Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering og kvantificering af Epstein-Barr-virus fra P3HR1-cellelinjen

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64279
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Experimental Pathology, Immunology and Microbiology, Faculty of Medicine, American University of Beirut, 2Center for Infectious Diseases Research (CIDR), Faculty of Medicine, American University of Beirut

Summary

Denne protokol tillader isolering af Epstein-Barr-viruspartikler fra den humane P3HR1-cellelinje ved inducering af den virale lytiske cyklus med phorbol 12-myristat 13-acetat. DNA ekstraheres efterfølgende fra det virale præparat og udsættes for PCR i realtid for at kvantificere den virale partikelkoncentration.

Abstract

Epstein-Barr-viruset (EBV), formelt betegnet som Human herpesvirus 4 (HHV-4), er den første isolerede humane tumorvirus. Næsten 90-95% af verdens voksne befolkning er inficeret af EBV. Med de seneste fremskridt inden for molekylærbiologi og immunologi har anvendelsen af både in vitro- og in vivo-eksperimentelle modeller givet dyb og meningsfuld indsigt i patogenesen af EBV i mange sygdomme såvel som i EBV-associeret tumorigenese. Formålet med dette visualiserede eksperimentpapir er at give et overblik over isoleringen af EBV-virale partikler fra celler i P3HR1-cellelinjen efterfulgt af kvantificering af det virale præparat. P3HR1-celler, oprindeligt isoleret fra et humant Burkitt-lymfom, kan producere en P3HR1-virus, som er en type 2 EBV-stamme. EBV-lytisk cyklus kan induceres i disse P3HR1-celler ved behandling med phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA), hvilket giver EBV-virale partikler.

Ved anvendelse af denne protokol til isolering af EBV-partikler dyrkes P3HR1-celler i 5 dage ved 37 °C og 5% CO2 i komplet RPMI-1640-medium indeholdende 35 ng/ml PMA. Derefter centrifugeres kulturmediet med en hastighed på 120 x g i 8 minutter for at pelletere cellerne. Den virusholdige supernatant opsamles derefter og spindes ned med en hastighed på 16.000 x g i 90 minutter for at pelletere EBV-partiklerne. Den virale pellet resuspenderes derefter i et komplet RPMI-1640-medium. Dette efterfølges af DNA-ekstraktion og kvantitativ realtids-PCR for at vurdere koncentrationen af EBV-partikler i præparatet.

Introduction

Epstein-Barr-virussen (EBV) er den første humane tumorvirus, der er blevet isoleret1. EBV, formelt benævnt Human herpesvirus 4 (HHV-4)2, er en del af gamma herpesvirus underfamilien af herpesvirusfamilien og er prototypen af Lymphocryptovirus-slægten. Næsten 90-95% af verdens voksne befolkning er inficeret af virussen3. I de fleste tilfælde forekommer indledende infektion inden for de første 3 år af livet og er asymptomatisk, men hvis infektion opstår senere i ungdomsårene, kan det give anledning til en sygdom kaldet infektiøs mononukleose4. EBV er i stand til at inficere hvilende B-celler, der får dem til at blive proliferative B-lymfoblaster, hvor virussen etablerer og opretholder en latent inficeret tilstand5. EBV kan genaktiveres når som helst og dermed føre til tilbagevendende infektioner6.

I løbet af de sidste 50 år er sammenhængen mellem nogle vira og udviklingen af menneskelige maligniteter blevet mere og mere tydelig, og i dag anslås det, at 15% til 20% af alle humane kræftformer er relateret til virusinfektioner7. Herpesvirus, herunder EBV, er nogle af de bedst undersøgte eksempler på disse typer tumorvirus8. Faktisk kan EBV forårsage mange typer humane maligniteter, såsom Burkitt lymfom (BL), Hodgkin lymfom (HL), diffust stort B-celle lymfom og lymfoproliferative sygdomme hos immunkompromitterede værter 9,10. EBV har også vist sig at være forbundet med udviklingen af systemiske autoimmune sygdomme. Nogle eksempler på disse autoimmune lidelser er reumatoid arthritis (RA), polymyositis-dermatomyositis (PM-DM), systemisk lupus erythematosus (SLE), blandet bindevævssygdom (MCTD) og Sjögrens syndrom (SS)11. EBV er også forbundet med udviklingen af inflammatorisk tarmsygdom (IBD)12.

Mange af disse sygdomme kan studeres eller modelleres ved hjælp af cellekultur, mus eller andre organismer, der er inficeret med EBV. Derfor er EBV-partikler nødvendige for at inficere celler eller organismer, hvad enten det er in vitro eller in vivo-modeller 13,14,15,16, og derfor er det nødvendigt at udvikle en teknik, der tillader isolering af virale partikler til en lav pris. Den protokol, der er beskrevet her, giver retningslinjer for en nem måde at pålideligt isolere EBV-partikler fra en relativt tilgængelig cellelinje og kvantificere partiklerne ved hjælp af realtids-PCR, som er omkostningseffektiv og let tilgængelig for de fleste laboratorier. Dette er i sammenligning med flere andre metoder, der er beskrevet for at isolere EBV fra forskellige cellelinjer17,18,19,20.

P3HR-1 er en BL-cellelinje, der vokser i suspension og er latent inficeret med en EBV type 2-stamme. Denne cellelinje er en EBV-producent og kan induceres til at producere virale partikler. Målet med dette manuskript er at fremvise en metode, der tillader isolering af EBV-partikler fra P3HR-1-cellelinjen, efterfulgt af kvantificering af den virale bestand, der senere kan bruges til både in vitro - og in vivo EBV-eksperimentelle modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: EBV bør betragtes som et potentielt biofarligt materiale og bør derfor håndteres under biosikkerhedsniveau 2-indeslutning eller højere. En lab frakke samt handsker skal bæres. Hvis der er potentiale for udsættelse for stænk, bør øjenbeskyttelse også overvejes. Følgende procedure skal udføres i et biologisk sikkerhedsskab.

1. Optælling af P3HR1-cellerne

  1. Centrifugering og resuspending celler
    1. Cellesuspensionen overføres fra en 100 mm kulturplade (eller T-25-kolbe) af en igangværende P3HR1-cellekultur ved 80% sammenløb til et 15 ml konisk rør. Såtætheden af P3HR-1-celler er 1 x 106 celler / ml. Oprethold i komplet RPMI-kulturmedium (79% RPMI-kulturmedium, 20% føtalt kvægserum, 1% Pen-Strep-antibiotikum) ved 37 ° C og 5% CO2 og passage hver 3-4 dage.
    2. Centrifuge i 8 min ved 120 x g. Efter centrifugering kasseres supernatanten, cellepelleten resuspenderes i 1 ml komplet RPMI-kulturmedium og blandes godt (denne opløsning benævnes suspension A).
  2. Forberedelse af cellesuspensionen til tælling
    1. Klargør en fortyndet cellesuspension B ved at blande 2 μL cellesuspension A med 8 μL kulturmedium. Tilsæt 10 μL 0,4% trypanblå til suspension B for at opnå suspension C. Bland præparatet godt ved blid pipettering.
  3. Tælling af celler ved hjælp af et hæmocytometer
    1. Anbring en glasdæksel på hæmocytometeret, og læg 10 μL suspension C. Placer hæmocytometeret under et lysmikroskop, og tæl antallet af celler, der ikke er farvet blå, i hver af de fire kvadranter i hæmocytometerkammeret ved hjælp af 40x mikroskopmålet (figur 1).
    2. Trypan blå pletter døde celler blå; Tæl ikke disse celler eller celler, der berører nogen af de øverste, nederste, højre eller venstre grænser af hver hæmocytometerkvadrant.
    3. Beregn koncentrationen af celler pr. ml ved hjælp af følgende formel:
      Equation 1
      BEMÆRK: Antallet af tællede kvadranter er fire, og 10-4 ml er volumenet af kvadraterne på hæmocytometeret. De fire kvadranter, der skal tælles, er repræsenteret med grønt i figur 1. Samlede celler Tælles i formlen er summen af antallet af celler i kvadrant 1, 2, 3 og 4. Celler repræsenteret med blåt i figur 1 skal tælles, mens celler i rødt ikke skal tælles, da de rører kvadrantens øverste, højre, nederste eller venstre kant.

Figure 1
Figur 1: Celletælling ved hjælp af et hæmocytometerkammer. Fire kvadranter tælles ved hjælp af et lysmikroskop; Disse kvadranter er repræsenteret i grønt. Samlede celler Tælles i formlen angivet i trin 1.3.3 i protokollen beskrevet her er summen af antallet af celler i kvadrant 1, 2, 3 og 4. Celler angivet med blåt skal tælles, mens celler i rødt ikke skal tælles, da de rører ved kvadrantens øverste, højre, nederste eller venstre kant Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Forberedelse af pladen til kultur

  1. Anbring et volumen cellesuspension A i et 15 ml konisk rør. Den krævede volumen afhænger af celletallet. Juster lydstyrken, så antallet af celler er ca. 2,2 x 106 celler for en 100 mm kulturplade.
  2. Tilsæt 5 ml komplet kulturmedium til røret, og overfør derefter rørets indhold til en 100 mm kulturplade. Der tilsættes 80 μL dimethylsulfoxid (DMSO) til dyrkningspladen.
    BEMÆRK: DMSO er lysfølsom, derfor skal den opbevares i en lysbestandig beholder eller dækkes med et uigennemsigtigt materiale som aluminiumsfolie.
  3. Der tilsættes 350 μL 1 mg/ml phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) til røret. Den endelige koncentration af PMA bør være 35 ng/ml, og DMSO's koncentration bør være 0,08%.
    FORSIGTIG: PMA er giftig, ætsende og kræftfremkaldende, og derfor bør den håndteres med ekstrem forsigtighed. PMA er lysfølsom, derfor skal den opbevares i en lysbestandig beholder eller dækkes med et uigennemsigtigt materiale som aluminiumsfolie.
  4. Tilsæt 4,27 ml kulturmedium, så det samlede volumen er 10 ml. Bland rørets indhold ved at vippe, og overfør derefter indholdet til en 100 mm kulturplade. Pladen efterlades i en cellekulturinkubator i 5 dage ved 37 °C, 5 % CO2.

3. Induktion og isolering af Epstein-Barr-viruspartikler

  1. Efter 5 dage i inkubatoren centrifugeres indholdet af pladen ved 120 x g i 8 minutter for at pelletere cellerne. Saml den cellefrie, virusholdige supernatant og kassér cellepellet.
  2. Supernatanten centrifugeres ved 16.000 x g i 90 minutter ved 4 °C for at pelletere viruspartiklerne. Kassér supernatanten og suspender viruspelleten i 5 ml kulturmedium.
    BEMÆRK: Fosfatbufferet saltvand (PBS) kan bruges til at resuspendere viruspellet i stedet for kulturmedium.
  3. Aliquot den virale suspension opnået i 20 rør, der hver indeholder 250 μL af den virale suspension. Suspensionen opbevares ved -80 °C.

4. DNA-ekstraktion fra virale partikler

FORSIGTIG: Der skal udvises ekstrem forsigtighed ved håndtering af phenol, da det er giftigt og ætsende og har evnen til at forårsage alvorlige forbrændinger. Phenol er lysfølsom og oxiderer ved kontakt med lys eller luft. Opbevar det i en lysbestandig beholder, eller dæk alternativt phenolrøret med et uigennemsigtigt materiale som aluminiumsfolie.

  1. Adskillelse af proteiner fra DNA
    1. Tilsæt 500 μL TrisCl-mættet phenol til et af de 250 μL rør. Tilsæt 100 μL vand (for at øge volumenet af den vandige fase) og hvirvelbrønd for at opnå en lyserød emulsion. Centrifuge i 15 min ved 9650 x g.
  2. DNA-udfældning
    1. Saml supernatanten (gennemsigtig, vandig fase) og overfør den til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    2. Tilsæt en ækvivalent på 1/10 af supernatantens volumen af koldt natriumacetat (3 M, pH 5,2) og bland ved pipettering op og ned. Tilsæt 1 μL 20 mg/ml glykogen og bland ved pipettering.
      BEMÆRK: Dette trin er valgfrit, men tilsætningen af glykogen forbedrer DNA-nedbør samt gør det lettere at visualisere DNA-pellet.
    3. Tilsæt tre gange supernatantens volumen af kold 100% ethanol. Opbevares ved -80 °C natten over.
      BEMÆRK: Proceduren kan stoppes her for at blive genoptaget på et senere tidspunkt. Prøven kan opbevares ved -80 °C i 1 time eller alternativt natten over. Opbevaring natten over forbedrer DNA-nedbør og anbefales derfor.
  3. Isolering af det virale DNA
    1. Den følgende dag centrifugeres ved 9650 x g i 15 minutter ved 4 °C og supernatanten kasseres for at opnå en DNA-pille.
    2. Pelleten vaskes tre gange med 1 ml kold 70% ethanol, centrifuge ved 9650 x g i 15 min., og supernatanten kasseres.
    3. Lufttør pelleten i ca. 10 min. Resuspender pelleten i 10-50 μL nukleasefrit destilleret vand (afhængigt af størrelsen på DNA-pellet).
    4. Prøverne opbevares ved -20 °C til senere behandling eller ved 4 °C natten over for at sikre maksimal DNA-opløsning efterfulgt af opbevaring ved -20 °C. Alternativt kan du fortsætte direkte med trin 5.

5. Kontrol af DNA-koncentration og renhed

  1. Efter rengøring af piedestalen på et mikrospektrofotometer med en delikat opgavevisker skal du indlæse 1 μL af DNA-præparatet.
  2. Bemærk koncentrationen af DNA'et i prøven. Kontroller absorbansforholdene ved både Equation 2 og Equation 3. DNA absorberes ved 260 nm, proteiner ved 280 nm, og organiske stoffer som phenol absorberes ved 230 nm. Et forhold på 1, 8-2 anses for tilstrækkeligt til PCR i realtid.

6. Kvantificering ved realtidspolymerasekædereaktion

  1. Fremstilling af PCR-reaktionsblandingerne
    1. Anbring 5 μL af en SYBR grøn realtids PCR-blanding i 0,2 ml PCR-rør. Til hvert rør tilsættes 1 μL 7,5 pmol/μL fremadgående primer og 1 μL 7,5 pmol/μL omvendt primer. Fremadgående primersekvens: 5'-CCCTAGTGGTTTCGGACACA-3'; omvendt primersekvens: 5'-ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'. Genet forstærket for at bestemme EBV-genomkopinummeret er Epstein-Barr-virusets lille RNA 2 (EBER-2) gen.
    2. Til et af rørene tilsættes 2 μL nukleasefrit vand og 1 μL viralt DNA fra trin 4. Det samlede volumen af reaktionsblandingen er 10 μL.
      BEMÆRK: Afhængigt af koncentrationen af DNA i prøven kan der være behov for et fortyndingstrin. Fortyndingsfaktoren F skal noteres og integreres i formlen i trin 6.3.
    3. Forbered andre rør, der vil blive brugt som standarder med kendte EBV-genomkopinumre (1000, 2000, 5000, 10.000 og 54.000 eksemplarer).
  2. PCR-blandingerne køres med udgangspunkt i et indledende aktiveringstrin ved 95 °C i 5 min. og derefter 40 cyklusser ved 95 °C og 58 °C (udglødning) i henholdsvis 15 s og 30 s.
  3. Generer en qPCR-standardkurve ved at plotte Ct-værdierne for standarderne mod loggen over antallet af EBV-genomkopier pr. Standardrør. Ved anvendelse af standardkurveplotligningen udledes antallet af EBV-genomkopier i PCR-røret indeholdende det inducerede virale DNA. Brug derefter følgende formel til at beregne koncentrationen af det inducerede virale præparat:
    Equation 4
    Hvor X er antallet af EBV-genomkopier afledt af standardkurven, og F er den fortyndingsfaktor, der anvendes til opsætning af det anvendte DNA pr. PCR-reaktion.

7. Kontrol af viruspartiklernes biologiske aktivitet/infektivitet

  1. Overfør BC-3-celler fra en 100 mm kulturplade ved 80% sammenløb til et 15 ml konisk rør. Såtætheden af P3HR-1-celler er 1 x 106 celler / ml. Oprethold i komplet RPMI-kulturmedium (79% RPMI-kulturmedium, 20% føtalt kvægserum, 1% Pen-Strep-antibiotikum) ved 37 ° C og 5% CO2 og passage hver 3-4 dage.
  2. Tæl BC-3-cellerne på samme måde som P3HR-1-cellerne blev talt ved at følge trin 1. Til en 96-brøndplade tilsættes 105 BC-3 celler til hver brønd. Brug tre, seks, ni eller 12 brønde for at sikre betydningen af resultater og minimere fejl.
  3. Der tilsættes et volumen viral bestand til hvert brønd afhængigt af koncentrationen af det virale præparat bestemt i trin 6.3. MOI kan variere, og optimering af denne protokol vil afsløre den bedste MOI for infektion (et MOI-interval på 2-50 anbefales). Sørg for, at det samlede volumen af blandingen, der er til stede i hver brønd, er 250 μL.
    1. For at bestemme det krævede volumen skal koncentrationen af den virale bestand være kendt, og en MOI skal vælges. For eksempel, hvis MOI er 2, skal antallet af tilsatte virale partikler være dobbelt så mange celler. Beregn volumen V af den virale bestand, der kræves ved hjælp af formlen: Equation 5, hvor n er antallet af nødvendige virale partikler, og C den kendte koncentration af virusbestanden
  4. Inkuber indholdet af 96-brøndpladen i 5 dage. Efter 5 dage overføres indholdet af hver brønd til et 1,5 ml rør.
  5. Centrifuger rørene ved 120 x g i 8 minutter for at adskille cellerne fra det virusholdige kulturmedium. Udsæt cellepillerne såvel som supernatanterne for DNA-ekstraktion efterfulgt af PCR-kvantificering i realtid for at kontrollere tilstedeværelsen af virale genomer i hver fraktion og dermed vurdere infektiviteten af de virale partikler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med denne procedure er at isolere EBV-partikler i en suspension med kendt viral titer, som efterfølgende kan bruges til at modellere EBV-infektion. Det er derfor yderst vigtigt at anvende optimale koncentrationer af de forskellige reagenser for at opnå det højeste EBV-udbytte ud af proceduren.

Et optimeringsforsøg blev udført for at bestemme koncentrationerne af PMA og DMSO, der ville give det højeste antal EBV-partikler (figur 2). En DMSO-koncentration på 0,8% og en PMA-koncentration på 35 ng/μL var optimale og resulterede i høje EBV-koncentrationer. Koncentrationen af virale partikler opnået fra optimeringsprotokollen var 917.471 virale partikler / μL.

Figure 2
Figur 2: EBV DNA-kopier/ml opnået ved induktion af P3HR-1-celler med phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA). P3HR-1-celler (105 celler) blev dyrket alene eller induceret med forskellige koncentrationer af PMA og DMSO ved hjælp af protokollen beskrevet her. Fejlbjælkerne angiver standardafvigelsen. En studerendes t-test blev udført, der sammenlignede PMA / PMA- og DMSO-behandlede celler med kontrolceller; * angiver p < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.

For at denne protokol kan betragtes som effektiv, skal trin 6 afsløre en rimelig koncentration af virale partikler, og trin 7 skal vise, at disse virale partikler faktisk er smitsomme. BC-3-cellelinjen, der blev brugt i trin 7, er EBV-negativ, så ved kvantificering af EBV-genomkopinumrene i negative kontroller (som ikke var underlagt denne protokol), bør der ikke påvises EBV-DNA.

EBV-DNA bør imidlertid detekteres i både cellerne og kulturmediet i forsøgsbrøndene (der blev udsat for denne protokol) af følgende grunde: EBV, der inficerer BC-3-celler, replikerer inde i disse celler, idet der tages højde for det faktum, at EBV-DNA vil blive detekteret i cellepelleten, og ved replikation vil BC-3-celler kaste virale partikler udefra; EBV-DNA vil således blive påvist i kulturmediet supernatant (efter DNA-ekstraktion).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Produktionen af EBV-partikler er nødvendig for at forstå biologien af denne virus såvel som dens tilknyttede sygdomme. Her beskrev vi produktionen af disse partikler fra P3HR-1 cellelinjen. Denne cellelinje er ikke den eneste EBV-producentlinje; faktisk er EBV-partikler også blevet isoleret fra B95-8 celler21,22 samt Raji-cellelinjen18,19. EBV-lytisk cyklus er blevet induceret i disse celler med n-butyrat. Alternativt kan phorbolestere såsom 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA), også kendt som phorbol 12-myristat-13-acetat (PMA), anvendes. Samlet set kan protokollen, der er beskrevet her, bruges til at anvende disse celler i stedet for P3HR-1-linjen. B95-8-linjen stammer imidlertid fra en bomuldstamarin (Saguinus oedipus), der i øjeblikket er klassificeret som en kritisk truet primatart23; Derfor sælges denne linje sjældent af leverandører med begrænsninger på salg og forsendelse. En licens er også påkrævet i henhold til konventionen om international handel med truede vilde dyr og planter (CITES) for alle ordrer uden for Det Forenede Kongerige. Mens Raji-cellelinjen er kommercielt tilgængelig, forekommer syntesen af replikativt viralt DNA og produktionen af viralt capsidantigen (VCA) ikke i disse celler efter induktion af kemikalier24,25. Disse kan dog let induceres ved komplementering efter superinfektion med EBV isoleret fra P3HR-1-celler20.

På grund af fraværet af et direkte plakassay til opregning af EBV-partikler26 stolede vi på en polymerasekædereaktion i realtid. Der er andre metoder til kvantificering, der kan fungere lige så godt til vores formål, såsom immunfluorescens eller PCR, der anvender fluorescerende sonder, der kan tilbyde forbedret specificitet. Valget af realtids-PCR ved hjælp af genomkopistandarder er baseret på det faktum, at dette er let tilgængeligt for de fleste laboratorier, mindre besværligt, mindre teknisk udfordrende og mere omkostningseffektivt27. Derfor kan andre metoder til kvantificering fungere lige så godt og kan anvendes baseret på tilgængelighed og erfaring.

Et af de mest kritiske trin i protokollen, der er beskrevet her, er plettering af celler i trin 2.1 og såning med et cellenummer inden for det område, der anbefales til pladens størrelse. Et lavt antal celler giver en lav koncentration af virale partikler, mens et stort antal celler vil trænge pladen, hæmme væksten og replikationen af celler og dermed bremse virusets lytiske cyklus. Derfor skal der udvises ekstrem forsigtighed, mens cellerne tælles i trin 1, beregnes det krævede volumen af suspension A og endelig pletteres cellerne i trin 2.

En begrænsning af protokollen er antagelsen om, at en kopi af EBV-genomet svarer til en viral partikel. Selvom denne antagelse er plausibel, kan det ikke påvises, om sådanne partikler er defekte eller ufuldstændige ved hjælp af dette assay. Da der ikke er nogen plaquedannelsesassays for EBV, som der er for mange andre vira, forbliver DNA-ekstraktion efterfulgt af realtids-PCR en accepteret metode til kvantificering af det virale præparat. En anden begrænsning er, at virussen induceres af en kontinuerlig pattedyrcellelinje, der kan akkumulere mutationer ved mange runder af passaging. Sådanne mutationer kan påvirke selve virusset, hvilket muligvis resulterer i ændrede in vivo- eller ex vivo-egenskaber af virusset. En potentiel løsning ville være regelmæssigt at sekvensere det cellulære og virale genom. Alternativt kan celler kasseres efter et par passager, og kulturen kan genstartes på ny fra en flydende nitrogenlagret celleprøve med et lavt antal tidligere passager. Det er også værd at bemærke, at EBV-partiklerne opnået fra P3HR-1-cellelinjen mangler EBNA2-antigenet, som normalt udtrykkes i B-lymfocytter, der er latent inficeret med EBV, som en del af seks virale nukleare proteiner i alt28. EBNA2-proteinet aktiverer promotorerne af gener, der udtrykker proteiner forbundet med type III af EBV-latenstid. Nylige undersøgelser har imidlertid vist, at EBNA2-mangelfuld EBV er i stand til at danne tumorer i CBH-mus, og at P3HR-1-cellelinjen derfor forbliver en nyttig model for EBV-positive lymfomer29. På den anden side kan EBV fra P3HR-1-celler bruges til at studere de roller, som EBNA2 spiller, mens de bruger en EBNA2-positiv EBV som kontrol. Sammenfattende har EBV opnået fra en kontinuerlig P3HR-1-cellelinje en betydelig forskningsværdi; det kan bruges til at studere biologi, infektivitet, virulens samt mange andre egenskaber ved EBV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Finansiering til dette arbejde blev støttet af tilskud til ER fra Asmar Research Fund, det libanesiske nationale råd for videnskabelig forskning (L-CNRS) og Medical Practice Plan (MPP) ved American University of Beirut.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL thin-walled PCR tubes Thermo Scientific AB0620 Should be autoclaved before use
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips Corning 4807 Should be autoclaved before use
0.5-10 µL Pipette BrandTech 704770
10 mL Disposable Serological Pipette Corning 4488
1000 µL Filtered Pipette Tips QSP TF-112-1000-Q
100-1000 µL Pipette Eppendorf 3123000063
100x20 mm Cuture Plates Sarstedt 83.1802
10-100 µL Pipette BrandTech 704774
15 mL Conical Tubes Corning 430791
200 µL Filtered Pipette Tips QSP TF-108-200-Q
20-200 µL Pipette Eppendorf 3123000055
50 mL Conical Tubes Corning 430828
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler Bio-Rad 184-1000
DMSO Amresco 0231
DNase/RNase Free Water Zymo Research W1001-1
EBER Primers Macrogen N/A Custom Made Primers
EBV DNA Control (Standards) Vircell MBC065
Ethanol (Laboratory Reagent Grade) Fischer Chemical E/0600DF/17
Fetal Bovine Serum Sigma F9665
Fresco 21 MicroCentrifuge Thermo Scientific 10651805
Glycogen Solution Qiagen 158930
Hemocytometer BOECO BOE 01
Inverted Light Microscope Zeiss Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5121
Microcentrifuge Tube Costar (Corning) 3621 Should be autoclaved before use
P3HR-1 Cell Line ATCC HTB-62
Penicillin-Streptomycin Solution Biowest L0022
Phenol VWR 20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Pipette Filler Thermo Scientific 9501
Precision Wipes Kimtech 7552
RPMI-1640 Culture Medium Sigma R7388
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030
Sodium Acetate Riedel-de Haën (Honeywell) 25022
Spectrophotomer DeNovix DS-11
Tris-HCl Sigma T-3253
Trypan Blue Solution Sigma T8154
Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Scientific 4121

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
  2. Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. Journal of Virology. 64 (9), 4084-4092 (1990).
  3. Chang, M. S., Kim, W. H. Epstein-Barr virus in human malignancy: a special reference to Epstein-Barr virus associated gastric carcinoma. Cancer Research and Treatment. 37 (5), 257-267 (2005).
  4. Manet, E. Encyclopedia of Cancer. Schwab, M. , Springer. Berlin Heidelberg. 1602-1607 (2017).
  5. Babcock, G. J., Decker, L. L., Volk, M., Thorley-Lawson, D. A. EBV persistence in memory B cells in vivo. Immunity. 9 (3), 395-404 (1998).
  6. Khan, G., Miyashita, E. M., Yang, B., Babcock, G. J., Thorley-Lawson, D. A. Is EBV persistence in vivo a model for B cell homeostasis. Immunity. 5 (2), 173-179 (1996).
  7. Jha, H. C., Banerjee, S., Robertson, E. S. The role of gammaherpesviruses in cancer pathogenesis. Pathogens. 5 (1), 18 (2016).
  8. El-Sharkawy, A., Al Zaidan, L., Malki, A. Epstein-Barr virus-associated malignancies: roles of viral oncoproteins in carcinogenesis. Frontiers in Oncology. 8, 265 (2018).
  9. Vereide, D., Sugden, B. Insights into the evolution of lymphomas induced by Epstein-Barr virus. Advances in Cancer Research. 108, 1-19 (2010).
  10. Vereide, D. T., Sugden, B. Lymphomas differ in their dependence on Epstein-Barr virus. Blood. 117 (6), 1977-1985 (2011).
  11. Houen, G., Trier, N. H. Epstein-Barr virus and systemic autoimmune diseases. Frontiers in Immunology. 11, 587380 (2020).
  12. Ortiz, A. N., et al. Impact of Epstein-Barr virus infection on inflammatory bowel disease (IBD) clinical outcomes. Revista Espanola de Enfermedades Digestivas. 114 (5), 259-265 (2021).
  13. Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Veterinary Pathology. 52 (5), 819-826 (2015).
  14. Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
  15. Warde, N. Experimental arthritis: EBV induces arthritis in mice. Nature Reviews Rheumatology. 7 (12), 683 (2011).
  16. Jog, N. R., James, J. A. Epstein Barr virus and autoimmune responses in systemic lupus erythematosus. Frontiers in Immunology. 11, 623944 (2020).
  17. Shimizu, N., Yoshiyama, H., Takada, K. Clonal propagation of Epstein-Barr virus (EBV) recombinants in EBV-negative Akata cells. Journal of Virology. 70 (10), 7260-7263 (1996).
  18. Hsu, C. H., et al. Induction of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation in Raji cells by doxorubicin and cisplatin. Anticancer Research. 22, 4065-4071 (2002).
  19. Nutter, L. M., Grill, S. P., Li, J. S., Tan, R. S., Cheng, Y. C. Induction of virus enzymes by phorbol esters and n-butyrate in Epstein-Barr virus genome-carrying Raji cells. Cancer Research. 47 (16), 4407-4412 (1987).
  20. Fresen, K. O., Cho, M. S., zur Hausen, H. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
  21. Glaser, R., Tarr, K. L., Dangel, A. W. The transforming prototype of Epstein-Barr virus (B95-8) is also a lytic virus. International Journal of Cancer. 44 (1), 95-100 (1989).
  22. Sairenji, T., et al. Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) release from P3HR-1 and B95-8 cell lines by monoclonal antibodies to EBV membrane antigen gp350/220. Journal of Virology. 62 (8), 2614-2621 (1988).
  23. Savage, A., et al. An assessment of the population of cotton-top tamarins (Saguinus oedipus) and their habitat in Colombia. PLoS one. 11 (12), 0168324 (2016).
  24. Kallin, B., Klein, G. Epstein-Barr virus carried by raji cells: a mutant in early functions. Intervirology. 19 (1), 47-51 (1983).
  25. Fresen, K. O., Cho, M. S., Hausen, H. Z. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
  26. Bounaadja, L., Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Evaluation of Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 (HHV-6), and HHV-8 antiviral drug susceptibilities by use of real-time-PCR-based assays. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1244-1246 (2013).
  27. Buelow, D., et al. Comparative evaluation of four real-time PCR methods for the quantitative detection of Epstein-Barr virus from whole blood specimens. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (4), 527-534 (2016).
  28. Wu, D. Y., Kalpana, G. V., Goff, S. P., Schubach, W. H. Epstein-Barr virus nuclear protein 2 (EBNA2) binds to a component of the human SNF-SWI complex, hSNF5/Ini1. Journal of Virology. 70 (9), 6020-6028 (1996).
  29. Li, C., et al. EBNA2-deleted Epstein-Barr virus (EBV) isolate, P3HR1, causes Hodgkin-like lymphomas and diffuse large B cell lymphomas with type II and Wp-restricted latency types in humanized mice. PLoS Pathogens. 16 (6), 1008590 (2020).

Tags

Immunologi og infektion udgave 187
Isolering og kvantificering af Epstein-Barr-virus fra P3HR1-cellelinjen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bitar, E. R., Shams Eddin, M. S.,… More

Bitar, E. R., Shams Eddin, M. S., Rahal, E. A. Isolation and Quantification of Epstein-Barr Virus from the P3HR1 Cell Line. J. Vis. Exp. (187), e64279, doi:10.3791/64279 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter