Traitement normalisé pour les contrôles immunohistochimiques des pastilles cellulaires fixées au formol et incorporées dans la paraffine

L’immunohistochimie (IHC) est l’un des tests les plus couramment utilisés en pathologie d’investigation et de diagnostic. Selon le contexte et le dosage, l’IHC est utilisée pour aider au diagnostic du cancer^1,2, prédire la réponse au traitement^3,4, identifier les agents pathogènes⁵, caractériser les types de cellules dans les tissus malades⁶ et étudier les voies biologiques et les réponses tissulaires ^7,8. Dans toutes les situations, le principe de base d’un test IHC est qu’un anticorps se lie spécifiquement à une cible d’intérêt, le plus souvent une protéine, et cet événement de liaison est ensuite visualisé dans une section tissulaire⁹. Cependant, l’un des plus grands défis de tout test IHC est de s’assurer que les anticorps détectent spécifiquement la cible d’intérêt¹⁰. La spécificité des anticorps est un défi dans la plupart des immunoessais, mais l’immunohistochimie offre des défis uniques en ce sens qu’il n’y a pas de mesures secondaires, telles que le poids moléculaire, pour différencier le marquage spécifique du marquage non spécifique. Ceci est particulièrement gênant lors de l’évaluation de cibles mal caractérisées ou exprimées de manière omniprésente qui manquent de modèles de localisation cellulaire bien définis. Par conséquent, des contrôles robustes qui peuvent aider à caractériser la spécificité de liaison sont essentiels lors de la mise au point d’un nouveau test IHC¹⁰.

Pour les cibles bien définies avec des modèles d’expression cellulaire caractéristiques, les contrôles tissulaires sont fréquemment utilisés dans les développements de méthodes IHC. Sur la base d’une multitude de données antérieures, on peut déterminer si l’anticorps marque le tissu, la cellule et le compartiment subcellulaire dans lequel il est connu pour être exprimé, et qu’il ne marque pas les composants tissulaires là où il ne devrait pas être présent¹¹. Cependant, les contrôles tissulaires sont d’une utilité limitée pour les nouvelles cibles mal caractérisées sans profils d’expression connus ou pour les protéines qui sont largement exprimées et qui n’ont pas de profils d’expression distincts. Dans ces deux scénarios, l’absence d’un modèle d’expression bien défini rend impossible la distinction entre l’étiquetage spécifique et non spécifique dans les tissus. Dans ces situations, les pastilles cellulaires offrent une alternative précieuse au contrôle de l’IHC. Les contrôles de granulés cellulaires peuvent inclure : le cancer ou d’autres lignées cellulaires qui ont des niveaux d’expression endogènes ou intrinsèques/non induits de la protéine d’intérêt, et dont l’expression protéique peut être caractérisée par transfert Western, analyses cytométriques en flux ou extrapolée à partir du profilage transcriptionnel; lignées cellulaires modifiées qui surexpriment la protéine d’intérêt ou dont le gène codant d’intérêt est supprimé; ou des cellules qui ont été traitées dans des conditions spécifiques pour induire l’expression de protéines ou des événements de signalisation d’intérêt (p. ex. phosphorylation)^10,12. Des niveaux d’expression protéique bien caractérisés dans les lignées cellulaires permettent également d’évaluer la sensibilité d’un essai en utilisant un panel de lignées cellulaires avec une expression protéique élevée, moyenne, faible et absente. De plus, les granules cellulaires modifiés peuvent être des contrôles spécifiques à une espèce valable pour les espèces vétérinaires, pour lesquelles la caractérisation ou les contrôles tissulaires disponibles peuvent être limités¹³. Bien que les pastilles cellulaires aient leurs limites, telles que le protéome limité présent dans les lignées cellulaires qui ne refléteront pas la diversité du protéome dans les tissus, ils servent de contrôles appropriés pour confirmer que l’anticorps peut détecter la cible d’intérêt ainsi que pour exclure la liaison aveugle par l’anticorps primaire, l’anticorps secondaire ou d’autres régents dans le test¹⁰.

