Summary
מוצג כאן פרוטוקול ליצירת בקרות כדוריות תאים קבועות בפורמלין, משובצות פרפין, לאימונוהיסטוכימיה.
Abstract
בקרות חיוביות ושליליות עם ביטוי ידוע של חלבוני מטרה חיוניות לפיתוח מבחני אימונוהיסטוכימיה (IHC). בעוד שבקרות רקמות מועילות לחלבונים המאופיינים היטב עם דפוסי ביטוי מוגדרים של רקמות ותאיים, הם פחות מתאימים לפיתוח הראשוני של מבחני IHC עבור חלבונים חדשים, בעלי אפיון גרוע או בעלי ביטוי בכל מקום. לחלופין, בשל האופי המתוקנן שלהם, כדורי תאים, כולל קווי תאים סרטניים עם רמות ביטוי מוגדרות של חלבון או תעתיק (למשל, ביטוי גבוה, בינוני ונמוך), קווי תאים המבטאים יתר על המידה, או קווי תאים עם גנים שנמחקו באמצעות טכנולוגיות הנדסת תאים כמו קריספר, יכולים לשמש כבקרות בעלות ערך, במיוחד עבור אפיון הנוגדנים הראשוני ובחירתם. על מנת שכדוריות תאים אלה ישמשו בפיתוח מבחני IHC לרקמות קבועות פורמלין, משובצות פרפין, יש לעבד ולהטמיע אותן באופן המשחזר את ההליכים המשמשים לעיבוד רקמות. פרוטוקול זה מתאר תהליך ליצירה ועיבוד של בקרות כדוריות תאים קבועות פורמלין, משובצות פרפין, שניתן להשתמש בהן לפיתוחים של שיטות IHC.
Introduction
אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא אחד המבחנים הנפוצים ביותר בפתולוגיה חקירתית ואבחנתית. בהתאם להקשר ולבדיקה, IHC משמש כדי לסייע באבחון סרטן1,2, לחזות את תגובת הטיפול3,4, לזהות פתוגנים5, לאפיין סוגי תאים ברקמות חולות6, ולחקור מסלולים ביולוגיים ותגובות רקמות 7,8. בכל המצבים, העיקרון הבסיסי של בדיקת IHC הוא שנוגדן נקשר באופן ספציפי למטרה מעניינת, לרוב חלבון, ואירוע קשירה זה מודגם לאחר מכן בסעיףרקמה 9. עם זאת, אחד האתגרים הגדולים ביותר של כל בדיקת IHC הוא להבטיח שהנוגדנים מזהים באופן ספציפי את היעד של עניין10. ספציפיות הנוגדנים היא אתגר ברוב הבדיקות החיסוניות, אך אימונוהיסטוכימיה מציעה אתגרים ייחודיים בכך שאין מדדים משניים, כגון משקל מולקולרי, כדי להבדיל בין תיוג ספציפי ללא ספציפי. זה מטריד במיוחד כאשר מעריכים מטרות שאינן מאופיינות היטב או מבוטאות בכל מקום, חסרות דפוסי לוקליזציה תאית מוגדרים היטב. לכן, פקדים חזקים שיכולים לעזור לאפיין ספציפיות מחייבת הם קריטיים בעת פיתוח מבחן IHCחדש 10.
עבור מטרות המוגדרות היטב עם דפוסי ביטוי תאיים אופייניים, בקרות רקמות משמשות לעתים קרובות בפיתוחים של שיטות IHC. בהתבסס על שפע של נתונים קודמים, ניתן לקבוע אם הנוגדן מסמן את הרקמה, התא והתא התת-תאי שבו הוא ידוע כמתבטא, וכי הוא אינו מתייג רכיבי רקמה שבהם הוא לא אמור להיות נוכח11. עם זאת, בקרות רקמות הן בעלות שימוש מוגבל עבור מטרות חדשניות המאופיינות בצורה גרועה ללא דפוסי ביטוי ידועים או עבור חלבונים המתבטאים באופן נרחב וחסרים דפוסי ביטוי מובחנים. בשני התרחישים הללו, היעדר דפוס ביטוי מוגדר היטב אינו מאפשר להבחין בין תיוג ספציפי לתיוג לא ספציפי ברקמות. במצבים אלה, כדורי התא מציעים שליטה חלופית רבת ערך ב- IHC. בקרות גלולות תאים יכולות לכלול: סרטן או קווי תאים אחרים שיש להם רמות ביטוי אנדוגניות או פנימיות/לא מושרות של החלבון המעניין, ושביטוי החלבון שלהם יכול להיות מאופיין על ידי כתם מערבי, ניתוחים ציטומטריים של זרימה, או אקסטרפולציה מתוך פרופיל שעתוק; קווי תאים מהונדסים שמבטאים יתר על המידה את החלבון המעניין או מוחקים את הגן המקודד המעניין; או תאים שטופלו בתנאים מסוימים כדי לגרום לביטוי חלבונים או לאירועי איתות בעלי עניין (למשל, זרחון)10,12. רמות ביטוי חלבונים מאופיינות היטב בקווי תאים מאפשרות גם להעריך את הרגישות של בדיקה באמצעות פאנל של קווי תאים עם ביטוי חלבון גבוה, בינוני, נמוך ונעדר. בנוסף, כדוריות תאים מהונדסות יכולות להיות בקרות ספציפיות למינים בעלי ערך עבור מינים וטרינריים, שעבורם עשוי להיות אפיון מוגבל או בקרות רקמות זמינות13. בעוד שלכדורי התא יש מגבלות, כגון הפרוטאום המוגבל הקיים בקווי התאים שלא ישקף את הפרוטאום המגוון ברקמות, הם משמשים כבקרות מתאימות לאישור כי הנוגדן יכול לזהות את מטרת העניין, כמו גם לשלול קשירה חסרת הבחנה על ידי הנוגדן הראשוני, נוגדן שניוני, או regents אחרים במבחן10.
