Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Meting van de samendrukbaarheid van cel en kern op basis van Acoustofluidic Microdevice

Published: July 14, 2022 doi: 10.3791/64225
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Sino-French Institute of Nuclear Engineering and Technology, Sun Yat-sen University

Summary

Hier wordt een protocol gepresenteerd om een snel en niet-destructief systeem te bouwen voor het meten van cel- of kerncompressie op basis van acoustofluidic microdevice. Veranderingen in mechanische eigenschappen van tumorcellen na epitheliaal-mesenchymale overgang of ioniserende straling werden onderzocht, wat het toepassingsperspectief van deze methode in wetenschappelijk onderzoek en klinische praktijk aantoont.

Abstract

Celmechanica speelt een belangrijke rol bij tumormetastase, kwaadaardige transformatie van cellen en radiosensitiviteit. Tijdens deze processen is het bestuderen van de mechanische eigenschappen van de cellen vaak een uitdaging. Conventionele meetmethoden op basis van contact, zoals compressie of stretching, kunnen celbeschadiging veroorzaken, wat de meetnauwkeurigheid en de daaropvolgende celcultuur beïnvloedt. Metingen in hechtende toestand kunnen ook de nauwkeurigheid beïnvloeden, vooral na bestraling, omdat ioniserende straling cellen zal afvlakken en de hechting zal verbeteren. Hier is een celmechanisch meetsysteem ontwikkeld op basis van een acoustofluidische methode. De samendrukbaarheid van de cel kan worden verkregen door het bewegingstraject van de cel te registreren onder invloed van de akoestische kracht, die snelle en niet-destructieve metingen in zwevende toestand kan realiseren. Dit artikel rapporteert in detail de protocollen voor chipontwerp, monstervoorbereiding, trajectregistratie, parameterextractie en -analyse. De samendrukbaarheid van verschillende soorten tumorcellen werd gemeten op basis van deze methode. Meting van de samendrukbaarheid van de kern werd ook bereikt door de resonantiefrequentie van het piëzo-elektrische keramiek en de breedte van het microkanaal aan te passen. In combinatie met de moleculaire niveauverificatie van immunofluorescentie-experimenten werd de celcompressie-voor en na geneesmiddel-geïnduceerde epitheliale naar mesenchymale overgang (EMT) vergeleken. Verder werd de verandering van de samendrukbaarheid van cellen na röntgenbestraling met verschillende doses onthuld. De celmechanica meetmethode die in dit artikel wordt voorgesteld, is universeel en flexibel en heeft brede toepassingsperspectieven in wetenschappelijk onderzoek en de klinische praktijk.

Introduction

Celmechanische eigenschappen spelen een belangrijke rol bij tumormetastase, kwaadaardige transformatie van cellen en radiogevoeligheid 1,2. Om een diepgaand inzicht te krijgen in de rol van celmechanische eigenschappen in het bovenstaande proces, is nauwkeurige meting van cellulaire mechanica van cruciaal belang en mag de meting geen schade aan de cellen veroorzaken voor daaropvolgende cultuur en analyse. Het meetproces moet zo snel mogelijk verlopen, anders kan de levensvatbaarheid van cellen worden aangetast als cellen voor een lange tijd uit de kweekomgeving worden verwijderd.

Bestaande celmechanica meetmethoden hebben te maken met enkele beperkingen. Sommige methoden, zoals magnetische draaiende cytometrie, magnetisch pincet en deeltjesvolgende microrheologie, veroorzaken celschade door de introductie van deeltjes in cellen 3,4,5. Methoden die meten door contact met cellen, zoals atoomkrachtmicroscoop (AFM), micropipette-aspiratie, microvernauwing en parallelplaattechniek, zijn ook gevoelig voor celbeschadiging en de doorvoer is moeilijk te verhogenmet 6,7,8. Bovendien zal ioniserende straling cellen afvlakken en hun hechting verhogen9; het is daarom noodzakelijk om de hele celmechanica in suspensie te meten.

Als antwoord op de bovenstaande uitdagingen is een celmechanisch meetsysteem ontwikkeld op basis van acoustofluidische methode10,11,12,13,14. De kanaalbreedte is afgestemd op de akoestische halve golflengte, waardoor een staande golfknoop ontstaat op de middellijn van het microkanaal. Onder invloed van akoestische stralingskracht kunnen de cellen of standaardparels naar de akoestische drukknoop bewegen. Omdat de fysische eigenschappen van de standaard kralen (grootte, dichtheid en samendrukbaarheid) bekend zijn, kan de akoestische energiedichtheid worden bepaald. Vervolgens kan de samendrukbaarheid van de cel worden verkregen door de bewegingstrajecten van cellen in het akoestische veld te registreren. Niet-destructieve high-throughput meting van cellen in suspensietoestand kan worden bereikt. Dit artikel introduceert het ontwerp van de microfluïdische chip, de oprichting van het systeem en de meetstappen. Meting van verschillende soorten tumorcellen is uitgevoerd om de nauwkeurigheid van de methode te verifiëren. Het toepassingsgebied van deze methode was uitgebreid tot subcellulaire structuren (zoals kern) door de resonantiefrequentie van het piëzo-elektrische keramiek en de breedte van het microkanaal aan te passen. Daarnaast werden de veranderingen in celcompressie na geneesmiddel-geïnduceerde EMT of röntgenbestraling met verschillende doses onderzocht. De resultaten tonen de brede toepasbaarheid van deze methode als een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de correlatie tussen biochemische veranderingen en cellulaire mechanische eigenschappen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vervaardiging en assemblage van het acoustofluidische microdevice

  1. Fabricage van de microfluïdische chip.
    1. Ontwerp een eenkanaalschip met slechts één in- en uitlaat, zoals weergegeven in figuur 1. Houd voor meetcellen de rechthoekige doorsnede van het microkanaal op 740 μm breed en 100 μm diep. Voor het meten van de celkern wijzigt u de breedte en diepte van het microkanaal in respectievelijk 250 μm en 100 μm.
    2. Bereid het microkanaal op siliciumwafer voor via reactief ionenetsen. Sluit de bovenkant van het microkanaal af met een stuk transparant hittebestendig glas door anodisch te verlijmen15. Was de chips met een ultrasone reiniger gedurende 10 min. Droog ze in een droogoven op 50 °C voor later gebruik.
  2. Fabriceer polydimethylsiloxaan (PDMS) blokken.
    1. Voeg 30 ml pre-polymeer toe aan een glazen schaal van 100 mm (in diameter). Voeg 3 ml uithardingsmiddel toe aan het prepolymeer met een spuit.
      OPMERKING: De volumeverhouding van het uithardingsmiddel en het pre-polymeer is 1:10.
    2. Meng het PDMS-prepolymeer en uithardingsmiddel krachtig met een glazen staaf gedurende ongeveer 10 minuten. Zoek naar kleine en gelijkmatig gescheiden luchtbellen in de oplossing, die aangeven dat het PDMS-prepolymeer en het uithardingsmiddel goed gemengd zijn.
    3. Plaats de glazen schaal in een vacuümdesiccator en evacueer gedurende 15-25 s. Herhaal dit proces totdat er geen luchtbellen in het mengsel zitten.
    4. Plaats de glazen schaal gedurende 1 uur in een droogoven op 50 °C om het mengsel te laten uitharden. Gebruik na de incubatie een scalpel om het PDMS in blokken van geschikte grootte van ongeveer 1,2 cm lang en 1 cm breed te snijden.
      OPMERKING: De lengte van het PDMS-blok is consistent met de breedte van de chip en de breedte is geselecteerd om ervoor te zorgen dat er voldoende ruimte in het midden is voor het piëzo-elektrische keramiek wanneer twee PDMS-blokken op de chip worden geplakt.
  3. Bind het PDMS-blok aan de chip.
    1. Ponsgaten in het PDMS-blok voor inlaat- en uitlaatpoorten met een holle naald met een diameter van 1 mm. Plaats de PDMS-blokken en chip (achterkant naar boven) gedurende 1 min in een plasmareiniger.
    2. Lijn de gaten op de PDMS-blokken uit met de chipinlaat en -uitlaat. Druk de PDMS-blokken zachtjes 15 s op de chip. Dit zou ervoor moeten zorgen dat er binding optreedt tussen de PDMS-blokken en het oppervlak van de chip.
  4. Sluit de polytetrafluorethyleenkatheter (PTFE) aan op de chip (figuur 2B).
    1. Snijd twee stukken PTFE-katheter met een binnendiameter van 0,8 mm en een lengte van 10 cm. Buig een roestvrijstalen naald met een binnendiameter van 0,7 mm en een lengte van 1,5 cm bij 90° in een L-vorm. Sluit het aan op het ene uiteinde van de katheter. Bereid twee van dergelijke katheters voor met naalden.
    2. Steek de roestvrijstalen naalden in de gaten van de PDMS-blokken. Sluit voor de inlaat een doseernaald van 19 G aan op het andere uiteinde van de katheter als connector voor een spuit.
    3. Na het voltooien van de bovenstaande stappen, injecteert u gedeïoniseerd water om de dichtheid van het totale kanaal te testen. Ondoordringbaar voor water betekent een goede afdichting.
  5. Piëzo-elektrische keramische assemblage (figuur 2C)
    1. Gebruik een diamantdraadsnijder om piëzo-elektrische keramische platen met een diameter van 2 cm in vier stroken met een breedte van 5 mm te snijden.
    2. Zorg ervoor dat de resonantiefrequentie van het piëzo-elektrische keramiek overeenkomt met de breedte van het chipmicrokanaal. Gebruik voor het 740 μm en 250 μm brede microkanaal piëzo-elektrische keramiek met resonantiefrequenties van respectievelijk 1 MHz en 3 MHz.
    3. Lasdraden aan beide zijden van het piëzo-elektrische keramiek aan het ene uiteinde.
    4. Lijm het piëzo-elektrische keramiek op het midden van de achterkant van de chip met cyanoacrylaatlijm.
    5. Om de lijm gelijkmatig te verdelen, plaatst u een druppel lijm op het piëzo-elektrische keramiek, maakt u de lijm glad met een tandenstoker en verwijdert u de overtollige lijm. Druk vervolgens snel op de chip en blijf ongeveer 1 minuut drukken. Zorg ervoor dat het piëzo-elektrische keramiek en de chip stevig zijn gebonden en gelijkmatig worden gecontacteerd.
  6. Monteer het microapparaat (figuur 2D).
    1. Snijd een stuk PDMS (ongeveer 1,5 cm lang en 1 cm breed) als basis van het microdevice. Plak met dubbelzijdige tape de ene kant van de basis op de PDMS-blokken in- en uitlaat en de andere kant op een transparante glazen schuif. Bevestig het hele microdevice aan de microscoopfase om de chip in één brandpuntsvlak te houden.

