Summary
Aquí se presenta un protocolo para generar controles de pellets celulares fijados en formalina e incrustados en parafina para inmunohistoquímica.
Abstract
Los controles positivos y negativos con expresión conocida de proteínas diana son esenciales para el desarrollo de ensayos de inmunohistoquímica (IHQ). Si bien los controles tisulares son beneficiosos para proteínas bien caracterizadas con patrones definidos de expresión tisular y celular, son menos adecuados para el desarrollo inicial de ensayos IHQ para proteínas nuevas, mal caracterizadas o expresadas ubicuamente. Alternativamente, debido a su naturaleza estandarizada, los gránulos celulares, incluidas las líneas celulares cancerosas con niveles definidos de expresión de proteínas o transcripciones (por ejemplo, expresión alta, media y baja), líneas celulares transfectadas que sobreexpresan o líneas celulares con genes eliminados a través de tecnologías de ingeniería celular como CRISPR, pueden servir como controles valiosos, especialmente para la caracterización y selección inicial de anticuerpos. Para que estos gránulos celulares se utilicen en el desarrollo de ensayos IHQ para tejidos fijados en formalina e incrustados en parafina, deben procesarse e incrustarse de una manera que recapitule los procedimientos utilizados para el procesamiento de tejidos. Este protocolo describe un proceso para crear y procesar controles de pellets de células fijadas en formalina e incrustadas en parafina que se pueden usar para el desarrollo de métodos IHQ.
Introduction
La inmunohistoquímica (IHC) es uno de los ensayos más utilizados en patología de investigación y diagnóstico. Dependiendo del contexto y del ensayo, la IHQ se utiliza para ayudar en el diagnóstico del cáncer1,2, predecir la respuesta al tratamiento 3,4, identificar patógenos5, caracterizar tipos de células en tejidos enfermos6 y estudiar vías biológicas y respuestas tisulares 7,8. En todas las situaciones, el principio básico de un ensayo IHQ es que un anticuerpo se une específicamente a un objetivo de interés, más comúnmente una proteína, y este evento de unión se visualiza posteriormente enuna sección 9 de tejido. Sin embargo, uno de los mayores desafíos de cualquier ensayo IHQ es asegurar que los anticuerpos detecten específicamente el objetivo de interés10. La especificidad de anticuerpos es un desafío en la mayoría de los inmunoensayos, pero la inmunohistoquímica ofrece desafíos únicos en el sentido de que no hay medidas secundarias, como el peso molecular, para diferenciar entre el etiquetado específico y no específico. Esto es particularmente problemático cuando se evalúan objetivos mal caracterizados o expresados ubicuamente que carecen de patrones de localización celular bien definidos. Por lo tanto, los controles robustos que pueden ayudar a caracterizar la especificidad de unión son críticos al desarrollar un nuevo ensayo IHQ10.
Para objetivos que están bien definidos con patrones de expresión celular característicos, los controles tisulares se utilizan con frecuencia en los desarrollos de métodos IHQ. Sobre la base de una gran cantidad de datos previos, se puede determinar si el anticuerpo está marcando el tejido, la célula y el compartimiento subcelular en el que se sabe que se expresa, y que no está marcando componentes tisulares donde no debería estar presente11. Sin embargo, los controles tisulares son de uso limitado para objetivos nuevos y mal caracterizados sin patrones de expresión conocidos o para proteínas que se expresan ampliamente y carecen de patrones de expresión distintos. En ambos escenarios, la falta de un patrón de expresión bien definido hace imposible discriminar el etiquetado específico del no específico en los tejidos. En estas situaciones, los gránulos celulares ofrecen una valiosa alternativa de control de IHQ. Los controles de pellets celulares pueden incluir: cáncer u otras líneas celulares que tienen niveles de expresión endógenos o intrínsecos/no inducidos de la proteína de interés, y cuya expresión proteica puede caracterizarse mediante western blotting, análisis citométricos de flujo o extrapolarse a partir del perfil transcripcional; líneas celulares diseñadas que sobreexpresan la proteína de interés o tienen el gen codificante de interés eliminado; o células que han sido tratadas bajo condiciones específicas para inducir la expresión de proteínas o eventos de señalización de interés (por ejemplo, fosforilación)10,12. Los niveles de expresión de proteínas bien caracterizados en líneas celulares también permiten la evaluación de la sensibilidad de un ensayo mediante el uso de un panel de líneas celulares con expresión de proteínas alta, media, baja y ausente. Además, los pellets de células modificadas pueden ser valiosos controles específicos de especies para especies veterinarias, para las cuales puede haber una caracterización limitada o controles tisulares disponibles13. Si bien los gránulos celulares tienen sus limitaciones, como el proteoma limitado presente en las líneas celulares que no reflejará el proteoma diverso en los tejidos, sirven como controles adecuados para confirmar que el anticuerpo puede detectar el objetivo de interés, así como para descartar la unión indiscriminada del anticuerpo primario, el anticuerpo secundario u otros regentes en el ensayo10.
La mayoría de los tejidos en patología diagnóstica e investigadora se fijan en formalina tamponada neutra, se deshidratan en una serie de alcoholes, se eliminan en xileno y se procesan e incrustan en cera de parafina. La fijación de formalina reticula proteínas, y la fijación y cada paso adicional en el procesamiento de tejidos pueden afectar directamente a las proteínas y la capacidad de los anticuerpos para detectarlas 9,14. Por lo tanto, es importante que cualquier control utilizado en un ensayo IHQ se someta a los mismos procedimientos de fijación, procesamiento de tejidos e incrustación. Este artículo describe las consideraciones únicas para procesar e incrustar células cultivadas para servir como controles para desarrollar ensayos de IHQ en tejidos embebidos en parafina fijada en formalina, con la metodología centrada principalmente en el manejo y procesamiento del pellet celular en un laboratorio de histología.
Protocol
1. Preparación de pellets celulares
- En cuatro a ocho matraces de 150 mm2 u ocho x T175, cultivar células en el medio y las condiciones recomendadas para la línea celular al 80%-90% de confluencia. Por ejemplo, cultive células 293T en el Medio de Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco con 10% de suero bovino fetal y 2 mM de L-glutamina15.
NOTA: Las células deben cultivarse utilizando las condiciones y el medio requeridos para la línea celular de interés16. Estas condiciones pueden variar dependiendo de la línea celular, pero los métodos de peletización aguas abajo deben ser adaptables para líneas celulares independientemente de las condiciones de cultivo. - Una vez que las células estén cerca de la confluencia (80%-90%), aspire los medios de crecimiento con una pipeta de vacío y enjuague las células en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Añadir 5 ml de 5-10 mM de EDTA a cada matraz e incubar los matraces a 37 °C durante 5-10 min. Golpee suavemente el costado del matraz para desalojar las células.
NOTA: No use tripsina ya que esto puede escindir epítopos superficiales que afectarían negativamente a algunos antígenos.- Una vez que las células se hayan desprendido, agregue 5 ml de medios de crecimiento utilizados para la línea celular (por ejemplo, DMEM para células 293T) a cada matraz, luego transfiera las células a tubos cónicos de 50 ml.
- Centrifugar los tubos cónicos a 930 x g a temperatura ambiente durante 5 min. Después de la centrifugación, retire el medio y el EDTA mediante aspiración de pipeta al vacío.
- Lave los gránulos celulares en 10-20 ml de 1x PBS y, si se usan múltiples placas o matrazs, agrupe las células de las placas o matraces (aproximadamente seis matraces T175 en el experimento representado en la Figura 1) en un solo tubo cónico de 50 ml.
- Centrifugar el tubo a 930 x g durante 5 min. Aspirar el PBS después de la centrifugación con una pipeta de vacío.
- Mantenga el tubo de pellets de células en hielo húmedo hasta la fijación.
NOTA: Las células se mantienen refrigeradas para limitar la actividad enzimática degradativa y minimizar la autólisis de las células y los cambios de proteínas asociados, incluidos los cambios en la localización de proteínas.
2. Fijación del pellet celular
- Realice la fijación agregando 30 ml de formalina tamponada neutra al 10% a un pellet de celda de 3 ml para crear una proporción fijadora a célula 10: 1 (vol: vol).
- Invierta el tubo de 50 ml bien tapado repetidamente hasta que las células estén completamente en suspensión.
NOTA: La formación de un gránulo de células condensadas antes de la fijación completa puede causar una fijación desigual, lo que resulta en artefactos durante los procedimientos posteriores de tinción e inmunomarcado. - Deje que la suspensión celular se asiente durante la noche a temperatura ambiente.
- Vuelva a invertir el tubo al día siguiente para resuspender las células, aumentando la relación superficie-volumen para mejorar la fijación.
NOTA: No se requiere ni recomienda vortexing de la bolita celular, ya que puede provocar daños celulares.
3. Recorte y procesamiento de pellets celulares
- Después de 24 h de fijación, centrifugar el tubo cónico de 50 ml a 930 x g a 5 °C durante 10-15 min. Asegúrese de que los tubos estén bien tapados, distribuidos equitativamente y equilibrados en la centrífuga.
NOTA: Los tiempos de fijación pueden modificarse para reflejar los tiempos de fijación tisular utilizados por el laboratorio o los requisitos de condiciones experimentales específicas. - Después de la centrifugación, asegúrese de que las células formen un pellet visible. Retirar el fijador decantando y/o aspirando cuidadosamente con pipeta de transferencia estéril.
- Agregue gel fundido (40-60 °C) a base de hidroxietil agarosa (consulte la Tabla de materiales) a la gránula celular en una proporción de gel a gel a gránulos de celda de 1:4 (vol:vol).
- Usando una sonda Sterling limpia de 5 pulgadas y 2 mm con un ojo enjuagado con agua del grifo, revuelva suavemente el gel fundido en el pellet de celda fija, creando una suspensión uniforme de células fijas en gel fundido en el fondo del tubo cónico de 50 ml (Figura 1A).
- Coloque el tubo cónico tapado de 50 ml con el gel fundido mezclado con pellet de celda fija en hielo húmedo durante 5-10 minutos para solidificar el pellet de celda gelificada.
- Usando una microespátula limpia, retire cuidadosamente el pellet del tubo cónico colocando una espátula a lo largo del costado del tubo y aprovechando suavemente el pellet sin perforarlo. Coloque el pellet en papel de biopsia.
- Usando una microespátula limpia, recorte el pellet celular en rodajas de 4-5 mm de espesor, de modo que cada rebanada pueda caber en un casete de tejido de 26 mm x 26 mm x 5 mm (Figura 1B).
- Coloque rodajas individuales de gránulos en el centro de un pedazo de papel de biopsia. Doble los dos extremos opuestos del papel de biopsia sobre el gránulo, envolviéndolo. Coloque el pellet envuelto en un cassette de tejido de 26 mm x 26 mm x 5 mm. Cierre la tapa, engarzando los lados desplegados de la envoltura de biopsia con la tapa del casete de tejido (Figura 1C).
- Coloque el casete de pellets de células recortadas en la retorta del procesador de tejidos llena de formalina tamponada neutra al 10% y ejecútela en un programa de procesamiento corto.
NOTA: El breve programa de procesamiento consiste en 30 minutos en cada retorta comenzando con formalina tamponada neutra al 10%, deshidratada a través de una serie de alcoholes cada vez más clasificados, eliminada en tres cambios de xilenos, y terminando con infiltración de parafina en dos cambios de infiltración fundida/incrustación de parafina a 60 °C (punto de fusión de 56 °C).
4. Incrustación de pellet celular
- Coloque los casetes procesados en el área de retención del centro de incrustación.
- Abra la tapa del cassette de tejido y despliegue cuidadosamente el papel de biopsia.
- Coloque el pellet de celda en un pequeño molde desechable de 15 mm x 15 mm, con el lado cortado hacia abajo.
NOTA: Un pequeño molde de incrustación permite que quepan hasta tres secciones de pellets de células en un portaobjetos de tejido sin teñir para ensayos IHQ. - Mientras sostiene suavemente el pellet celular en el fondo del molde con fórceps, agregue 62 °C de infiltración de tejido / parafina incrustada en el molde, cubriendo el pellet celular.
- Mueva el molde a un bloque frío para comenzar a solidificar la parafina. Ajuste los gránulos de celda mientras la parafina se solidifica para fijarlos en su posición adecuada en el fondo del molde.