רוב הרקמות בפתולוגיה אבחנתית וחקירתית קבועות בפורמלין חוצץ נייטרלי, מיובשות בסדרה של אלכוהולים, מנוקות בקסילן, ומעובדות ומוטבעות בשעוות פרפין. קיבוע פורמלין בין חלבונים, וקיבוע וכל שלב נוסף בעיבוד רקמות יכולים להשפיע ישירות על חלבונים ועל יכולתם של נוגדנים לזהות אותם 9,14. לכן, חשוב שכל הבקרות המשמשות במבחן IHC יעברו את אותם הליכי קיבוע, עיבוד רקמות והטמעה. מאמר זה מתאר את השיקולים הייחודיים לעיבוד והטמעה של תאים בתרבית שישמשו כבקרות לפיתוח מבחני IHC ברקמות משובצות פרפין קבועות פורמלין, כאשר המתודולוגיה מתמקדת בעיקר בטיפול ובעיבוד של גלולת התא במעבדה היסטולוגית.
Protocol
1. הכנת גלולה סלולרית
- בארבעה עד שמונה צלוחיות150 מ"מ 2 או 8 x T175, לגדל תאים בתווך ובתנאים המומלצים לקו התא עד 80%-90% מפגש. לדוגמה, לגדל 293T תאים במדיום הנשר המתוקן (DMEM) של דולבקו עם 10% סרום בקר עוברי ו-2 mM L-גלוטמין15.
הערה: יש לגדל תאים באמצעות התנאים והמדיום הדרושים לקו הענייןשל התא 16. תנאים אלה עשויים להשתנות בהתאם לקו התא, אך שיטות ההטלה במורד הזרם צריכות להיות ניתנות להתאמה עבור קווי תאים ללא תלות בתנאי תרבית. - ברגע שהתאים קרובים למפגש (80%-90%), שאפו את מדיית הגדילה עם פיפטה ואקום ושטפו את התאים בתמיסת מלח אפוספטית (PBS).
- מוסיפים 5 מ"ל של 5-10 mM EDTA לכל בקבוקון ומדגרים את הצלוחיות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות. הקישו בעדינות על צד הבקבוקון כדי לנתק תאים.
הערה: אין להשתמש בטריפסין מכיוון שהדבר עלול לבקע אפיטופים של פני השטח שעלולים להשפיע לרעה על אנטיגנים מסוימים.- לאחר ניתוק התאים, יש להוסיף 5 מ"ל של מדיית גדילה המשמשת לקו התא (לדוגמה, DMEM עבור תאי 293T) לכל בקבוקון, ולאחר מכן להעביר את התאים לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
- צנטריפוגה צינורות חרוטיים ב 930 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, הסר את המדיה ואת EDTA על ידי שאיפת פיפטה ואקום.
- שטפו את כדורי התא ב-10-20 מ"ל של PBS אחד, ואם נעשה שימוש במספר צלחות או צלוחיות, איחדו את התאים מהצלחות או הצלוחיות (כשש צלוחיות T175 בניסוי המתוארות באיור 1) לצינור חרוטי יחיד של 50 מ"ל.
- צנטריפוגה את הצינור ב 930 x גרם במשך 5 דקות. לשאוף את PBS לאחר צנטריפוגה עם פיפטה ואקום.
- שמור את צינור גלולת התא על קרח רטוב עד קיבוע.
הערה: התאים נשמרים מקוררים כדי להגביל את פעילות האנזימים המשפילים ולמזער את האוטוליזה של התאים ואת השינויים הקשורים לחלבונים, כולל שינויים בלוקליזציה של חלבונים.
2. קיבוע של כדור התא
- בצע קיבוע על-ידי הוספת 30 מ"ל של פורמלין נאגר ניטרלי ב-10% לכדורי תאים של 3 מ"ל כדי ליצור יחס קיבוע לתא של 10:1 (vol:vol).
