجة العظمية الغضروفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتبع البروتوكول التالي المبادئ التوجيهية الأخلاقية لجامعة بيتسبرغ ولجنة أخلاقيات البحوث البشرية بجامعة بيتسبرغ. يتم سرد المعلومات حول المواد المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.
1. تصنيع المفاعلات الحيوية المطبوعة 3D
- استخدم برنامج كمبيوتر لتصميم المفاعلات الحيوية العظمية الغضروفية (الشكل 2 أ) والمفاعلات الحيوية الصغيرة (الشكل 2 ب) التي تتضمن حجرات وإدخالات وأغطية. يتم عرض معلومات الأبعاد لكل جزء في الشكل S1.
- انقل التصميم إلى طابعة 3D ، واطبع باستخدام حبر فوتوبوليمر.
- شطف الأجزاء المطبوعة 3D (الشكل 2C-F) مع 15 مل من الإيثانول 95 ٪ ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بربط القطع المطبوعة بالكامل لمدة 200 ثانية في جهاز بلمرة مصباح يدوي.
- أضف حلقات O إلى الإدخالات والأغطية (الشكل 2C ، D) ، واختبر ما إذا كانت الأجزاء مناسبة (الشكل 2G ، H).
الشكل 2: تصنيع المكونات المختلفة لصنع المفاعل الحيوي miniJoint (A ، B) ، نماذج 3D للمفاعلات الحيوية لإنشاء (A) هشاشة العظام و (B) رقائق miniJoint . (C ، D) 3D مطبوعة (C) الأغطية و (D) إدراج مع تثبيت الحلقة O. (E ، F) غرف مطبوعة 3D ل (E) العظم الغضروفي و (F) زراعة الأنسجة المصغرة. (ز ، ح) تجميع (G) رقائق العظم الغضروفي و (H) miniJoint . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. هندسة مكونات الأنسجة
ملاحظة: تم وصف عمليات تصنيع الليثيوم فينيل -2،4،6-ثلاثي ميثيل بنزويل فوسفينات (LAP) والجيلاتين الميثيل (GelMA) في الدراسات السابقة8،9.
- لإنشاء GelMA، اتبع الخطوات أدناه.
- أضف 17 جم من الجيلاتين من النوع B إلى 500 مل من الماء المقطر ، ثم اخلطه على شاكر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- ثم أضف 13 مل من أنهيدريد الميثاكريليك ، وضعه مرة أخرى على شاكر 37 درجة مئوية ، واتركه يهتز طوال الليل.
- في اليوم التالي ، قم بقسمة GelMA في أكياس غسيل الكلى الفردية ، مع ~ 60 مل في كل كيس.
- ضع جميع أكياس غسيل الكلى في الماء المقطر بقضيب تقليب ، واتركها لمدة 7 أيام من غسيل الكلى. قم بتغيير الماء عدة مرات في اليوم ، واترك الأكياس عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
- في اليوم 7 ، قم بتجميد GelMA عند -80 درجة مئوية. بمجرد تجميدها تماما ، انتقل إلى التجفيد.
- ضع GelMA في طبق في غرفة التفريغ في مجفف التجميد ، واتركه يجف بالتجميد. تأكد من تجفيف GelMA تماما قبل إزالته من مجفف التجميد.
- قم بإذابة GelMA في محلول ملح هانك المتوازن (HBSS مع Ca 2+ و Mg2+) عند 15٪ (وزن / حجم). للتأكد من أن الرقم الهيدروجيني عند 7.4 ، أضف هيدروكسيد الصوديوم بكميات صغيرة حتى يصل الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. استكمل المحلول ب 1x مضاد حيوي مضاد حيوي و 0.15٪ (وزن / حجم) LAP بناء على الحجم المكتسب. قم بتخزين محلول GelMA بنسبة 15٪ في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام ، وقم بحمايته من الضوء.
- ضع غرف المفاعل الحيوي ثنائي التدفق المطبوعة 3D ، والأغطية ، وإدراج في أكياس الأوتوكلاف ، والأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع البخار ثم لمدة 20 دقيقة مع الحرارة الجافة.
- داخل خزانة السلامة البيولوجية ، انقع غرف المفاعل الحيوي والأغطية والإدخالات في 15 مل من المحلول الملحي المعقم المخزن بالفوسفات طوال الليل ، وبعد ذلك اتركها حتى تجف.
- عزل MSCs المشتقة من نخاع العظم البشري من إجمالي النفايات الجراحية لرأب المفاصل بموافقة IRB (جامعة بيتسبرغ وجامعة واشنطن).
- على وجه التحديد ، اطرد نخاع العظم من العظم التربيقي لعنق الفخذ ورأسه ، وأعد تعليقه في وسط النسر المعدل في Dulbecco (DMEM).
- قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة 40 ميكرومتر ، وطرد مركزي التدفق عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الكريات باستخدام وسط النمو [DMEM ، مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) ، و 1x مضاد حيوي مضاد للفطريات] ، ثم ضعه في قوارير زراعة الأنسجة.
- قم بتغيير وسط الثقافة كل 3 أيام إلى 4 أيام. تأكد من الوصول إلى التقاء 70٪ إلى 80٪ قبل المضي قدما.
- فصل الخلايا عن طريق الحضانة مع التربسين-EDTA لمدة 2-3 دقائق ، والمرور بمعدل 1 مليون خلية لكل قارورة T150.
- قم بتوسيع الخلايا إلى P5. بعد التربسين ، قم بتعليق الخلايا ، وعدها ، ثم الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 300× جم لمدة 5 دقائق.
- باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ، أعد تعليق الخلايا عند 20 × 106 خلايا / مل في محلول GelMA بنسبة 15٪.
ملاحظة: أطفئ ضوء خزانة السلامة البيولوجية. - باستخدام قفازات معقمة ، اضغط على قالب سيليكون معقم وجاف على طبق بتري. بعد ذلك ، ضع ملحقا واحدا في كل فتحة من قالب السيليكون بالملقط ، بحيث يكون جانب فتحة الملحق متجها لأسفل.
- باستخدام ماصة 200 ميكرولتر ، أضف تعليق الخلية لملء الملحق (~ 50 ميكرولتر لكل إدخال).
- استخدم مصباح يدوي للأشعة فوق البنفسجية (ضوء LED بطول موجي 395 نانومتر) لربط الجزء العلوي من الجل / الإدراج لمدة 1.5 دقيقة. ثم أضيء الجانب الآخر لمدة 30 ثانية. يحدث التشابك عندما يتعرض البادئ الضوئي LAP لضوء الأشعة فوق البنفسجية.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بتعليق الخلية في الحاضنة خلال هذه الفترة أو حمايته من الضوء. - باستخدام ملقط معقم ، انقل الحشوات على الفور إلى 8 مل من وسط النمو في لوحة غير أنسجية ذات 6 آبار (DMEM مكمل ب 10٪ [v / v] FBS و 1x مضاد حيوي مضاد للفطريات) للسماح للخلايا بالتعافي بين عشية وضحاها.
- فرق الخلايا نحو أربع سلالات.
- لهندسة الأنسجة الدهنية (AT) ، انقل الحشوات إلى 8 مل من الوسط الدهني (AM ؛ ألفا-ميم، 10٪ FBS، 0.2 مللي متر إندوميتاسين، 1x أنسولين-ترانسفيرين-سيلينيوم (ITS)، 0.45 مللي متر 3-إيزوبوتيل-1-ميثيل زانثين، 0.1 ميكرومتر ديكساميثازون، و 1x مضاد حيوي مضاد للفطريات) لبدء التمايز. من الناحية المثالية ، يتم وضع أربعة إدخالات في بئر واحد من صفيحة بئر غير الأنسجة مع 8 مل من الوسط الشحمي. استزرع الخلايا في ألواح البئر لمدة 28 يوما ، مع تغييرات متوسطة كل يوم.
- لهندسة الوحدات العظمية الغضروفية (OC) ، ضع الإدخالات في غرف مفاعل حيوي مزدوج التدفق ، وقم بتغطية الآبار ، وغرس التيارين بشكل منفصل بمعدل تدفق 5 ميكرولتر / دقيقة مع 35 مل من الوسط العظمي (OM; DMEM, 10٪ FBS, 1x مضاد حيوي مضاد للفطريات, 0.1 ميكرومتر ديكساميثازون, 0.01 M β-glycerophosphate, 100 نانوغرام/مل بروتين مورفوجينيك عظمي 7 (BMP7), 50 ميكروغرام/مل حمض الأسكوربيك, و10 نانومتر فيتامين D3) و35 مل من وسط غضروفي (CM; DMEM ، 1x مضاد حيوي مضاد حيوي ، 1x ITS ، 0.1 ميكرومتر ديكساميثازون ، 40 ميكروغرام / مل برولين ، 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك ، و 10 نانوغرام / مل تحويل عامل النمو β3) 10. الحفاظ على تمايز الخلايا لمدة 28 يوما عن طريق إجراء تغييرات متوسطة كل أسبوعين.
- لاشتقاق الخلايا الليفية ، قم بتمييز MSCs في ثقافة ثنائية الأبعاد على مدار 21 يوما في دورق زراعة الأنسجة T150 سم2 باستخدام 20 مل من الوسط الليفي (FM ؛ DMEM المتقدم ، 5٪ FBS ، 1x GlutaMAX ، 1x مضاد حيوي مضاد حيوي ، و 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك). تغيير الوسيط كل أسبوع. استخدم 4 مل من التربسين لفصل الخلايا ، وتغليف المواد الهلامية ثلاثية الأبعاد داخل الإدخالات ، باتباع البروتوكول الموضح أعلاه ، للحصول على الأنسجة الليفية الزليلية (SFT).
ملاحظة: يمكن العثور على تركيبات جميع وسائط التمايز في الجدول 1.
3. إنشاء شريحة miniJoint
- الأوتوكلاف غرف المفاعل الحيوي 3D miniJoint ، أنابيب السيليكون بقطر داخلي 0.062 بوصة وقطر خارجي 0.125 بوصة ، وموصلات F 1/16 Luer-lock. قم بتوصيل أنبوب السيليكون بشوكة المفاعل الحيوي miniJoint في أحد طرفيه ، وقم بتوصيل قفل Luer في الطرف الآخر.
- قم بإعداد AM و OM (إزالة BMP7) وFMCM المذكورة في الخطوة 2.11. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد الوسط المشترك المشترك (SM ؛ DMEM الخالي من الفينول الأحمر ، 1x مضاد حيوي مضاد حيوي ، 1x Na-pyruvate ، 1x ITS ، 40 ميكروغرام / مل برولين ، 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك ، و 0.5 نانوغرام / مل عامل النمو المحول β3) لاستخدامها في ثقافة miniJoint . قم بتحميل 35 مل من كل وسط في الخزانات المتوسطة.
- استخدم ملقط مستقيم لنقل الوحدة العظمية الغضروفية من المفاعل الحيوي ثنائي التدفق إلى البئر الأيمن للمفاعل الحيوي miniJoint . نقل إدراج الأنسجة الدهنية وإدخال الأنسجة الليفية في الآبار اليسرى والوسطى ، على التوالي. قم بتغطية جميع الآبار بأغطية معقمة.
- قم بتوصيل مداخل رقاقة miniJoint بالخزانات المتوسطة والمنافذ بالمحاقن (الشكل 3A-C).
- قم بتركيب المحاقن على مضخة حقنة (الشكل 3C) ، وانقل المضخة والرقائق إلى حاضنة. يتم الاحتفاظ بالخزانات المتوسطة على الجليد خارج الحاضنة.
- قم بتشغيل المضخة في وضع السحب ، وسحب الوسط من الخزان المتوسط إلى غرفة المفاعل الحيوي miniJoint . تستمر عملية الاستزراع المشتركة المصغرة هذه 28 يوما.
- لنمذجة التهاب المفاصل وتنكس الغضروف ، أضف إنترلوكين 1β (IL-1β) إلى التيار المتوسط الليفي المنشأ عند 10 نانوغرام / مل. استبدل المحاقن في اليوم الثالث من علاج IL-1β ، وقدم IL-1β طازجا للوسط الليفي المنشأ. يستمر العلاج لمدة 7 أيام.
- أثناء خطوة اختبار الدواء ، بعد 3 أيام من علاج IL-1β ، قم بإعطاء الدواء إما في الوسط المشترك ، ومحاكاة "الإدارة داخل المفصل" (الشكل 3D) عند استخدام الدواء محليا في مفصل الركبة ، أو في جميع الأنواع المتوسطة ، محاكاة "الإدارة الجهازية" (الشكل 3E) عندما يعمل الدواء على مفصل الركبة من خلال الدورة الدموية.