2. Monstervoorbereiding

  1. Bereiding van polystyreen standaard deeltjesoplossingen.
    1. Voeg 0,05 ml polystyreendeeltjes (6 μm in diameter) oplossing (2,1 x 108 deeltjes / ml) toe aan 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en meng goed.
      OPMERKING: Om de meetfout veroorzaakt door de verandering van de akoestische energiedichtheid te verminderen, werd de polystyreendeeltjesoplossing in elk experiment als kalibratie gemengd met de monsteroplossing.
  2. Voorbereiding van celsuspensies.
    1. Was de aanhangende cellen (bijv. MCF7, MDA-MB-231, HCT116) met 90% samenvloeiing (~ 5 x 105 cellen) met PBS. Voeg 500 μL 0,25% trypsine (1x) toe gedurende 1-2 min bij kamertemperatuur (25 °C). Verwijder de trypsine, voeg 1 ml compleet medium toe en vorm een celsuspensie door te pipetteren.
    2. Centrifugeer de celsuspensie bij 100 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 0,5-1 ml PBS om een celsuspensie te verkrijgen. Cellen werden geteld met een hemocytometer en de concentratie was ongeveer 3-5 x 105 cellen / ml.
  3. Bereiding van celkernsuspensie
    1. Voer stap 2.2 uit. Verwijder vervolgens het supernatant en voeg 200 μL cytoplasmatisch eiwitextractiereagens A (aangevuld met 1% PMSF) per 20 μL celpellet (ongeveer 5 miljoen cellen) toe en meng goed.
    2. Vortex het bovenstaande mengsel op 220 x g gedurende 5 s en plaats het vervolgens gedurende 10 minuten op het ijsbad. Voeg na incubatie 10 μL cytoplasmatisch eiwitextractiereagenS B toe aan de oplossing.
    3. Vortex bij 220 x g gedurende 5 s. Plaats op ijsbad gedurende 1 min en vortex opnieuw op 220 x g gedurende 5 s. Centrifugeer vervolgens bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: De volumeverhouding van cytoplasmatische eiwitextractiereagentia A en B is 20:1.
    4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml PBS. Centrifugeer vervolgens bij 1.000 x g bij 4 °C gedurende 4 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer in 100 μL PBS als celkernsuspensie.
    5. Voeg trypan blue toe aan de bovenstaande celkernsuspensie en beits bij kamertemperatuur (25 °C) gedurende 4 min. De volumeverhouding van trypanblauwe oplossing tot nucleussuspensie is 1:1. Tel het aantal kernen onder de omgekeerde microscoop met een 10x objectief.
      OPMERKING: Om de celkernen onder de microscoop duidelijk te identificeren, is trypan blue-kleuring vereist. Trypan blue-oplossing moet gedurende 10 minuten in een waterbad van 37 °C liggen voor effectieve kleuring.
    6. Verdun de bovenstaande celkernsuspensie met PBS-buffer tot een concentratie van 2-3 x 105 kern/ml. Filtreer de celkernsuspensie door een zeef van 70 μm.