- Retire la tapa del cassette. Coloque el cassette, de abajo hacia abajo, encima del molde de incrustación y agregue parafina fundida adicional para cubrir el cassette.
- Cuando la parafina se llene sobre el casete de tejido, devuelva el molde al bloque frío para solidificar17,18.
5. Seccionamiento de pellets celulares
- Utilice un conjunto de micrótomo rotativo con un grosor de sección de 20 μm para recortar el bloque de pellets de celda hasta que la cara completa del bloque de parafina y el pellet de celda se capturen en la cinta de sección de parafina. Esto se denomina "enfrentar" el bloque.
- Enfríe y remoje los bloques de pellets en una bandeja de baño de hielo durante 5-15 minutos para enfriar e hidratar el bloque antes de seccionar.
NOTA: Cuando el bloque está hidratado, el pellet celular será translúcido en la cinta de parafina. Si es opaco, se requiere más remojo y los artefactos pueden estar presentes. - Seccionar la cinta de parafina del bloque de pellets de celda a un espesor de 4 μm u otro espesor deseado en modo de corte continuo utilizando un micrótomo rotativo.
- Colocar las cintas de parafina en un baño de flotación con agua a 42 °C.
- Recoja las secciones de parafina preparadas con el microtomo rotativo del baño de flotación en portaobjetos cargados positivamente.
- Coloque la primera sección en la parte superior de la diapositiva dentro del cubreobjetos y el límite de tinción, colocando la segunda debajo de ella y la tercera sección de pellets de celda debajo de ella (Figura 1D).
- Después de seccionar, secar los portaobjetos a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) durante 24 h, seguido de 60 °C durante 30 min.
NOTA: Después de hornear los portaobjetos a 60 °C, las secciones de pellets celulares se pueden utilizar con cualquier protocolo IHQ estándar, incluidos los protocolos que utilizan recuperaciones de antígenos inducidos por calor y basados en enzimas9.
Representative Results
Tras la adición del gel a base de agarosa, el pellet celular debe formar una masa gelatinosa sólida susceptible de manipulación (Figura 1B). Una vez incrustado, el pellet tendrá una consistencia similar a un tejido sólido, y debe ser relativamente fácil de seccionar rutinariamente en un micrótomo. Una vez que los gránulos celulares están incrustados, se pueden usar en experimentos de histología e IHQ de manera idéntica a los tejidos fijados en formalina e incrustados en parafina. Esto incluye el uso de epítopos inducidos por calor o recuperación de antígeno enzimático con métodos de detección cromogénica indirecta (por ejemplo, utilizando un anticuerpo secundario con detección de peroxidasa de rábano picante y diaminobencidina como se muestra en la Figura 2 y Figura 3) utilizando plataformas comerciales IHQ9. Histológicamente, las células deben dispersarse uniformemente por toda la sección con una aglutinación celular mínima, aunque las células adherentes pueden mantener sus interacciones célula-célula en el pellet. Esta dispersión permite la distinción entre células individuales, aunque esta distinción estará significativamente influenciada por el tamaño de la célula y la densidad relativa dentro del gel de pellet. El núcleo, el citoplasma y la membrana celular son más distintos y fáciles de visualizar tras la dispersión (Figura 2). En la Figura 2, tres líneas celulares están inmunomarcadas para el factor de transcripción TEAD. El inmunomarcaje se visualiza con el cromógeno diaminobencidina marrón (DAB). Las líneas celulares tienen diferentes niveles de expresión del factor de transcripción TEAD, que van desde ninguna expresión (Figura 2A) hasta expresión débil (Figura 2B) y expresión fuerte (Figura 2C). En este ejemplo, el etiquetado se observa en el núcleo, como cabría esperar de un factor de transcripción, y está ausente del citoplasma y la membrana celular, que son visibles pero carecen de etiquetado (Figura 2). Los pellets celulares se pueden incorporar en microarrays de pellets celulares (Figura 3) en portaobjetos estándar de 23 mm x 75 mm x 1 mm. La incorporación de los pellets celulares en un microarray permite la evaluación de controles con diferentes niveles de expresión en el mismo portaobjetos. En este ejemplo, las células madre embrionarias de ratón deficientes en PEG10 (izquierda) sirven como control negativo y las células 293T que sobreexpresan PEG10 (derecha, inmunomarcaje marrón) sirven como un control positivo en la micromatriz (Figura 3). No hay variación en los procedimientos de tejido e incrustación para los gránulos celulares que se incluirán en los microarrays, y los microarrays pueden generarse utilizando métodos similares a los utilizados para los tejidos19.
Figura 1: Procesamiento de pellets celulares . (A) Las células se peletizan en tubos cónicos de 50 ml y se mezclan con el gel. (B) Una vez solidificados, los pellets se cortan en serie para caber en un casete de tejido de 26 mm x 26 mm x 5 mm. (C) Los gránulos de células se envuelven en papel de biopsia antes de colocarlos en el procesador de tejidos. (D) Se pueden recolectar en serie hasta tres gránulos celulares en un solo portaobjetos histológicos de vidrio de 25 mm x 75 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Se pueden usar gránulos celulares con diferentes niveles de expresión de proteínas o transcripciones para evaluar el rango dinámico del ensayo. Los gránulos celulares están inmunomarcados para el factor de transcripción TEAD y demuestran niveles variables de expresión de TEAD. (A) Las células DAUDI carecen de expresión TEAD y no tienen inmunomarcaje en el citoplasma o el núcleo. La tinción azul es la contratinción de hematoxilina del núcleo. (B) Las células 293T demuestran un marcado nuclear débil (cromogen diaminobencidina marrón [DAB]) del factor de transcripción TEAD. (C) Las células Detroit 562 expresan fuertemente TEAD como lo demuestra el marcado marrón intenso en el núcleo. El etiquetado dentro del núcleo, pero no en el citoplasma (región blanquecina a gris alrededor del núcleo marrón), demuestra el etiquetado apropiado del ensayo inmunohistoquímico. Tenga en cuenta que en las tres líneas celulares, las células están dispersas, lo que permite la visualización de células individuales, incluidas sus morfologías nucleares y citoplasmáticas. Barra de escala = 25 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El microarray de pellets celulares creado mediante el uso de múltiples pellets celulares con diferentes niveles de expresión de proteínas permite la evaluación simultánea de los controles en un solo portaobjetos. Las células madre embrionarias de ratón deficientes en PEG10 (izquierda) y las células 293T que sobreexpresan PEG10 (derecha) están inmunomarcadas para PEG10. Si bien se observa un marcado fuerte (cromogen DAB marrón) en las células 293T que sobreexpresan PEG10, no hay marcado aparente en las células deficientes en PEG10. El azul representa la contratinción de hematoxilina. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Este protocolo describe una metodología para generar gránulos celulares fijados en formalina e incrustados en parafina que pueden usarse como controles para estudios de inmunohistoquímica e hibridación in situ aguas abajo. Las metodologías histológicas descritas en este protocolo son aplicables a una amplia gama de cánceres y líneas celulares primarias, y principalmente adapta las técnicas histológicas de rutina para producir estos gránulos17,18. Cuando se procesan e incrustan, los gránulos se pueden usar de manera similar a los tejidos. Esto incluye usarlos con protocolos de recuperación de antígenos enzimáticos e inducidos por calor para experimentos de inmunohistoquímica. Uno de los objetivos de las metodologías utilizadas en este protocolo es preservar la morfología y antigenicidad de las células durante todo el proceso. Por lo tanto, el EDTA, que es relativamente suave en términos de cambios tanto en la morfología como en la antigenicidad, se utiliza para separar las células. Esto no quiere decir que otros enfoques, como la interrupción física, no sean viables; Sin embargo, cualquier enfoque para separar las células debe garantizar que las células no se lesionen en el proceso. El segundo objetivo de este protocolo es fijar y procesar las células de manera similar a los tejidos, utilizando el mismo fijador, relación de fijación, programa de procesamiento (fijación, deshidratación, limpieza e infiltración de parafina) y técnicas de incrustación, para que puedan servir como controles comparables para ensayos posteriores. Por lo tanto, los enfoques de fijación y procesamiento utilizados para generar gránulos celulares deben imitar los enfoques utilizados para los tejidos.
El protocolo descrito en este informe no está adaptado para manejar células con agentes infecciosos, como células infectadas con bacterias o virus patógenos, ya que las células se desprenden, recolectan y centrifugan antes de la fijación. Los investigadores podrían considerar protocolos para arreglar las células antes del desprendimiento, pero esto requeriría una mayor optimización para recolectar las células sin alterar la morfología celular. Además, los tiempos de fijación y las condiciones de manipulación de las células con agentes infecciosos requieren consideraciones adicionales basadas en el agente infeccioso y los protocolos institucionales de bioseguridad asociados.
Los gránulos celulares fijados en formalina e incrustados en parafina son excepcionalmente ventajosos para tener niveles de expresión de proteínas bien definidos10. Mientras que el cáncer y las líneas celulares endógenas ofrecen una selección de células con diferentes niveles de expresión de proteínas, las tecnologías de ingeniería genética permiten a los científicos modelar la expresión de proteínas, a través de la sobreexpresión de proteínas de interés y el uso de tecnologías CRISPR para extirpar o insertar genes codificadores de interés20,21 . La desventaja de las proteínas sobreexpresadas en líneas celulares es que son medidas pobres para la sensibilidad de un ensayo, ya que pueden no representar niveles endógenos de proteínas22. Por el contrario, tanto las líneas celulares endógenas como las líneas celulares cancerosas pueden representar mejor los niveles de expresión endógena, y la eliminación mediada por CRISPR del gen codificante en una línea afín puede servir como un control negativo correspondiente. Además, las líneas celulares endógenas o líneas celulares cancerosas con niveles variables de expresión de proteínas son ideales para los experimentos de titulación para elegir diluciones finales de anticuerpos y comprender mejor la sensibilidad de un ensayo (Figura 2). La decisión sobre qué líneas celulares usar debe basarse en las necesidades experimentales individuales y, a menudo, utilizará una combinación de enfoques.
Además de evaluar si un anticuerpo puede detectar la proteína de interés, se puede utilizar un panel de líneas celulares para definir la especificidad de un anticuerpo. Por ejemplo, un panel de líneas celulares que expresan individualmente una familia de proteínas estrechamente relacionadas se puede usar para probar si un anticuerpo es específico para una proteína individual o si también detecta otras proteínas estrechamente relacionadas. Los controles más elaborados pueden implicar el uso de líneas celulares que expresan, ya sea a través de CRISPR knock-in o a través de sobreexpresión, proteínas con mutaciones puntuales que no pueden someterse a eventos de señalización específicos que se están detectando (por ejemplo, mutación en sitios específicos de fosforilación al evaluar un anticuerpo fosfo-específico). Si bien estos son enfoques más complejos, pueden ser necesarios para confirmar que el anticuerpo usó solo etiquetas en circunstancias específicas10.
Es importante tener en cuenta que las manipulaciones genéticas de líneas celulares podrían no generar una población celular homogénea. Por ejemplo, la eficiencia de la transfección en la sobreexpresión de líneas celulares generalmente no es del 100% y algunas células pueden no sobreexpresar la proteína de interés. La inclusión de FLAG o una etiqueta relacionada en la transfección que pueda detectarse con métodos estándar puede ser útil para evaluar la eficiencia de transfección de la línea celular23. Esto puede ser útil tanto para determinar si la transfección fue exitosa y descartar una falta de detección debido a la expresión de proteínas, como para servir como referencia para la proporción esperada de células que deben expresar la proteína de interés.
La hibridación in situ (ISH) también puede ser una herramienta beneficiosa para caracterizar la expresión génica diana en gránulos celulares e informar el desarrollo del método IHQ10. Al examinar los anticuerpos, puede ser informativo saber cuándo se puede detectar la transcripción y, por lo tanto, la proteína potencial. Además, la detección de ISH de pellets celulares puede ser beneficiosa para el desarrollo del método ISH. Si bien la especificidad es con menos frecuencia un problema para los ensayos de ISH, sigue siendo importante tener controles apropiados y consideraciones similares para el desarrollo y la utilización de controles que se puedan aplicar a los estudios de ISH.