- הפוך את צינור 50 מ"ל מכוסה היטב שוב ושוב עד שהתאים נמצאים לחלוטין בהשעיה.
הערה: היווצרות של כדור תא מעובה לפני קיבוע מלא עלולה לגרום לקיבוע לא אחיד, וכתוצאה מכך לממצאים במהלך הליכי צביעה ותיוג חיסוני מאוחרים יותר. - אפשרו לתרחיף התא לשקוע למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
- הפוך מחדש את הצינור למחרת כדי להשעות מחדש את התאים, להגדיל את המשטח לנפח יחס כדי לשפר את הקיבוע.
הערה: מערבולת גלולת התא אינה נדרשת או מומלצת מכיוון שהיא עלולה לגרום נזק לתאים.
3. חיתוך ועיבוד של גלולת התא
- לאחר קיבוע של 24 שעות, צנטריפוגה של צינור חרוטי 50 מ"ל ב 930 x גרם ב 5 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות. ודא שהצינורות סגורים היטב, מפוזרים שווה ומאוזנים בצנטריפוגה.
הערה: ניתן לשנות את זמני הקיבוע כך שישקפו את זמני קיבוע הרקמות המשמשים את המעבדה או את הדרישות של תנאי ניסוי ספציפיים. - לאחר צנטריפוגה, ודא כי התאים יוצרים גלולה גלויה. יש להסיר את התוסף על ידי ניקוי ו/או שאיפה זהירה עם פיפטה סטרילית.
- הוסיפו ג'ל מותך (40-60 מעלות צלזיוס) על בסיס הידרוקסיאתיל אגרוז (ראו טבלת חומרים) לכדור התא ביחס של 1:4 (vol:vol) בין ג'ל לכדור.
- באמצעות בדיקה סטרלינג נקייה בקוטר 5 אינץ' ו-2 מ"מ עם עין שטופה במי ברז, ערבבו בעדינות את הג'ל המותך לתוך גלולת התא הקבוע, ויצרו תרחיף אחיד של תאים קבועים בג'ל מותך בתחתית הצינור החרוטי בקוטר 50 מ"ל (איור 1A).
- מניחים את הצינור החרוטי המכוסה 50 מ"ל עם הג'ל המותך מעורבב עם כדור תא קבוע על קרח רטוב למשך 5-10 דקות כדי לחזק את כדור התא הג'ל.
- באמצעות מיקרו-מרית נקייה, הסר בזהירות את הכדור מהצינור החרוטי על ידי הנחת מרית לאורך צד הצינור ומינוף עדין של הכדור מבלי לחדור אותו. מניחים את הכדור על נייר ביופסיה.
- באמצעות מיקרו-מרית נקייה, קצצו את גלולת התא לפרוסות בעובי 4-5 מ"מ, כך שכל פרוסה תוכל להתאים לקלטת רקמה בגודל 26 מ"מ x 26 מ"מ x 5 מ"מ (איור 1B).
- מניחים פרוסות כדורי ג'ל בודדות במרכז פיסת נייר ביופסיה. מקפלים את שני הקצוות המנוגדים של נייר הביופסיה מעל הכדור, ועוטפים אותו. מניחים את הכדור העטוף בקלטת רקמה בגודל 26 מ"מ x 26 מ"מ x 5 מ"מ. סגרו את המכסה, תוך לחיצה על הצדדים הפתוחים של עטיפת הביופסיה עם מכסה קלטת הרקמה (איור 1C).
- הכניסו את קסטת גלולת התאים החתוכים לתוך ריטורט מעבד הרקמות המלא בפורמלין מאגר נייטרלי של 10% ופעלו על פי לוח זמנים קצר לעיבוד.
הערה: לוח הזמנים הקצר לעיבוד מורכב מ-30 דקות בכל ריטורט שמתחיל ב-10% פורמלין נאגר נייטרלי, מיובש באמצעות סדרה של אלכוהולים מדורגים יותר ויותר, מנוקה בשלושה שינויים של קסילנים, וכלה בחדירת פרפין בשני שינויים של 60 °C חדירה/הטמעת פרפין מותך (56 °C נקודת התכה).
4. הטבעה של כדור התא
- הכניסו את הקסטות המעובדות לאזור ההחזקה של מרכז ההטבעה.
- פתח את מכסה קלטת הרקמה ופתח בזהירות את נייר הביופסיה.
- הכניסו את כדור התא לתוך תבנית הטבעה חד פעמית קטנה בגודל 15 מ"מ על 15 מ"מ, חתוכה כלפי מטה.
הערה: תבנית הטבעה קטנה מאפשרת לעד שלושה חלקי כדורי תאים להתאים לשקופית רקמה אחת לא מוכתמת עבור מבחני IHC. - תוך כדי החזקה עדינה של גלולת התא בתחתית התבנית עם מלקחיים, יש להוסיף 62 מעלות צלזיוס לחדירה/הטמעת פרפין לתוך התבנית, המכסה את גלולת התא.
- מעבירים את התבנית לגוש קר כדי להתחיל לחזק את הפרפין. התאימו את כדורי התא בזמן שהפרפין מתמצק כדי לקבע אותם במקומם המתאים בתחתית התבנית.
- הסר את המכסה מהקלטת. מניחים את הקלטת, בצד התחתון כלפי מטה, על גבי תבנית ההטבעה ומוסיפים פרפין מותך נוסף לכיסוי הקלטת.
- כאשר פרפין מתמלא מעל קסטת הרקמה, החזירו את התבנית לגוש הקור כדי להתמצק17,18.
5. חתך של כדור התא
- השתמש במיקרוטום סיבובי שנקבע בעובי חתך של 20 מיקרומטר כדי לקצץ את בלוק גלולת התא עד שהפנים המלאות של בלוק הפרפין וכדור התא נלכדים בסרט מקטע הפרפין. זה נקרא "מול" הבלוק.
- מצננים ומשרים את גושי הכדורים הפונים על מגש אמבט קרח למשך 5-15 דקות כדי לצנן וללחח את הבלוק לפני החתך.
הערה: כאשר הבלוק הוא hydrated, גלולת התא יהיה שקוף בסרט פרפין. אם אטום, נדרשת השרייה נוספת, וממצאים עשויים להיות נוכחים. - חתך את סרט הפרפין של גוש גלולת התא בעובי של 4 מיקרומטר או עובי רצוי אחר במצב חיתוך רציף באמצעות מיקרוטום סיבובי.
- מניחים את סרטי הפרפין על אמבט ציפה במים שנקבע ל-42 מעלות צלזיוס.
- הרימו את מקטעי הפרפין שהוכנו באמצעות המיקרוטום הסיבובי מאמבט הציפה על גבי מגלשות טעונות חיובית.
- מקמו את החלק הראשון בחלק העליון של המגלשה בתוך מכסה וגבול הכתמים, והניחו את החלק השני מתחתיו ואת מקטע גלולת התא השלישי מתחתיו (איור 1D).
- לאחר החתך, יבש את המגלשות בטמפרטורת החדר (כ -23 מעלות צלזיוס) למשך 24 שעות, ואחריו 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
הערה: לאחר אפיית השקופיות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס, ניתן להשתמש בחלקי כדורי התא עם כל פרוטוקול IHC סטנדרטי, כולל פרוטוקולים המשתמשים באחזור אנטיגן המושרה בחום ומבוסס אנזים9.
Representative Results
לאחר הוספת הג'ל המבוסס על אגרוז, גלולת התא צריכה ליצור מסה ג'לטינית מוצקה הניתנת לטיפול (איור 1B). לאחר ההטבעה, הכדור יהיה בעל עקביות דומה לרקמה מוצקה, ואמור להיות קל יחסית לחיתוך שגרתי של מיקרוטום. לאחר הטמעת כדוריות תאים, ניתן להשתמש בהן בניסויים בהיסטולוגיה וב-IHC באופן זהה לרקמות משובצות פרפין קבועות בפורמלין. זה כולל שימוש באפיטופ המושרה בחום או שליפת אנטיגן אנזימטי עם שיטות זיהוי כרומוגניות עקיפות (למשל, שימוש בנוגדן משני עם פרוקסידאז חזרת וזיהוי דיאמינובנזידין כפי שמוצג באיור 2 ובאיור 3) באמצעות פלטפורמות IHC מסחריות9. מבחינה היסטולוגית, התאים צריכים להיות מפוזרים באופן שווה לאורך כל החלק עם גוש תאים מינימלי, אם כי תאים דבקים עשויים לשמור על אינטראקציות התא-תא שלהם בכדור. פיזור זה מאפשר הבחנה בין תאים בודדים, אם כי הבחנה זו תושפע באופן משמעותי מגודל התא ומהצפיפות היחסית בתוך גלולת הג'ל. הגרעין, הציטופלסמה וקרום התא מובחנים יותר וקל יותר לדמיין אותם בעת פיזורם (איור 2). באיור 2, שלושה קווי תאים מסומנים כבעלי תווית חיסונית עבור גורם השעתוק TEAD. תיוג חיסוני הוא הדמיה עם כרומוגן חום diaminobenzidine (DAB). לשורות התאים יש רמות ביטוי משתנות של גורם השעתוק TEAD, החל מאי-ביטוי (איור 2A) לביטוי חלש (איור 2B) ועד לביטוי חזק (איור 2C). בדוגמה זו, תיוג נצפה בגרעין, כפי שניתן היה לצפות מגורם שעתוק, והוא נעדר מהציטופלסמה וממברנת התא, הנראים לעין אך חסרים תיוג (איור 2). ניתן לשלב כדורי תא במיקרו-מערכים של כדורי תא (איור 3) בשקופיות סטנדרטיות של 23 מ"מ x 75 מ"מ x 1 מ"מ. שילוב כדורי התא במיקרו-מערך מאפשר הערכה של פקדים בעלי רמות ביטוי משתנות באותה שקופית. בדוגמה זו, תאי גזע עובריים של עכברים עם מחסור ב-PEG10 (משמאל) משמשים כבקרה שלילית, ותאי 293T שמבטאים יתר על המידה את PEG10 (מימין, חיסונית חומה) משמשים כבקרה חיובית במיקרו-מערך (איור 3). אין שונות ברקמות ובתהליכי ההטבעה של כדורי התא שייכללו במיקרו-מערכים, וניתן ליצור מיקרו-מערכים בשיטות דומות לאלה המשמשות לרקמות19.
איור 1: עיבוד כדוריות תאים . (A) התאים מעובדים בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל ומעורבבים עם הג'ל. (B) לאחר ההתמצקות, הכדורים נפרסים באופן סדרתי כך שיתאימו לקלטת רקמה בגודל 26 מ"מ x 26 מ"מ x 5 מ"מ. (C) כדורי התא עטופים בנייר ביופסיה לפני שהם מוכנסים למעבד הרקמות. (D) ניתן לאסוף עד שלושה כדורי תאים באופן סדרתי על שקופית היסטולוגיה אחת של זכוכית בגודל 25 מ"מ x 75 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: ניתן להשתמש בכופתיות תאים עם רמות שונות של ביטוי חלבון או תעתיק כדי להעריך את הטווח הדינמי של הבדיקה. כדוריות תאים עוברות תווית חיסונית עבור גורם השעתוק TEAD ומדגימות רמות שונות של ביטוי TEAD. (A) תאי DAUDI חסרים ביטוי TEAD ואין להם תווית חיסונית בציטופלסמה או בגרעין. כתם כחול הוא כתם נגדי המטוקסילין של הגרעין. (B) תאי 293T מדגימים תיוג גרעיני חלש (כרומוגן חום דיאמינובנזידין (DAB) של גורם השעתוק TEAD. (C) תאי דטרויט 562 מבטאים באופן חזק TEAD כפי שמודגם על ידי הסימון החום העז בגרעין. תיוג בתוך הגרעין, אך לא הציטופלסמה (אזור לבן עד אפור סביב הגרעין החום), מדגים את הסימון המתאים של הבדיקה האימונוהיסטוכימיה. שימו לב שבכל שלושת קווי התאים, התאים מפוזרים, מה שמאפשר הדמיה של תאים בודדים, כולל המורפולוגיות הגרעיניות והציטופלסמיות שלהם. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: מיקרו-מערך כדורי תאים שנוצר על-ידי שימוש במספר כדורי תאים עם רמות ביטוי חלבון משתנות מאפשר הערכה בו-זמנית של פקדים בשקופית אחת. תאי גזע עובריים של עכברים עם מחסור ב-PEG10 (משמאל) ו-293T המבטאים יתר על המידה PEG10 (מימין) הם בעלי תווית חיסונית עבור PEG10. בעוד תיוג חזק (כרומוגן DAB חום) נצפה בתאי 293T המבטאים יתר על המידה PEG10, לא ניתן לראות תיוג בתאים החסרים ב-PEG10. כחול מייצג כתם נגדי של המטוקסילין. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה ליצירת כדורי תאים קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין, שיכולים לשמש כבקרה על אימונוהיסטוכימיה במורד הזרם ומחקרי הכלאה באתרם. מתודולוגיות ההיסטולוגיה המתוארות בפרוטוקול זה ישימות למגוון רחב של סוגי סרטן וקווי תאים ראשוניים, ובעיקר מתאימות טכניקות היסטולוגיה שגרתיות לייצור כדוריםאלה 17,18. כאשר הם מעובדים ומוטמעים, ניתן להשתמש בכדורים באופן דומה לרקמות. זה כולל שימוש בהם עם פרוטוקולי אחזור אנטיגן המושרים בחום ואנזימטיים לניסויים אימונוהיסטוכימיים. אחת המטרות של המתודולוגיות המשמשות בפרוטוקול זה היא לשמר את המורפולוגיה והאנטיגניות של התאים לאורך כל התהליך. לכן, EDTA, שהוא עדין יחסית מבחינת שינויים הן במורפולוגיה והן באנטיגניות, משמש לניתוק התאים. אין בכך כדי לומר שגישות אחרות, כגון הפרעה פיזית, אינן בנות קיימא; עם זאת, כל גישה לניתוק תאים צריכה להבטיח שהתאים לא ייפגעו בתהליך. המטרה השנייה של פרוטוקול זה היא לתקן ולעבד את התאים באופן דומה לרקמות, תוך שימוש באותו יחס קיבוע, קיבוע, לוח זמנים לעיבוד (קיבוע, התייבשות, ניקוי וחדירת פרפין) וטכניקות הטמעה, כך שהם יוכלו לשמש כבקרות דומות עבור בדיקות במורד הזרם. לפיכך, גישות הקיבוע והעיבוד המשמשות ליצירת כדורי תאים צריכות לחקות את הגישות המשמשות לרקמות.
הפרוטוקול המתואר בדו"ח זה אינו מותאם לטיפול בתאים עם גורמים מזהמים, כגון תאים הנגועים בחיידקים פתוגניים או בנגיפים, מכיוון שהתאים מנותקים, נאספים ועוברים צנטריפוגות לפני הקיבוע. חוקרים עשויים לשקול פרוטוקולים לתיקון התאים לפני הניתוק, אך הדבר ידרוש אופטימיזציה נוספת כדי לאסוף את התאים מבלי להפריע למורפולוגיה של התא. יתר על כן, זמני הקיבוע ותנאי הטיפול בתאים עם גורמים מזהמים דורשים שיקולים נוספים המבוססים על הגורם המזהם ופרוטוקולי בטיחות ביולוגית מוסדיים נלווים.
כדורי תאים קבועים בפורמלין ומשובצים בפרפין הם בעלי יתרון ייחודי בכך שיש להם רמות ביטוי חלבוןמוגדרות היטב 10. בעוד שקווי תאים סרטניים ואנדוגניים מציעים מבחר של תאים עם רמות שונות של ביטוי חלבונים, טכנולוגיות הנדסה גנטית מאפשרות למדענים למדל את ביטוי החלבון, באמצעות ביטוי יתר של חלבונים בעלי עניין ושימוש בטכנולוגיות קריספר כדי לכרות או להחדיר גנים מקודדים בעלי עניין20,21 . החיסרון של חלבונים המתבטאים יתר על המידה בקווי התאים הוא שהם מדדים גרועים לרגישות של בדיקה מכיוון שהם עשויים שלא לייצג רמות חלבון אנדוגניות22. לעומת זאת, גם קווי תאים אנדוגניים וגם קווי תאים סרטניים יכולים לייצג טוב יותר את רמות הביטוי האנדוגניות, ומחיקה בתיווך קריספר של הגן המקודד בקו קוגנטי יכולה לשמש כבקרה שלילית מקבילה. יתר על כן, קווי תאים אנדוגניים או קווי תאים סרטניים עם רמות שונות של ביטוי חלבונים הם אידיאליים לניסויי טיטרציה כדי לבחור דילולי נוגדנים סופיים ולהבין בצורה הטובה ביותר את הרגישות של בדיקה (איור 2). ההחלטה באילו קווי תאים להשתמש צריכה להתבסס על צרכים ניסיוניים אינדיבידואליים ולעתים קרובות תשתמש בשילוב של גישות.
בנוסף להערכה אם נוגדן יכול לזהות את החלבון המעניין, ניתן להשתמש בפאנל של קווי תאים כדי להגדיר את הספציפיות של נוגדן. לדוגמה, פאנל של קווי תאים המבטאים בנפרד משפחה של חלבונים קרובים זה לזה יכול לשמש כדי לבדוק אם נוגדן הוא ספציפי לחלבון בודד או אם הוא מזהה גם חלבונים קרובים אחרים. בקרות משוכללות יותר עשויות לכלול שימוש בקווי תאים המבטאים, בין אם באמצעות חיטוי קריספר או באמצעות ביטוי יתר, חלבונים עם מוטציות נקודתיות שאינן יכולות לעבור אירועי איתות ספציפיים המתגלים (למשל, מוטציה באתרי זרחון ספציפיים בעת הערכת נוגדן ספציפי לפוספו). בעוד אלה הן גישות מורכבות יותר, הם עשויים להיות נחוצים כדי לאשר כי הנוגדן השתמש רק תוויות בנסיבות ספציפיות10.
חשוב לציין כי מניפולציות גנטיות של קווי תאים עשויות שלא ליצור אוכלוסיית תאים הומוגנית. לדוגמה, יעילות ההעברה בביטוי יתר של קווי תאים היא בדרך כלל לא 100% וייתכן שחלק מהתאים לא מבטאים יתר על המידה את החלבון המעניין. הכללה של FLAG או תג קשור בטרנספקציה שניתן לזהות בשיטות סטנדרטיות יכולה להיות מועילה להערכת יעילות הטרנספקציה של קו התא23. זה יכול להיות מועיל הן כדי לקבוע אם ההעברה הצליחה והן כדי לשלול חוסר זיהוי עקב ביטוי החלבון, והן כדי לשמש התייחסות לשיעור הצפוי של תאים שאמורים לבטא את החלבון המעניין.
הכלאה באתרה (ISH) יכולה גם להיות כלי מועיל לאפיון ביטוי גן המטרה בכדורי תאים ולפיתוח שיטת IHC10. בעת סינון נוגדנים, זה יכול להיות אינפורמטיבי לדעת מתי התעתיק, ובכך את החלבון הפוטנציאלי, ניתן לזהות. בנוסף, בדיקת ISH של כדוריות תאים יכולה להועיל לפיתוח שיטת ISH. בעוד שספציפיות היא פחות בעיה עבור מבחני ISH, עדיין חשוב שיהיו בקרות מתאימות ושיקולים דומים לפיתוח וניצול של בקרות שניתן ליישם במחקרי ISH.
מיקרו-מערכים של רקמות נוצרים על-ידי הסרת ליבות מבלוקים של תורמים והעברת ליבות אלה, לעתים קרובות בתבנית רשת, לתוך בלוק פרפין מקבל. בסופו של דבר, בלוק הנמען מכיל ספקטרום של דגימות בבלוק אחד, המאפשר לכל הדגימות בבלוק לעבור הליכי IHC זהים ומאפשר השוואה ישירה של דגימות מרובות באותה שקופית24,25. מאחר שכדורי תאים הם אוכלוסיות אחידות יחסית, הם יכולים להיות מיוצגים במדויק על ידי ליבות של 1 מ"מ, מה שהופך אותם למועמדים אידיאליים להכללה במערכים דומים. באמצעות מערך כדורי תא, ניתן לכלול כדוריות תאים עם רמות ביטוי שונות, כדורי תאים המבטאים באופן ייחודי חלבונים קשורים, וכדורי תאים המבטאים אורתולוגים של החלבון המעניין ממינים שונים בשקופית אחת (איור 3). זה מאפשר להעריך את כל כדורי התא בו זמנית בתנאים אחידים באופן מהיר, תוך מזעור השימוש בריאגנטים25.
נפח כדוריות תא התחלתי מינימלי של 2 מ"ל שנאסף משמונה צלוחיות T175 מומלץ לפרוטוקול זה. נפח זה מאפשר ייצור ואחסון בארכיון של בלוקים מרובים של כדורי תאים, כך שניתן יהיה לתקנן את פקדי כדורי התא על פני פרקי זמן ארוכים יותר וניתן ליצור מערכי כדורי תאים מרובים מכדור נתון. נפחי כדוריות תאים נמוכים יותר יכולים לשמש כאשר מתמודדים עם קווי תאים ראשוניים שמקורם בחולה, קווי תאים הגדלים לאט, או כאשר התנאים מגבילים את נפח הדגימה. כמובן, נפחי התחלה נמוכים יותר יגבירו את ההשפעה השלילית מכל אובדן תאים במהלך קיבוע והכנת הכדור ויגבילו את החומר הזמין לתהליכים במורד הזרם. חשוב במיוחד להיזהר בעת הסרת קיבוע לאחר צנטריפוגה, כדי למזער כל אובדן הקשורים. עבור נפחי דגימה נמוכים יותר, ניתן להשתמש בצינור צנטריפוגה מכוסה של 1.5 מ"ל כדי לגלגל את התאים. צינורות אלה ניתן לחתוך אורכי עם להב לעיבוד.
בדומה לקיבוע רקמות, קיבוע תאים בתוך כדור זה הוא קריטי להערכות IHC במורד הזרם. על מנת להשיג קיבוע מלא, אנו משתמשים לפחות ביחס של 10:1 פורמלין לכדוריות התא והופכים את הצינור החרוטי כדי לשמור על התאים בתרחיף. אם התאים אינם נמצאים בהשעיה בזמן הקיבוע, קיים סיכון של קיבוע לא שלם או לא מספק, אשר ישפיע על התווית החיסונית במורד הזרם. לעתים קרובות זה מתבטא בתיוג חזק בפריפריה ואובדן תיוג במרכז הכדור או תיוג בעוצמה משתנה לאורך כל הכדור.
פרוטוקול זה משתמש בהיסטוגל, המורכב בעיקר מהידרוקסיאתיל אגרוז, הן כדי לקשור את כדור התא והן כדי לאפשר לתאים להתפזר באופן שווה בכל כדור התא. בלעדיו, התאים הופכים דחוסים ומאבדים את הפרטים הציטומורפולוגיים שלהם. פרטים ציטומורפולוגיים אלה חשובים לעתים קרובות במהלך בדיקת נוגדנים, שכן הם מספקים מידע נוסף לגבי האם הנוגדן מתנוסס בתא התת-תאי המתאים (למשל, הגרעין, הציטופלסמה או קרום הפלזמה). לעומת זאת, כמות גדולה מדי של ג'ל עלולה לגרום לצפיפות תאים נמוכה יותר בתוך הכדור, מה שיוביל לפיזור נרחב של התאים, ויפחית את מספר התאים לכל מקטע.
ניתן להשתמש בפרוטוקול זה באופן שגרתי לפיתוח בקרות IHC. החומרים הדרושים ליצירת כדורים אלה נפוצים במעבדות לביולוגיה חוקרת והיסטולוגיה, והשיטות פשוטות וקלות להתאמה. בעוד שלכדורי תאים יש מגבלות כמו לבקרות IHC, הם משמשים ככלים נהדרים לסינון נוגדנים ראשוני ומשלימים בקרות רקמות אחרות.
Disclosures
כל הכותבים הם עובדי ג'ננטק/ רוש, וככאלה הם בעלי מניות ברוש.
Acknowledgments
ברצוננו להודות על שיתוף הפעולה של עמיתינו בארגון המחקר של Genentech, ובמיוחד מעבדות הליבה הפתולוגית (P-core) שתרמו לפיתוח שיטות אלה לאורך השנים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| 50 mL Conical Tube | Becton Dickinson Labware | #0747-1886 | |
| 70% Ethanol | Koptec | V1401 | |
| 95% Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Biopsy Wraps | Surgipath Medical Industries, Inc | #01090 | |
| Costar Stripette serological pipette 10mL | Corning | CLS4101 | |
| Flex 100 | Epredia | 8101 | |
| Flex 95 | Epredia | 8201 | |
| Histogel | Thermo Scientific | #R904012 | |
| Leica Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| Micro Spatula, rounded and tapered ends | Tedd Pella | #13510 | |
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin | Surgipath | 39601006 | |
| Pipette Controller | CAPP | PA-100 | |
| Reagent Alcohol | Epredia | 9111 | |
| Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | #RS-9522 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette | Epredia | B851120WH | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHistech LTD | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
- Wennerberg, A. E., Nalesnik, M. A., Coleman, W. B. Hepatocyte paraffin 1: a monoclonal antibody that reacts with hepatocytes and can be used for differential diagnosis of hepatic tumors. American Journal of Pathology. 143 (4), 1050-1054 (1993).
- Chu, P. G., Ishizawa, S., Wu, E., Weiss, L. M. Hepatocyte antigen as a marker of hepatocellular carcinoma. American Journal of Surgical Pathology. 26 (8), 978-988 (2002).
- Cobleigh, M. A., et al. Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. Journal of Clinical Oncology. 17 (9), 2639-2648 (1999).
- Vogel, C. L., et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 719-726 (2002).
- Webster, J. D., Miller, M. A., DuSold, D., Ramos-Vara, J. A. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Veterinary Pathology. 47 (3), 529-535 (2010).
- Havnar, C., et al. Characterization of tumor-immune microenvironment by high-throughput image analysis of CD8 immunohistochemistry combined with modified Masson's trichrome. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 69 (9), 611-615 (2021).
- Newton, K., et al. RIPK1 inhibits ZPB1-driven necroptosis during development. Nature. 540 (7631), 129-133 (2016).
- Webster, J. D., Solon, M., Haller, S., Newton, K. Detection of necroptosis by phospho-RIPK3 immunohistochemical labeling. Methods in Molecular Biology. 1857, 153-160 (2018).
- Ramos, J. A., Miller, M. A., et al. When antibodies and antigens get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry-the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
- Webster, J. D., Solon, M., Gibson-Corley, K. N. Validating immunohistochemistry assay specificity in investigative studies: consideration for a weight of evidence approach. Veterinary Pathology. 58 (5), 829-840 (2021).
- Ramos-Vara, J. A., et al. American association of veterinary laboratory diagnosticians subcommittee on standardization of immunohistochemistry suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary diagnostic laboratories. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (4), 393-413 (2008).
- Dominguez, S., et al. Genetic inactivation of RIP1 kinase does not ameliorate disease in a mouse model of ALS. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 915-931 (2021).
- Lean, F. Z. X., et al. Differential susceptibility of SARS-CoV-2 in animals: evidence of ACE2 host receptor distribution in companion animals, livestock and wildlife by immunohistochemical characterization. Transboundary and Emerging Disease. , 14232 (2021).
- Dunstan, R. W., Wharton, K. A., Quigley, C., Lowe, A. The use of immunohistochemistry for biomarker assessment-can it compete with other technologies. Toxicologic Pathology. 39 (6), 988-1002 (2011).
- Atcc.org. , Available from: http://www.atcc.org (2022).
- Thermo Fisher Scientific. Cell Culture Basics Handbook. , Gibco. (2020).
- Carson, F. Histotechnology: A Self-Instructional Text, 2nd Ed. , ASCP Press. Chicago, IL. (1997).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Tissue Processing. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Ed. Spencer, L. T., Bancroft, J. D. , Churchill Livingstone-Elsevier. China. (2013).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G. Tissue Microarrays. Cancer Gene Profiling. , Humana Press. New York. 53-65 (2016).
- Jinek, M., et al. Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Ferrando, R., Newton, K., Chu, F., Webster, J., French, D. Immunohistochemical detection of FLAG-tagged endogenous proteins in knock-in mice. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (4), 244-255 (2015).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nature Medicine. 4 (7), 844-847 (1998).
- Moch, H., Kononen, J., Kallioniemi, O. P., Sauter, G. Tissue microarrays: what will they bring to molecular and anatomic pathology. Advances in Anatomic Pathology. 8 (1), 14-20 (2001).