3. Meten van de samendrukbaarheid van cel en kern

  1. Het meetsysteem instellen (figuur 3)
    1. Schakel de lichtbron van de microscoop in en open de camerasoftware. Gebruik het 4x-objectief om de middelste positie van het microkanaal te vinden, d.w.z. de positie van het piëzo-elektrische keramiek.
    2. Sluit de draden aan en las ze aan de positieve en negatieve aansluitingen van de signaalgeneratoruitgang op respectievelijk het piëzo-elektrische keramiek.
    3. Plaats de spuit op de micro-injectiepomp en sluit deze aan op de inlaatkatheter. Plaats een kleine container aan het einde van de uitlaatkatheter om de vloeistof die uit het microkanaal stroomt vast te houden.
  2. Meetparameters bepalen
    1. Zuig de oplossing van polystyreendeeltjes aan met de spuit en injecteer deze in het chipmicrokanaal. Vermijd luchtbellen in het chipmicrokanaal om een nauwkeurige meting te garanderen. Zorg ervoor dat deeltjes gelijkmatig verdeeld zijn in het chipmicrokanaal.
      OPMERKING: De meting kan worden uitgevoerd zonder stroom- of spuitpomp. Indien nodig moet het debiet van de micro-injectiepomp op een juiste waarde worden ingesteld. Hier is het debietbereik 0-20 μL/h.
    2. Stel de uitgang van de signaalgenerator in op een sinussignaal met een frequentie van 1 MHz (3 MHz voor celkernmeting) en piek-piekspanning (Vpp) van 10 V.
    3. Stem de frequentie van het signaal af totdat wordt waargenomen dat de deeltjes naar de middellijn van het microkanaal bewegen en in voorwaartse beweging blijven langs de middellijn na het bereiken van de middellijn (figuur 4).
      OPMERKING: De snelheid van de deeltjes die naar de middellijn bewegen, wordt bepaald door de spanningsamplitude, die kan worden aangepast tussen 5 Vpp en 20 Vpp.
  3. Cellen en kernen meten
    1. Meng 1 ml cel- of kernsuspensie met de standaard deeltjesoplossing in de verhouding van 1:1 en injecteer deze met een spuit in het microkanaal.
    2. Begin met opnemen met ccd-camera wanneer de cellen of kernen het gezichtsveld betreden. Schakel vervolgens de signaalgenerator in. Stop met opnemen wanneer de cellen of kernen de middellijn bereiken.
    3. Spoel het microkanaal af met gedeïoniseerd water, 75% alcohol en gedeïoniseerd water in volgorde voor later gebruik.