Las micromatrices de tejido se crean eliminando núcleos de bloques donantes y transfiriendo estos núcleos, a menudo en un patrón de cuadrícula, a un bloque de parafina receptor. Al final, el bloque receptor contiene un espectro de muestras en un solo bloque, lo que permite que todas las muestras del bloque pasen por procedimientos IHQ idénticos y permite la comparación directa de múltiples muestras en la misma diapositiva24,25. Dado que los pellets celulares son poblaciones relativamente uniformes, pueden representarse con precisión mediante núcleos de 1 mm, lo que los convierte en candidatos ideales para su inclusión en matrices similares. Usando una matriz de pellets celulares, es posible incluir pellets celulares con diferentes niveles de expresión, pellets celulares que expresan de manera única proteínas relacionadas y pellets celulares que expresan ortólogos de la proteína de interés de diferentes especies en un solo portaobjetos (Figura 3). Esto permite que todos los pellets celulares sean evaluados simultáneamente en condiciones uniformes de manera rápida, minimizando el uso de reactivos25.
Para este protocolo se recomienda un volumen mínimo de pellets de células iniciales de 2 ml recogidos de ocho matraces T175. Este volumen permite la producción y el archivo de múltiples bloques de pellets celulares, de modo que los controles de pellets celulares se pueden estandarizar durante períodos de tiempo más largos y se pueden crear múltiples matrices de pellets celulares a partir de un pellet determinado. Se pueden utilizar volúmenes de pellets celulares más bajos cuando se trata de líneas celulares primarias derivadas de pacientes, líneas celulares de crecimiento lento o cuando las condiciones limitan el volumen de la muestra. Por supuesto, los volúmenes iniciales más bajos potenciarán el impacto negativo de cualquier pérdida celular durante la fijación y preparación del pellet y limitarán el material disponible para los procesos posteriores. Es especialmente importante tener cuidado al retirar el fijador después de la centrifugación, para minimizar cualquier pérdida asociada. Para volúmenes de muestra más bajos, se puede usar un tubo centrífugo tapado de 1,5 ml para granular las células. Estos tubos se pueden dividir longitudinalmente con una cuchilla para su procesamiento.
Similar a la fijación tisular, la fijación celular dentro de este pellet es crítica para las evaluaciones posteriores de IHQ. Para lograr una fijación completa, utilizamos al menos una proporción de formalina a pellet celular de 10: 1 e invertimos el tubo cónico para mantener las células en suspensión. Si las células no están en suspensión en el momento de la fijación, existe el riesgo de una fijación incompleta o inadecuada, lo que afectará el inmunomarcaje posterior. A menudo esto se manifiesta como un fuerte etiquetado en la periferia y pérdida de etiquetado en el centro del pellet o etiquetado de intensidad variable en todo el pellet.
Este protocolo utiliza Histogel, que se compone principalmente de hidroxietil agarosa, tanto para unir el pellet celular como para permitir que las células se distribuyan uniformemente por todo el pellet celular. Sin ella, las células se compactan y pierden sus detalles citomorfológicos. Estos detalles citomorfológicos a menudo son importantes durante la detección de anticuerpos, ya que proporcionan información adicional sobre si el anticuerpo se está marcando en el compartimiento subcelular apropiado (por ejemplo, el núcleo, el citoplasma o la membrana plasmática). Por el contrario, demasiado gel puede resultar en densidades celulares más bajas dentro del pellet, lo que lleva a que las células se distribuyan ampliamente y reduzcan el número de células por sección.
Este protocolo se puede utilizar de forma rutinaria para desarrollar controles IHQ. Los materiales necesarios para crear estos gránulos son comunes en los laboratorios de investigación de biología e histología, y los métodos son sencillos y fáciles de adaptar. Si bien los gránulos celulares tienen limitaciones como controles IHQ, sirven como excelentes herramientas para la detección inicial de anticuerpos y complementan otros controles de tejidos.
Disclosures
Todos los autores son empleados de Genentech/ Roche y, como tales, son accionistas de Roche.
Acknowledgments
Nos gustaría reconocer la colaboración de nuestros colegas en la organización de investigación de Genentech, y especialmente los laboratorios centrales de patología (P-core) que contribuyeron al desarrollo de estos métodos a lo largo de los años.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| 50 mL Conical Tube | Becton Dickinson Labware | #0747-1886 | |
| 70% Ethanol | Koptec | V1401 | |
| 95% Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Biopsy Wraps | Surgipath Medical Industries, Inc | #01090 | |
| Costar Stripette serological pipette 10mL | Corning | CLS4101 | |
| Flex 100 | Epredia | 8101 | |
| Flex 95 | Epredia | 8201 | |
| Histogel | Thermo Scientific | #R904012 | |
| Leica Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| Micro Spatula, rounded and tapered ends | Tedd Pella | #13510 | |
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin | Surgipath | 39601006 | |
| Pipette Controller | CAPP | PA-100 | |
| Reagent Alcohol | Epredia | 9111 | |
| Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | #RS-9522 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette | Epredia | B851120WH | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHistech LTD | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
- Wennerberg, A. E., Nalesnik, M. A., Coleman, W. B. Hepatocyte paraffin 1: a monoclonal antibody that reacts with hepatocytes and can be used for differential diagnosis of hepatic tumors. American Journal of Pathology. 143 (4), 1050-1054 (1993).
- Chu, P. G., Ishizawa, S., Wu, E., Weiss, L. M. Hepatocyte antigen as a marker of hepatocellular carcinoma. American Journal of Surgical Pathology. 26 (8), 978-988 (2002).
- Cobleigh, M. A., et al. Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. Journal of Clinical Oncology. 17 (9), 2639-2648 (1999).
- Vogel, C. L., et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 719-726 (2002).
- Webster, J. D., Miller, M. A., DuSold, D., Ramos-Vara, J. A. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Veterinary Pathology. 47 (3), 529-535 (2010).
- Havnar, C., et al. Characterization of tumor-immune microenvironment by high-throughput image analysis of CD8 immunohistochemistry combined with modified Masson's trichrome. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 69 (9), 611-615 (2021).
- Newton, K., et al. RIPK1 inhibits ZPB1-driven necroptosis during development. Nature. 540 (7631), 129-133 (2016).
- Webster, J. D., Solon, M., Haller, S., Newton, K. Detection of necroptosis by phospho-RIPK3 immunohistochemical labeling. Methods in Molecular Biology. 1857, 153-160 (2018).
- Ramos, J. A., Miller, M. A., et al. When antibodies and antigens get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry-the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
- Webster, J. D., Solon, M., Gibson-Corley, K. N. Validating immunohistochemistry assay specificity in investigative studies: consideration for a weight of evidence approach. Veterinary Pathology. 58 (5), 829-840 (2021).
- Ramos-Vara, J. A., et al. American association of veterinary laboratory diagnosticians subcommittee on standardization of immunohistochemistry suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary diagnostic laboratories. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (4), 393-413 (2008).
- Dominguez, S., et al. Genetic inactivation of RIP1 kinase does not ameliorate disease in a mouse model of ALS. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 915-931 (2021).
- Lean, F. Z. X., et al. Differential susceptibility of SARS-CoV-2 in animals: evidence of ACE2 host receptor distribution in companion animals, livestock and wildlife by immunohistochemical characterization. Transboundary and Emerging Disease. , 14232 (2021).
- Dunstan, R. W., Wharton, K. A., Quigley, C., Lowe, A. The use of immunohistochemistry for biomarker assessment-can it compete with other technologies. Toxicologic Pathology. 39 (6), 988-1002 (2011).
- Atcc.org. , Available from: http://www.atcc.org (2022).
- Thermo Fisher Scientific. Cell Culture Basics Handbook. , Gibco. (2020).
- Carson, F. Histotechnology: A Self-Instructional Text, 2nd Ed. , ASCP Press. Chicago, IL. (1997).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Tissue Processing. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Ed. Spencer, L. T., Bancroft, J. D. , Churchill Livingstone-Elsevier. China. (2013).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G. Tissue Microarrays. Cancer Gene Profiling. , Humana Press. New York. 53-65 (2016).
- Jinek, M., et al. Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Ferrando, R., Newton, K., Chu, F., Webster, J., French, D. Immunohistochemical detection of FLAG-tagged endogenous proteins in knock-in mice. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (4), 244-255 (2015).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nature Medicine. 4 (7), 844-847 (1998).
- Moch, H., Kononen, J., Kallioniemi, O. P., Sauter, G. Tissue microarrays: what will they bring to molecular and anatomic pathology. Advances in Anatomic Pathology. 8 (1), 14-20 (2001).