- جمع الأنسجة الفردية لتحليلها بعد 7 أيام من العلاج IL-1β سواء خضعت العينات للعلاج الدوائي لمدة 4 أيام السابقة أم لا.
الشكل 3: تجميع المفصل الصغير. (أ ، ب) يتم إدخال الوسائط الخاصة بالأنسجة من المداخل 1-3 (I1-3) ونقلها من المنافذ 1-3 (O1-3). يتم توزيع الوسيط المشترك من I4 إلى O4. (ج) الإعداد الكامل للثقافة المشتركة المصغرة. يمكن إدخال الأدوية (الأشكال الشبيهة بالشمس الخضراء) في (د) الوسط المشترك فقط أو (ه) جميع الوسائط لمحاكاة "الإدارة داخل المفصل" أو "الإدارة الجهازية" على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. جمع الأنسجة الفردية
- استخدم ملقط منحني معقم لإزالة الحشوات.
- ادفع لكمة خزعة من خلال مركز الملحق لإزالة الجل ، ووضع الجل في برنامج تلفزيوني.
- قطع المواد الهلامية العظمية الغضروفية إلى النصف عند تقييم التعبير الجيني.
ملاحظة: بما أن الجل العظمي الغضروفي يتكون من نوعين من الأنسجة ، فمن المهم فصل الخلايا العظمية والخلايا الغضروفية. - جمع الوسائط والأنسجة المشروطة لإجراء تجارب مختلفة.
- اجمع حوالي 1.5 مل من كل مصدر وسيط.
- قم بتجميد الوسائط المكيفة في النيتروجين السائل بعد الطرد المركزي عند 14000 × جم لمدة 10 دقائق والتخلص من الرواسب.
- بالنسبة للتلطيخ النسيجي والمناعة ، قم أولا بإصلاح عينات OC و SFT في الفورمالين المخزن بنسبة 10٪ ، وقم بتجفيفها في الإيثانول بتركيزات تصاعدية ، وقم بإزالتها في الزيلين ، وقم بتضمينها في البارافين ، وأخيرا قسمها بسمك 6 ميكرومتر.
- بالنسبة للأنسجة الدقيقة AT ، قم بتثبيت العينات في 10٪ من الفورمالين المخزن ، وقم بتلطيخها مباشرة بمحلول Oil Red O أو BODIPY.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم جمع جميع أنسجة المفصل الصغير لتحليل أنماطها الظاهرية بعد 28 يوما من الثقافة في المفصل الصغير (الشكل 4 أ). تم تفصيل ذلك في منشورنا السابق7.
من خلال استخدام RT-qPCR ، والتلوين المناعي ، والتلوين النسيجي ، تم التأكيد على أن الأنماط الظاهرية الخاصة بالأنسجة قد تم الحفاظ عليها جيدا للأنسجة الدقيقة الفردية (الشكل 4). على سبيل المثال ، أعرب المكون العظمي للأنسجة الدقيقة OC (OC-O) ، ولكن ليس مكونات الأنسجة الأخرى ، عن مستويات عالية من أوستيوكالسين (OCN). على النقيض من ذلك ، في الجزء الغضروفي من الأنسجة العظمية الغضروفية (OC-C) ، تم التعبير عن الكولاجين من النوع الثاني (COL2) و aggrecan (ACAN) بمستويات أعلى بكثير من الأنسجة الأخرى (الشكل 4B). كانت مستويات التعبير عن الأديبونيكتين (ADIPOQ) واللبتين (LEP) ، وهما جينان تمثيليان للدهون ، أعلى بكثير في AT منه في الأنسجة الأخرى. شوهد ترسب معادن الكالسيوم (الشكل 4F ، G) وكذلك الفوسفاتيز القلوي (ALP) وبروتينات OCN (الشكل 4D) بشكل أساسي في OC-O ، وأظهر OC-C الجليكوزامينوجليكان المحتفظ به جيدا (GAG) (الشكل 4C) و COL2 (الشكل 4D). بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على التعبير عن اثنين من العلامات المرتبطة بتضخم الخلايا الغضروفية ، الكولاجين من النوع X (COL10) والقنفذ الهندي (IHH) ، والتي تم اكتشافها في OC-C في اليوم 28 ، يتم تنظيمها بشكل كبير بعد 28 يوما من الثقافة في المفصل المصغر (الشكل 4E).