4. Gegevensverwerking

  1. Breng deeltjes- of celtrajecten in kaart.
    1. Importeer de vastgelegde video in imageJ-software: Bestand > Openen> Selecteer map. Klik op de ellipsvorm in de werkbalk van de ImageJ-software om een interessante cel en het aangrenzende deeltje te kiezen (figuur 5).
    2. Zoals weergegeven in figuur 5, vooraf ingestelde meetparameters in ImageJ-software als Analyze→ Set Measurement →Area, Centroid, Display Label.
    3. Het frame nemen waar de doelcel of het deeltje longitudinale verplaatsing ondergaat als het startframe; noteer de pixelpositie en -grootte van de cel of het deeltje in elk frame totdat het de middellijn van het microkanaal bereikt. Exporteer de gegevens als een spreadsheetbestand en herhaal de stap totdat trajecten voor alle interessante cellen zijn verkregen.
  2. Coördineer transformatie en correctie.
    1. Noteer de pixelcoördinaten van de vier hoeken van het microkanaal in dit gezichtsveld als (0, y1), (0, y2), (x3, y3), (x4, y4). Hier x3 = x4.
    2. Bereken voor elk meetpunt (xi, yi) de nieuwe coördinaat (xi', yi') na rotatiecorrectie met behulp van de volgende formules:
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
    3. Converteer pixelcoördinaten naar coördinaten op ware grootte. De werkelijke coördinaten kunnen worden verkregen door pixelcoördinaten te vermenigvuldigen met de verhouding. De verhouding was de werkelijke breedte van het microkanaal gedeeld door de pixelbreedte (H) van het microkanaal.
    4. Transformeer en corrigeer de pixelcoördinaten van de cellen en deeltjes die in stap 4.1 zijn verkregen naar de uiteindelijke gegevens over het bewegingstraject. Alle coördinaten minus de coördinaten van de linkerbenedenhoek, d.w.z. (0, y2). De framesnelheid van de video is 40 frames per seconde, dus vermenigvuldig het aantal frames dat overeenkomt met elke coördinaat met 0,025 s om de tijd van deeltjesbeweging te verkrijgen, waardoor de verandering van de positie in de y-richting met de tijd wordt verkregen.
  3. Bereken de akoestische energiedichtheid (figuur 6A,B).
    1. De beweging van de cel of het deeltje in de Y-richting wordt aangedreven door de akoestische kracht Fac en hydrodynamische kracht FD. Bereken het bewegingstraject met behulp van de volgende formules:
      Equation 4(1)
      Equation 5(2)
      Equation 6(3)
      waarbij r en D de straal en diameter van de cel of het deeltje zijn, ρ en β de dichtheid en samendrukbaarheid zijn, ν de snelheidsvector. De subscripts c en f geven respectievelijk de cel en de vloeistof aan. d is de afstand tot de dichtstbijzijnde akoestische drukknoop, μ is de dynamische viscositeit van de vloeistof, k is het golfgetal en E is de akoestische energiedichtheid.
      OPMERKING: De dichtheid van MCF7, HCT116, A549 en celkernen was 1068 kg/m3, 1077 kg/m3, 1073 kg/m3 en 1155 kg/m3, respectievelijk 12,16,17.
    2. Gebruik volgens de formules beschreven in stap 4.3.1 de MATLAB-software om de numerieke oplossing voor het standaard deeltjestraject onder het akoestisch veld te verkrijgen met eindige verschilmethode.
    3. Wijzig binnen het vooraf ingestelde akoestische veldbereik de akoestische energiedichtheid en pas de numerieke oplossing (verkregen in stap 4.3.2) en het gemeten bewegingstraject (verkregen in stap 4.2) voor het standaarddeeltje aan. Selecteer het beste aanpassingsresultaat op basis van de maatgemiddelde kwadratische fout. De hier verkregen akoestische energiedichtheid wordt gebruikt als parameter voor de latere berekening van de samendrukbaarheid van cellen.
  4. Bereken de samendrukbaarheid van de cel (figuur 6C,D).
    1. Stel de akoestische energiedichtheid in op de waarde die is verkregen in stap 4.3.3.
    2. Gebruik volgens de formules beschreven in stap 4.3.1 de MATLAB-software om de numerieke oplossing voor het celtraject onder het akoestisch veld te verkrijgen met eindige verschilmethode.
    3. Net als bij stap 4.3.3 wijzigt u binnen het vooraf ingestelde samendrukbaarheidsbereik de samendrukbaarheid en past u de numerieke oplossing (verkregen in stap 4.4.2) en het gemeten bewegingstraject voor de cel (verkregen in stap 4.2) aan. Gebruik de samendrukbaarheidscoëfficiënt die overeenkomt met het best passende resultaat als de gemeten celdrukbaarheid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier presenteerde het werk een protocol voor de bouw van een snel en niet-destructief celdrukbaarheidsmeetsysteem op basis van acoustofluidisch microdevice en demonstreerde het de voordelen ervan voor het meten van cel en kern onder verschillende situaties. Figuur 1 toont het schema van het microfluïdische kanaal. De componenten en assemblage van het acoustofluidische microdevice zijn weergegeven in figuur 2. Figuur 3 toont de opstelling van het meetsysteem. Onder invloed van de akoestische veldkracht zullen cellen en deeltjes naar de middellijn van het microkanaal bewegen, zoals weergegeven in figuur 4A. De meting van de grootte en positie van cellen of deeltjes is weergegeven in figuur 5. De berekening van de energiedichtheid en de samendrukbaarheid van de cel door aanpassing is weergegeven in figuur 6. Om het toepassingsgebied van dit apparaat uit te breiden tot cellulaire organellen, met name de kern, werden hoge zuiverheid en intacte kernen geïsoleerd uit cellen (figuur 7A). Door de resonantiefrequentie van het piëzo-elektrische keramiek en de breedte van het microkanaal dienovereenkomstig aan te passen, werd het bewegingstraject van de kern verkregen (figuur 4B) en werd de meting van de samendrukbaarheid van de kern bereikt (figuur 7B).

Op basis van dit systeem werd de samendrukbaarheid van verschillende soorten kankercellen gemeten en vergeleken (figuur 8A). Daarnaast werden de veranderingen in celcompressie na geneesmiddel-geïnduceerde EMT of röntgenbestraling met verschillende doses onderzocht (figuur 8B,C). Voor EMT-inductie werden groeifactoren zoals transformerende groeifactor bèta (TGFβ), epidermale groeifactor (EGF) en basis fibroblastgroeifactor (bFGF) gebruikt. Voor bestraling was het dosistempo 153 mU/min en de gebruikte doses waren 1, 2, 4 en 8 Gy. Deze resultaten tonen de brede toepasbaarheid van deze methode als een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de correlatie tussen biochemische veranderingen en cellulaire mechanische eigenschappen. Het belangrijkste was dat deze methode een niet-vernietigingsmeting was. De gemeten cellen werden verzameld en gezaaid in een celkweekschaal, en er werd vastgesteld dat er geen significant verschil was in celproliferatie en levensvatbaarheid in vergelijking met de onbehandelde groep na 48 uur cultuur, zoals weergegeven in figuur 9, wat aangeeft dat de meting geen effect heeft op celproliferatie en overleving.