La plupart des tissus en pathologie diagnostique et d’investigation sont fixés dans du formol tamponné neutre, déshydratés dans une série d’alcools, éliminés dans du xylène et traités et incorporés dans de la cire de paraffine. La fixation du formol réticulent les protéines, la fixation et chaque étape supplémentaire dans le traitement des tissus peuvent affecter directement les protéines et la capacité des anticorps à les détecter ^9,14. Par conséquent, il est important que tous les témoins utilisés dans un test IHC subissent les mêmes procédures de fixation, de traitement tissulaire et d’enrobage. Cet article décrit les considérations uniques pour traiter et intégrer des cellules cultivées pour servir de contrôles pour le développement de tests IHC dans des tissus incorporés de paraffine fixés au formol, la méthodologie se concentrant principalement sur la manipulation et le traitement de la pastille cellulaire dans un laboratoire d’histologie.

1. Préparation des granulés cellulaires

1. Dans quatre à huit fioles de 150 mm² ou huit x T175, faire pousser les cellules dans le milieu et les conditions recommandés pour la lignée cellulaire jusqu’à 80%-90% de confluence. Par exemple, cultivez 293T dans le milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10% de sérum bovin fœtal et 2 mM de L-glutamine¹⁵.
   NOTE: Les cellules doivent être cultivées en utilisant les conditions et le milieu requis pour la lignée cellulaire d’intérêt¹⁶. Ces conditions peuvent varier selon la lignée cellulaire, mais les méthodes de granulation en aval doivent être adaptables aux lignées cellulaires indépendamment des conditions de culture.
2. Une fois que les cellules sont proches de la confluence (80%-90%), aspirez le milieu de croissance avec une pipette à vide et rincez les cellules dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
3. Ajouter 5 mL de 5 à 10 mM d’EDTA dans chaque fiole et incuber les fioles à 37 °C pendant 5 à 10 min. Tapotez doucement le côté de la fiole pour déloger les cellules.
   REMARQUE: N’utilisez pas de trypsine car cela peut cliver les épitopes de surface qui auraient un impact négatif sur certains antigènes.
   1. Une fois les cellules délogées, ajouter 5 mL de milieu de croissance utilisé pour la lignée cellulaire (p. ex. DMEM pour les cellules 293T) à chaque flacon, puis transférer les cellules dans des tubes coniques de 50 mL.
4. Centrifuger les tubes coniques à 930 x g à température ambiante pendant 5 min. Après la centrifugation, retirer le média et l’EDTA par aspiration à la pipette sous vide.
5. Laver les granulés de cellules dans 10-20 mL de 1x PBS et, si plusieurs plaques ou flacons sont utilisés, regrouper les cellules des plaques ou des flacons (environ six flacons T175 dans l’expérience illustrée à la figure 1) dans un seul tube conique de 50 mL.
6. Centrifuger le tube à 930 x g pendant 5 min. Aspirer le PBS après centrifugation avec une pipette à vide.
7. Gardez le tube de granulés de la cellule sur de la glace humide jusqu’à la fixation.
   REMARQUE: Les cellules sont conservées au frais pour limiter l’activité enzymatique de dégradation et minimiser l’autolyse des cellules et les changements protéiques associés, y compris les changements dans la localisation des protéines.

2. Fixation de la pastille cellulaire

1. Effectuer la fixation en ajoutant 30 mL de formol tamponné neutre à 10 % à la pastille cellulaire de 3 mL pour créer un rapport fixateur/cellule de 10:1 (vol:vol).
2. Retourner le tube hermétiquement bouché de 50 ml à plusieurs reprises jusqu’à ce que les cellules soient complètement en suspension.
   REMARQUE: La formation d’une pastille de cellule condensée avant la fixation complète peut provoquer une fixation inégale, entraînant des artefacts lors des procédures ultérieures de coloration et d’immunomarquage.
3. Laissez la suspension cellulaire se déposer pendant la nuit à température ambiante.
4. Retournez le tube le lendemain pour remettre les cellules en suspension, en augmentant le rapport surface/volume pour améliorer la fixation.
   REMARQUE: Il n’est pas nécessaire ou recommandé de vortex de la pastille de cellule, car cela pourrait endommager la cellule.

3. Rognage et traitement des granulés cellulaires

1. Après 24 h de fixation, centrifuger le tube conique de 50 mL à 930 x g à 5 °C pendant 10-15 min. Assurez-vous que les tubes sont bien bouchés, répartis de manière égale et équilibrés dans la centrifugeuse.
   REMARQUE : Les temps de fixation peuvent être modifiés pour refléter les temps de fixation tissulaire utilisés par le laboratoire ou les exigences de conditions expérimentales particulières.
2. Après la centrifugation, s’assurer que les cellules forment une pastille visible. Retirer le fixateur par décantation et/ou aspiration prudente à l’aide d’une pipette de transfert stérile.
3. Ajouter du gel fondu (40-60 °C) à base d’hydroxyéthylagarose (voir le tableau des matières) à la pastille de cellule à un rapport gel/granulés de cellule de 1:4 (vol:vol).
4. À l’aide d’une sonde Sterling propre de 5 po et d’une pointe de 2 mm avec un œil rincé à l’eau du robinet, agiter doucement le gel fondu dans la pastille à cellules fixes, créant ainsi une suspension uniforme des cellules fixes dans du gel fondu au fond du tube conique de 50 ml (figure 1A).
5. Placer le tube conique de 50 mL recouvert avec le gel fondu mélangé à la pastille à cellules fixes sur de la glace humide pendant 5 à 10 minutes pour solidifier la pastille de cellules gélifiées.
6. À l’aide d’une micro-spatule propre, retirez délicatement la pastille du tube conique en plaçant une spatule le long du côté du tube et en tirant doucement parti de la pastille sans la percer. Placer la pastille sur du papier de biopsie.
7. À l’aide d’une microspatule propre, couper la pastille de cellule en tranches de 4 à 5 mm d’épaisseur, de sorte que chaque tranche puisse tenir dans une cassette de tissu de 26 mm x 26 mm x 5 mm (figure 1B).
8. Placez des tranches individuelles de granulés de gel au centre d’un morceau de papier de biopsie. Pliez les deux extrémités opposées du papier de biopsie sur la pastille, en l’enveloppant. Placer la pastille enveloppée dans une cassette de tissu de 26 mm x 26 mm x 5 mm. Fermez le couvercle en sercissant les côtés dépliés de l’enveloppe de biopsie à l’aide du couvercle de la cassette en tissu (figure 1C).
9. Placez la cassette de granulés de cellules taillées dans l’autoclave du processeur de tissu rempli de formol tamponné neutre à 10% et exécutez selon un calendrier de traitement court.
   NOTE: Le programme de traitement court consiste en 30 minutes dans chaque cornue en commençant par du formol tamponné neutre à 10%, déshydraté par une série d’alcools de plus en plus classés, éliminé en trois changements de xylènes et se terminant par une infiltration de paraffine en deux changements d’infiltration fondue / enrobage de paraffine à 60 °C (point de fusion de 56 °C).

4. Encastrement de granulés cellulaires

1. Placez les cassettes traitées dans la zone d’attente du centre d’encastrement.
2. Ouvrez le couvercle de la cassette en tissu et dépliez soigneusement le papier de biopsie.
3. Placez la pastille de cellule dans un petit moule d’encastrement jetable de 15 mm x 15 mm, côté coupé vers le bas.
   REMARQUE: Un petit moule d’enrobage permet de tenir jusqu’à trois sections de granulés de cellule sur une lame de tissu non colorée pour les tests IHC.
4. Tout en maintenant doucement la pastille cellulaire dans le fond du moule avec une pince, ajouter une infiltration tissulaire de 62 °C / incorporation de paraffine dans le moule, en recouvrant la pastille de cellule.
5. Déplacez le moule dans un bloc froid pour commencer à solidifier la paraffine. Ajustez les granulés de cellule pendant que la paraffine se solidifie pour les fixer dans leur position appropriée au fond du moule.
6. Retirez le couvercle de la cassette. Placez la cassette, en bas vers le bas, sur le moule d’enrobage et ajoutez de la paraffine fondue supplémentaire pour couvrir la cassette.
7. Lorsque la paraffine est remplie sur la cassette de tissu, remettre le moule dans le bloc froid pour solidifier^17,18.

5. Sectionnement du granulé cellulaire

1. Utiliser un microtome rotatif réglé à une épaisseur de section de 20 μm pour couper le bloc de pastilles de cellule jusqu’à ce que la face complète du bloc de paraffine et la pastille de cellule soient capturées dans le ruban de section de paraffine. C’est ce qu’on appelle « faire face » au bloc.
2. Refroidir et faire tremper les blocs de granulés sur un plateau de bain glacé pendant 5 à 15 minutes pour refroidir et hydrater le bloc avant la section.
   REMARQUE: Lorsque le bloc est hydraté, la pastille cellulaire sera translucide dans le ruban de paraffine. S’il est opaque, un trempage supplémentaire est nécessaire et des artefacts peuvent être présents.
3. Couper le ruban de paraffine du bloc de pastilles de la cellule à une épaisseur de 4 μm ou une autre épaisseur souhaitée en mode de coupe continue à l’aide d’un microtome rotatif.
4. Placer les rubans de paraffine sur un bain de flottaison réglé à 42 °C.
5. Ramasser les sections de paraffine préparées à l’aide du microtome rotatif du bain de flottaison sur des lames chargées positivement.
   1. Placez la première section en haut de la lame à l’intérieur de la lamelle de couverture et de la limite de coloration, en plaçant la deuxième section en dessous et la troisième section de granulés de cellule en dessous (Figure 1D).
   2. Après sectionnement, sécher les lames à température ambiante (environ 23 °C) pendant 24 h, puis 60 °C pendant 30 min.
      REMARQUE: Après cuisson des lames à 60 °C, les sections de pastilles cellulaires peuvent être utilisées avec n’importe quel protocole IHC standard, y compris les protocoles utilisant des récupérations d’antigènes induites par la chaleur et à base d’enzymes⁹.

Après l’ajout du gel à base d’agarose, la pastille cellulaire doit former une masse gélatineuse solide pouvant être manipulée (figure 1B). Une fois incorporée, la pastille aura une consistance similaire à celle d’un tissu solide et devrait être relativement facile à sectionner systématiquement sur un microtome. Une fois que les granulés cellulaires sont intégrés, ils peuvent être utilisés dans les expériences histologiques et IHC de la même manière que les tissus fixés au formol et incorporés dans la paraffine. Cela comprend l’utilisation d’épitopes induits par la chaleur ou de récupération d’antigènes enzymatiques avec des méthodes de détection chromogénique indirecte (p. ex. utilisation d’un anticorps secondaire avec détection de peroxydase de raifort et de diaminobenzidine, comme illustré à la figure 2 et à la figure 3) à l’aide de plateformes IHC commerciales9. Histologiquement, les cellules doivent être dispersées uniformément dans toute la section avec une agglutination minimale des cellules, bien que les cellules adhérentes puissent maintenir leurs interactions cellule-cellule dans la pastille. Cette dispersion permet de distinguer les cellules individuelles, bien que cette distinction soit considérablement influencée par la taille des cellules et la densité relative dans la pastille de gel. Le noyau, le cytoplasme et la membrane cellulaire sont plus distincts et plus faciles à visualiser lors de la dispersion (Figure 2). Dans la figure 2, trois lignées cellulaires sont immunomarquées pour le facteur de transcription TEAD. L’immunomarquage est visualisé avec le chromogène brun diaminobenzidine (DAB). Les lignées cellulaires ont différents niveaux d’expression du facteur de transcription TEAD, allant de l’absence d’expression (Figure 2A) à l’expression faible (Figure 2B), en passant par une expression forte (Figure 2C). Dans cet exemple, le marquage est observé dans le noyau, comme on pourrait s’y attendre d’un facteur de transcription, et est absent du cytoplasme et de la membrane cellulaire, qui sont visibles mais manquent de marquage (Figure 2). Les pastilles cellulaires peuvent être incorporées dans des puces de cellules (Figure 3) sur des lames standard de 23 mm x 75 mm x 1 mm. L’incorporation des pastilles cellulaires dans un microréseau permet d’évaluer des contrôles avec différents niveaux d’expression dans la même lame. Dans cet exemple, les cellules souches embryonnaires de souris déficientes en PEG10 (à gauche) servent de contrôle négatif et les cellules 293T qui surexpriment PEG10 (immunomarquage brun à droite) servent de contrôle positif dans la puce à ADN (Figure 3). Il n’y a pas de variation dans les procédures tissulaires et d’incorporation pour les pastilles cellulaires qui seront incluses dans les microréseaux, et les microréseaux peuvent être générés à l’aide de méthodes similaires à celles utilisées pour les tissus19.

Figure 1 : Traitement des granulés cellulaires. (A) Les cellules sont granulées dans des tubes coniques de 50 ml et mélangées au gel. (B) Une fois solidifiés, les pastilles sont tranchées en série pour tenir dans une cassette de tissu de 26 mm x 26 mm x 5 mm. (C) Les granulés cellulaires sont enveloppés dans du papier de biopsie avant d’être placés dans le processeur de tissus. (D) Jusqu’à trois pastilles de cellule peuvent être collectées en série sur une seule lame histologique en verre de 25 mm x 75 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Des granulés cellulaires avec différents niveaux d’expression de protéines ou de transcriptions peuvent être utilisés pour évaluer la plage dynamique de l’essai. Les pastilles cellulaires sont immunomarquées pour le facteur de transcription TEAD et présentent différents niveaux d’expression TEAD. (A) Les cellules DAUDI n’ont pas d’expression TEAD et n’ont pas d’immunomarquage dans le cytoplasme ou le noyau. La tache bleue est la contre-coloration de l’hématoxyline du noyau. (B) Les cellules 293T présentent un faible marquage nucléaire (chromogène brun diaminobenzidine (DAB)) du facteur de transcription TEAD. (C) Les cellules Detroit 562 expriment fortement TEAD comme démontré par le marquage brun intense dans le noyau. Le marquage dans le noyau, mais pas dans le cytoplasme (région blanc cassé à gris autour du noyau brun), démontre le marquage approprié du test d’immunohistochimie. Notez que dans les trois lignées cellulaires, les cellules sont dispersées, ce qui permet de visualiser les cellules individuelles, y compris leurs morphologies nucléaire et cytoplasmique. Barre d’échelle = 25 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Un microréseau de pastilles cellulaires créé à l’aide de plusieurs granulés cellulaires avec différents niveaux d’expression protéique permet l’évaluation simultanée des contrôles dans une seule lame. Les cellules souches embryonnaires de souris déficientes en PEG10 (à gauche) et les cellules 293T surexprimant PEG10 (à droite) sont immunomarquées pour PEG10. Alors qu’un marquage fort (chromogène DAB brun) est observé dans les cellules 293T surexprimant PEG10, aucun marquage n’est apparent dans les cellules déficientes en PEG10. Le bleu représente la contre-coloration de l’hématoxyline. Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tous les auteurs sont des employés de Genentech/ Roche et, à ce titre, sont actionnaires de Roche.