أكدت نتائج RT-qPCR والمناعة والأنسجة أنه تم الحفاظ على الأنماط الظاهرية ل AT و SFT بنجاح بعد 4 أسابيع من المزرعة المشتركة المصغرة (الشكل 4B ، H ، I). باستخدام تلطيخ BODIPY وتلطيخ Oil Red O ، لاحظنا ترسب قطرات الدهون بكثرة في AT (الشكل 4H). تظهر صور تلطيخ التألق المناعي في الشكل 4I تعبيرا قويا عن مادة التشحيم والكاديرين 11 (CDH11) بواسطة SFT بعد 4 أسابيع من ثقافة miniJoint .
مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى إنشاء نموذج مفصل زليلي وظيفي متعدد الأنسجة في نظام miniJoint .
الشكل 4: الحفاظ على الأنماط الظاهرية للأنسجة الفردية للأنسجة الدقيقة بعد 4 أسابيع من الزراعة المشتركة في شريحة miniJoint . (أ) الجدول الزمني لتوليد شريحة miniJoint عادية مع الحفاظ على الأنماط الظاهرية الخاصة بالأنسجة. (ب) نتائج RT-qPCR تظهر جينات الواسمات الرئيسية في جميع مكونات الأنسجة. تمت تسوية بيانات OCN إلى القيم الموجودة في OC-O وبيانات COL2 و ACAN إلى القيم الموجودة في OC-C ، وبيانات ADIPOQ و LEP إلى القيم الموجودة في AT ، وبيانات TNC و COL1 إلى القيم الموجودة في SFT. تم تحليل البيانات بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه (N = 3 مكررات بيولوجية). * ص < 0.05 ؛ ** ص < 0.01 ؛ ص < 0.001 ؛ ص < 0.0001. (ج) تلطيخ Safranin O لوحدة OC ثنائية الطور. شريط المقياس = 1 مم. (د) صور التلوين النسيجي والبقع المناعية التي تؤكد وجود علامات خاصة بالعظام والغضاريف في المكونات المقابلة لوحدة OC. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ه) يظهر التلوين المناعي تعبيرا أقل بكثير عن علامتين للتضخم ، COLX و IHH ، في OC-C في اليوم 56 مقارنة باليوم 28. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (F) أليزارين تلطيخ أحمر لوحدة OC يظهر وجود رواسب الكالسيوم بشكل أساسي في OC-O. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (G) مناظر مكبرة لصورة تلطيخ Alizarin Red في (F). شريط المقياس = 200 ميكرومتر. (H) صور تلطيخ باللون الأحمر الزيتي O و BODIPY تظهر الاحتفاظ بقطرات الدهون في AT. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (I) صور مناعية تظهر تعبير اللوبيسين و CDH11 بواسطة النسيج الليفي الشبيه بالزلال (SFT). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. مستنسخة بإذن من Li et al.7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لإنشاء نموذج مرض ، تم إدخال إنترلوكين 1β (IL-1β) إلى تيار FM بعد 28 يوما من الثقافة المشتركة (الشكل 5A ، B). أدى علاج IL-1β إلى موت الخلايا المبرمج وارتفاع مستويات MMP-13 في SFT (الشكل 5C). ومن المثير للاهتمام ، لاحظنا تدهور الغضروف في المفصل المصغر الذي عولج بواسطة IL-1β (الشكل 5D) ، مما يشير إلى حدوث تداخل بين OC-C و SFT.
الشكل 5: نمذجة التهاب المفاصل وانحطاطها في المفصل المصغر . (أ) رسم تخطيطي يوضح تحريض "التهاب الغشاء المفصلي" عن طريق تحدي SFT باستخدام IL-1β. (ب) الجدول الزمني لإنشاء وتحليل نموذج المرض. (C) مقايسة TUNEL و MMP-13 المناعية التي تظهر التغيرات المرضية في SFT. يشار إلى تجزئة الحمض النووي بواسطة رؤوس الأسهم الحمراء. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (د) صور تلطيخ Safranin O و MMP-13 المناعية التي تظهر انحطاط OC-C. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. مستنسخة بإذن من Li et al.7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
أخيرا ، اختبرنا الفعالية العلاجية للنابروكسين (NPX) من خلال "الإدارة الجهازية" (الشكل 6 أ) ، والذي ثبت أنه يقلل من تدهور الغضروف في المفصل المصغر المعالج ب IL-1β (الشكل 6 ب). قمنا أيضا بفحص أربعة DMOADs محتملة أخرى من خلال "الإدارة داخل المفصل" (الشكل 6 أ). أشارت نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي إلى أن هذه المركبات الأربعة كانت قادرة على عكس فقدان الغضروف جزئيا (الشكل 6C).
الشكل 6: اختبار الأدوية عبر الطرق "الجهازية" و "داخل المفصل" في نموذج المرض المعمول به. (أ) رسم تخطيطي يوضح طريقين مختلفين لإدارة الدواء ، بما في ذلك "الإدارة الجهازية" للنابروكسين (NPX) و "الإدارة داخل المفصل" لعامل نمو الخلايا الليفية 18 (FGF18) ، SM04690 ، التصلب (SOST) ، ومضادات مستقبلات IL-1 (IL-1RN). (ب) صور تلطيخ Safranin O و MMP-13 تظهر تنكس OC-C المخفف بعد معالجة NPX. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ج) التعبير الجيني في OC-C بعد "الإدارة داخل المفصل" لأربعة أدوية مختلفة. يشار إلى الفروق الإحصائية بين كل مجموعة معالجة بالمخدرات والمجموعة الضابطة ب * p < 0.05 ؛ ** ص < 0.01 ؛ ص < 0.001 ؛ و **** ص < 0.0001. تم تحليل البيانات بواسطة اختبار t للطالب (N = 4 مكررات بيولوجية). مستنسخة بإذن من Li et al.7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا لإنشاء نظام مفصل الركبة على رقاقة ، حيث يتم تشكيل العظام والغضاريف والأنسجة الدهنية والأنسجة الشبيهة بالغشاء الزليلي من MSCs ويتم استزراعها بشكل مشترك داخل مفاعل حيوي مخصص. يمثل هذا النظام متعدد المكونات المشتق من الخلايا البشرية مع ميزات التوصيل والتشغيل أداة جديدة لدراسة التسبب في أمراض المفاصل وتطوير الأدوية.
بالنظر إلى أن الأنسجة المختلفة تفضل وسائط استزراع معينة ، فمن الأهمية بمكان توفير الوسيط المعني لكل نسيج ومنع التبادل الوسيط الحر بين التدفقات. على وجه الخصوص ، أثناء توليد الأنسجة العظمية الغضروفية ثنائية الطور ، يتم تحديد مصير MSCs الساذجة من خلال الوسط الذي تتعرض له. في التصميم الحالي ، نستخدم هيدروجيل قائم على الجيلاتين كسقالة ، والتي توفر نموذجا لنمو الخلايا وتسد الفجوة المحتملة بين الأنسجة وجدران الإدخالات. لذلك ، من الأهمية بمكان ربط الهلام في الموقع داخل الإدراجات. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استكمال عوامل النمو مثل BMP7 و TGFβ3 في الوسط العظمي والوسط الغضروفي ، على التوالي. للحفاظ على أنشطتهم الحيوية لعدة أيام ، يجب أن تبقى الوسائط الجديدة خارج الحاضنة قبل إدخالها إلى ثقافة الرقائق. لذلك ، نحتاج إلى استخدام المحاقن لسحب الوسائط من الخزانات بدلا من غرس الوسائط في الحاضنة.
نقطة أخرى حرجة أثناء التعامل مع المفاعل الحيوي هي تجنب الضغط غير الضروري. تعتمد الأنسجة على الارتباط المادي بجدار الإدخال للبقاء في موضعها. نظرا لأنها تتعرض للتدفقات المتوسطة العلوية والسفلية ، إذا كان لمرحلة واحدة من التدفق ضغط أعلى ، فقد تدفع الأنسجة خارج الإدخالات ، مما يؤدي إلى التسرب. لذلك ، أثناء عمليات المناولة ، كما هو الحال عند إزالة الفقاعات ، يكون الضغط اللطيف للمحقنة أمرا بالغ الأهمية. إذا تم دفع سقالة الهيدروجيل للخارج ، فيمكن إعادتها ، ويمكن تطبيق هيدروجيل إضافي غير معالج لملء الفجوة ، ويمكن علاجه ، مما يسمح بسقالة آمنة وثابتة داخل الإدخال.
نظرا لتوافقها الحيوي المثبت ، يتم استخدام السقالات القائمة على الجيلاتين لإنشاء جميع الأنسجة الأربعة في النظام الحالي. تجدر الإشارة إلى أن الجيلاتين قد لا يمثل أفضل مادة لدعم تكوين الأنسجة. لذلك ، إذا لزم الأمر ، يمكن تكييف أنواع أخرى من السقالات للاستخدام. على سبيل المثال ، يمكن للمرء استخدام سقالة مسامية وقاسية ودمجها مع الجيلاتين لزيادة تعزيز تكوين العظم MSC11. في هذه الحالة ، يحتاج المرء إلى التأكد من عدم وجود تغيير وسيط حر بين التدفقات العلوية والسفلية. كما نوقش أعلاه ، يمكن للمرء استخدام الهلاميات المائية المتوافقة حيويا لإغلاق نقاط التسرب المحتملة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام MSCs في رقاقة الأنسجة الحالية. نظرا لقدرتها الواضحة على التمايز في الأنسجة العضلية الهيكلية ، يمكن أيضا استخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) في المستقبل لتحل محل MSCs. كخطوة أولى نحو هذا التحقيق ، استخدمنا مؤخرا iPSCs لإنشاء أنسجة عظميةغضروفية 12.
التهاب الغشاء المفصلي ، أو التهاب الغشاء المفصلي ، هو سمة رئيسية من هشاشة العظام والعديد من أمراض المفاصل الأخرى. علاوة على ذلك ، وجد Atukorala et al. أن التهاب الغشاء المفصلي هو مؤشر قوي للتصوير الشعاعي اللاحق OA13. لذلك ، قمنا بإحداث التهاب SFT بواسطة علاج IL-1β لتوليد ميزات تشبه الزراعة العضوية في miniJoint. ومع ذلك ، فإننا ندرك أن طريقة تحريض المرض هذه لا يمكنها التقاط جميع جوانب الزراعة العضوية. وبالتالي ، في بحثنا المستقبلي ، سوف نستكشف طرقا بديلة لنمذجة الزراعة العضوية في miniJoint عن طريق ، على سبيل المثال ، استخدام التحميل الفسيولوجي المفرط للحث على الإصابة الميكانيكية لمكون الغضروف14. لتطبيق التحميل الميكانيكي ، سيكون من الضروري تكييف تصميم miniJoint . على سبيل المثال ، يمكن تعديل الجزء السفلي من رقاقة miniJoint لجعل نسيج الغضروف في متناول طرف الصدمة لجهاز تصادم مخصص محمل بنابض تم تطويره في مختبرنا15.
على حد علمنا ، فإن مفصل الركبة على رقاقة الموصوف هنا هو أول نموذج في المختبر يتضمن أنسجة متعددة داخل نظام واحد لمحاكاة مفصل زليلي. تسمح قدرة التوصيل والتشغيل الجديدة بالتحقيق في دور نسيج واحد في تطور المرض واستجابته للعلاجات المختلفة. يمكن أيضا استخدام هذا النظام لنمذجة أمراض المفاصل بخلاف الزراعة العضوية. على سبيل المثال ، يمكن إدخال البكتيريا ومسببات الأمراض الأخرى في SM لنمذجة التهاب المفاصل الإنتاني16. بالإضافة إلى ذلك ، يتيح التصميم الحديث المتبادل في الوقت الفعلي بين الأنسجة ، وبالتالي التغلب على قيود استخدام الوسيط المشروط. على وجه التحديد ، يمكن للأنسجة الدهنية والزليلية والغضاريف التواصل من خلال الوسط المشترك ، ويمكن أن تتفاعل العظام والغضاريف من خلال الارتباط المادي المباشر. ومع ذلك ، هناك بعض القيود على miniJoint الحالي. أولا ، يتم استخدام الأنسجة المشتقة من الخلايا الجذعية ، وما إذا كان نمطها الظاهري ووظيفتها يشبهان نظيراتها في مفصل الركبة الأصلي يحتاج إلى مزيد من التحقيق. ثانيا ، لا يتم تضمين الخلايا المناعية مثل الضامة ، التي تلعب دورا مهما في التسبب في OA. أظهرت دراستنا السابقة جدوى تضمين البلاعم في سقالات الجيلاتين17. أخيرا ، لم يتم تضمين آلية تمكين الإجهاد البدني لمحاكاة الحمل الميكانيكي على الأنسجة في مفصل الركبة الأصلي. في الآونة الأخيرة ، طور Occhetta et al. نموذجا للغضروف على رقاقة ، حيث تم تطبيق الضغط المتحكم فيه بالإجهاد لتحفيز أنسجة الغضاريف المهندسة14. يمكن اعتماد طريقة مماثلة لتمكين التحميل الميكانيكي في miniJoint.
باختصار ، يمكن أن يكون miniJoint بمثابة منصة فريدة للتحقيق في التسبب في الزراعة العضوية والظروف ذات الصلة في المختبر وتوفير آلية لاستكشاف DMOADs المحتملة والتدخلات للطب الشخصي. يمكن أيضا دمج نظام miniJoint مع OoCs الذي يحاكي الأعضاء الأخرى لإنشاء أنظمة الجسم على الرقاقة التي يمكن استخدامها لدراسة التفاعلات بين محاكاة الأعضاء المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث في المقام الأول بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (UG3 / UH3TR002136 ، UG3 / UH3TR003090). بالإضافة إلى ذلك ، نشكر الدكتور بول مانر (جامعة واشنطن) على توفير عينات الأنسجة البشرية والدكتور جيان تان لمساعدتهم في عزل MSCs وإنشاء تجمع الخلايا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma -Aldrich | I17018-1G | |
| 6 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351146 | |
| 24 well non-tissue culture plate | Corning Falcon® Plates | 351147 | |
| 30 mL syringes | BD Syringe Luer Lock Cascade Health | 302832 | |
| Alcian blue stain | EK Industries | 1198 | 1% w/v, pH 1.0 |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491-015 | |
| αMEM | Gibco | 12571-063 | |
| Antibiotic-antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Biopsy punch | Integra Miltex | 12-460-407 | |
| BODIPY® fluorophore | Molecular Probes | ||
| Bone morphogenic protein 7 (BMP7) | Peprotech | ||
| Curved forceps | Fisher Brand | 16100110 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium |
| Dexmethasome | Sigma -Aldrich | 02-05-2002 | |
| E-Shell 450 photopolymer in | EnvisionTec | RES-01-4022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini-Bio Products | 900-208 | |
| GlutaMAX | Gibco | 3505-061 | |
| gelatin from bovine skin | Hyclone | 1003372809 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma -Aldrich | SH30588.02 | |
| indomethacin | Sigma -Aldrich | I7378-56 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS) | Gibco | 51500-056 | |
| interleukin 1β | Peprotech | 200-01B | |
| Leur-loc connectors | Cole-Parmer Instruments | 45508-50 | |
| L-proline | Sigma -Aldrich | 115388-93-7 | |
| β-glycerophosphate | Sigma -Aldrich | 1003129352 | |
| Medium bags | KiYATEC | FC045 | |
| Methacrylic Anhydride | Sigma -Aldrich | 102378580 | |
| Phosphate buffered Saline | Corning | 21-040-CM | |
| Pointed forceps | Fisher Brand | 12000122 | |
| Silicon mold | McMaster-Carr | RC00114P | |
| Silicon o-rings | McMaster-Carr | ZMCCs1X5 | 1mm x 5mm |
| SolidWorks | Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France | ||
| Surgical Blades | Integra Miltex | 4-122 | |
| Syringe pump | Lagato210P, KD Scientific | Z569631 | 10 syringe racks |
| T-182 tissue culture flasks | Fisher Brand | FB012939 | |
| Tissue Culture Dish 150 mm | Fisher Brand | FB012925 | |
| Transforming Growth Factor Beta (TGF-β3) | Peprotech | 100-36E | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| UV Flashlight | KBS | KB70109 | 395 nm |
| Vida Desktop 3D Printer | EnvisionTec | ||
| Vitamin D3 | Sigma -Aldrich | 32222-06-3 | 1,25-dihydroxyvitamin D3 |
References
- Safiri, S., et al. Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017. Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).
- Lawrence, R. C., et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II. Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).
- Makarczyk, M. J., et al. Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs. Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).
- He, Y., et al. Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models. Biology. 9 (8), 194 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
- Li, Z., et al. Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing. Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).
- Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1β. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).
- Yin, B., et al. Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).
- Lin, Z., et al. Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).
- Atukorala, I., et al. Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).
- Occhetta, P., et al. Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).
- He, C., et al. Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models. Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).
- Elsissy, J. G., et al. Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review. JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).
- Romero-Lopez, M., et al. Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model. Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).