Figure 1
Figuur 1: Schematisch diagram van het chipmicrokanaal. Deze afbeelding toont de structuur en afmetingen van het chipmicrokanaal met een enkele in- en uitlaat. Het toestel is mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Montagefoto voor het acoustofluidische microdevice. (A) Voor- en achterfoto's van de chip. (B) Deze afbeelding toont de PTFE-inlaatkatheter met bevestigde doseernaald van 19 G en een naald van roestvrij staal. (C) Deze afbeelding toont het piëzo-elektrische keramiek met gelaste draden. (D) Deze afbeelding toont de assemblage van het acoustofluidische microdevice met basis voor bevestiging. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Opstelling van het celdrukbaarheidsmeetsysteem. Deze afbeelding toont de opstelling van het meetsysteem bestaande uit signaalgenerator, spuitpomper, het acoustofluidische microdevice, microscoop en CCD-camera. Dit cijfer is gewijzigd van10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: De beweging van cellen en kernen. Deze figuur toont de beweging van cellen (A) en celkernen (B) naar de middellijn van het microkanaal onder invloed van de akoestische veldkracht. Schaalbalk = 250 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Meting van de grootte en positie van een cel of deeltje met behulp van ImageJ-software. Deze afbeelding toont de klik op de knop voor het verkrijgen van parameters zoals gebied en centroïde in de ImageJ-software. De pixelcoördinaten van de vier hoeken van het microkanaal werden geregistreerd als (0, y1), (0, y2), (x3, y3), (x4, y4). De pixelbreedte werd weergegeven als H. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: De berekening van de energiedichtheid en de samendrukbaarheid van cellen door aanpassing. (A) Gemiddelde LS-waarden (Squared Error) bij verschillende energiedichtheden. De akoestische energiedichtheid werd verkregen uit het best passende resultaat. De eenheid van energiedichtheid is J/m3. (B) Deze figuur toont de aanpassing van de numerieke oplossing en het gemeten bewegingstraject voor het deeltje. (C) Gemiddelde LS-waarden (squared error) bij verschillende celcompressie. De samendrukbaarheid van de cel werd verkregen uit het best passende resultaat. (D) Deze figuur toont de aanpassing van de numerieke oplossing en het gemeten bewegingstraject voor de cel. De eenheid van cel samendrukbaarheid is 10-10 Pa-1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Kernextractie en samendrukbaarheidsmeting. (A) Deze afbeelding toont de celkernen geëxtraheerd uit A549-cellen bekeken met een 40x-objectief. Schaalbalk = 20 μm. (B) Deze afbeelding toont de gemeten samendrukbaarheidsvergelijking van A549-cellen (N = 38) en hun kernen (N = 45). De eenheid van cel samendrukbaarheid is 10-10 Pa-1. De lengte van het vak vertegenwoordigt de standaarddeviatie. Student's t-test en chi-kwadraatanalyse werden gebruikt om significantie te beoordelen. **P < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: De samendrukbaarheid van verschillende soorten kankercellen en cellen na geneesmiddel-geïnduceerde EMT of röntgenbestraling. (A) De cel samendrukbaarheid van verschillende soorten kankercellen. HCT116 (N = 36), A549 (N = 68) en MDA-MB-231 (N = 32) waren de cellijnen van respectievelijk colorectaal carcinoom, longadenocarcinoom en borstadenocarcinoom. (B) De cel samendrukbaarheid van MCF7 en A549 voor en na inductie van EMT. (C) Samendrukbaarheid van cellen gemeten op 3 uur na bestraling met verschillende doses. De eenheid van cel samendrukbaarheid is 10-10 Pa-1. De eindbalken van de boxplot vertegenwoordigen respectievelijk de waarden 10% en 90%. De lengte van het vak vertegenwoordigt de standaarddeviatie. De middelste horizontale lijn vertegenwoordigt de mediaanwaarde. ns betekent geen statistische significantie. Student's t-test en chi-kwadraatanalyse werden gebruikt om significantie te beoordelen. *P < 0,05, **P < 0,01. Een deel van dit cijfer is aangepast van 18,19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: Celproliferatie en levensvatbaarheid na samendrukbaarheidsmeting. Deze figuur toont de A549-celproliferatie (A) en levensvatbaarheid (B) na samendrukbaarheidsmeting. Controlegroepen zijn onbehandelde cellen. Testgroepen zijn de cellen die na samendrukbaarheidsmeting gedurende 48 uur worden gekweekt. Elk experiment heeft ten minste drie replicaties. Voor de levensvatbaarheid van cellen werden minstens 300 cellen geteld. Student's t-test en chi-kwadraatanalyse werden gebruikt om significantie te beoordelen. ns geeft aan niet statistisch significant te zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Veelgebruikte celmechanica meetmethoden zijn AFM, micropipette aspiratie, microfluïdica methoden, parallel-plaat techniek, optische pincet, optische brancard en akoestische methoden20. Microfluïdische methoden kunnen werken met drie benaderingen: micro-vernauwing, extensieve stroming en afschuifstroom. Onder hen zijn optische brancards, optische pincetten, akoestische methoden, extensieve stroming en afschuifstroombenaderingen contactloze metingen. In tegenstelling tot contactmetingen kunnen contactloze metingen effectief het celschadeprobleem voorkomen dat wordt veroorzaakt door contact of lokale vervorming. Optische pincetten zijn zeer gevoelig voor de meetomgeving21. Verstoringen in optische omstandigheden kunnen aanzienlijke verschillen in meetresultaten veroorzaken en een hoog laservermogen tijdens de meting kan ook celschade veroorzaken. Bovendien hebben optische brancards en optische pincetten over het algemeen een lagedoorvoersnelheid van 20,22. Microfluïdische methoden zoals extensional flow en shear flow kunnen micromechanica van tumorcellen niet direct meten23. In vergelijking met andere methoden hebben akoestische methoden de voordelen van niet-destructieve, hoge doorvoer en brede toepasbaarheid bij het meten van celmechanica.

De meetmethode op basis van acoustofluidisch microdevice die in dit artikel is ontworpen, maakt gebruik van contactloze akoestische stralingskracht en het grootste voordeel is dat het cellen niet beschadigt, wat werd bevestigd door de hier getoonde experimentele resultaten (figuur 9). Een ander voordeel van deze methode is de hoge doorvoer, die kan worden aangepast door de celconcentratie te wijzigen. Momenteel kan een meetsnelheid van ongeveer 50-70 cellen / min worden bereikt op basis van het waarborgen van de nauwkeurigheid van de daaropvolgende gegevensanalyse. Omdat de cellen in suspensie worden gemeten, kan ook de meting van niet-hechtende cellen worden bereikt, waardoor het toepassingsgebied wordt uitgebreid. Bovendien werd in dit artikel de meting van de samendrukbaarheid van de cel na bestraling bereikt en werd de relatie tussen celcompressie en bestralingsdosis onthuld (figuur 8). Bovendien kan de meting van cellen of kernen met verschillende stijfheid ook worden aangepast door de resonantiefrequentie van het piëzo-elektrische keramiek en de breedte van het microkanaal aan te passen. Zoals te zien is in figuur 7, werd de meting van de samendrukbaarheid van de kern bereikt.

Hier werd alleen de beweging van cellen langs de lengte en breedte van het microfluïdische kanaal overwogen. De cellen werden beschouwd als in suspensie omdat de dichtheid van de cellen dicht bij die van de vloeistof ligt. Als er sprake was van celzetting of wrijving met de bodem, zou dit worden gevonden in het daaropvolgende trajectaanpassingsproces. Dergelijke gegevens worden verwijderd. Om de voorgestelde methode te valideren, werden twee soorten polystyreenparels met verschillende diameter (6 μm en 10 μm) getest. De kralen met een diameter van 6 μm werden gebruikt als controle. De samendrukbaarheid van kralen met een diameter van 10 μm werd verkregen als 2,37 ± 0,11 x 10-10 Pa-1, consistent met de waarde (2,1-2,4 x 10-10 Pa-1) gerapporteerd in een ander onderzoek15,24.

Op basis van deze methode werd de samendrukbaarheid van cellen en kernen gemeten. Aangezien kern een belangrijke rol speelt bij mechanosensing en mechanotransductie, kan meting van de mechanische eigenschappen van de kern helpen om beter te begrijpen hoe ze reageren op externe stimulus zoals ioniserende straling-geïnduceerde DNA-schade (figuur 8). Bovendien toonden experimenten aan dat celcompressie kan dienen als een nieuwe indicator voor het monitoren van het EMT-proces (figuur 8), waarbij de toepassingsvooruitzichten bij kankerdiagnostiek worden getoond. Omdat de akoestische stralingskracht gerelateerd is aan de celgrootte, celdichtheid en samendrukbaarheid, kan deze methode ook worden gebruikt voor celisolatie, zoals de scheiding van circulerende tumorcellen (CTC's) of hun clusters van het bloedmonster. CTC's en hun clusters spelen een belangrijke rol bij de vroege detectie van gemetastaseerde tumoren en de monitoring van de werkzaamheid van radiotherapie25,26. Daarom heeft deze methode geweldige klinische toepassingsvooruitzichten bij vroege screening en werkzaamheidsevaluatie van kanker.

Het is vermeldenswaard dat de belangrijkste factor die van invloed is op de meting van deze methode de afstemming van de resonantiefrequentie op de breedte van het microkanaal is, wat resulteert in het verschijnen van een staande golfknoop op de middellijn van het microkanaal. Tegelijkertijd moet aandacht worden besteed aan het plakken van piëzo-elektrische keramiek. Bovendien, om het traject van cellen of deeltjes nauwkeurig te identificeren en te volgen en het probleem van celaggregatie als gevolg van adhesie te voorkomen, mag de doorvoer niet te hoog zijn. Hoe veranderingen in andere parameters (zoals celgrootte, celdichtheid, enz.) de meting van samendrukbaarheid beïnvloeden, is bestudeerd in eerder werk18. Bovendien is bij het meten van celkernen, vanwege hun zachtheid, een grote akoestische stralingsdrijvende kracht nodig om ze soepel naar de middellijn van het microkanaal te laten bewegen, waardoor een snelle camera nodig is om de trajecten nauwkeurig vast te leggen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant-nummers 12075330 en U1932165) en de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong, China (Grant-nummer 2020A1515010270).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin(1x) GIBCO 15050-065
502 glue Evo-bond cyanoacrylate glue
A549 ATCC CCL-185 lung adenocarcinoma
Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit Beyotime P0027 Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  corning 10-013-CVRC
Fetal Bovine Srum(FBS) AUSGENEX FBS500-S
HCT116 ATCC CCL247 colorectal carcinoma
Heat-resistant glass Pyrex
Leibovitz’s L-15 medium  GIBCO 11415-064
MCF-7 ATCC HTB-22  breast Adenocarcinoma
MDA-MB-231 ATCC HTB-26  breast Adenocarcinoma
Minimum Essential Medium (MEM) corning 10-010-CV
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15140-122
Phosphate buffer corning 21-040-cvc
PMSF Beyotime ST506 100mM
Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere  polysciences 15714 The diameter of microshpere is 6.00µm
propidium iodide(PI) Sigma-Aldrich P4170
SYLGARD 184Silicone ELASTOMER Dow-Corning 1673921 Contains prepolymers and curing agents
Trypan Blue Beyotime C0011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  2. Frame, F. M., et al. HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells. British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).
  3. Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology. Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).
  4. Möller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium. Particle and Fibre Toxicology. 2, 7 (2005).
  5. Wang, X., et al. A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement. IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).
  6. Machida, S., et al. Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe. Nanotechnology. 21 (38), 385102 (2010).
  7. Bufi, N., et al. Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation. Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).
  8. Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
  9. Jung, J. -W., et al. Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells. European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).
  10. Hartono, D., et al. On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation. Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).
  11. Sitters, G., et al. Acoustic force spectroscopy. Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).
  12. Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -W., Bruus, H., Voldman, J. Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping. Nature Communications. 7 (1), 11556 (2016).
  13. Cushing, K. W., et al. Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples. Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).
  14. Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing. Physical Review Applied. 13 (3), 034058 (2020).
  15. Petersson, F., Aberg, L., Swärd-Nilsson, A. -M., Free Laurell, T. flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation. Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).
  16. Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zänker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
  17. Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschläger, M., Weichhart, T. Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells. Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).
  18. Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice. Biomicrofluidics. 15 (6), 064101 (2021).
  19. Zhang, Y., et al. Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).
  20. Hao, Y., et al. Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications. Biotechnology Advances. 45, 107648 (2020).
  21. Yousafzai, M., et al. Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation. Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004 (2016).
  22. Wei, M. -T., et al. A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers. Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).
  23. Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device. Biomicrofluidics. 7 (1), 011806 (2013).
  24. Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins. Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).
  25. Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. detection, and clinical implications of circulating tumor cells. EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).
  26. Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).

Tags

Kankeronderzoek Nummer 185
Meting van de samendrukbaarheid van cel en kern op basis van Acoustofluidic Microdevice
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liu,… More

Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liu, Y. Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice. J. Vis. Exp. (185), e64225, doi:10.3791/64225 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter